Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Агрегационные свойства субпопуляций активированных тромбоцитов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Агрегационные свойства субпопуляций активированных тромбоцитов"

На правах рукописи

Якименко Алена Олеговна

АГРЕГАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА СУБПОПУЛЯЦИЙ АКТИВИРОВАННЫХ ТРОМБОЦИТОВ

03.01.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 14 МАР 2013

2013

005050631

005050631

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской

академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Пантелеев Михаил Александрович

Официальные оппоненты: Мовшев Борис Ефимович,

доктор медицинских наук, ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории физической биохимии

Сарбаш Василий Иванович, доктор биологических наук, ООО «Гематологическая Корпорация», заведующий лабораторией научно-исследовательских разработок

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр

детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Защита диссертации состоится «_»_2013 года в_часов

на заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: г. Москва, улица Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН.

Автореферат разослан «_»_ 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Николаева Ирина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Гемостаз - это комплекс реакций организма, направленный на остановку кровотечений при повреждении сосудов. Важнейшими участниками гемостаза являются тромбоциты, специализированные клетки крови, способные к активации, качественному переходу в новое состояние, позволяющему им выполнять свои функции. Активированные тромбоциты выполняют в гемостазе две основные функции - механическое препятствование потере крови за счет прикрепления к стенке сосуда (адгезии) и скрепления друг с другом (агрегации) и предоставление своей отрицательно заряженной поверхности для генерации тромбина, основного фермента плазменного свертывания.

Уже более десяти лет назад началось активное изучение феномена гетерогенности активированных тромбоцитов, заключающегося в неодинаковости их свойств. Часть тромбоцитов при активации тромбином или тромбином с агонистом гликопротеина VI, коллагенового рецептора, экспрессирует большое количество фосфатидилсерина и удерживает на внешней стороне своей мембраны альфа-гранулярные белки (белковую «шубу»), такие как фибриноген, фактор Виллебранда, фибронектин, фактор V и тромбоспондин [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005]. Известно, что такие тромбоциты не связывают РАС-1, моноклональные антитела к активной форме главного рецептора агрегации, гликопротеина (GP) Ilbllla (интегрина allb(33) [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005]. Это привело к предположению, что РАС-1-отрицательные тромбоциты не могут агрегировать. Считается, что такое их свойство может играть роль в регуляции роста тромба [Kulkami S., Jackson S.P. 2004; Jobe S.M. et al. 2008]. Однако их агрегационная способность напрямую изучена не была.

В лаборатории физической биохимии крови Гематологического научного центра Министерства здравоохранения России аспирантом Н.Н. Топаловым недавно была обнаружена и охарактеризована еще одна субпопуляция активированных тромбоцитов (Topalov N.N. et al. Two types of procoagulant platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin a(IIb)P(3), Arterioscler Thromb Vase Biol., 2012). Она образуется при активации тромбоцитов в физиологической концентрации помимо субпопуляций РАС-1-отрицательных и фосфатидилсерин-отрицательных («обычных» активированных) тромбоцитов. Как и РАС-1-отрицательные тромбоциты, тромбоциты новой субпопуляции экспрессируют большое количество фосфатидилсерина и удерживают на своей поверхности много фибриногена, однако, как и фосфатидилсерин-отрицательные тромбоциты, имеют низкую концентрацию внутриклеточного кальция и хорошо связывают РАС-1. Наличие интегринов allb(}3 в активной конформации на поверхности тромбоцитов новой субпопуляции (фосфатидилсерин/РАС-1 -положительных тромбоцитов) позволяет предположить, что эти тромбоциты агрегируют так же хорошо, как и фосфатидилсерин-отрицательные тромбоциты, однако агрегационная способность фосфатидилсерин/РАС-1-положительных тромбоцитов изучена не была.

Цель работы: исследование агрегациониой способности субпопуляций активированных тромбоцитов.

Задачи исследования:

1. Определить способность тромбоцитарных субпопуляций участвовать в формировании агрегатов методами агрегометрии и проточной цитометрии.

2. Выявить механизмы, ответственные за агрегацию тромбоцитарных субпопуляций.

3. Исследовать распределение РАС-1-отрицательных тромбоцитов в тромбах с помощью конфокальной микроскопии.

Научная новизна. В работе обнаружено, что РАС-1-отрицательные тромбоциты участвуют в формировании агрегатов: они агрегируют с тромбоцитами других субпопуляций, имеющих на своей поверхности активную форму интегрина аИЬрЗ, но не друг с другом. Выявлен механизм данного процесса: агрегация РАС-1-отрицательных тромбоцитов с фосфатидилсерин-отрицательными происходит за счет связывания активных интегринов аПЬрЗ фосфатидилсерин-отрицательных тромбоцитов с лигандами, удерживаемыми на поверхности РАС-1-отрицательных тромбоцитов. Показано, что в условиях как венозного, так и артериального потока крови РАС-1-отрицательные тромбоциты преимущественно распределяются на поверхности тромбов, формирующихся на коллагене. Показано, что фосфатидилсерин/РАС-1 -положительные тромбоциты могут эффективно формировать агрегаты с тромбоцитами любых субпопуляций.

Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание свойств субпопуляций активированных тромбоцитов и их (пато)физиологической роли. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых методов антитромботической терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1) РАС-1-отрицательные тромбоциты обладают способностью связываться с фосфатидилсерин-отрицательными и фосфатидилсерин/РАС-1-положительными тромбоцитами, но не друг с другом.

2) Механизм агрегации РАС-1-отрицательных тромбоцитов с тромбоцитами двух других субпопуляций заключается в связывании активных интегринов аНЬрЗ фосфатидилсерин-отрицательных и фосфатидилсерин/РАС-1-положительных тромбоцитов с лигандами, удерживаемыми на поверхности РАС-1 -отрицательных тромбоцитов.

3) Фосфатидилсерин/РАС-1-положительные тромбоциты, в отличие от РАС-1-отрицательных и по аналогии с фосфатидилсерин-отрицательными тромбоцитами, могут эффективно формировать агрегаты с тромбоцитами любых субпопуляций.

4) РАС-1-отрицательные тромбоциты в тромбах, формирующихся на коллагене в условиях венозного и артериального потока крови, преимущественно распределяются на их поверхности.

Апробация работы состоялась 1 февраля 2013 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Результаты диссертационной работы были представлены на International conference «54th Congress of the Gesellschaft für Thrombose und Hämostaseforschung» (Нюрнберг, Германия, 24-27 февраля, 2010), 5-ой Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, Россия, 31 января - 2 февраля, 2011), XXIII Congress of International Society of Thrombosis and Hemostasis (Киото, Япония, 23 -28 июля, 2011), 2-й Международной школе по проточной цитометрии (Москва, Россия, 26 - 31 августа,

2011), 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society of Thrombosis and Hemostasis (Ливерпуль, Англия, 27 - 30 июня,

2012), Gordon Research Conference on Hemostasis (Waterville Valley, США, 22-27 июля, 2012), 6-ой Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, Россия, 31 января - 2 февраля, 2013), VIII Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, Россия, 1 - 3 февраля, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 публикаций. Статей в рецензируемых журналах - 2; публикаций в трудах конференций и съездов - 5.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описания экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 142 источника. Работа выполнена на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией проф., д.ф.-м.н. Пантелеев М.А.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, сформулированы цели и задачи исследования, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Приведены основные сведения о гемостазе и тромбозе, функциях тромбоцитов и видах их ответов на активацию. Кратко изложены история развития представлений об агрегации тромбоцитов и современные сведения об этом процессе. Описаны феномен гетерогенности активированных тромбоцитов и основные свойства субпопуляций активированных тромбоцитов. Рассмотрены основные методы изучения агрегации тромбоцитов и тромбоцитарных субпопуляций, проанализированы преимущества и недостатки их применения.

В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в работе. Помимо специфических методов, использующихся в работе и кратко изложенных ниже, приведены все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов,

методика выделения тромбоцитов из крови доноров с помощью центрифугирования и гель-фильтрации, процедура мечения фибриногена флуоресцеинизотиоцианатом. Описаны принципы агрегометрии, проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, а также процедура обработки результатов, получаемых с помощью этих методов.

Агрегометрия

Исследование агрегации на агрегометре

Отмытые от плазменных белков тромбоциты в концентрации 100 000 мкл"1 в буфере А (150 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 0,4 мМ NaH2P04, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0,5 % бычий сывороточный альбумин, рН 7,4), инкубировали в течение 3 мин при 37°С в присутствии 2,5 мМ СаС12, далее активировали тромбином или тромбином с конвульксином и инкубировали в течение 15 минут при 37°С, чтобы позволить сформироваться субпопуляциям [Munnix I.C.A. et al. 2007]. Затем в суспензию добавляли 1 мкМ РРАСК (ингибитор тромбина) и 1 мг/мл фибриногена, чтобы предотвратить производимое тромбином образование фибрина и обеспечить достаточное для агрегации тромбоцитов количество фибриногена (предварительно проведенные контроли подтвердили, что агрегация сильно ингибируется без добавления РРАСК и фибриногена (данные не показаны)). Агрегацию образцов анализировали на агрегометре модели 490 (Chrono-Log, Havertown, РА, США) при перемешивании со скоростью 800 оборотов/мин в течение 15 минут при 37°С.

По зависимостям светопропускания от времени, получаемым с агрегометра, оценивали степень (максимальное за время исследования приращение светопропускания) и скорость (максимальный наклон кривой светопропускания) агрегации.

Проточная цитометрия

Исследование агрегации на проточном цитометре

Тромбоциты в концентрации 20 000, 50 000 или 100 000 мкл"1 активировали путем инкубации с агонистами в буфере А с 2,5 мМ СаС12 в течение 15 минут в присутствии флуоресцентно меченных антитромбоцитарных антител и аннексина V. Затем к ним добавляли 1 мкМ РРАСК и 1 мг/мл фибриногена, как в экспериментах на агрегометре данной работы. Тромбоциты перемешивали (600 оборотов/мин) на минишейкере в течение 3 или 5 минут при комнатной температуре или не подвергали перемешиванию, разводили в 10 раз буфером А с 2,5 мМ СаС12 и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, США). Полученные данные затем обрабатывались в программе WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, США). Здесь и далее перед началом работы на проточном цитометре для каждой пары используемых вместе флуоресцентных меток проводили процедуру компенсации, то есть учет перекрывания их спектров флуоресценции.

В другой серии экспериментов тромбоциты в концентрации 50 000 мкл"1 активировали инкубацией с агонистами в буфере А с 2,5 мМ СаС12 в течение 15 мин в присутствии аннексина V-FITC и анти-СБ61-РегСР (антител к тромбоцитарному

рецептору GPIIIa) или aHTH-CD62P-PE (антител к Р-селектину на активированных тромбоцитах), в присутствии или отсутствии 200 мкг/мл монафрама (F(ab')2 фрагменты моноклональных антител, которые блокируют активность рецептора GPIIblIIa). Тромбоциты перемешивали (600 оборотов/мин) на минишейкере в течение 3 минут или не подвергали перемешиванию, разводили в 10 раз буфером А с 2,5 мМ СаС12 и анализировали на проточном цитометре.

При обработке результатов на диаграмме распределения тромбоцитов по боковому и малоугловому рассеянию выделяли регион одиночных тромбоцитов и регион тромбоцитарных агрегатов, в который попадали события больших по сравнению с одиночными тромбоцитами размеров. Затем среди событий, попавших в регион одиночных тромбоцитов, выделяли тромбоцитарные субпопуляции по характеристикам светорассеяния и связыванию флуоресцентно меченного аннексина V, связывающегося с фосфатидилсерином, и определяли изменение количества тромбоцитов разных субпопуляций в пробах с перемешиванием по сравнению с пробами, не подвергавшимися перемешиванию (в части экспериментов - с использованием калибровочных шариков для контроля количества событий).

Связывание внешнего фибриногена субпопуляциями тромбоцитов

Тромбоциты в концентрации 20 000 мкл"1 активировали 200 нМ тромбина в буфере А с 2,5 мМ СаС12 в течение 15 минут. Затем к ним добавляли 1 мкМ РРАСК, чтобы предотвратить формирование фибрина, индуцированное тромбином, и дополнительно инкубировали с флуоресцентно меченным аннексином V и 0,5 мг/мл фибриногена, меченного FITC, в течение 3 минут, разводили в 20 раз буфером А с 2,5 мМ СаС12 и анализировали на проточном цитометре.

Микроскопия

Адгезия к иммобилизованному фибриногену

Стеклянные покровные стекла (24x24 мм, Heinz Herenz, Hamburg, Германия) очищали в смеси 100% перекиси водорода и 98% серной кислоты (соотношение перекись : кислота составляло 1:3), отмывали дистиллированной водой и высушивали при 50°С. После этого на них наносили фибриноген в концентрации 20 мг/мл, разведенный в буфере А, инкубацией в течение 40 минут при комнатной температуре, затем остатки белка смывали дистиллированной водой и стекла высушивали при 37°С. Отмытые тромбоциты (10 000 мкл"1) активировали 100 нМ тромбина с 250 нг/мл конвульксина в буфере А с 2,5 мМ СаС12, флуоресцентно меченными антителами к CD42b (антитела к тромбоцитарному рецептору GPIb) и аннексином V в течение 15 минут. Затем тромбоциты связывались с иммобилизованным фибриногеном в течение 10 минут при комнатной температуре в плоско-параллельной проточной камере, образованной предметным стеклом и покровным стеклом с нанесенным на него фибриногеном, соединенными друг с другом с помощью двух полосок двустороннего скотча. Камеру промывали буфером А с 2,5 мМ СаС12, и монослой адгезировавших тромбоцитов анализировался на световом микроскопе (Leica DMRBE microscope, Leica, Германия) при помощи объектива с увеличением 100х. Количество проанализированных полей зрения для каждого донора равнялось 30.

Определялось общее количество связавшихся с фибриногеном тромбоцитов (по флуоресценции антител к CD42b) и сколько из них составляет субпопуляция РАС-1-отрицательных тромбоцитов (по флуоресценции аннексина V).

Исследование тромбоцитарных агрегатов на конфокальном микроскопе

Стеклянные покровные стекла очищали бихроматом калия, отмывали дистиллированной водой и высушивали при 50°С. После этого на них наносили фибриноген в концентрации 20 мг/мл, разведенный в буфере А, инкубацией в течение 40 минут при комнатной температуре. Остатки белка смывали дистиллированной водой, стекла высушивали при 37°С и затем собирали как часть плоско-параллельной проточной камеры, аналогичной используемой в экспериментах по адгезии тромбоцитов к фибриногену. Тромбоциты в концентрации 20 ООО мкл"1 активировали инкубацией с агонистами в буфере А с 2,5 мМ СаСЬ и флуоресцентно меченным аннексином V в течение 15 минут. После добавления 1 мкМ РРАСК и 1 мг/мл фибриногена тромбоциты перемешивали на минишейкере (600 об/мин) или на вортексе в течение 3 минут и затем 10-20 минут позволяли им связываться с поверхностью, покрытой фибриногеном, в загерметизированной лаком проточной камере. Конфокальные изображения тромбоцитарных агрегатов, сформировавшихся после перемешивания активированных тромбоцитов, получали на конфокальном микроскопе AxioObserver.Zl (Carl Zeiss, Jena, Германия) с помощью объектива с увеличением 100*.

Исследование тромбов, формирующихся в проточной камере, на конфокальном микроскопе

Стеклянные покровные стекла очищали бихроматом калия, отмывали дистиллированной водой и высушивали при 50°С. После этого на них наносили нативный фибриллярный коллаген I типа в концентрации 200 мкг/мл, разведенный в буфере А, инкубацией в течение 60 минут при комнатной температуре во влажной камере. Остатки белка смывали дистиллированной водой, стекла высушивали при 37°С и затем собирали как часть плоско-параллельной проточной камеры. Рабочее пространство камеры имело размеры 4 мм х 17 мм х 0,08 мм

(ширина х длина х высота) (объем около 5,5 мкл) и ограничивалось пластиковой поверхностью с подведенными через специальные отверстия входной и выходной трубочками сверху и покровным стеклом с иммобилизованным коллагеном снизу. Боковые поверхности рабочего объема камеры были образованы двусторонним скотчем, используемым для склеивания камеры. В качестве герметика использовался лак. Перед экспериментом камера с обеими трубочками промывалась буфером А для проверки ее герметичности и забивки мест неспецифического связывания входящим в его состав альбумином. Камеру закрепляли на предметном столике инвертированного конфокального микроскопа, а выходную трубочку камеры соединяли со шприцем, установленным в шприцевом насосе Harvard Apparatus 11 Plus (Harvard Apparatus, Holliston, MA, США), контролирующем скорость потока. Цельную кровь, взятую на 3,8 % цитратный буфер, рекальцифицировали до физиологической концентрации свободного ионизированного кальция (около 1 мМ) добавлением 100 мМ раствора

хлорида кальция в соотношении кровь: раствор 12,3:1 (таким образом, разбавление крови не превышало 10%). Рекальцификация производилась непосредственно перед экспериментом, поэтому с помощью проточной цитометрии параллельно проверяли изменение состояния тромбоцитов в рекальцифицированной крови в течение времени эксперимента по связыванию флуоресцентно меченных анти-С062Р антител и аннексина V (количество активированных тромбоцитов и фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов за время эксперимента не превышало 10 % и 3 % соответственно). Рекальцифицированная кровь с помощью насоса прокачивалась над покровным стеклом с коллагеном с постоянной скоростью, соответствующей скорости сдвига 500 или 1500 с"1, в течение 2 или 4 минут соответственно. После этого в течение дополнительных 2 или 4 минут при той же скорости потока через камеру прокачивался буфер А с 2,5 мМ СаС12, 1 мкМ РРАСК. (для инактивации сформировавшегося в камере тромбина) и флуоресцентно меченными аннексином V (для детекции фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов) и антителами к CD42b (для детекции всех тромбоцитов). Затем получали конфокальные изображения тромбов, сформировавшихся на коллагене, на конфокальном микроскопе с помощью объектива с увеличением 100х. Эксперименты полностью проводились в течение 3 часов с момента взятия крови. Скорость прокачки, соответствующая необходимой скорости сдвига в проточной камере, вычислялась по следующей формуле [Son Y. y-h2-L

2007]: Q = —-—, где Q — объемная скорость прокачки (мкл/с), у - сдвиговая

скорость (с1), И- высота камеры (мм) и L — ширина камеры (мм). Математическая модель агрегации

Рассматривается суспензия тромбоцитов заданного объема, непрерывно перемешиваемая и содержащая тромбоциты двух разных субпопуляций, РАС-1-отрицательные и фосфатидилсерин-отрицательные тромбоциты, формирующие растущие в размере агрегаты по мере того, как они необратимо связываются друг с другом. Пусть вероятность столкновения двух частиц (как одиночных тромбоцитов, так и агрегатов) не зависит от их размера, то есть вероятности столкновения между двумя одиночными тромбоцитами, агрегатом и тромбоцитом и двумя агрегатами одинаковы. Будем интересоваться ситуацией, когда тромбоциты двух различных субпопуляций имеют разную способность связываться с другими тромбоцитами. Уравнения модели, описывающие динамику ухода тромбоцитов из суспензии для участия в формировании агрегатов: dX ~dt dX, dt

где X](t) - концентрация фосфатидилсерин-отрицательных тромбоцитов и агрегатов, преимущественно из них состоящих, X-,(t) - концентрация РАС-1-отрицательных тромбоцитов и агрегатов, преимущественно из них состоящих, к\ - вероятность слипания двух фосфатидилсерин-отрицательных тромбоцитов, к2 - вероятность

= (1) = -к2-Х1-Х2-кг-Х2\ (2)

слипания фосфатидилсерин-отрицательного и РАС-1-отрицательного тромбоцитов, к3 - вероятность слипания двух РАС-1-отрицательных тромбоцитов, Г - время. Смысл уравнений (1) и (2) состоит в следующем: РАС-1-отрицательный тромбоцит, прикрепляющийся к агрегату, сформированному фосфатидилсерин-отрицательными тромбоцитами, не меняет число фосфатидилсерин-отрицательных частиц (одиночных тромбоцитов и агрегатов), но уменьшает количество РАС-1-отрицательных частиц на единицу. Решения уравнений (1) и (2) с учетом начальных концентраций тромбоцитов разных субпопуляций (Х^О) = Х10, Х2(0) = Х2о): 1

X,{t) =

X2(f)-

1

х,(0)

(3)

к.ЛЫк. •/ + —'—) ехр(----!-)

(4)

k,-Œ-t + ——)

3 ' Х,(0)___¿2-Х|(0)-уХ,(0) + уХ2(0)

Светопропускание у зависит от числа частиц в суспензии по экспоненциальному закону [Cronberg S. 1971], в предположении, что PAC-1-отрицательные и фосфатидилсерин-отрицательные тромбоциты рассеивают свет одинаково:

y = A+B-exp(-S-(Xl+X2)), (5)

где S - некоторая константа. Учитывая значения светопропускания в начальный момент времени и при / —> оо (у (0) = 0, у (t —» со) = 1), получаем:

у — — -+- —!--ехр( -S ■ (X. + Xj ))

1-ехр(5-(^,(0)+^2(0))) 1 - ехр( -S • (X, (0) + X, (0)) ) "

Константы к, (к2, к3) и S были подобраны так, чтобы аппроксимация уравнением Хилла типичной экспериментальной агрегационной кривой и кривой светопропускания, получаемой с помощью математической модели, давала одинаковые результаты: к, =к3 = 0.0009, к2 = 0.00091, S= 0.001.

Статистический анализ результатов

Все эксперименты проводились по крайней мере три раза с тромбоцитами от разных доноров. Статистический анализ производился в программе OriginPro 7.5 (OriginLab Corporation, Northampton, Massachusetts, США) с помощью парного критерия Стьюдента или однофакторного теста ANOVA. Различие считалось статистически значимым при Р < 0,05.

Глава 3 содержит результаты работы.

Исследование агрегационной способности PAC-1-отрицательных и фосфатидилсерин-отрицательных тромбоцитов на агрегометре

В первую очередь агрегационные способности тромбоцитарных субпопуляций оценивались в классическом агрегометрическом тесте. Исследовались гетерогенные по составу суспензии тромбоцитов, состоящие преимущественно из

фосфатидилсерин-отрицательных (РБ ) и РАС-1-отрицательных (РАС-1 ) тромбоцитов. Для того чтобы сравнить агрегационные способности РАС-1 -тромбоцитов и РБ -тромбоцитов, исследовалась агрегация образцов с разным количеством РАС-1 -тромбоцитов, достигающимся активацией агонистами разной мощности. Параметры агрегации не менялись при наличии в суспензии от 0 до 60 % РАС-1 -тромбоцитов, тогда как дальнейшее увеличение их числа сильно ингибировало как скорость (рис.1 А), так и степень (рис.1 Б) агрегации.

20 30 40 50 60 70 80 90 100 -отрицательные тромбоциты,

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 РАС-1-отрицательные тромбоциты, %

Рис.1 Зависимость скорости (А) и степени (Б) агрегации от содержания РАС-1 -тромбоцитов в суспензии (черные точки). Тромбоциты (100 000 мкл"1) активировали тромбином (10, 50 или 100 нМ) или тромбином (50 или 100 нМ) с конвульксином (0,1; 0,5; 1; 3; 5; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 150; 200; 500 или 1000 нг/мл). Представлены усредненные величины ± стандартные отклонения (п=2-3). Данные получены совместно с аспирантом ЦТП ФХФ РАН Я.Н. Котовой в экспериментах, проведенных с кровью шести здоровых доноров. Красные кривые - соответствующие зависимости, полученные с помощью математической модели агрегации в случае, когда РАС-1 -тромбоциты могут связывать Рв -тромбоциты, но не агрегируют между собой (пояснения дальше по тексту).

Эти данные свидетельствуют, что РАС-1 -тромбоциты участвуют в формировании агрегатов, иначе их присутствие в суспензии в количестве 50 % значительно уменьшало бы параметры агрегации. Однако их способность к агрегации действительно уменьшена по сравнению с Р8 -тромбоцитами, так как при высоких концентрациях РАС-1 -тромбоцитов наблюдается ингибирование параметров агрегации.

Сравнение экспериментальных данных и результатов математической модели агрегации

Для того чтобы правильно интерпретировать результаты, полученные в экспериментах на агрегометре, была разработана математическая модель, описывающая взаимодействие между тромбоцитами двух разных субпопуляций (описание модели изложено в главе «Материалы и методы»), Агрегометрические кривые, то есть зависимости светопропускания от времени, получающиеся с использованием этой модели (рис.2А), были построены для трех разных случаев: 1) РАС-1 -тромбоциты и РБ -тромбоциты обладают одинаковой способностью связывать друг друга, 2) РАС-1 -тромбоциты могут связывать Р8 -тромбоциты, но не

11

могут агрегировать друг с другом и 3) РАС-1 -тромбоциты вообще не имеют

Q и ¿.и tu ии ои i ии (_) и ¿и чи ÜU ои i ии

РАС-1-отрицательные тромбоциты, % РАС-1-отрицательные тромбоциты, %

Рис.2 Зависимости параметров агрегации от количества РАС-1 -тромбоцитов, построенные на основании математической модели агрегации. А, Зависимости светопропускания от времени при наличии в суспензии 50 % РАС-1 -тромбоцитов. Б и В, Зависимости скорости (Б) и степени (В) агрегации от содержания РАС-1 -тромбоцитов. Три кривые на каждом графике иллюстрируют один из трех случаев: 1) все тромбоциты обладают одинаковой способностью связывать друг друга (ki = кз = 0.0009, к2= 0.00091, S = 0.001), 2) РАС-1~-тромбоциты могут связывать Р8~-тромбоциты, но не агрегируют друг с другом (к! = 0.0009, к2= 0.00091, к3 = 0, S = 0.001) и 3) РАС-Г-тромбоциты совсем не могут агрегировать (ki = 0.0009, к2 = кз = 0, S = 0.001) (синяя, зеленая и красная кривая соответственно).

Для каждой кривой светопропускания, построенной с помощью математической модели, были определены параметры агрегации так, как это делалось для экспериментальных кривых, и для каждого из трех перечисленных случаев были построены зависимости скорости (рис.2Б) и степени агрегации (рис.2В) от содержания в суспензии РАС-1 -тромбоцитов. В случае, если все тромбоциты обладают одинаковой способностью связывать друг друга, то есть все константы отличны от нуля, нет никакой корреляции между параметрами агрегации и количеством РАС-1 -тромбоцитов в суспензии (рис.2Б,В, синие кривые). Если РАС-1 "-тромбоциты связывают Р8~-тромбоциты, но не агрегируют между собой, то есть к3 = 0, то зависимости параметров агрегации от процентного содержания РАС-1 -тромбоцитов (рис.2Б,В, зеленые кривые) напоминают аналогичные зависимости, полученные в экспериментах на агрегометре (рис.1 А,Б, наложение). Видно, что

зависимость скорости агрегации от количества РАС-1-тромбоцитов плохо описывается в рамках данной модели, в то время как для зависимости степени агрегации от количества РАС-1 -тромбоцитов наблюдается полное соответствие экспериментальных и модельных данных. И наконец, если РАС-1 "-тромбоциты вообще не могут агрегировать, то есть = ^ = 0, скорость и степень агрегации резко ингибируются с увеличением числа РАС-1 -тромбоцитов (рис.2Б,В, красные кривые). Эти результаты указывают на то, что характер зависимостей, полученных в агрегометрическом исследовании, обусловлен ни чем иным, как участием РАС-1--тромбоцитов в формировании агрегатов вместе с Р8~-тромбоцитами. В соответствии с этой моделью РАС-1 -тромбоциты не могут агрегировать друг с другом, но вовлекаются в агрегаты Рв -тромбоцитами.

Исследование агрегацнонной способности РАС-1-отрицательных, фосфатидилсерин-отрицательных и фосфатидилсерин/РАС-1-положителы1ых тромбоцитов на проточном цитометре

Чтобы напрямую проверить, действительно ли РАС-1 "-тромбоциты участвуют в формировании агрегатов, тромбоциты активировались в концентрации 20 ООО мкл"1 в течение 15 минут, а затем либо сразу анализировались на проточном цитометре (рис.ЗБ), либо сначала перемешивались со скоростью 600 оборотов/мин в течение нескольких минут (рис.ЗВ). Видно, что благодаря перемешиванию события в регионе Я1 смещаются вправо вверх (рис.ЗВ по сравнению с ЗБ, верхняя и средняя панели), то есть происходит интенсивное формирование агрегатов (шкалы логарифмические). Чтобы понять, какие из тромбоцитов и в какой степени участвуют в формировании этих агрегатов, в регионе одиночных тромбоцитов (рис.ЗБ,В, средняя панель, К2) определялось количество -тромбоцитов и РАС-1 -тромбоцитов по флуоресценции аннексина V в пробах без перемешивания (рис.ЗБ, нижняя панель) и с перемешиванием (рис.ЗВ, нижняя панель), и вычислялся процент тромбоцитов обеих субпопуляций, покинувших регион одиночных тромбоцитов, то есть ушедших в агрегаты, как разность количества тромбоцитов в регионе одиночных тромбоцитов в пробе без перемешивания и соответствующей пробе с перемешиванием, отнесенная к количеству тромбоцитов в пробе без перемешивания (рис.ЗГ). Эффективность ухода Р8 -тромбоцитов и РАС-1 -тромбоцитов в агрегаты после перемешивания составила 68,6 ± 7,4 % (п = 3) и 26,1 ± 5,3 % (п = 3) соответственно.

^ 80-1 * г I70]

I И Ш

га 50^ 40 н

чей*

рз. тромбозы троМбоциты

Рис.3 А-В, Диаграммы распределения неактивированных (А) и активированных 50 нМ тромбина с 50 нг/мл конвульксина тромбоцитов (20 000 мкл"1), не подвергавшихся (Б) и подвергавшихся (В) перемешиванию, по флуоресценции антител к С061 (верхняя панель) или аннексина V (нижняя панель) и контурные диаграммы малоуглового (ГвС) против бокового (88С) рассеяния (средняя панель). События с высокой флуоресценцией антител к СБ61 выделены в регион Я5 для неактивированных (А, верхняя панель) и регион для активированных (Б,В, верхняя панель) тромбоцитов. Активированные одиночные тромбоциты и агрегаты выделены в регионы 1*2 (по внешней линии) и Г13 (зеленого цвета) соответственно (Б,В, средняя панель). Представлены результаты типичного эксперимента из трех, проведенных с кровью разных доноров. Г, Гистограмма количества Р8 -тромбоцитов (слева) и РАС-1 -тромбоцитов (справа), ушедших в агрегаты после перемешивания, в процентах. Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=3).

Чтобы проверить, действительно ли уменьшение количества событий в регионе одиночных тромбоцитов обусловлено GPITbIIIa-зависимым формированием агрегатов, тромбоциты (20 ООО мкл"1) активировались 50 нМ тромбина и 5 мкг/мл CRP (коллаген-ассоциированного пептида, агониста GPVI) в присутствии избытка монафрама (200 мкг/мл), антагониста GPIIbllla, подвергались перемешиванию и анализировались на проточном цитометре. В пробе, активированной в присутствии монафрама (рис.4Б), после перемешивания образовывалось гораздо меньше (и меньших по размеру) агрегатов, чем в пробе без монафрама (рис.4А). Таким образом, уменьшение количества событий в регионе одиночных тромбоцитов обусловлено именно формированием агрегатов.

Рис.4 Типичные точечные диаграммы распределения активированных в отсутствии (А) или в присутствии (Б) избытка монафрама тромбоцитов после перемешивания по связыванию антител к CD6I (ось абсцисс) и малоугловому рассеянию (FSC, ось ординат). Одиночные тромбоциты и агрегаты выделены синей и красной рамками соответственно.

Далее, чтобы исследовать агрегационную способность фосфатидилсерин/РАС-1-положительных (PS/PAC-1+) тромбоцитов, были проведены эксперименты на проточном цитометре, подобные описанным выше, но с концентрацией тромбоцитов 100 000 мкл"1 и активацией 50 нМ тромбина и 2 нг/мл конвульксина, что приводило к формированию трех субпопуляций тромбоцитов. Аналогичная приведенной выше обработка результатов экспериментов, проведенных с кровью трех разных доноров, показала, что PS/PAC-1 +-тромбоциты уходят в агрегаты так же эффективно, как и Р8~-тромбоциты (85,9 ± 2,4% и 90,6 ± 0,3% соответственно (n = 3)), РАС-1 -тромбоциты участвуют в формировании агрегатов несколько менее эффективно (51,8 ± 6,9 % (п = 3)) (рис.5).

100

s?

3 80

г s

Il 60

ю га

Щ, ш

â » 40

h I

4

° 20

0

PS- трр0здаь; TP0.60U-t тромбо^ь-

Рис.5 Гистограмма количества тромбоцитов трех субпопуляций, ушедших в агрегаты после перемешивания, в процентах. Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=3).

Выявление механизма вовлечения PAC-1-отрицательных тромбоцитов в агрегаты

Основным механизмом агрегации «обычных» активированных тромбоцитов (Р8~-тромбоцитов) является связывание двух концов симметричной молекулы фибриногена рецепторами GPIIblIIa соседних тромбоцитов [Jackson S.Р. 2007; Jackson S.P. et al. 2009]. Механизм агрегации PS/PAC-1 -тромбоцитов, по-видимому, не отличается от того, как агрегируют PS -тромбоциты, так как на их поверхности рецепторы GPIIblIIa также находятся в активном состоянии.

Участие же РАС-1 "-тромбоцитов в формировании агрегатов с учетом того факта, что интегрины allbp3 на их поверхности находятся в неактивном или оккупированном состоянии [Dale G.L. 2005; Dale G.L. et al. 2002], требует более тщательного изучения механизма такой уникальной агрегационной способности. Напомним, что РАС-1~-тромбоциты имеют белковую «шубу» на своей поверхности, в составе которой находятся такие лиганды интегрина allb[33, как фибриноген, тромбоспондин и фибронектин. Рассмотрим наиболее вероятные варианты механизма, благодаря которому РАС-1 "-тромбоциты могут вовлекаться в агрегаты: 1) связывание GPIIblIIa Р8~-тромбоцитов с фибриногеном или другим лигандом на поверхности РАС-1 -тромбоцитов; 2) связывание GPIIblIIa PS -тромбоцитов с неизвестным рецептором к фибриногену/другому лиганду РАС-1 "-тромбоцитов через плазменный фибриноген/другой лиганд; 3) связывание неизвестного рецептора к фибриногену/другому белку на поверхности РАС-1 -тромбоцитов с фибриногеном/другим белком на поверхности соседних РАС-1 -тромбоцитов; 4) полимеризация фибрина на поверхности соседних РАС-1 -тромбоцитов, приводящая к их «слипанию». Для проверки описанных вариантов вовлечения РАС-1 -тромбоцитов в агрегаты были проведены три серии экспериментов.

В первой серии экспериментов исследовалась роль белковой «шубы» на поверхности РАС-1 -тромбоцитов в их вовлечении в агрегаты. Для этого на проточном цитометре сравнивалась эффективность ухода в агрегаты тромбоцитов разных субпопуляций при двух типах активации - тромбином с CRP (РАС-1 -тромбоциты имеют на своей поверхности много фибриногена [Dale G.L. et al. 2002]) или одним CRP (РАС-1 -тромбоциты имеют на своей поверхности мало фибриногена [Jobe S.M. et al. 2005]). Тромбоциты в концентрации 50 000 мкл"1 активировали 100 нМ тромбина с 10 мкг/мл CRP или только 10 мкг/мл CRP в течение 15 минут, затем к ним добавляли 1 мкМ РРАСК и 1 мг/мл фибриногена, тромбоциты перемешивали в течение 5 минут при 600 об/мин и анализировали на проточном цитометре. Оценивался процент тромбоцитов всех трех субпопуляций, которые покинули регион одиночных тромбоцитов после перемешивания. На рис.6 видно, что Р8~-тромбоциты и PS/PAC-Г-тромбоциты эффективно уходят в агрегаты независимо от типа активации, в то время как агрегационная способность РАС-1 -тромбоцитов снижается в 5 раз в отсутствие белковой «шубы» на их поверхности. Эти данные демонстрируют, что белковая «шуба» на поверхности РАС-1 -тромбоцитов играет важную роль в обеспечении их агрегационной способности.

Д PS- тромбоциты Г7""^ PS/PAC-1+тромбоциты

2 РАС-1-тромбоциты

Рис.6 Гистограмма, характеризующая уход активированных 100 нМ тромбина с 10 мкг/мл CRP (слева) или 10 мкг/мл CRP (справа) тромбоцитов (50 000 мкл"1) трех субпопуляций в агрегаты. Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=4).

Во второй серии экспериментов была исследована способность РАС-1 -тромбоцитов связывать внешний по отношению к ним фибриноген, иммобилизованный на поверхности и растворимый. Сначала тромбоциты (10 000 мкл"1) активировали 100 нМ тромбина и 250 нг/мл конвульксина в течение 15 минут в присутствии флуоресцентно меченных анти-С042Ь антител и аннексина V, наносили на покровное стекло с иммобилизованным фибриногеном на 10 минут, смывали несвязавшиеся тромбоциты буфером и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии количество и тип тромбоцитов (принадлежность к

одной из двух субпопуляций, РАС-1 -тромбоцитам или Р8 -тромбоцитам), связавшихся с фибриногеном. Параллельно с помощью проточной цитометрии измерялось количество тромбоцитов обеих субпопуляций, образующееся в суспензии при данных условиях активации. На рис.7 представлена гистограмма, характеризующая соотношение двух тромбоцитарных субпопуляций, РАС-1 -тромбоцитов и РБ -тромбоцитов, в суспензии и на фибриногене.

100-, 8060 40 20Н о

■ т I ■

РБ- тромбоциты, % | РАС-1- тромбоциты, %

В суспензии

На фибриногене

Рис.7 Гистограмма соотношения Рв -тромбоцитов и РАС-1 -тромбоцитов в суспензии (слева) и на фибриногене (справа). Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=3).

Соотношение Р8~-тромбоцитов и РАС-1 -тромбоцитов в суспензии после активации составляло 28,1 ± 5,5 % (п = 3) и 71,8 ± 5,5 % (п = 3) соответственно. Однако только Рв -тромбоциты хорошо связывались с иммобилизованным фибриногеном (92,1 ± 2,7 % (п = 3)), в то время как РАС-1 -тромбоциты практически с ним не связывались (7,9 ±2,7% (п = 3)). Контрольные эксперименты показали, что количество РАС-1 -тромбоцитов, связывающихся с иммобилизованным фибриногеном, даже меньше, чем количество связывающихся с фибриногеном в аналогичных условиях неактивированных тромбоцитов (данные не показаны).

Далее тромбоциты в концентрации 20 000 мкл"1 активировали 200 нМ тромбина в течение 15 минут, к ним добавляли 1 мкМ РРАСК, чтобы предотвратить формирование фибрина, индуцированное тромбином, дополнительно инкубировали с аннексином V, меченным РЕ, и 0,5 мг/мл фибриногена, меченного ПТС, и анализировали на цитометре флуоресценцию связывающегося с тромбоцитами растворимого фибриногена (рис.8). Средняя интенсивность флуоресценции Р8 -тромбоцитов была равна 91,4 ±17,8 усл.ед. (п = 3), в то время как для РАС-1 -тромбоцитов и неактивированных тромбоцитов она составила 8 ± 0,4 усл.ед. и 3,6 ± 0,1 усл.ед. (п = 3) соответственно.

Рис.8 Точечные диаграммы распределения неактивированных (А) и активированных 200 нМ тромбина (Б) тромбоцитов (20 000 мкл1) по связыванию флуоресцентно меченных аннексина V (ось абсцисс) и фибриногена (ось ординат). Представлены результаты типичного эксперимента из трех, проведенных с кровью разных доноров. РАС-1 -тромбоциты выделены рамкой.

Таким образом, РАС-1 -тромбоциты не могут связывать фибриноген, внешний по отношению к уже входящему в состав их «шубы», что находится в соответствии с литературными данными [Berny М.А. et al. 2010]. Это также свидетельствует против наличия на поверхности РАС-1 -тромбоцитов другого (помимо GPlIbllla) рецептора к фибриногену.

В третьей серии экспериментов проверялась зависимость агрегации РАС-1 -тромбоцитов от рецепторов GPlIbllla на PS -тромбоцитах, а также возможность вовлечения РАС-1 -тромбоцитов в агрегаты за счет сшивания их белковых «шуб» друг с другом благодаря полимеризации фибрина. Тромбоциты (50 000 мкл"1) активировали либо 100 нМ тромбина (при этом образовывалось около 5 % РАС-1 -тромбоцитов), либо 100 нМ тромбина плюс 30 мкг/мл CRP (около 80% РАС-1--тромбоцитов) в присутствии или отсутствии избытка монафрама (200 мкг/мл) и одновременным перемешиванием (600 об/мин) в течение 15 минут, а затем анализировали на проточном цитометре. Определялся процент тромбоцитов (без разделения на субпопуляции), покидающих регион одиночных событий после перемешивания. Тромбоциты, активированные тромбином, эффективно формировали агрегаты, тогда как сильная активация тромбином с CRP ингибировала агрегацию в пробе (из-за большого числа РАС-1 -тромбоцитов с неактивными или оккупированными рецепторами GPlIbllla) (рис.9, слева). Добавление монафрама сильно снижало как тромбин-индуцированную, так и TpoMÖHH/CRP-HHflyunpoBaHHyro агрегацию (рис.9, справа). Эти результаты показывают, что, во-первых, вовлечение РАС-1 -тромбоцитов в агрегаты зависит от GPlIbllla на поверхности PS -тромбоцитов, а во-вторых, что РАС-1 -тромбоциты не могут агрегировать друг с другом.

Рис.9 Гистограмма, характеризующая уход в агрегаты тромбоцитов (50 ООО мкл"1), активированных 100 нМ тромбина или 100 нМ тромбина с 30 мкг/мл CRP в отсутствии (слева) и в присутствии (справа) монафрама. Представлены средние значения ± стандартные ошибки среднего (п=3).

Итак, из перечисленных выше вариантов вовлечения РАС-1 -тромбоцитов в агрегаты полученными экспериментальными результатами были опровергнуты все, кроме первого. Было показано, что агрегация РАС-1 -тромбоцитов зависит, с одной стороны, от активных рецепторов GPIIblIIa на поверхности PS -тромбоцитов (и, по-видимому, PS/PAC-1+-тромбоцитов) и, с другой стороны, от наличия белковой «шубы» на поверхности РАС-1 "-тромбоцитов. Таким образом, РАС-1 -тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания свободных концов молекул фибриногена или другого лиганда GPIIblIIa, удерживаемого на поверхности РАС-1 -тромбоцитов, активированными рецепторами GPIIblIIa на тромбоцитах двух других субпопуляций. Безусловно, нельзя исключать существование еще каких-то не учтенных нами механизмов, дающих свой вклад в агрегацию РАС-1 -тромбоцитов.

Эффективность вовлечения РАС-1 -тромбоцитов в формирующиеся агрегаты, оцениваемая с помощью проточной цитометрии, количественно зависит, вероятно, от концентрации добавленного в пробу фибриногена. Так как РАС-1 -тромбоциты вовлекаются в агрегаты благодаря своей белковой альфа-гранулярной «шубе», добавление внешнего фибриногена может приводить к конкуренции между РАС-1 -тромбоцитами и молекулами добавленного фибриногена за сайты связывания на PS -тромбоцитах и PS/PAC-Г-тромбоцитах. Концентрация фибриногена, равная 1 мг/мл, была выбрана как сопоставимая с плазменной концентрацией и оставалась в разных экспериментах данной работы неизменной для корректного сравнения результатов, получаемых с помощью различных экспериментальных методик.

Исследование тромбоцитарных агрегатов на конфокальном микроскопе

Чтобы проверить наиболее непосредственным образом достоверность результатов, полученных с помощью проточной цитометрии, - действительно ли вовлечение РАС-1 -тромбоцитов в агрегаты имеет место, - использовались методы конфокальной микроскопии. Агрегаты, меченные аннексином V- Р1ТС, сформированные в условиях, использованных в экспериментах на проточном цитометре, исследовались на конфокальном микроскопе. На рис.10 изображена типичная фотография агрегата, содержащего как Р8 -тромбоциы, так и РАС-1 -тромбоциты.

Аннексии ,. Р1С Наложение

А

Б

Рис.10 Типичные конфокальные изображения агрегата тромбоцитов, активированных 100 нМ тромбина и S мкг/мл CRP, полученные методами дифференциально-интерференционного контраста (DIC) (слева) и флуоресценции аинексина V-FITC (посередине), справа - наложения этих изображений. На всех панелях представлено одно поле зрения. А и Б, Два оптических среза, отстоящих друг от друга на 4,6 мкм. Зеленым цветом изображены РАС-1 -тромбоциты. Приведенный масштаб - S мкм. Данные получены совместно с аспирантом ЦТП ФХФ РАН Ф.Ю. Верхоломовой.

Видно, что фосфатидилсерин-положительные тромбоциты (рис.10, зеленые) удерживаются вместе бесформенной массой фосфатидилсерин-отрицательных тромбоцитов, в полном соответствии с гипотезой, согласно которой РАС-1 -тромбоциты могут агрегировать с PS -тромбоцитами, но не способны связываться между собой. То, что фосфатидилсерин-положительные тромбоциты, представленные на рис.10, являются РАС-1 -тромбоцитами, а не PS/PAC-1 -тромбоцитами, также связывающими аннексии V, подтверждает их форма. Именно РАС-1 "-тромбоциты имеют шарообразную, округлую форму [Heemskerk J.W. et al. 1997; Hess M.W., Siljander P. 2001], тогда как PS/PAC-1+-тромбоциты по морфологии сходны с PS -тромбоцитами (неопубликованные данные аспиранта ЦТП ФХФ РАН С.И. Обыденного). Вид агрегатов, сформированных при перемешивании суспензии активированных тромбоцитов, наглядно показывает, что РАС-1 -тромбоциты не

пассивно вовлекаются в агрегаты, иначе они находились бы внутри агрегата, окруженные PS -тромбоцитами.

Исследование тромбов, формирующихся на коллагене в условиях потока, на конфокальном микроскопе

Чтобы проверить, способны ли РАС-1 -тромбоциты встраиваться в тромбы в условиях, наиболее приближенных к ситуации in vivo, рекальцифицированная цельная кровь прокачивалась над поверхностью с иммобилизованным коллагеном в проточной камере, и сформированные тромбы исследовались методами конфокальной микроскопии (рис.11).

А

J¡Sl-é м, - *W ' t Ш \ . ' L

Б

• Í

с/

Рис.11 Типичные конфокальные изображения тромбов, сформированных на коллагене при прокачивании через проточную камеру рекальцифицированной крови со скоростью сдвига 500 с"1 в течение 2 минут. Представлены изображения, полученные методами дифференциально-интерференционного контраста (1МС) (А) и флуоресценции антител к С042Ь (тромбоцитарному рецептору вР1Ь) (Б) и аннексина V (В). На всех панелях представлено одно поле зрения. Приведенный масштаб - 5 мкм.

Эксперименты проводились при двух сдвиговых скоростях, соответствующих венозным (500 с"1) и артериальным (1500 с'1) условиям потока. На рис.11 представлены типичные конфокальные изображения тромбов, формирующихся на коллагене как при одной скорости сдвига, так и при другой. После обработки полученных конфокальных изображений из оптических срезов с шагом 0,2 мкм создавались ЗБ-реконструкции сформированных тромбов. На рис.12 представлена типичная ЗБ-реконструкция тромбов, формирующихся на коллагене как при венозной, так и при артериальной скорости потока.

В

Рис.12 Типичная ЗБ-реконструкция тромбов, сформированных на коллагене при прокачивании через проточную камеру рекальцифицированной цельной крови со скоростью сдвига 500 с"1 в течение 2 минут. Зеленой изображена флуоресценция антител к CD42b (тромбоцитарному рецептору GPIb), малиновой - флуоресценция аннексина V.

Видно, что РАС-1 -тромбоциты (рис.12, круглой формы, малинового цвета) действительно детектируются в тромбах и располагаются на их поверхности.

Глава 4 посвящена обсуждению.

Целью данной работы было исследование агрегационных способностей тромбоцитарных субпопуляций, образующихся в результате активации тромбоцитов тромбином или тромбином совместно с агонистом гликопротеина VI. Была произведена оценка эффективности вовлечения тромбоцитов разных субпопуляций в агрегаты, и выявлены механизмы такого вовлечения. Методами конфокальной микроскопии было показано, что РАС-1 -тромбоциты, до сих пор считавшиеся не способными агрегировать, обнаруживаются в агрегатах, полученных при перемешивании суспензии с активированными тромбоцитами, а также вовлекаются в тромбы, формирующиеся на коллагене в условиях потока.

В данной работе впервые показано, что РАС-1 -тромбоциты обладают способностью к агрегации. Они могут связываться с PS -тромбоцитами и PS/PAC-1+-тромбоцитами, но не агрегируют друг с другом. Показано, что в условиях потока как с венозной, так и с артериальной скоростью сдвига РАС-1 -тромбоциты вовлекаются в тромбы, формирующиеся на коллагене при прокачивании рекальцифицированной цельной крови. Этот результат согласуется с данными нескольких исследований, в которых с помощью микроскопии и флуоресцентно меченного аннексина V показано присутствие фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов в тромбах,

сформированных в проточных камерах [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004; Munnix I.C.A. et al. 2007; Kuijpers M.J. et al. 2008; Berny M.A. et al. 2010] и in vivo [Munnix I.C.A. et al. 2007; Hayashi T. et al. 2008; Kuijpers M.J. et al. 2008; Berny M.A. et al. 2010]. Необходимо отметить, что только в некоторых из указанных работ [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004; Munnix I.C.A. et al. 2007; Hayashi T. et al. 2008] видна форма

фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов - округлая, что позволяет соотнести их с субпопуляцией РАС-1_-тромбоцитов [Heemskerk J.W. et al. 1997; Hess M.W., Siljander P. 2001]. Однако ни в одной из этих работ не было показано вовлечение PAC-1-тромбоцитов в тромбы как при венозной, так и при артериальной скорости сдвига, с использованием коллагена в качестве адгезивного субстрата и рекальцифицированной цельной крови без добавления тканевого фактора.

Основным механизмом агрегации активированных тромбоцитов («обычных», PS -тромбоцитов) при малых сдвиговых скоростях является связывание двух концов симметричной молекулы фибриногена рецепторами GPIIblIIa соседних тромбоцитов [Leung L., Nachman R. 1986]. В данной работе методами проточной цитометрии было впервые показано, что PS/PAC-1+-тромбоциты участвуют в формировании агрегатов наравне с Р8_-тромбоцитами. При этом H.H. Топаловым ранее было показано, что на поверхности PS/PAC-1+-тромбоцитов интегрины allbß3 находятся в активном состоянии. Это позволило предположить, что механизм агрегации PS/PAC-1+-тромбоцитов не отличается от того, как агрегируют PS -тромбоциты.

В данной работе впервые был выявлен основной механизм агрегации РАС-1 -тромбоцитов. Было показано, что РАС-1 -тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания активированными рецепторами GPIIblIIa на PS -тромбоцитах (а также, по-видимому, и на PS/PAC-1+-тромбоцитах) свободных концов молекул фибриногена или другого лиганда GPIIblIIa, удерживаемого на поверхности РАС-1 -тромбоцитов в составе их белковой «шубы». При этом друг с другом РАС-1 -тромбоциты агрегировать не могут. Эти результаты хорошо согласуются с существующими в литературе данными [Agam G., Livne A.A. 1983; Agam G., Livne A.A. 1992], согласно которым тромбоциты, фиксированные формальдегидом и несущие на своей поверхности фибриноген, а также эритроциты с ковалентно связанным с их поверхностью фибриногеном участвуют в формировании агрегатов таким же образом, как и PAC-1-тромбоциты в экспериментах данной работы. Такие заместители тромбоцитов не агрегируют друг с другом, но вовлекаются в агрегаты активированными тромбоцитами, находящимися в той же суспензии.

Результаты данной работы снимают долгое время существовавшее в литературе противоречие между традиционно приписываемой РАС-1 -тромбоцитам ролью в гемостазе и их общепризнанной неспособностью агрегировать. В данной работе показано, что РАС-1 "-тромбоциты способны встраиваться в тромбы и удерживаться в них в условиях потока, несмотря на неактивные или оккупированные интегрины allbp3 [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005], благодаря связыванию с PS~-тромбоцитами, а значит, и поддерживать реакции свертывания в месте повреждения сосуда.

В данной работе было впервые показано, что РАС-1 -тромбоциты распределяются на поверхности тромбов, формирующихся на коллагене. Этот результат подтверждается данными других исследований, проводимых, однако, в других условиях - с добавлением тканевого фактора в прокачиваемую кровь [Munnix I.C.A. et al. 2007; Berny M.A. et al. 2010] или с использованием суспензии

тромбоцитов и эритроцитов [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004], хотя есть одна работа [Hayashi Т. et al. 2008], где в модели лазер-индуцированного тромбоза РАС-1-тромбоциты составляют, наоборот, ядро тромба, окруженное PS -тромбоцитами. Распределение РАС-1 -тромбоцитов на поверхности тромбов, по-видимому, помогает им осуществлять свою прокоагулянтную функцию, обеспечивая оптимальный доступ плазменных факторов к фосфатидилсерину на их внешней мембране. Также такая локализация РАС-1 -тромбоцитов хорошо согласуется с другой возможной их ролью, провоспалительной, предложенной Кулкарни с коллегами, - регуляцией адгезии и распластывания нейтрофилов в месте повреждения сосуда [Kulkarni S. et al. 2007].

В лаборатории молекулярных механизмов гемостаза Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН недавно было показано (неопубликованные данные аспиранта С.И. Обыденного), что альфа-гранулярные белки, в частности фибриноген, распределены по поверхности РАС-1 "-тромбоцитов неравномерно, с наличием небольшой области повышенной концентрации белков по сравнению с остальной поверхностью тромбоцита. Эти результаты в совокупности с результатами данной работы позволяют по-новому взглянуть на роль РАС-1--тромбоцитов в регуляции роста тромба. Считалось, что РАС-1~-тромбоциты могут останавливать рост тромба [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004; Jobe S.M. et al. 2008] в силу того, что они не способны агрегировать, или связывать другие тромбоциты (при этом никак не обсуждался вопрос о том, как они удерживаются в тромбе). Принимая во внимание показанное в данной работе наличие у РАС-1 "-тромбоцитов агрегационной способности и их распределение на поверхности тромбов, а также неравномерность распределения альфа-гранулярных белков на внешней мембране РАС-1--тромбоцитов, можно сформулировать новую гипотезу о сдерживании роста тромба РАС-1 -тромбоцитами. При небольших скоростях сдвига ведущую роль в росте тромба играет связывание интегринов allb[33 на тромбоцитах, находящихся в кровяном русле, и фибриногена, адсорбирующегося на верхнем слое тромбоцитов растущего тромба [Jackson S.P. 2007; Jackson S.P. et al. 2009]. Поверхность тромба, состоящая преимущественно из РАС-1 -тромбоцитов с резко неравномерно распределенным фибриногеном на мембране, представляет собой механизм, сдерживающий прикрепление новых тромбоцитов к тромбу за счет уменьшения вероятности связывания молекул фибриногена рецепторами GPIIblIIa на проносящихся в потоке тромбоцитах. Более того, вполне вероятно, что неспособность РАС-1 -тромбоцитов агрегировать друг с другом уже сама по себе является механизмом, предотвращающим тромбозы.

ВЫВОДЫ

1. РАС-1-отрицательные тромбоциты обладают способностью связываться и формировать агрегаты с фосфатидилсерин-отрицательными и фосфатидилсерин/РАС-1-положительными тромбоцитами, но не друг с другом.

2. Механизм агрегации РАС-1-отрицательных тромбоцитов с тромбоцитами двух других субпопуляций заключается в связывании активных интегринов allbp3

фосфатидилсерин-отрицательных и фосфатидилсерин/РАС-1 -положительных тромбоцитов с лигандами, входящими в состав белковой «шубы» РАС-1-отрицательных тромбоцитов.

3. Фосфатидилсерин/РАС-1-положительные тромбоциты, в отличие от РАС-1-отрицательных и по аналогии с фосфатидилсерин-отрицательными тромбоцитами, могут эффективно формировать агрегаты с тромбоцитами любых субпопуляций.

4. РАС-1-отрицательные тромбоциты в тромбах, формирующихся на коллагене в условиях венозного и артериального потока крови, преимущественно распределяются на их поверхности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Yakimenko А.О., Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Coated platelets: do they aggregate or not? 1 Joint Meeting GTH & NVTH (54rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research and Symposium of the Netherlands Society of Thrombosis and Haemostasis), Nürnberg, Germany, February 24 - 27, 2010, Hämostaseologie, 1, 2010, p.A90.

2. Якименко A.O., Котова Я.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев M.A. Сравнение проагрегаторных способностей тромбоцитов разных субпопуляций. 5-ая Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, Москва, Россия, 31 января-2 февраля, 2011, материалы конференции, стр.586.

3. Yakimenko А.О., Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Coated platelets form aggregates with non-coated ones, but do not aggregate with each other. XXIII Congress of International Society of Thrombosis and Hemostasis, Kyoto, Japan, July 23 - 28, 2011, abstract P-MO-023, p.65.

4. Yakimenko A.O., Verholomova F.Y., Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Identification of different proaggregatory abilities of activated platelet subpopulations. Biophys J. 2012; 102(10): 2261-2269.

5. Topalov N.N., Yakimenko A.O., Canault M., Loosveld M., Ataullakhanov F.I., Nurden A.T., Alessi M.C., Panteleev M.A. Two types of phosphatidylserine-expressing platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin alpha lib beta 3 signaling. 58th Annual Meeting of the Scientific and Standardization Committee of the International Society of Thrombosis and Hemostasis, Liverpool, UK, June 27-30, 2012, abstract PBS13.

6. Topalov N.N., Yakimenko A.O., Canault M., Artemenko E.O., Zakharova N.V., Abaeva A.A., Loosveld M., Ataullakhanov F.I., Nurden А.Т., Alessi M.C., Panteleev M.A. Two types of procoagulant platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin a(IIb)ß(3). Arterioscler Thromb Vase Biol. 2012; 32(10): 2475-2483.

7. Якименко A.O., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев M.A. Фосфатидилсерин-положительные тромбоциты локализованы на поверхности тромбов, сформированных в проточной камере на коллагене. 6-ая Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии, Москва, Россия, 31 января - 2 февраля, 2013, материалы конференции, стр.462.

Подписано в печать. 2.03.2013 Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 0083 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39