Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов остановки роста тромба

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов остановки роста тромба"

На правах рукописи

Зарницына Вероника Игоревна ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ОСТАНОВКИ РОСТА ТРОМБА 03.00.02 - БИОФИЗИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Гематологическом Научном Центре РАМН

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ф.И.Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор технических наук,

профессор М.А.Ханин кандидат физико-математических наук А.Н.Заикин

Ведущая организация - Физический факультет

Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится 199?г.

в {б часов на заседании диссертационного совета Д200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292 г.Пущино Московской области, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ' П.А.Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поскольку система свертывания крови является одной из наиболее уязвимых в организме, то многие заболевания сопровождаются различными нарушениями ее работы. И именно эти нарушения нередко приводят к летальному исходу. Поэтому исследование динамики свертывания крови относится к наиболее актуальным проблемам биологии и медицины.

При активации системы свертывания крови, в норме, происходит быстрый локальный переход части жидкой крови в плотный нерастворимый фибриновый сгусток, закрывающий собой место повреждения. Обзор литературы показал, что вопросы, связанные с пространственной организацией процесса свертывания и механизмами остановки роста тромба, являются наименее изученными. Есть неопределенность в определении скоростей реакций положительных обратных связей в основном каскаде реакций, ведущих к свертыванию (Gailani D., Broze G.J.,1991; Scott C.F., Colman R.W., 1992; Bruiinee et al, 1993). Реакции такого типа теоретически могут приводить к автоволновому распространению факторов свертывания в пространстве (Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., 1994), поэтому актуальной является задача количественного исследования роли таких реакций.

Какова пространственная динамика роста и остановки тромба в организме? Недавно экспериментально были получены данные о росте фибринового сгустка при активации плазмы in vitro (Атауллаханов Ф.И. и др., 1995 - при активации внутреннего пути системы свертывания; Навдаев A.B., диссертация. 1997 - при активации внешнего пут). Кинетика образования отдельных факторов при активации системы свертывания также известна. В частности, хорошо изучена кинетика образования тромбина, основного фактора свертывания, переводящего фибриноген в фибрин. Возникает вопрос: может ли наблюдаемая в системе с перемешиванием кинетика образования тромбина обеспечить экспериментально наблюдаемый характер роста фибринового сгустка в пространстве? При каких условиях возможно автоволновое распространение факторов свертывания? Какие механизмы приводят к остановке роста сгустка? В данной работе мы попытались получить ответы на эти вопросы.

Целью данной работы является теоретическое исследование пространственной динамики роста тромба на основе современных молекулярных представлений о системе свертывания крови; а также анализ влияния отдельных факторов и реакций системы свертывания на характер остановки роста тромба.

Задачи исследования: 1. Построить модель внутреннего пути системы свертывания крови, базирующуюся на современных биохимических представлениях и согласующуюся с экспериментальной зависимостью гомогенной (системе с перемешиванием in vitro) кинетики свертывания от концентрации ионов кальция.

2. Рассмотреть задачу о пространственном росте фибринового сгустка:

• влияние реакции активации XI фактора свертывания тромбином,

• влияние реакций, связанных с протеином С.

3. Провести качественное исследование гомогенной кинетики и пространственной динамики свертывания.

Научная новизна.

1. Проведен анализ математических моделей процесса, базирующихся на известной схеме каскадного устройства биохимической системы свертывания крови, с учетом экспериментально установленных положительных и отрицательных петель обратных связей. Показано, что система уравнений, не содержащая реакцию активации XI фактора тромбином, не описывает экспериментально наблюдаемую кривую роста фибринового сгустка в плазме.

2. Показано, что реакция активации XI фактора тромбином не влияет на гомогенную кинетику свертывания при значении константы скорости (кц) менее КМмшг1. На характеристики растущего тромба эта реакция начинает влиять при значении этой константы на два порядка ниже (кц>10'6мин'1). Наилучшее качественное описание экспериментальных данных достигается при значении к| ]=810"6мин"'.

3. Для количественного описания динамики роста тромба была рассмотрена гипотеза о переключении активности тромбина но отношению к его субстратам под действием пептида, образующегося при активации протеина С тромбином. В рамках згой гипотезы была получена кривая роста фибринового сгустка, хорошо согласующаяся с экспериментальной.

4. Исследование простых моделей системы свертывания, полученных в результате редукции полной системы уравнений показало:

• введение блока реакций, связанных с протеином С, приводит к автоколебаниям факторов свертывания, т.е. системе свертывания присуща нестабильность;

• в моделях типа "реакция-диффузия" с одинаковыми коэффициентами диффузии всех активных переменных возможно образование неподвижных пространственно-локализованных структур (приведены результаты для одно- и двумерного случаев).

Научно-ппактическое значение.

Результаты работы будут полезны для исследователей, занимающихся свертыванием крови. Результаты работы могут найти практическое применение в разработке новых методов диагностики и лечения различных патологий, возникающих при нарушениях нормального функционирования системы свертывания человека. Полученные в работе результаты также представляют интерес для исследователей, занимающихся вопросами нелинейной динамики и пространственной самоорганизации биологических и химических систем.

Апробация диссертации состоялась 20 мая 1997 года на заседании проблемной комиссии "Консервирование клеток крови и костного мозга, биохимия, биофизика крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН. Материалы диссертации докладывались на международных

конференциях "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах" (Суздаль, 1995), "Thrombin and Vascular Medicine" (USA, 1995), 40-ом Съезде Американского Биофизического общества (Baltiinor, USA, 1996), Гордоновской конференции "Oscillations and Dynamic Instability" (Newport, USA, 1997).

Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на /2Л1страницах машинописного текста, включающих 44 рисунка и 5 таблиц, и состоит из введения, пяти глав (главы I - обзор литературы, главы 2 - методы исследования, глав 3, 4, 5 - собственных исследований), обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего /¿/¿} источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПЕРВАЯ ГЛАВА представляет краткое описание современных представлений о системе свертывания крови. Проанализированы экспериментальные данные о структуре системы и кинетике активации отдельных факторов свертывания, рассмотрены известные математические модели системы, обсуждается возможность отнесения крови к "активным средам'' и изучения протекающих в ней процессов с использованием соответствующих методов теории самоорганизации.

ВТОРАЯ ГЛАВА дает описание численных методов, использованных автором работы при написании пакета программ для исследования пространственной динамики свертывания крови (системы соответствующих уравнений в частных производных параболического типа).

Одномерная задача решалась вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга (RKF2(3)). Рассматривалась система уравнений вида:

ct ас'

с пространственной дискретизацией:

<5Um _ п Um^2-Um+Um_x

А 1 1 J"1'

a h

Используемый численный метод давал второй порядок точности и по

времени и по пространству.

В случае исследования пространственных эффектов в Главе 5 для fm

использовалась аппроксимация Нумерова:

— -f — —.Г

^ ^ * j ^ ' Jт + J2 ' J '

приводящая к разностной схеме четвертого порядка точности по пространству.

При моделировании опытов роста фибринового сгустка в чашках Петри (Глава 4) при активации плазмы крови стеклянным шариком

рассматривалась квазиодномерная задача (двумерная с цилиндрической симметрией).

При численном моделировании двумерной пространственной задачи использовался модифицированный метод "ЬорхаПсЬ". Полученная в результате схема имеет второй порядок точности по пространству и порядок точности между первым и вторым по времени.

ТРЕТЬЯ ГЛАВА посвящена построению точечной (гомогенной в эксперименте) математической модели внутреннего пути системы свертывания крови.

На рисунке I представлена биохимическая схема реакций внутреннего пути системы свертывания крови, положенная в основу математической модели.

Рис.1 Используемая биохимическая схема реакций внутреннего пути системы свертывания крови.

АКТИВЗЦИЯ и лсх/аооаасгоааипоаасзпсггэ Ц

5_у> \ 4У_

г: - -- §к9 р

ХШЦС г* у _ Вка1К

Ш^ШЙЖЙЖМГ 0 8

\ протромбмназа В

К- Чу,

VI Са а/

-ч/ ' Ьоо«

а |оае

( II | ~ — • -»И И А [ааооРД^цсзао

протромбин / тромбин

Ч

________ п

[фиОриногенН^=^фиРрнн|

превращение

<> - катапиз 1 Тромб

Факторы свертывания обозначены римскими цифрами в соответствии с общепринятой системой классификации. Активированные факторы помечены индексом "а". На схеме к| - константа активации ¿-го фактора, 1\, - константа инактивации 1-го фактора под действием ингибиторов плазмы. На схеме учтены реакции ферментативного катализа в основном каскаде, реакции положительной обратной связи через активацию тромбином кофакторов и сборку соответствующих ферментативных комплексов теназы и протромбиназы, инактивация активных факторов ингибиторами плазмы, а также реакции отрицательной обратной связи через активацию тромбином протеина С с последующей инактивацией кофакторов. Учет блока реакций, связанных с протеином С отличает предложенную модель от рассмотренных ранее моделей внутреннего пути

системы ' свертывании крови, описывающих начальную кинетику свертывании (Семенов В.В., Ханип М.Л., 1990). Реакция активации XI фактора тромбином отмечена пунктиром. В модель |I|-(Sj она не входит, а ее влияние рассматривается далее отдельно.

Модель представлена системой восьми обыкновенных дифференциальных уравнений |1]-|8|:

V Xla-h>-IXi |!|

dt

vz-Ao-^ 121

dt

— =k,-Xi----+ -£=--Ы-Па [3]

dt - (П+К1т) - (17+К1т) '

, v л -г ... Л

— = -k, ■ Ха---h-W--4

dt ■(&+&_„) - (П+Кгт) ,

^YHIi - kz- Па - kd- АРС- (Villa + Z)- Villa [5]

dt

— = k5 ■ Ha - k ■ APC- (Va + W)~hs-Va [6| dt

dAPC

-^=kapc-IIa-hapc-APC 17]

[8]

dt 1

Переменные модели - концентрации факторов IXa, Ха. Па (тромбин), II (протромбин), Villa, Va, АРС (активированный протеин С) . и фибрин. Образующиеся комплексы 1Ха фактора с Villa фактором и Ха фактора с Va фактором - Z (теназа) и W (протромбиназа), соответственно, полагались быстрыми переменными. Их квазистационарные концентрации:

kZ9-Villa-Ш ^-Va-Xi Z=- и W-

+ к3 ■ АРС) (4мо + ка-АРС) Начальная концентрация протромбина полагалась равной его нормальной концентрации в плазме (ЮООнМ). Начальные концентрации всех активных факторов (кроме фактора Х1а) полагались равными нулю.

Экспериментально было показано (/МаиПакЬапоу Р.1., РоЫ1ко АЛ'., БтаипсЬе Е.1., Volkova И.!., 1994), что в плазме при контакте с чужеродной поверхностью (стеклом кварцевой кюветы) квазистационарная концентрация Х1а фактора устанавливается менее чем за 0.2 минуты и далее не меняется в течении часа. Нас будет интересовать кинетика свертывания на временах от 1 до 100 минут. Поэтому в данной модели концентрация ХГа фактора считалась постоянной и определяла уровень активации системы (СО).

Константы реакций активации факторов свертывания в прямом каскаде взяты из соответствующих экспериментальных работ. Значения k.lpc и к/ взяты из модельных теоретических работ (Willems G M., Lindliout Т., Herniens W.T., Hemker H.C., 1991 и Light R.T., 19S7, соответственно). Для определения полного набора констант реакции, характеризующих петли положительной обратной связи через V и VIII кофакторы недостаточно экспериментальных данных. В предложенной модели эти петли отличаются только на уровне констант активации тромбином V и VIII кофакторов (соответственно кинетических констант kj и ks). Все остальные константы полагались равными для обеих петель и были оценены из соответствующих экспериментальных данных. При таких допущениях константы к< и kg не определяют кинетические константы скоростей соответствующих реакций, а являются интегральной характеристикой относительной ¡тспснпности рассматриваемых петепь обратной связи.

Верификация модели проводилась по серии кинетических кривых расщепления специфичного флуорогенного субстрата тромбина: ВОС-А1а~ Pro-Arg-AMC (S) (Ataullakhanov F.I., Pohilko A.V., Sinauridze E.I., Volkova R.Í., 1994) (рисунок 2). Эти кривые получены при контактной активации свертывания стеклом в плазме при разных концентрациях кальция и отражают кинетику образования тромбина. С целью сравнения с экспериментом в модель была введена реакция расщепления тромбином субстрата S с кинетической константой kcat=7.8-10jmiih"1 (Kawabata S. et al, 19SS). Эта реакция не меняет кинетику свертывания, а только фиксирует количество образующегося в системе тромбина.

Рис.2 Теоретические кривые

(сплошные линии) и

экспериментальные данные

(треугольники) по

образованию AMC при

различных концентрациях

кальция. Концентрация

Са2+ изменялась от 0.24мМ

до 1.44мМ.

t, мин

Зависимость от кальция была введена в кинетические константы скорости к2, к2, к10, кК) в виде кса1 = кса1.тахГ(Са) + кСаЮ- Известно, что скорость этих реакций зависит от концентрации кальция сигмоидным образом. Поэтому, при верификации модели варьирование констант, характеризующих интенсивность петель положительной обратной связи через кофакторы (к5 и к8) сопровождалось выбором функции ДСа) (одинаковой для всех четырех констант), лежащей внутри

экспериментально очерченного диапазона. Используемая функция 1"(Са) приведена на рисунке 3. 0 8

0.4

Рис.3 Функция КСа), 'а

аппроксимирующая ^

экспериментальные данные и используемая в модельных расчетах.

Са.тМ

Используемые в модели значения констант: к9=20мин"1, Ь9=0.2мин-1. СО=О.ЗнМ, к8=10-5мин-1, к5=0.17мин 118=115=0.31мшГ1, кю=(0.003-Г(Са)+0.0003)мин-1, А^=500Г(Са)мин к2=(2.3 Г(Са) +0.15)мин"1, 1Г2 =2000-Г(Са)мин"1, к5,, 0=к8.9= ЮОн \Г1 мин ¡151ю=!18,9=1°0мин"1> к2т-"58нМ, £7т=210нМ, ка=1.2нМ"1мнн Ью=1мин"^, 112=2.Змин"к1=2.82мин"' кп=10-4-10-бмин-1, ]111=0.2мин"1.

Как и предложенные ранее модели (Семенов В.В., Ханин М.А., 1990) данная модель [1]-[8] обладает пороговым поведением при изменении уровня активирующего воздействия (пороговое значение 0.007нМ Х1а фактора), а вид кинетических кривых образования факторов Па, Ха, 1Ха согласуется с экспериментальным (Мс№е1у Т.В., войт М.Л., 1985). Для приведенных выше констант кинетика образования тромбина имеет вид одиночного импульса (рис.4А). Однако при увеличение константы активации протеина С тромбином (эффект тромбомодулииа) кинетика

Рис.4 Изменение кинетики образования тромбина при увеличении константы скорости реакции активации протеина С тромбином (А - кяг„. = 0.0014 мин"1 и В - кя

к2т =210нМ, карс=0.0014мин"*,

Ьарс=0- 1мин"

^арс

800

_ 400

А

= 0.1 мин *).

180 -

.90

В

5 10 (, мин

15

40 I, мин

80

0

образования тромбина приобретает вид нескольких последовательных импульсов, уменьшающихся но амплитуде (см рис.4В).

Поскольку затухание амплитуды импульсов тромбина (рис.4В) может быть связано с исчерпанием предшественника, а появление нескольких импульсов свидетельствует о нестабильности системы, было проведено качественное исследование редуцированной модели.

Исходная модель [1|-[S] была редуцирована:

am dt

k) • CD VAo

ÄS.9

•*9

IIa

ю'

Оъ + Ь- APQ

(k2 + k2 • -

^5,10 '

IIa

Лс.л (fy + k, ■ APQ

IIa 1000

)- Ih ■ IIa

[91

(1АРС

= каре ■ Па ~ аре ■ АРС

Для анализа фазовых портретов уравнение исчерпания предшественника тромбина [4) заменено ограничением концентрации тромбина максимальной концентрацией протромбина в плазме (ЮООнМ). Показано, что при изменении значения СО (уровня активации системы) и константы активации протеина С тромбином (карс), увеличение которой можно рассматривать как влияние тромбомодулина, поведение системы [91 качественно меняется. Приведенные ниже рисунки иллюстрируют изменение фазового портрета при уменьшении уровня активации системы (рисунок 6) и увеличении значения карс (рисунок 7). На рисунке 5 приведен фазовый портрет для значений констант, приведенных на странице 9 и соответствующих кинетической кривой тромбина в виде одиночного импульса в полной системе Ш-(81. В данном случае система |9] имеет единственную особую точку - устойчивый узел, соответствующую свернувшемуся состоянию плазмы крови.

Рис.5 Фазовый портрет упрощенной системы [9] для значений констант, приведенных ^ 40 -на странице 9 ■>--»*

кп„с=0.0014мин_1).

(С0=0.3нМ,

"аре /• Изоклины

показаны жирными линиями, фазовые траектории - тонкими линиями.

е_

<

550 На, нМ

1100

Сдвиг изоклины первого уравнения системы [9] при уменьшении значения СО объясняет пороговую зависимость свертывания от уровня активации. На рисунке 6 показан фазовый портрет для долорогового

lü

значения СО^О.ООЗнМ. В данном случае система |9| имеет три особые точки (на рисунке показаны только две из них, расположенные вблизи начала координат, третья - устойчивым узел находится за пределами выбранного масштаба и соответствуе свернувшемуся состоянию плазмы).

0.001

Рис.6. Изменение фазового Щ; портрета для случая допороговой 0.0005 активации системы (СО = 0.005 ^ нМ, остальные значения констант < приведены на стр.9).

0

Па. нМ

Появление устойчивой особой точки вблизи нуля соответствует выходу системы (при нулевых начальных значениях переменных) на небольшие (допороговые) стационарные концентрации активных факторов. Рисунок б также объясняет наблюдаемый в полной системе запуск свертывания небольшими концентрациями тромбина. На приведенном рисунке видно, что для данного допорогового уровня активации (0.005нМ) концентрация тромбина начинает резко нарастать, если начатьные концентрации превышают 0.043нМ.

Рисунок 7 объясняет поведение полной системы при увеличении значения константы активации протеина С тромбином (см рис.4В -несколько всплесков концентрации тромбина с уменьшающейся амплитудой при карс=0.1мин~*). Рисунок 7 отличается от рисунка 5 изменением наклона изоклины, соответствующей второму уравнению системы [9]. На фазовом портрете редуцированной системы приведена

Рис.7 Изменение фазового портрета упрощенной системы при увеличении значения константы активации протеина С тромбином (карс=0.1мин"1, остальные константы

приведены на стр.9). Изоклины показаны жирными линиями, траектория предельного цикла -тонкой линией.

0 0.05

Па, нМ

траектория предельного цикла. Из приведенного рисунка 7 видно, что в системе (в отсутствии исчерпания) могут существовать устойчивые незатухающие колебания факторов свертывания.

Ранее было показано (Gailani D., Broze G.J., 1991), что очищенный тромбин активирует очищенный фактор XI с кинетической константой скорости кса1=7.8Т0~3мин~' и константой Михаэлнса Кт=50нМ. В присутствии фибриногена (Scott С.F., Colman R.W., 1992) и в плазме (Brunnee et al, 1993) эту реакцию зарегистрировать не удалось. В модели эта реакция была учтена введением дополнительного уравнения:

IIa-Д,- Ma+vtok, 110]

где vtok = СО • hn.

Решение системы 1П-|8],(10] показало, что эта реакция при значении кц меньше 1Сг\шн-1 не влияет на кинетику факторов свертывания (при насыщающих концентрациях кальция). При анализе пространственного роста сгустка будут использоваться значения из этого диапазона. В уравнениях рассматриваемой системы не присутствуют комплексы тромбина с его субстратами. Оценка конкурентного связывания тромбина только с фибриногеном показывает понижение скорости реакции активации XI фактора тромбином в 7 раз. Это означает, что учет связывания тромбина со всеми его субстратами может настолько уменьшить скорость этой реакции, что она может оказаться не регистрируемой в плазме.

ЧЕТВЕРТАЯ ГЛАВА посвящена изучению пространственного роста и остановки фибринового сгустка.

В эксперименте (Атауллаханов Ф.И. и др., 1995; Sarbash V.l. et al, Biophysical J., in press) наблюдался рост тромба в тонком слое плазмы в чашке Петри. Рост аустка инициировался помещением стеклянного шарика с одновременным добавлением насыщающих концентраций кальция. Описывая рост сгустка вокруг шарика, мы рассматривали квазиодномерную задачу (с цилиндрической симметрией). Соответствующая математическая модель представлена восьмью уравнениями в частных производных (полученным из уравнений [ 11-[7],[10] добавлением диффузионных членов) и одним обыкновенным дифференциальным уравнением для фибрина [8] (предполагается, что образующиеся мономеры фибрина сразу полимеризуются в сгусток). На границах рассматриваемого отрезка были заданы условия непротекания для всех активных факторов. Активация системы моделировалась постоянным втоком Х1а фактора с левой границы. Отрезок длиной 3 мм был разбит на 200 точек. За начальные условия взяты нулевые концентрации всех активных факторов. Начальная концентрация протромбина во всех точках равна 1000 нМ. Коэффициент диффузии полагался одинаковым для всех факторов (О=3.7Т0~3мм2мин"').

Рисунок 8 иллюстрирует профили пространственного распределения концентрации тромбина через одинаковые промежутки времени для случаи, когда реакция активации тромбином XI фактора не учитывалась

(к1(—0, остальные констангы приведены на стр.9). В области активации (на левой границе рассматриваемого отрезка) концентрация тромбина резко нарастает, формируется импульс, который двигается из зоны активации с уменьшающейся скоростью и амплитудой. Рисунок 9 показывает накопление фибрина, фиксирующее прохождение тромбина (фибрин в модели не диффундирует).

Рис.8. Пространственно-временная динамика распространения тромбина с активирующей границы. Профили тромбина представлены с минутным интервалом с 12 по 36 минуты от начала активации системы.

Исследование фазового портрета редуцированной модели [9] показало, что при увеличении константы активации протеина С тромбином (карс) в системе наблюдалась нестабильность. Мы проанализировали влияние увеличения этой константы на пространственный рост сгустка. Показано, что в данном случае

Рис.9 Соответствующие рисунку 8 профили пространственного распределения фибрина,

иллюстрирующие динамику его накопления. Интервал между профилями - 2 минуты.

становится возможным появление вторичных тромбиновых волн внутри растущего тромба, как следствие неполного исчерпания протромбина при

О 0.5 1 1.5 X, мм

проходе первой волны. Амплитуда этих вторичных волн нарастает к краю сгустка, что приводит к его уплотнению. При этом концентрация фибрина на краю сгустка может превышать ее значение в области активации (центре сгустка) в 1.5-2 раза. Такой результат кажется нам физиологичным, так как уплотнение края тромба уменьшает вероятность его размывания, отрыва кусков под действием потока крови.

На рисунке 10 представлена зависимость размера сгустка от времени для различных значений константы активации XI фактора тромбином, а также экспериментальные данные (Sarbash V.l. et al, Biophysical J., in press). Размер сгустка определялся как координата полувысоты от максимума текущего пространственного профиля фибрина (см рис.9). Согласно данным экспериментов в образовании фибринового сгустка можно выделить три стадии: период задержки роста (период образования тромбина в области активации), рост с практически постоянной скоростью во второй стадии (примерно 30 минут) и затем резкое торможение роста сгустка (Sarbash V.l. et al, Biophysical J., in press, Атауллаханов Ф.И и др., 1995). Из рисунка 10 видно, что без учета

Рис. 10 Зависимость размера тромба (движения координаты фибринового сгустка на полувысоте его максимальной плотности) для различных значений кц: кривая I - кц=0, 2 -кц=6-10"6мин"',3 - кц=8Т0" 6мин-', 4 - ku=10"5 мин''. Значения экспериментальных точек по росту сгустка (Sarbash V.I et al, in press) отмечены квадратами.

О 35 70

t, мин

реакции активации XI фактора тромбином активный рост сгустка продолжается в течении примерно 10 минут (кривая 1), после чего наблюдается резкая остановка, в то время как в эксперименте рост сгустка более длителен. При значении кц<10"бмин"1 соответствующая реакция не влияет на рост сгустка. При Ю'Чшн'^кц-СЮ^мшг1 наблюдается увеличение (с увеличением к])) участка приблизительно линейного роста сгустка. Значение кц=8Т0"6мин"1 качественно описывает экспериментально наблюдаемый рост сгустка. Для данного значения наблюдается длительный рост фибринового сгустка со скоростью, совпадающей с экспериментальной. При значении к[[>=10 5мшг' рост сгустка становится неограниченным. Подчеркнем, что гомогенная кинетика свертывания при константе кц из рассматриваемого диапазона остается без изменений.

Таким образом введение реакции активации XI фактора тромбином улучшает описание экспериментальных данных, однако, несмотря на качественное соответствие, количественного согласия получить не удается.

Для того, чтобы количественно описать полученные экспериментальные данные по зависимости роста сгустка от времени была предложена гипотеза, согласно которой возможно переключение активности тромбина по отношению к его субстратам под действием пептида, отщепляющегося при активации протеина С. Рассмотрение соответствующих реакций позволило количественно описать экспериментально наблюдаемый рост сгустка, а также получить остановку автоволны тромбина при кц >= 105 мин"1.

В соответствии с предложенной гипотезой отщепляемый при активации протеина С под действием тромбина пептид, связываясь с тромбином, может менять его активность по отношению к субстратам, увеличивая скорость образования протеина С и одновременно снижая скорость расщепления фибриногена. Введение в систему [10] переключения активности тромбина по отношению к протеину С при допущении равновесия между формами тромбина (кр - константа равновесия) изменит уравнение для АРС: дАРС

а

= D ■ MPC +

(kapcl ' кр + k-apcl '

+ Р)

■Па

hapc-APC,

[11]

Р=-

{К

apcl

■ Па -

VV

Крс\ ' кр' hр'

Па

2-Нр

здесь Р - концентрация пептида, карс1 и карс2 - кинетические константы скорости образования активированного протеина С ' первой и второй формами тромбина, соответственно (карс1<карс2, карсХ =0.0014мшг'), кр-

константа инактивации пептида. Также изменится и уравнение образования фибрина, однако это изменение никак не влияет на кинетику образования всех остальных факторов свертывания.

Рис.11. Зависимость размера фибринового сгустка, полученная в модели для значений констант А:р = 10нМ, = 1 1-ТП-5мнн-1

Ир = 1м ип"1,

показана сплошной экспериментальные (ЗагЬгшЬ V.! с1 а1, показаны квадратами.

кл=1.1Т0омин каРл =0.07мшг|,

линиеи, данные in press)

1,8 1,2 0,6

Lz.

20

40 60 t, мин

80

Варьируя константы кц и карс2 удается получить количественное

описание экспериментальной кривой роста фибринового сгустка в плазме (рисунок 11).

Проведено исследование влияния скорости изчезновения пептида из плазмы на динамику роста сгустка. Уменьшение значения константы скорости инактивации пептида (кр) приводит к более быстрой остановке роста сгустка. Для того, чтобы время роста сгустка сохранить соответствующим рисунку 11 и одинаковым для всех значений Ир,

уменьшалась константа активации протеина С второй "переключенной" формой тромбина. Полученная зависимость приведена на рисунке 12.

Рис.12 Изменение значения константы скорости карс2 при уменьшении значения

константы Ир, сохраняющее

фиксированное (около часа) время роста фибринового сгустка. Все остальные константы те же, что и для рисунка 11.

Виа уравнений [11] не позволяет рассмотреть случай, когда пептид в плазме не разрушается =0). Экстраполяция прямой рисунка 12 к

нулевому значению константы Ир дает значение ¿орс2=0.0023мшг1 (при

этом карс2 больше значения скорости образования протеина С первой

формой тромбина). Это значение соответствует остановке роста сгустка за фиксированное время при условии, что весь тромбин находится во второй переключенной форме.

Таким образом рассмотрение совокупности всех основньсх реакций свертывания показывает, что для количественного описания пространственного роста сгустка недостаточно общепринятых представлений о процессе. По-видимому, в системе существуют неизвестные механизмы типа рассмотренного выше механизма о переключении.

Поскольку наблюдаемая в системе пространственная динамика образования сгустка оказалась довольно сложной, мы решили провести качественное исследование системы на упрощенных моделях. Полученным результатам посвящена ПЯТАЯ ГЛАВА диссертации.

Система уравнений, включающая гипотезу о переключении, была редуцирована до системы трех уравнений с переменными концентрациями Х1а фактора, тромбина и активированного протеина С. Для полученной системы рассматривалась одномерная пространственная

0.04 т

0 ---и-,

0 0.25 0.5

Ир, мин-1

задача. Сели начальная активация системы превышала пороговое значение, то с активирующей границы распространялся импульс, который в зависимости от параметров модели либо замедлялся и останавливался на некотором расстоянии от границы (как правило с последующей релаксацией системы к нулевому пространственно-однородному решению), либо двигался до естественных границ среды в виде автоволны активных переменных. Однако в узком, диапазоне параметров был обнаружен режим, при котором бегущий от активирующей границы импульс после остановки не диссипирует, а стабилизируется и продолжает существовать неограничено долго.

Для исследования режима "неподвижного импульса" редуцированная система была обезразмерена. Затем был проведен рял структурных упрощений, сохраняющих описанный режим. В результате был получен класс моделей, обладающих сходным повелением. На примере наиболее простой модели из этого класса [ 12] было теоретически показано существование такого стационарного решения, а также исследована его устойчивость.

âU_

а ¿г

et &V ci

= DAU + Ky-U - V •(} - U) ■

(1 + K,-U)

(1 + ф-ио'

■ и

= DAV + U-

KA -V

[12]

DAW + K5 ■ UK6 ■ W

На рисунке 13 приведено пространственное распределение переменных модели после выхода системы на стационарное решение. При

- аналог АРС в полной модели), а фактора) шире, чем распределение и все распределения симметричны

этом распределение ингибитора (\¥ также переменной V (аналог Х1а активатора (и - аналог тромбина) относительно центра структуры.

1 т

Рис.13. Пространственное

распределение переменных и, V, У/, отнормированное на соответствующие максимумы переменных, для установившейся структуры. Нормировочные

максимумы указаны в скобках рядом с соответствующими переменными.

1.5

2.5

Значения констант, соответствующих режиму установления стационарной структуры: К|=6.85, К.2= 15.15, Kj=2.36, K<i=0.087, К5 -17, К6=0.05, D=0.00026.

Также показано, что при взаимодействии неподвижной установившейся структуры с набегающей на нее волной концентраций активных факторов волна гасилась, а полученный системой импульс приводил к затухающим со временем колебаниям амплитуды пика структуры и выходу на начальное стационарное решение.

В двумерной задаче при определенных значениях параметров начальное возмущение (квадрат концентраций активатора U в центре счетной области) распадается на четыре стационарных пространственно-локализованных структуры, остающихся неподвижными в течении длительного времени.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. В работе была проанализирована реакция активации тромбином XI фактора свертывания - петля положительной обратной связи в основном каскаде реакций. Увеличение скорости этой реакции оказывает влияние на пространственную динамику роста тромба при значении соответствующей константы на два порядка меньше, чем для изменений гомогенной кинетики свертывания. Показано, что при значениях константы активации XI фактора тромбином, никак не влияющей на кинетику системы с полным перемешиванием, пространственный рост тромба может стать неограниченным. Существование этой реакции не регистрируется в плазме крови (Bruanee et al, 1993) в гомогенной кинетике, в то же время в экспериментах пространственного роста сгустка ее зарегистрировать значительно проще.

2. Анализ реакций, связанных с о стан вкоЛ пространственного роста сгустка (предсуществующие ингибиторы, протеин С) показал, что современные представления о системе свертывания крови не могут объяснить экспериментальные данные. Поэтому в работе предложена гипотеза о существовании новых реакций, вызывающих переключение активности тромбина. Эта гипотеза предполагает, что тромбин может существовать в двух формах. Такое предположение не ново. Известно переключение активности тромбина под действием тромбомодулина (Esinon С.Т. et al, 1982), синтетического переключателя (Berg D.T. et al, 1996), ионов натрия (Di Cera Е. et al, 1993). Новым является то, что в роли переключателя используется вещество, образующееся в ходе свертывания. Эта гипотеза хорошо описывает все экспериментальные результаты. Отметим, что она не является единственно возможным объяснением. Это показывает, что вопрос об остановке роста тромба требует дополнительных экспериментальных исследований.

3. Качественное исследование системы свертывания показало, что в ней возможны периодические пульсации концентраций активных факторов. Это свойство системы может играть с одной стороны полезную физиологическую роль (уплотнение края тромба), а с другой стороны вызывать патологии типа синдрома диссеминированного

внутрисосудистого свертывания. Динамические особенности системы свертывания приводят к тому, что ее пространственное поведение может быть сложным. Примером такого поведения являются описанное в работе образование стационарных пространственно-локализованных структур.

На сегодняшний день не по веем реакциям свертывания имеется исчерпывающая информация: неизвестен ряд кинетических констант, существование некоторых реакций является спорным. Сравнение поведения гомогенной и пространственной- моделей показало, что наиболее чувствительной к изменению констант может оказаться пространственная динамика системы. Поэтому необходимо дальнейшее экспериментальное исследование пространственного роста тромба в силу большой важности этой системы для организма.

ВЫВОДЫ

1. Построена математическая модель внутреннего пути системы свертывания крови, основным отличием которой от предложенных ранее является введение блока реакций, связанных с протеином С. Показано, что в широком диапазоне параметров в системе могут наблюдаться колебательные режимы.

2. Рассмотрена динамика роста тромба в пространстве. Показано, что система уравнений процесса свертывания, не содержащая реакцию активации тромбином XI фактора, не описывает экспериментально наблюдаемую кривую роста фибринового сгустка в плазме. Введение этой реакции при соответствующей константе скорости 810"6 мин"1, не влияя на гомогенную кинетику системы, позволяет качественно описать экспериментальные данные.

3. Для количественного описания экспериментальной кривой пространственного роста тромба рассмотрена гипотеза о переключении активности тромбина (увеличения активности по отношению к протеину С с одновременным уменьшением по отношению к фибриногену) под действием пептида, отщепляющегося от протеина С в реакции его активации тромбином. Результаты, полученные в рамках этой гипотезы, хорошо согласуются с экспериментальными данными по росту фибринового сгустка в плазме.

4. Анализ упрощенной модели гипотезы о переключении активности тромбина позволил выделить класс трехкомпонентных систем, в которых наблюдается образование неподвижных пространственно-локализованных структур в одно- и двумерном случаях. Отличием формирования данных структур от описанных ранее является равенство коэффициентов диффузии всех активных переменных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Zarnitsina V.I., Pokhilko A.V., Ataullakliauov F.I. A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. I.The model description. Thrombosis Research, (1996) v.84(4), p.225-236.

2. Zarnitsina V.I., Pokhilko A.V., Ataullakhanov F.I. A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II.Results. Thrombosis Research, (1996) v.84(5), p.333-344.

3. Ataullakhanov F.I., Pokhilko A.V., Zarnitsina V.I. Thrombin "pulsar" under the blood clotting system intrinsic pathway activation. Proceeding of international Conference "Modelling, Simulation & ldentiiication. Ed. Y.Kagawa. Kinki Univer. September (1994) p.262-265.

4. Pokhilko A.V., Zarnitsina V.I., Sarbash V.I., Ataullakhanov F.I., Guria G.T. The autowave mechanism of clot formation. Experimental and theoretical study. Intern.Confer, on Complex Dynamics in Chemistry and Biology. Odence. Denmark. (June 1995).

5. Зарницына В.И., Атауллаханов Ф.И., Похилко А.В. Структурные особенности роста фибринового сгустка в плазме крови. Тезисы конфер. Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах. Суздаль. (1995) стр.177.

6. Ataullakhanov FI, Guria GT, Sarbash VI, Volkova RI, Zarnitcina-V Spatial Dynamics and Pattern-Formation During Clot Growth in-Vitro Biophysical Journal, 1996, Vol 70, Iss 2, pp SU468-SU468 Meeting-Abstract