Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы противотромбоцитарного действия биогенных хлораминов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы противотромбоцитарного действия биогенных хлораминов"

) ^

(Г.° -"" На правах рукописи

Аднорал Наталья Владимировна

Механизмы протнвотромбоцитарного действия биогенных

хлораминов

Биофизика - 03.00. 02.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва -1999

Работа выполнена в Российском Государственном Медицинско Университете и Научно-исследовательском институте физико-химическо медицины МЗ РФ (Москва)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д.И. Рощупкин

Научный консультант:

кандидат биологических наук М.А. Мурина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.И. Иванов доктор медицинских наук, профессор В.И. Сороковой

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт фармакс логии РАМН

Защита состоится "_" _ 1999 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д.084.66.01. при НИИ физике химической медицины МЗ РФ по адресу : Москва, ул. М. Пироговская, д. а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физике химической медицины МЗ РФ.

Автореферат разослан "_"_ 1999 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Мурина М.А.

г - * ■ - :' - !

ê ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование влияния биогенных хлораминов на функциональную активность тромбоцитов представляет интерес в двух аспектах. Во-первых, N-хлорпроизводные аминокислот и таурина являются природными соединениями: они образуются в активированных нейтрофилах в результате реакции гипохлорной кислоты с эндогенными аминокислотами [Stelmaszynska T., Zgliczynska J.M., 1974]. В ряде работ [Kim С., Park Е., Quinn M.R., Schuller-Levis G, 1996] показано, что N-монохлортаурин, являющийся сигнальной молекулой нейтрофилов, способен снижать образование тканеповреж-дающих медиаторов воспаления макрофагами (окиси азота, фактора некроза опухоли-сс, простагландина Ej) за счет ингибирования процессов транскрипции и трансляции, и тем самым защищать собственные ткани от повреждения. В организме, в случае воспалительного повреждения эндотелия сосуда, происходит взаимодействие лейкоцитов и тромбоцитов. Продукты миелопероксидазной реакции оказывают влияние на функциональную активность тромбоцитов. Впервые противоагрегационное действие N-хлорпроизводных аминокислот на тромбоциты было показано в работах нашей лаборатории [Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И., 1989, 1992, 1995, 1997]. Во-вторых, гиперактивность тромбоцитов играет фундаментальную роль в развитии тромбоза, вазоспазма и атеросклероза, составляющих патогенетическую триаду сердечно-сосудистых заболеваний, которые по-прежнему являются основной причиной смертности населения развитых стран [Wu К.К., 1996]. В настоящее время существуют препараты, каждый из которых блокирует преимущественно одну функцию тромбоцитов: адгезию, агрегацию, секрецию. Таким образом, поиски нового антитромбо-цитарного препарата, сочетающего максимальную способность к угнетению активности тромбоцитов с минимальным повреждением других компонентов крови и организма в целом, продолжаются. В нашей лаборатории N-шорпроизводные аминокислот предложены как возможные антитромбоцитар-ные средства для предотвращения тромбозов, опосредованных тромбоцитами Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И., 1993]. Химическая модификация биогенными хлораминами плазматической мембраны тромбоцитов может шзывать генерализованное подавление адгезии, агрегации и секреции тромбоцитов. Известно, что N-хлораминокислоты способны химически модифицировать серосодержащие группы [Thomas G., 1986]. Эти группы обнаружены в лруктуре коллагенового, фибриногенового и аг-адренергического рецепторов таазматической мембране тромбоцитов [Siess W., 1989; Панченко Е.П., 1997] и 4грают важную роль в процессах их адгезии и агрегации.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в эценке эффективности противотромбоцитарного действия биогенных хлорами-чов на тромбоциты человека в зависимости от путей и механизмов их активации; присутствия других клеток крови; структуры хлораминовых производных шинокислот. В соответствии с этим предусматривалось решение следующих (адач:

1) Исследование угнетения активности тромбоцитов (агрегации и секреции содержимого плотных гранул) под действием N-хлораминокислот в зависимости от их структуры и природы индуктора агрегации.

2) Сравнение эффективности противоагрегационного действия N-;лораминокислот на нативные, предварительно активированные тромбоциты и тетки в составе агрегатов.

3) Сравнительное изучение действия N-хлорпроизводных аминокислот и таурина на функциональную активность тромбоцитов и эритроцитов.

4) Оценка эффективности антитромбоцитарного действия N-хлорпроизводных аминокислот и таурина при их введении в цельную кровь человека.

Научная новизна исследования. Было выяснено, что агрегация тромбоцитов кролика, вызванная различными индукторами (АДФ, коллагеном и адреналином), эффективно угнетается N-монохлорпроизводными аланина и фенилала-нина; при этом противоагрегационное действие N-хлораминокислот зависит от способа активации тромбоцитов: агрегация тромбоцитов, индуцированная коллагеном и адреналином и сопровождающаяся реакцией выброса плотных и а-гранул, подавляется N-хлораминокислотами в 2-5 раз эффективнее, чем АДФ-индуцированная агрегация.

Установлено, что N-хлорпроизводные аминокислот и таурина эффективно подавляют агрегацию как нативных, так и предактивированных тромбоцитов человека; при этом в условиях кратковременной инкубации тромбоцитов с N-хлораминокислотами, их противотромбоцитарное действие зависит от структуры N-хлораминокислот: N-хлораланин более эффективно подавляет агрегацию тромбоцитов, чем N-хлорфенилаланин. При увеличении продолжительности взаимодействия нативных и предактивированных тромбоцитов человека с N-хлорпроизводными аминокислот и таурина различия в эффективности их про-тивоагрегационного действия исчезают.

Показано, что секреторная активность тромбоцитов человека, отражающая выброс во внеклеточную среду содержимого плотных гранул и приводящая к каскадной активации форменных элементов крови, подавляется N-хлорпроизводными аминокислот и таурина в большей степени, чем агрегация.

Выяснено, что N-хлорпроизводные аминокислот и таурина, введенные в цельную кровь человека, проявляют высокую избирательность противоагрега-ционного действия на тромбоциты; при этом не наблюдается повреждения эритроцитов, регистрируемого по критериям гемолиза и изменения их агрегацион-ной способности. Эритроциты человека модифицируются N.N-дихлортаурином в количествах, на 2-3 порядка выше требуемых для угнетения агрегации тромбоцитов.

Установлено, что ^И-дихлортаурин способен подавлять начальную агрегацию тромбоцитов человека и вызывать полный распад образовавшихся агрегатов.

Показано, что HN-дихлортаурин и общепринятые антитромбоцитарные препараты аспирин и тиклопидин при введении в кровь человека одинаково эффективно подавляют агрегацию тромбоцитов.

Практическое значение работы. С одной стороны изучение влияния биогенных хлораминов на функциональную активность тромбоцитов и эритроци тов представляет интерес с точки зрения перспективы получения нового антит ромбоцитарного препарата для предотвращения тромбозов, опосредованные тромбоцитами. Потенциально возможным кандидатом на эту роль являете* N.N-дихлортаурин (ДХТ), который характеризуется значительной химической устойчивостью. ДХТ эффективно подавляет начальную и конечную агрегацик тромбоцитов человека, и реакцию выброса содержимого плотных гранул, npt введении ДХТ в цельную кровь человека значительное ингибирование arpera ции тромбоцитов не сопровождается заметным повреждением эритроцитов Важным достоинством ДХТ следует также счиуцуъ его способность подавлят!

агрегацию спонтанно и экзогенно активированных тромбоцитов человека и вызывать полный распад образовавшихся агрегатов. С другой стороны, таурин in vivo составляет 70 % от свободных аминокислот, содержащихся в нейтрофилах, и является "ловушкой" гипохлорит-аниона, предохраняя клетки крови от цито-токсического и цитолитического действия гипохлорной кислоты. В результате образуется долгоживущий хлортаурин. Поэтому большой интерес представляет исследование закономерностей действия ДХТ на функциональную активность тромбоцитов и эритроцитов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, апрель 1998 г., на II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов", Воронеж, июль 1998 г., на V Международной конференции "Биоантиоксидант", Москва, ноябрь 1998 г.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 25 рисунков и 10 таблиц, состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение" и выводов. Список литературы включает 231 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Реактивы. В работе использовались аминокислоты фирмы "Reanal" и "Реахим"; коллаген, адреналин, АДФ ("Serva"); аспирин и тиклопидин ("Sigma"); люмиреагент ("Chrono-log"); соли марок ЧДА и ХЧ. Гипохлорит натрия (ГХН) получали электролизом 0,9 % раствора хлорида натрия на аппарате ЭДО-4 [Мартынов А.К., 1985]. Концентрацию ГХН определяли методом иодометриче-ского титрования [Кудрявцев Н.Т., Вячеславов П.М.,1980].

Получение N-хлорпроизводиых аминокислот и N.N-дихлортаурииа. N-Хлораминокислоты получали при взаимодействии гипохлорита натрия с раствором аминокислоты в молярной концентрации, превышающей концентрацию ГХН на 10 %. Ы,М-Дихлортаурин (ДХТ) получали при введении в раствор ГХН раствора таурина в соотношении конечных концентраций 2:1. Образование N-хлораминокислот и ДХТ контролировали спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 (Россия) по наличию в спектре поглощения максимума 252-255 нм для монохлорпроизводных и 300 нм для ДХТ [Мурина М.А., 1997]. Концентрации N-хлораминокислот и ДХТ определяли методом иодометрического титрования.

Работа проводилась на тромбоцитах кролика и человека в составе ОТП и изолированных тромбоцитах кролика; на суспензии изолированных эритроцитов человека.

Выделение тромбоцитов кролика. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), кровь из краевой вены уха кролика смешивали с 3,8 % раствором цитрата натрия, приготовленном на забуференном физиологическом растворе (142 мМ NaCl; 10 мМ №2НР04*12Нг0) в соотношении 9:1 по объему и центрифугировали 20 мин при 460 g. Отобранная надосадочная суспензия клеток представляла собой ОТП. Для получения изолированных тромбоцитов в ЭТП добавляли раствор ЭДТА в конечной концентрации 1 мМ и центрифугиро-зали 7 минут при 1850 g. Осадок ресуспендировали в буфере для тромбоцитов с ЭДТА (0,5 мМ) (134 мМ NaCl; 5 мМ KCl; 0,4 мМ NstfHFCU; 0,1 мМ SíaHzPOí; 1,0 мМ MgS04; 10 мМ HEPES; 5 мМ глюкозы; рН=7,^) ^ снова осаж-

дали при тех же условиях. Затем осадок ресуспендировали в рабочем буфере (состав тот же, но без ЭДТА).

Выделение тромбоцитов человека. Кровь, полученную на пункте переливания от здоровых доноров, смешивали с кислым цитратом (цитрат натрия 0,1 М, лимонная кислота 7 мМ, глюкоза 0,14 М) в соотношении 6:1. ОТП получали центрифугированием крови в течение 15 мин при 200 g.

Выделение эритроцитов человека. Суспензию эритроцитов, остающуюся после отбора ОТП, отмывали двукратным центрифугированием в течение 10 мин при 460 g с забуференным физиологическим раствором. Для опытов клетки ресуспендировали в физиологическом растворе (рН=7,35).

Регистрация агрегации тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов кролика регистрировалась турбидиметрическим методом Борна [Born G.V.R., 1962] при комнатной температуре на электрофотометре КФК-2МП при 670 нм. Турбиди-метрическое исследование агрегации тромбоцитов человека проводили на лю-миагрегометре "Platelet ionized calcium aggregometer" (P.I.C.A.) фирмы "Chrono-log Corporation". Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов было максимальное изменение светопропускания их суспензии, регистрируемое через 5 минут после введения агониста, либо по мере выхода кривой изменения светопропускания на плато. Результаты представлены в виде отношения ДТ/ДТк, где ДТки ДТ - изменение светопропускания в контрольных и опытных образцах.

Начальную агрегацию тромбоцитов человека исследовали новым нефело-метрическим методом, который недавно разработан в нашей лаборатории и заключается в регистрации увеличения интенсивности света, рассеянного под малыми углами, при образовании мелких тромбоцитарных агрегатов [Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю., 1995]. Количественным показателем агрегационной способности тромбоцитов служило максимальное изменение светорассеяния их суспензии по мере выхода кривой изменения светорассеяния на плато. Результаты представлены в виде отношения Д1/Л1к, где Д1 и Д1к- изменение светорассеяния в контрольных и опытных образцах.

Регистрация дезагрегации тромбоцитов. Дезагрегация тромбоцитов человека вызывалась введением N,N-дихлортаурина в момент достижения кривой агрегации тромбоцитов максимального значения и регистрировалась нефеломет-рическим и турбидиметрическим методами. Количественным показателем де-загрегационной способности тромбоцитов служило максимальное уменьшение светорассеяния (светопропускания) их суспензии после введения дезагрегирующего соединения. Результаты представлены в виде отношения Д1дез/Д1агг (ДТдез/ДТагр), где Д1дез (ДТдез) и Д1агр (ДТагр) - изменение светорассеяния (светопропускания) при дезагрегации и агрегации соответственно.

Регистрация реакции выброса содержимого плотных гранул тромбоцитов человека. Реакция выброса АТФ регистрировалась на люмиагрегометре (P.I.C.A.) с использованием люмиреагента, содержащего 0,008 мг люциферина и 0,88 ЕД d-люциферазы, параллельно с агрегацией. Количественным показателем степени секреции была выбрана максимальная интенсивность хемилюминисцен-ции. Результаты представлены в виде отношения Д1ш/Д1хлк, где Д1*л и Д1хлк- изменение хе милю мини с цен ции в контрольных и опытных образцах.

Регистрация агрегации эритроцитов человека. Агрегация эритроцитов человека вызывалась альциановым синим в конечной концентрации 0,001% и регистрировалась турбидиметрическим методом Борна при комнатной температуре на КФК-2МП. Количественным показателем агрегационной способное™

эритроцитов было максимальное изменение светопропускания их суспензии по мере выхода кривой изменения светопропускания на плато. Результаты представлены в виде отношения ДТ/ЛТк, где ДТк и ДТ - изменение светопропускания в контрольных и опытных образцах.

Кинетический гемолиз эритроцитов человека исследовали турбидиметриче-ским методом на на электрофотометре КФК-2МП. Показателем гемолиза эритроцитов служило увеличение светопропускания их суспензии.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась по параметрическому t-критерию Стьюдента и непараметрическому U-критерию Вил-коксона-Манна-Уитни.

Результаты и их обсуждение

1. Противотромбоцитарное действие хлораминовых производных аминокислот и

таурина

В работе исследовалась эффективность противоагрегационного действия биогенных хлораминов на тромбоциты в зависимости от путей и механизмов их активации, структуры N-хлораминокислот и присутствия других клеток крови. Кроме того, изучалось влияние N-хлораминокислот на реакцию выброса АТФ из плотных гранул тромбоцитов. В работе использовались: N-хлораланин, соединение с сильным противоагрегационным действием, N-хлорфенилаланин, более слабый противотромбоцигарный агент, и NN-дихлортаурин (ДХТ), характеризующийся наибольшей химической устойчивостью и являющийся перспективным противотромбоцитарным средством [Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И., 1993].

N-Хлораминокислоты, согласно данным литературы [Zgliczynska J.M., 1971], быстро и эффективно модифицируют серосодержащие химические группы. Какие химические группы в структуре N-хлораминокислот обусловлавли-вают их противоагрегационное действие? В реакции с сульфгидрильной группой восстановленного глутатиона хлораминовая группа превращается обратно в аминогруппу с образованием иона хлора [Chesney J.A., Eaton J.W., Mahoney J.R., 1996]. Было получено, что если в раствор N-хлораланина в конечной концентрации 1 мМ ввести восстановленный глутатион в конечной концентрации 0,5 мМ и добавить эту смесь к обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП), то АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов кролика практически не отличалась от контрольной (табл. 1). В то время, как один N-хлораланин в конечной концентрации 1 мМ вызывал 80 % подавление агрегации тромбоцитов.

Таблица 1. Действие восстановленного глутатиона на противоагрегацион-ный эффект N-хлораланина.

Степень агрегации в % к контролю под действием N-хлораланина (1 мМ) Степень агрегации в % к контролю под действием глутатиона (0,5 мМ) Степень агрегации в % к контролю под действием смеси N-хлораланина с глутатионом

23+7 (п=6) 94±2 (п=6) 98±1 (п=6)

Этот результат говорит о том, что противоагрегационные свойства № хлораминокислот определяются хлораминовой группой.

Серосодержащие группы в большом количестве присутствуют на мембране тромбоцитов и в плазме крови. Мы изучали продолжительность взаимодействия N-хлораминокислот с компонентами ОТП кролика: N-хлораминокислоты вводили в ОТП в конечной концентрации 1,5 мМ и через 0,5 и 5 мин иодометри-ческим методом измеряли количество хлораминовых групп (активного хлора). Спектры поглощения иодо-крахмального комплекса, образующегося при окислении N-хлораминокислотами иодида калия до молекулярного иода, регистрировали на СФ-18 с использованием сферы Ульбрехта. Было получено, что через 0,5 и 5 мин содержание N-хлораланина в ОТП составило соответственно около 20 и менее 1 % от введенного количества, а содержание N-хлорфенилаланина было равно соответственно около 33 и менее 1 %. Таким образом, 70-80 % N-хлораминокислот реагирует с компонентами ОТП кролика за 0,5 минуты, а практически полное взаимодействие хлораминов с ОТП кролика происходит за 5 мин. В дальнейшем индуктор агрегации тромбоцитов вводили в образец через 0,5 и 5 мин после добавления N-хлораминокислот.

1.1. Зависимость противоагрегационного действия N-хлораминокислот от их

Известно, что эффективность антитромбоцитарных препаратов во многом определяется способом активации тромбоцитов. Мы решили сравнить действие Ы-хлораланина и Ы-хлорфенилаланина на агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ, коллагеном и адреналином. Работа проводилась на ОТП кролика. Продолжительность взаимодействия ОТП с №хлораминокислотами (время до введения индуктора агрегации) составляло 0,5 мин. Активация тромбоцитов тремя исследуемыми агонистами в конечном итоге приводит к экспрессии фибриноге-новых рецепторов и агрегации клеток, однако механизмы активации тромбоцитов, запускаемые АДФ, коллагеном и адреналином различаются.

Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ. Основное отличие активации тромбоцитов кролика под действием АДФ от других агонистов заключается в том, что АДФ вызывает агрегацию тромбоцитов, не приводя к реакции высвобождения во внеклеточную среду содержимого плотных и а-гранул. Типичные кинетические кривые агрегации тромбоцитов представлены на рис. 1.

структуры и природы индуктора агрегации

Т

Рис. 1. Кинетические кривые АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов кролика в составе ОТП: 1 - в контроле; 2 ■ при введении 1 мМ Ы-хлораланина.

Т - светопропускание, отн. ед.; t - время.

Стрелками указан момент введения АДФ (10 мкМ).

5 мин t

-i—-

Противоагрегационное действие Ы-хлорамииокислот на тромбоциты кро лика в составе ОТП (рис. 2) возрастает с увеличением концентраций N

хлораминокислот и зависит от их структуры. Ы-Хлораланин подавляет агрегацию тромбоцитов в 2 раза эффективнее, чем Ы-хлорфеиилаланин: С50 Ы-хлорпроизводных аланина и фенилалаиина соответственно равны примерно 0,5 и 1,2 мМ.

ДТ/ДТг. %

100«

80 60

40 -

20

0

Рис. 2. Противоагрегационное действие М-хлораминокислот на тромбоциты кролика в составе ОТП.

Индуктор агрегации - АДФ (10 мкМ).

Время инкубации ОТП с Ы-хлораминокислотами - 0,5 мин.

ЛТ/ЛТк - степень агрегации в % к кон-М-Хлораланин тролю.

N-Хлорфенил-аланин

1.2

0.0 0.4 0.8

Концентрация N-хлораминокислот, мМ

Агрегация тромбоцитов, индуцированиая коллагеном. Коллаген является компонентом субэндотелия и способен вызывать активацию тромбоцитов и образование их агрегатов [Sixma J.J., 1995; Thomas M. Chiang., 1997]. При действии коллагена на тромбоциты кролика агрегация полностью обусловлена вторичной активацией, сопровождающаяся реакцией выброса содержимого внутриклеточных гранул, в ходе которой происходит вторичная экспозиция рецепторов к фибриногену под действием секретируемой АДФ. В кинетиках коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов обычно наблюдается латентный период (рис. 3).

Рис. 3. Кинетические кривые коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов кролика в составе ОТП: 1 - в контроле; 2 -под действием 0,2 мМ Ы-хлораланина.

Стрелками указан момент введения коллагена (5 мкг/ мл).

Т - светопропускание, отн. ед.; I- время, мин.

Латентный

период ^

5 мин

Исследуемые Ы-хлораминокислоты эффективно подавляют коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов в составе ОТП (рис. 4). Зависимость противоагрегационного действия Ы'-хлораминокислот от их структуры прослеживается в области сравнительно высоких концентраций (0,4 мм). В этом случае

Ы-хлораланин достоверно (Р<0,01) эффективнее подавляет коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов, чем хлорфенилаланин: степень агрегации составила соответственно 10±4 и 24±6 % от контрольной.

ДТ/ДТ,, %

Важно отметить, что коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов в ОТП подавлялась №хлораминокислотами в концентрациях, которые в 3-4 раза ниже требуемых для ингибирования АДФ-индуцированной агрегации (рис. 2, рис. 4): снижение амплитуды АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации на 50 % наблюдалось при введении в.ОТП Ы-хлораланина в конечных концентрациях соответственно 0,55 мМ и 0,2 мМ; для Ы-хлорфенилаланина Сзо АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации составили соответственно 1,25 мМ и 0,3 мМ.

Агрегация тромбоцитов, индуцированная адреналином. Действие адреналина на активацию тромбоцитов существенно отличается от других агонистов. Во-первых, адреналин вызывает появление псевдоподий без округления тромбоцитов, что сопровождается поступлением ионов кальция внутрь клеток из внешней среды. Во-вторых, экспозиция рецепторов к фибриногену под действием адреналина происходит независимо от внеклеточного АДФ или высвобождения метаболитов арахидоновой кислоты, но существенно зависит от внеклеточного Саг+ р^сЬеке Н„ 1980; Бош М.О., 1993; Клтига У., Окиёа Н., 1994]. Вероятно, действие адреналина связано с активацией кальциевых каналов.

Агрегация тромбоцитов, индуцированная адреналином (1 мкМ), подавляется Ы-хлораминокислотами при их введении в ОТП в тех же концентрационных диапазонах, что и коллаген-индуцированная агрегация (рис. 5, рис. 4). Зависимость противоагрегационого действия Ы-хлораминокисяот от их структуры наблюдалось в области сравнительно больших концентраций (0,4 мМ). Сравнение противоагрегационного действия Ы-хлораминокислот на агрегацию тромбоцитов в составе ОТП, индуцированную АДФ и адреналином, показало, что адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов подавляется N1-хлораминокислотами в 1,5-2 раза эффективнее, чем агрегация, вызванная АДФ (рис. 2 и 5).

Рис. 4. Противоагрегационное действие >1-хлораминокислот на тромбоциты кролика в составе ОТП.

Индуктор агрегации - коллаген (5 мкг/ мл).

Время инкубации ОТП с Ы-хлораминокислотами - 0,5 мин.

ДТ/ДТ* - степень агрегации в % к контролю.

о

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

Концентрация К-хлорамипокислот, мМ

ДТ/ДТк, %

Рис. 5. Противоагрегационное действие >1-хлораминокислот на тромбоциты кролика в составе ОТП.

Индуктор агрегации - адреналин (1 мкМ).

Время инкубации ОТП с М-хлораминокисло-тами - 0,5 мин.

ЛТ/ДТк - степень агрегации в % к контролю.

20 Ь

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

Концентрация N-хлораминокислот, мМ

Таким образом, во-первых, N-хлорпроизводные аланина и фенилаланина эффективно подавляют агрегацию тромбоцитов кролика, вызванную различными агонистами. Это является важным свойством биогенных хлораминов как противотромбоцитарных средств. Вместе с тем при определенных условиях противоагрегационное действие N-хлораминокислот зависит от способа активации клеток: коллаген- и адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов кролика, сопровождающаяся (в отличие от агрегации, вызванной АДФ) реакцией выброса содержимого внутриклеточных гранул, подавляется N-хлораминокислотами эффективнее, чем агрегация, индуцированная АДФ. Продукты тромбоцитарной секреции являются мощными индукторами агрегации и вызывают каскадную активацию тромбоцитов. Модификация мембранных структур, участвующих в реакции выброса, возможно, блокирует вторичную активацию клеток и приводит к значительному подавлению коллаген- и адрена-пин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Вероятно также, что N-гаораминокислоты химически модифицируют серосодержащие группы в структуре коллагенового и адреналинового рецепторов, приводя к их инактивации. Возможная инактивация рецептора для фибриногена сказывается на конечном этапе активации тромбоцитов под действием всех исследованных агонистов.

Во-вторых, противоагрегационное действие N-хлораминокислот зависит эт их структуры: N-хлораланин более эффективно подавляет агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ, коллагеном и адреналином, чем N-хлорфенилаланин. Толученные данные [Мурина М.А., Кравченко H.H. и др., 1997] свидетельствует о том, что эффект ингибирования агрегации тромбоцитов в составе ОТП N-шорпроизводными аминокислот зависит от их молекулярной массы и опреде-хяется реакциями двух типов. Реакция типа I, идущая одновременно с тромбо-датами и плазмой, доминирует в случае N-хлораминокислот с значительной мо-юкулярной массой (N-хлорфенилаланин); реакция второго типа, протекающая, юзможно, с химическими группами в узком кармане тромбоцитов, определяет действие N-хлораминокислот с меньшей молекулярной массой (N-хлораланин). 1ри этом отношение константы скорости данной реакции к константе скорости 13аимодействия с плазмой увеличивается при снижении молекулярной массы N-лораминокислот по экспоненциальному закону. Таким образом, определяю-цим фактором более эффективного противоагрегационного действия N-

хлораланина в ОТП является его более низкая молекулярная масса и соответственно меньший, размер молекул.

1.2. Зависимость противоагрегационного действия 1У-хлораминокислот от состояния тромбоцитов

Известно, что гиперактивность тромбоцитов играет важную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, что способность тромбоцитов к спонтанной агрегации в клинике является показателем риска развития острого инфаркта миокарда, и, наконец, что в организме лишь часть тромбоцитов активируется субэндотелием в месте повреждения сосудистой стенки - остальные тромбоциты активируют друг друга К.К., 1996]. Все это побудило изучить влияние Ы-хлораминокислот на активированные тромбоциты. Исследовали колла-ген-индуцированную агрегацию тромбоцитов кролика в составе ОТП и изолированном виде и АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека в составе ОТП.

Противоагрегационное действие ТУ-хлораминокислот иа активированные тромбоциты кролика.

В серии экспериментов в кинетиках коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов кролика отсутствовал латентный период (рис. 6). Это наблюдалось: при попадании в ОТП гемолизированных эритроцитов, либо длительной инкубации тромбоцитов, за счет выброса АДФ - мощного активатора тромбоцитов; и при специальной активации тромбоцитов путем введения в нативный образец суспензии проагрегировавших под действием коллагена клеток.

А ктивировшшые

тромбоциты Рис. 6. Кинетические кривые коллаген-

индуцированной агрегации тромбоцитов кролика в составе ОТП.

Неактивировшшые Стрелками указан момент введения колетромбоциты лагена (5 мкг/ мл).

/ Т - светопропускание, отн. ед.; I- время,

/ мин.

I

Латентный период

Было получено (рис. 7), что Ы-хлораланин вызывает 50 % подавление агрегации активированных тромбоцитов в концентрации, примерно в 2 раза большей, чем в случае агрегации нативных клеток. Ы-Хлорфенилаланин в концентрации 0,4 мМ на агрегацию активированных тромбоцитов практически не действует; то есть сохраняется зависимость противоагрегационного действия Ы-хлораминокислот от их структуры.

А ктивировашые тромбоциты

Нашивные тромбоциты

Рис. 7. Ингибирование коллаген-индуцированной (5 мкг/ мл) агрегации тромбоцитов кролика в составе ОТП под действием К-хлораланина (кривые I и 3) и № хлорфенилаланина (кривые 2 и 4).

Время инкубации ОТП с Ы-хлораминокислотами - 0,5 мин.

ДТ/ДТх - степень агрегации в % к контролю.

Концентрация Ы-хлораминокислот, мМ

Таким образом, противоагрегационное действие 1^-хлорпроизводных ала-нина и фенилаланина зависит от их структуры и состояния тромбоцитов кролика. Однако, учитывая возможность использования Ы-хлорпроизводных аминокислот в качестве антитромбоцитарных средств, необходимо исследовать их влияния на функциональную активность тромбоцитов человека.

Противоагреганиониое действие хлораминовых производных аминокислот и таурина на нативиые и активированные тромбоциты человека

Исследовали противоагрегационное действие Ы-хлораминокислот на тромбоциты человека в зависимости от их состояния, структуры Ы-хлораминокислот и продолжительности их взаимодействия с компонентами ОТП человека. Агрегацию тромбоцитов человека в составе ОТП индуцировали АДФ. АДФ является одним из самых распространенных эндогенных медиаторов, который высвобождается из плотных гранул активированных тромбоцитов и при гемолизе эритроцитов и приводит к каскадной активации форменных элементов крови. Известно, что в тромбоцитах человека АДФ вызывает изменение их формы, агрегацию и секрецию содержимого гранул (Л*/и К.К., 1996]. Мы исследовали агрегацию тромбоцитов человека в составе ОТП под действием АДФ в конечной концентрации 2 мкМ, вызывающей реакцию выброса и необратимую вторичную агрегацию тромбоцитов. Дальнейшее увеличение концентрации индуктора не приводило к усилению агрегационного ответа тромбоцитов. Исходные соединения - аминокислоты апанин и фенилаланин, и сульфоновая кислота таурин в конечных концентрациях 0,5-1 мМ на агрегацию тромбоцитов не влияли: степень агрегации после их инкубации с ОТП человека в течение 5 мин изменялась лишь в пределах ошибки измерения и составляла 94-100 % от контроля.

Агрегация тромбоцитов человека сопровождается секрецией во внеклеточное пространство соединений, стимулирующих нативные клетки. Действие этих соединений эквивалентно активации тромбоцитов под влиянием АДФ в концентрации нескольких микромолей. В нашей работе показателем тромбоци-тарной активации считалось увеличение светопропускания их суспензии при ее перемешивании в отсутствии индуктора агрегации. Это происходило в случаях спонтанной и экзогенной стимуляции тромбоцитов. Специальную активацию клеток (экзогеную предстимуляцию) проводили следующим образом: в натив-ный образец ОТП добавляли суспензию проагрегировавших под действием АДФ клеток. В некоторых образцах ОТП человека тромбоциты проявляли спо-

собность к агрегации без введения индуктора извне. Вероятно, в этом случае активация тромбоцитов происходила в результате действия трудно контролируемых факторов, приводящих к высвобождению агонистов. Между результатами, полученными на ОТП со спонтанной и экзогенной предстимуляцией, достоверной разницы не наблюдалось, поэтому эти данные были объединены. Изучение действия Ы-хлораминокислот на спонтанную агрегацию тромбоцитов человека представляет большой интерес, поскольку в клинике способность тромбоцитов к спонтанной активации считается "предсказателем" риска острого инфаркта миокарда и выявляется у 10-20 % больных с инфарктом миокарда, инсультом и нарушениями периферического кровообращения |ЛУи К.К., 1996].

ДТ/ДТк,% о о гг

Рис. 8. Противоагрегационное действие Н-хлораминокислот на активированные (кривые 2 и 4) и на-тивные (кривые 1 и 3) тромбоциты человека в составе ОТП. Индуктор агрегации - АДФ (2 мкМ).

Время инкубации ОТП с Ы-хлора-минокислотами - 0,5 мин.

И-Хлорфенил-аланин

^ И-Хлораланин

1.5

Концентрация М-хдораминокислот, мМ

Противоагрегационное действие Ы-хлораминокислот на нативные и активированные тромбоциты человека наблюдалось уже через 0,5 мин после введения М-хлораминокислот в ОТП в конечных концентрациях 1,5-3 мМ и зависло от их структуры: ЬГ-хлораланин более эффективно ингибировал агрегацию, чем М-хлорфенилаланин (рис. 8). При этом агрегация предактивированных тромбоцитов в ОТП подавлялась Ы-хлорпроизводными фенилаланина и аланина в концентрациях в 1,5-1,7 раз больших, чем агрегация нативных клеток.

Увеличение продолжительности взаимодействия ОТП человека с ]чГ-хлораминокислотами до 5 мин (инкубация проходила при 37° С) привело, во-первых, к резкому усилению их противоагрегационного действия как на нативные, так и на активированные тромбоциты. Ингибирование агрегации тромбоцитов на 40-50 % наблюдалось при концентрации ЬГ-хлорпроизводных аланина и фенилаланина и М,Ы-дихлортаурина (ДХТ) 0,5 мМ (здесь и далее в данной главе представлены концентрации ДХТ в рассчете на активный хлор (рис. 9). Подобный рост эффективности действия Ы-хлораминокислот трудно объяснить лишь тем, что за 5 мин с тромбоцитами дополнительно взаимодействует остаток хлораминов, поскольку было показано, что основная их часть реагирует за 0,5 мин. Вероятно, это обусловлено тем, что первичные продукты взаимодействия хлораминов с серосодержащими группами тромбоцитов и компонентов плазмы сравнительно медленно превращаются во вторичные продукты. Во-вторых, продолжительная инкубация ОТП с хлораминами (5 мин) привела к исчезновению зависимости их противоагрегационного действия от структуры: агрегация как активированных, так и нативных тромбоцитов в этом случае в оди-

наковой степени подавлялась хлорпроизводными аланина, фенилаланина и тау-рина.

ДТ/ДТк, %

100 г

80

60

40

20

Нативные тромбоциты

Рис. 9. Противоагрегационное действие хло-Актнвированиые Раиновых производных аминокислот и тау-тромбоииты Рина на тромбоциты человека в составе ОТП.

Представлены суммарные значения по всем соединениям.

Индуктор агрегации - АДФ (2 мкМ).

Время инкубации ОТП с хлораминовыми производными аминокислот и таурина - 5 мин.

0,5 мМ 0,5 мМ 0,25 мМ

ДТ/ДТк - степень агрегации в % к контролю.

о

По-видимому, при длительной инкубации ОТП с Ы-хлораминокислотами, их противоагрегационное действие определяется реакцией типа 1, которая происходит одновременно с тромбоцитами и плазмой и обусловливает не зависящий от размера молекул эффект. В-третьих, хлораминовые производные аминокислот и таурина одинаково эффективно подавляли агрегацию активированных, и нативных тромбоцитов.

1.3. Подавление секреции АТФ тромбоцитами человека под действием хлорамино-вых производных аминокислот и таурина

Важным этапом тромбоцитарной активации, ответственным за переход обратимой первичной агрегации в необратимую вторичную агрегацию клеток, является сокращение микротрубочек, сопровождающееся выбросом содержимого плотных и а-гранул, которая наблюдается после стимуляции клеток любым из тромбоцитарных агонистов. Плотные гранулы содержат АДФ, АТФ, серото-нин и кальций, высвобождение которых из активированных тромбоцитов во внеклеточную среду, способствует привлечению к поврежденному участку сосуда все новых и новых тромбоцитов, упрочению и расширению агрегата [Мгсато-Ба^гаг в., 1994].

В настоящей работе мы исследовали влияние 1Ч-хлорпроизводных аланина, фенилаланина и М,М-дихлортаурина на выброс АТФ из плотных гранул тромбоцитов человека, активированных АДФ. В опыте ОТП выдерживали с хлораминами 5 мин при комнатной температуре, затем добавляли люмиреагент и через 1-2 мин вводили АДФ в конечной концентрации 3-8 мкМ. Кинетические кривые изменения интенсивности хемилюминисценции системы люциферин-люцифераза (люмиреагента) в ОТП при введении АДФ представлены на рис. 10. Вначале, после введения АДФ, наблюдался непродолжительный латентный период, затем происходило возрастание этой интенсивности, отражающее высвобождение из плотных гранул АТФ и пропорциональное её концентрации.

Подавление реакции выброса АТФ на 50 % наблюдалось под действием Ы-хлораминов в концентрации 0,25 мМ и не зависело от их структуры (табл. 2). Более чем на 50 % секреция подавлялась Ы-хлораминами в концентрации 0,5 мМ. Исходные соединения фенилаланин и таурин в концентрации 0,5 мМ влия-

пия на секрецию ие оказывали: степень секреции под действием данных амипо кислот не отличалась от контрольной.

1ш -Г

Л1к

Рис. 10. Кинетические кривые измепеиш интенсивности хемшиомиписценции лю цифсрин-люцифсразного люмирсагснта ] ОТП человека: 1 - в контроле; 2 - под дей стписм 0,25 мМ Ы,Н-дихлортаурина. I хл - интенсивность хемшиомиписценции отн. сд.; I - время, мин. Стрелками указан момент введения АД<\ д! (3-8 мкМ).

3 мин

Таблица 2. Подавление активности тромбоцитов человека в составе ОТП при её инкубации с 1Ч-хлораминами 5 мин при комнатной температуре

t

Вид Степень секреции или агрегации, %

активности Все N-хлорами- N-Хлор- N-Хлорфс- N,N^nxjiop-

ны аланин нилаланин таурин

Концентрация (мМ) 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 (но С1-)

Секреция 49±15 38+13 40+11 31+13 39±15

(ч=7) (п=27) (п=9) (п=9) (п=9)

Агрегация 86+4 73±7 75+6 66+7 78+8

(п=7) (п=27) (п=9) (п=9) (п=9)

Параллельно секреции на тех же образцах ОТП исследовали также агрсп цию тромбоцитов. В отличие от предыдущих серий в этом случае использование высокие концентрации АДФ (3-8 мкМ) и иной режим инкубации ОТП с > хлораминами (при комнат ной температуре). Противоагрсгационный эффект, ка и в предыдущей серии экспериментов при несколько иных условиях (рис. 9), н зависел от сгруктуры хлораминов (табл. 2). Однако в условиях изучения сскрсци (табл. 2), N-хлорамины оказывали более слабое иротииоагрсгационнос действи< чем при инкубации ОТП с N-хлораминами при 37° С и использовании более ни: ких концентраций АДФ (рис. 9). Вопрос о том, что определяет указанную разш цу: температура инкубации, введение люмирсагснта или концентрация АДФ, oi тасгся открытым. Интересно, что в одинаковых условиях секреция подавляла^ N-хлораминокислогами в концентрации 0,5 мМ в большей степени (степень cci реции снижалась на 60-70 %), чем агрегация (степень агрегации снижалась на 2! 35 %) (табл. 2). Таким образом, мембранные структуры, обеспечивающие pcai цию выброса гранулярного аппарата тромбоцитов, значительно модифицирую ся N-хлораминами. В этой связи необходимо вспомнить, что коллаген- и адрсн; лин-индуцированная агрегация тромбоцитов кролика, сопровождающаяся pcai

цией выброса, подавлялась N-хлораминамн в большей степени, чем агрегация, вызванная АДФ и протекающая без стимуляции реакции выброса.

Таким образом, генерализованный характер ингибирования активацион-ных ответов тромбоцитов является важным достоинством биогенных хлораминов, как возможных противотромбоцитарпых соединений.

1.4. Противоагрегационное действие биогенных хлорамииов на тромбоциты человека в составе цельной крови

N-Хлораминокислоты химически модифицируют сульфгидрильные группы (Thomas G.„ 1986]. Серосодержащие группы плазматической мембраны тромбоцитов играют важную роль в процессах их адгезии и агрегации. Согласно неопубликованным данным, получепиым в нашей лаборатории, при 50 %-ом подавлении Ы^-дихлортаурином агрегации изолированных тромбоцитов, уровень сульфгидрильиых групп их плазматических мембран, определяемый с помощью дитионитробеизойпой кислоты, снижается примерно па 30 %. По-видимому, наибольший вклад в антиагрегациошюе действие биогенных хлораминов вносит химическая модификация сульфгидрильиых групп плазматической мембраны тромбоцитов. Подобные химические группы также входят в состав других, преобладающих в численном отношении, клеточных и неклеточных компонентов крови. Поэтому можно ожидать, что при введеннии в цельную кровь, эффективность антитромбоцитарного действия хлораминов может оказаться минимальной. Задача настоящей работы заключалась в оценке эффективности противоагрегационного действия хлораминовых производных аминокислот и таурина па тромбоциты человека в присутствии других компонентов крови.

Прежде всего методом иодометрического титрования была изучена продолжительность взаимодействия между хлораминами и компонентами крови человека. Содержание хлораминов определяли в ОТП после удаления эритроцитов, занимавшего около 10 минут. Оказалось, что за этот период N-хлораланшг, N-хлорфенилалании и iN.N-дихлортаурип, введенные в кровь в конечной концентрации 1,5 мМ, практически полностью прореагировали, их остаток был менее 1 %. Таким образом, за 10 минут происходит практически полное взаимодействие хлораминов с компонентами крови человека.

Мы исследовали эффективность антитромбоцитарного действия N-хлорпроизводных аланина, фенилаланина и таурина при их введении в цельную кровь человека. Хлораминовые производные аминокислот и таурина вводили в цельную кровь, инкубировали 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугированием осаждали эритроциты и регистрировали в ОТП АДФ-нндуцировапную агрегацию тромбоцитов. N-Хлорфепилаланин и N,N-дихлортаурин, введенные в кровь в конечной концентрации 1 мМ, снижали степень агрегации тромбоцитов в составе ОТП на 50-60 % (рис. 11).

Было обнаружено резкое отличие действия N-хлораланина от других хлораминов: в концентрации до 2 мМ это соединение агрегацию тромбоцитов не по-ивляло, и лишь при более высокой концентрации проявлялся противоагрегаци-зппый эффект (рис. 11), в то время, как при 5-мипутной инкубации с ОТП все исцелованные хлорамины оказывали примерно одинаковое действие па агрега-1ию тромбоцитов человека (рис. 9, табл. 2). В пашей лаборатории проводились омерсния относительных констант взаимодействия N-хлораминокислот с эрнт-юцитами. Было получено, что N-хлораланип в 1,6 раз эффективнее взаимодейст-1ует с эритроцитами, чем N-хлорфенилалании. Поэтому более низкая эффектив-

ность антагромбоцитариого действия К-хлоралаиииа, по сравнению с 1\ хлорфенилаланином и М,1Ч-дихлортауршюм, при введении в цельную кров1 возможно, обусловлена повышеппым расходом данного соединения в реакциях эритроцитами.

ДТ/ДТк, %

100'

80 60 40 20 0

Рис. 11. Противоагрсгационное действи М-хлораланина (1), >4,>)-дихлортаурина (2 и 1Ч-хлорфенилаланш1а (3) при их введепи в цельную кровь на тромбоциты человека составе ОТП.

Индуктор агрегации - АДФ (2 мкМ). Время инкубации хлораминов с кровыо -мин.

ДТ/ДТк - степень агрегации в % к контре то.

1 2 3

Концентрация М-хлораминокислот, мМ

Таким образом, ТЧ-хлорфенилаланип и М,1Ч-дихлортаурип, вводимые : цельную кровь, эффективно подавляют агрегацию тромбоцитов в тех же конце» трациошшх диапазонах, что и при введении в ОТП (рис. 9 и 11), что говорит о< избирательности исследуемых соединений по отношению к тромбоцитам. Эт1 является важным достоинством возможного аититромбоцитарного препарата Для того, чтобы количественно оценить степень избирательности антитромбоци тарного действия Ы-хлораминокислог, мы сравнили концентрации N хлорамииокислот, вводимые в цельную кровь и вызывающие 50 % подавлепи агрегации тромбоцитов, с концентрациями ГЧ-хлорамипов, вводимых в суслен зию изолированных тромбоцитов и приводящих к 50 % угнетению их агрегации Было получено, что снижение амлитуды агрегации тромбоцитов в составе ОТ1 на 50% (С50) наблюдалось при введении в кровь Ы-хлораминокислот в концеи трации около 0,8 мМ, а при действии на изолированные тромбоциты - в кои центрации 0,08 мМ; то есть примерно десятая часть Ы-хлораминокислот, вводи мых в кровь, идет па эффективную модификацию тромбоцитов. Таким образом с учетом доли объема тромбоцитов в цельной крови (0,2 %), выходит, что N хлорамипокислоти примерно в 50 раз эффективнее взаимодействуют с тромбо цигами, чем с другими компонентами крови.

2. Деза1регация тромбоцитов человека под действием ГУ.М-дих.юртаурина

В клинике важным показателем эффективности аптитромбоцитарных пре паратов служит не только их противоагрегационпое действие, но и способности вызывать распад уже образовавшихся агрегатов. Задача настоящей работы со стояла в исследовании влияния НК-дихлортаурипа (ДХТ) па процессы началь пой агрегации и дезагрегации тромбоцитов человека, регистрируемых с помо щыо нефелометрического метода, разработанного в нашей лаборатории и позво ляющего регистрировать изменение интенсивности рассеянного под малыми уг лами света [Рощупкин Д.И., Соколов А.Ю., 1996]. Начальная агрегация тромбо цитов представляет собой процесс образования мелких агрегатов, иаблюдаемьп с первых секунд активации клеток, при этом с увеличением размеров частиц воз растает интенсивность рассеянного под малыми углами света. Введение ДХТ 1

ОТП человека в конечной концентрации 0,5 мМ (при инкубации ОТП с ДХТ в течение 5 мин при комнатной температуре) приводило к 50 % подавлению АДФ-ицдуциропанной (0,4 мкМ) агрегации тромбоцитов.

С помощью нефелометрнческого метода мы исследовали дезагрегацион-пую активность Ы^-дихлортаурииа на тромбоциты человека в составе ОТП, сагрегировавшие спонтапно, либо под действием АДФ в конечной концентрации 0,4 мкМ. Дезагрегацию тромбоцитов вызывали введением ДХТ в момент максимальной агрегации. В ходе дезагрегации тромбоцитов происходило уменьшение светорассеяния в образце (рис. 12).

Рис. 12. Кинетические кривые изменения интенсивности рассеянного свста при начальной агрегации (Д1а) и дезагрегации (41л) тромбоцитов человека в составе ОТП.

Индуктор агрегации АДФ (0,4 мкМ). 1рс - интенсивность рассеянного под малыми углами свста, отн. сд.; I - время, мин. Дезагрегация тромбоцитов после введения: М,1Ч-Дихлортаурина

Цитра та натрия .........

Цитрата натрия и кальция-----

| 1 мин г

Спонтанная и АДФ-иидуцированная агрегации были примерно сопоставимы по амплитуде. Результаты представлены в виде отношения Д1л/ Д1а, где Д1д и Д1а амплитуды дезагрегации и агрегации соответственно (рис. 12).

Таблица 3. Дезагрегационное действие ДХТ на тромбоцитарные агрегаты.

Вид агрегации Степень дезагрегации тромбоцитов, %

тромбоцитов ДХТ; 0,5 мМ Цит рат; 5 мМ

Спонтанная 85±4 (п=8) 100 (п=2)

Индуцированная АДФ; 0,4 мкМ 96+3 (п—16) 75±5 (п=5)

В обоих случаях М,1Ч-дихлортаурин вызывал практически полную дезагрегацию тромбоцитов. В контрольных образцах дезагрегация, как правило, не происходила, однако в отдельных случаях наблюдался спонтанный распад, степень которого составляла 18±4 %. Вводимый в ОТП, в момент максимальной агрегации, таурин в конечной концентрации 0,5 мМ пе вызывал дезагрегацию тромбоцитов и пе влиял па ход кривой спонтапной дезагрегации. Следует отметить, что в пробах, где была зарегистрирована дезагрегация тромбоцитов под действием ДХТ и цитрата натрия, агрегаты визуально не наблюдались, тогда как в контрольных образцах были видны крупные или средние агрегаты.

Известно, что агрегаты тромбоцитов формируются путем образования межклеточных фибрипогеиовых мостиков. Для связывания фибриногена с рецептором (GP ИЬ/Ша) на мембране тромбоцитов и стабильности этого комплекса необходимы ионы кальция [Smith J.W., 1994]. Связывание Са2+ в области межклеточных взаимодействий может привести к распаду уже образовавшихся агрегатов. И действительно, известный комплексен па кальций цитрат натрия в конечной концентрации 5 мМ вызывал практически полную дезагрегацию клеток 'табл. 3, рис. 12). А если через 30 сек после введения цитрата натрия в образец до-

Дихлортаурии; цитрат Na

бавляли кальций в концентрации 0,4 мМ, т.е. примерно на порядок меньше, че цитрата, дезагрегация тромбоцитов не наблюдалась (рис. 12). Однако, распа тромбоцитарпых агрегатов под действием ДХТ в конечной концентрации 0,5 мГ (па фоне АДФ-индуцировапной - 0,4 мкМ, агрегации тромбоцитов) не устраши ся введением кальция в конечной концентрации от 0,4 до 3 мМ: степень дезагр гации под действием ДХТ без добавления и с добавлением кальция составила а ответственно 93+5 и 84+4 % (результаты объединены но всему концентрационш му диапазону кальция). Поэтому распад тромбоцитарных агрегатов под действ! ем ДХТ не может быть объяснен простым связыванием кальция в области мея клеточных контактов. Возможно, дезагрегирующий эффект дихлортаурипа об; словлен инактивацией фибрииогепового рецептора и/или модификацией ме( связывания кальция па рецепторе для фибриногена па плазматической мембран тромбоцитов.

З.Сравии гельнаи оценка эффективности иротиво громбоци гарного действия аспи рииа.тиклоиидииа и N ^-дихлортаурипа при их введении в кровь человека В настоящее время в борьбе со склонностью к тромбообразованию в юн пике широко применяются аспирин и тиклопидин, влияющие соответственно 1 циклооксигепазный (ЦОГ) и АДФ-индуцированный пути активации тромбоц] тов. Мы провели сравнительный анализ противоагрегационного действия асга рииа, тиклопидина и ДХТ при их введении в цельную кровь человека в конечно концентрации 0,5 мМ на тромбоциты в составе ОТП (рис. 13). Время ипкубащ цельной крови с аспирином, тиклопидииом и ДХТ составляло 10-20 мин.

ДТ/ДТк, %

Рис. 13. Ингибирование АДФ-индуцированнс (0,5-2 мкМ) агрегации тромбоцитов человека составе ОТП при введении в цельную кро аспирина, тиклопидина и М^-дихлортаурщ в конечных концентрациях 0,5 мМ. Время инкубации исследуемых соединений кровыо - 10-20 мин.

ЛТ/ДТк - степень агрегации в % к контролю.

100

75

50

Аспирин

X

25

Дихлортаурин

Тиклид

Было получено, что аспирин, тиклопидин и ДХТ, введенные в кровь, пример! одинаково эффективно подавляют агрегацию тромбоцитов в составе ОТП сос ветсгвснно на 39+5, 52+4 и 48+5 %.

4. Гемолиз и ¡прегатт эритроцитов человека под действием N.14-дихлортаурина

При введении в цельную кровь человека ^Ы-дихлортаурин (ДХТ) оказ вает эффективное противоагрегациоппое действие па тромбоциты в соста ОТП. Однако б цельной крови содержится 0,2 % тромбоцитов и 45 % эритрои тов. Поэтому необходимо выяснить, происходит ли повреждение эритроцит под действием ДХТ, введенного в цельную кровь в концентрации, вызывающ значительное подавление агрегации тромбоцитов. Оценку повреждения эритр цитов проводили по двум критериям: гемолизу и изменению их агрегациопп-активности. ДХТ вводили в суспензию отмытых эритроцитов и в цельную кро! Концентрации ДХТ представлены в расчете па активный хлор.

4.1.Влияние ГЧ.ГУ-дихлортаурииа на агрегацию эритроцитов, ипдунироваи-ную алуииаповым синим

Мы исследовали агглютинацию эритроцитов человека под действием аль-цианового синего (АС) в конечной концентрации 10-3 %. Обладая положительным зарядом, АС нейтрализует отрицательный заряд поверхности эритроцитов и тем самым приводит к слипанию клеток. Связывание красителя с мембраной происходит за счет электростатических сил. Местом связывания для АС на мембране эритроцитов MOiyr служить сиаловыс кислоты - основные носители заряда. Показано, что добавление АС в сусиснзию эритроцитов приводит к снижению элсктрофорстичсской подвижности и смснс поверхностного заряда клеток [Булегснов К.Е., Балмуханов B.C., 1993].

Мы исследовали агрегацию эритроцитов человека под действием N,N-дихлортаурина, вводимого в сусиснзию отмытых эритроцитов, содержащую 12,5 млн клеток в 1 мл. Время инкубации эритроцитов с М,1Ч-дихлортаурином при комнатной температуре (время до введения АС) составляло 5 мин (рис. 14).

Рис. 14. Иншбирование агрегации эритроцитов человека, индуцированной AC (103 %) под действием ДХТ.

Концентрация эритроцитов в суспензии -12,5 млн/ мл.

Время инкубации эритроцитов с ДХТ - 5 мин.

ДТМТк - степень агрегации в % к контролю.

I. . I -I- I- I - )

О 50 100 150 200 250 Концен трация ДХТ, мкМ

Получили, что ДХТ подавляет агрегацию эритроцитов. Снижение амплитуды агрегации эритроцитов на 50 % при 5 мин инкубации наблюдалось под действием 80 мкМ ДХТ (6,4 нмолей в рассчстс на 1 миллион эритроцитов). Это эквивалентно введению в цельную кровь ДХТ в конечной концентрации 32 мМ. В наших экспериментах такие большие концентрации не использовались.

В нашей работе 50 % подавление агрегации тромбоцитов в составе ОТП достигалось введением в цельную кровь ДХТ в конечной концентрации менее 1 мМ (0,7 мМ) (рис. 11), нри этом изменения агрегации изолированных эритроцитов, индуцированной АС, но сравнению с контрольной, не происходило: степень агрегации эритроци тов, выраженная в условных единицах, составила в контроле и иод действием ДХТ, введенного в кровь в конечной концентрации 1 мМ, соответственно 21,1±0,2 и 20,8+1,2.

дт/дт„ %

1001

80 Л1

60

40 -

20

0 ...J - .1.

4.2. Гемолиз эритроцитов под действием 1Ч,М-дихлортаурина

Мы исследовали длительный (период наблюдения 11-12 часов) гемолиз эритроцитов (5-7 млн клеток в мл) под действием ДХТ в конечных концентрациях по хлору 0,2; 20; 100; 200 и 300 нмоль на 1 миллион эритроцитов и таурина в конечной концентрации 100 нмоль на 1 миллион (рис. 15). В кон трольную пробу вводили 0,9 % ЫаС1. Показателем гемолиза служило увеличение свсгонропуска-ния суспензии эритроцитов, регистрируемое турбидиметричсским методом.

Т, %

)(к. Рис. 15. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов

под действием N, N -д их л о рт ау р и н а (ДХТ). й() Кривая 1-« контроле; 2 - под действием таурипа в

конечной концентрации 100 нмоль; ы) 7 3, 4, 5, 6 и 7 - иод дейепшем ДХТ в конечной кон-

, -центрации по хлору 0,2; 20; 100; 200 и 300 нмоль со/ 6 оч'вегстнешю.

,' / ] Концентрации ДХТ представлены в расечстс на 1 / / 3 млн эритроцитон. 20 _ 1 Т, % - свстопропусканис, I, мин - время после вбсдс-

01 . . . . ' 2' «и* ДХТ.

0 180 3«) 540 720 I, МИН

При введении в цельную кровь М,1М-дихлортаурииа в конечной концентрации 1 мМ (по хлору) (при этом наблюдается 50 %-ое подавление агрегации тромбоцитов в ОТП) на 1 миллион эритроцитов приходится около 0,2 нмолей ДХТ. Важно отметить, что гемолиз эритроцитов за 11-й часовой период пе наблюдался даже под действием ДХТ в концентрациях, в 100 и 500 раз более высоких (20 и 100 нмоль иа 1 миллион клеток). Повреждение эритроцитов по критерию их гемолиза регистрировалось через 7 часов после введения в суспензию изолированных клеток ДХТ в соотношении 200 и 300 нмоль на 1 миллион эритроцитов и достигало 33-56 % за 12-и часовой период наблюдения (рис. 15). Это соответствует введению в кровь ДХТ в конечных концентрациях 1-1,5 М.

Таким образом, эритроциты взаимодействуют с ДХТ. Однако, повреждение эритроцитов, оцениваемое по критериям их гемолиза и изменения агрегации, регистрируется под действием ДХТ в концентрациях, на 2-3 порядка выше требуемых для эффективного подавления агрегации тромбоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано противотромбоцитарпое действие Ы-хлораминокислот при активации клеток по различным механизмам специфическими индукторами. Показано, что агрегация тромбоцитов кролика в составе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), вызванная коллагеном и адреналином, подавляется ТЧ-клорпроизводпыми аланипа или фенилалапина эффективнее, чем АДФ-индуцированная агрегация. Наиболее чувствительными к действию 14-шораминокислот являются мембранные структуры тромбоцитов, отвечающие за реакцию выброса содержимого внутриклеточных гранул.

2. При кратковременной инкубации тромбоцитов человека в составе ОТП и цельной крови с И-хлораминокислотами проявляется зависимость противоаг-регациопного действия от структуры этих соединений. Возможно, что при этом :уществениа величина молекулярной массы. При продолжительном взаимодействии ОТП с М-хлорамипокислотами их противоагрегациопные эффекты выравии-заются.

3. Ы-Хлораминокислоты в условиях кратковременной инкубации с ОТП до зведения агописта, подавляют агрегацию частично активированных тромбоцитов человека и кролика в концентрациях, которые в 1,3-5 раза выше требуемых для подавления агрегации нативных клеток. Угнетение агрегационной способности тромбоцитов человека не зависит от их состояния при их продолжительном ззаимодействии с Г^-хлорамино кислотами.

4. Реакция выброса АТФ тромбоцитами человека подавляется № шорпроизводными аланипа, фенилалапина и таурииа в одинаковой степени и шляется более чувствительной к ингибирующему действию М-хлора.минокислот, [ем агрегация: в одинаковых условиях ослабление реакции выброса на 60-70 % юпровождалось подавлением агрегации па 25-35 %. По-видимому, это связано с различными типами модификации клеточных мембран.

5. Обнаружено, что 1Ч,М-дихлортаурии индуцирует распад тромбоцитар-1ых агрегатов. Дезагрегация тромбоцитов под действием Ы,Ы-дихлортаурииа не устранялась дополнительным введением кальция и, следовательно, не вызывается 1росгым связыванием кальция. Дезагрегирующий эффект М,Гч'-дихлортаурипа )бусловлен инактивацией рецепторов для фибриногена на плазматической мем-5ране тромбоцитов.

6. В цельной крови и ОТП М-хлораминокислоты проявляют высокую из-щрателыюсть противоагрегациошюго действия на тромбоциты: эффективность ¡заимодействия Ы-хлорамипокислот с тромбоцитами примерно на порядок вы-пе, чем с другими компонентами крови.

7. В цельной крови человека Г^Ы-дихлортаурип в концентрации 1 мМ (в соличестве 0,2 имоля на 1 миллион эритроцитов), приводящей к подавлению аг->егации тромбоцитов на 50 %, не вызывает модификации эритроцитов по крите->ию их гемолиза или индуцированной агрегации. Модификация эритроцитов 1ызывается М,ГЧ-дихлортаурипом в количествах, на 2-3 порядка выше требуемых 1ля угнетения агрегации тромбоцитов. Таким образом, эффективное подавление [грегации тромбоцитов при введении в кровь 1М,М-дихлортаурина не сопровож-(ается заметным повреждением эритроцитов.

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Рощупкип Д.И., Мурина М.А., Аднорал Н.В., Кравченко H.H., Cepmei ко В.И. Угнетение функций тромбоцитов биогенными хлораминами. Физиологи человека, 1998, т. 24, № 3, с. 113-120.

2. Мурина М.А., Рощупкип Д.И., Аднорал Н.В., Сергиенко В.И. Средств для угнетения активности тромбоцитов на основе биогенных хлораминов. В кн "Человек и лекарство." Москва, 1998, с. 593.

3. Мурина М.А., Рощупкип Д.И., Аднорал Н.В., Сергиенко В.И. Распа тромбоцитарпых агрегатов при окислении белковых серосодержащих групп N,ls дихлортаурипом. В кн.: "Физико-химические основы функционирования белко и их комплексов". Воронежский гос. университет, 1998, с. 158-161.

4. Мурина М.А., Аднорал Н.В., Рощупкип Д.И., Савельева E.JI., Кравченк H.H., Сергиенко В.И. О защитном действии таурипа и аминокислот при окислг тельном повреждении клеток крови гипохлоритом натрия. В юг "Биоантиоксидант." Москва, 1998, с. 154-155.