Комплексный подход к изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении вируса гепатита A

Элбакян, Радмила Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексный подход к изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении вируса гепатита A
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Комплексный подход к изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении вируса гепатита A"

На правах рукописи

Элбакян Радмила Михайловна

Комплексный подход к изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении вируса гепатита А

03.00.06 вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ДЕК 2009

003488085

На правах рукописи

Элбакян Радмила Михайловна

03.00.06 вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научные руководители:

кандидат медицинских иаук Замятина Наталья Александровна

кандидат медицинских наук Пантелеева Людмила Григорьевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАМН Шахгильдян Иосиф Васильевич

доктор биологических наук Ожерелкоа Сергей Викторович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии медицинских наук научно-исследовательский Институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится г. в часов ушн на заседании

диссертационного совета д.001.026.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, пос. Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

<• , „ .—----

Автореферат разослан к '» года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Медведкина О. А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Вирусные гепатиты, и энтеральный гепатит А (ГА) в частности, остаются одной из серьезных проблем здравоохранения. Российская Федерация считается территорией, неблагополучной в отношении ГА. Интенсивная циркуляция вируса сочетается с достаточно крупной прослойкой восприимчивого населения. Периодические спады уровня заболеваемости ГА на отдельных территориях, по всей видимости, лишь отражают волнообразный характер эпидемического процесса, и нередко сменяются крупными вспышками или подъемом заболеваемости. Дополнительным фактором, отягощающим эпидемическую обстановку по ГА, является нарастание в стране числа чрезвычайных ситуаций как природного, так и техногенного характера.

В конце XX и начале XXI века проблеме гепатита А уделялось меньше внимания, чем другим вирусным гепатитам. Во многом это было связано с многолетним снижением заболеваемости ГА, которое отмечалось с середины 90-х годов двадцатого столетия. К сожалению, наблюдаемое снижение заболеваемости не привело к сопоставимому уменьшению значимости ГА для практического здравоохранения. В последние годы стал отмечаться сдвиг уровня заболеваемости ГА в старшие возрастные группы, сопровождающийся повышением вероятности развития тяжелых форм ГА. Смещение заболеваемости ГА на старшие возрастные группы объясняется сокращением в них доли лиц с наличием антител к вирусу ГА (ВГА) в крови и увеличением числа лиц, восприимчивых к этому вирусу [С.Н. Соринсон, 1998 г., М.С. Балаян, 1999 г., Т.Н. Бьгстрова, 2004 г.]. Явное смещение пика заболеваемости ГА в последние годы от детей 3-6 и 7-10 лет к более взрослым категориям населения (прежде всего, в возрастных группах 15-19 и 20-29 лет) привело к тому, что заболевание стало чаще протекать в клинически более выраженных формах и с большей частотой осложнений [М.И. Михайлов, 2002 г.].

Гепатит А передается фекаяьно-оральным механизмом, который реализуется водным, пищевым и контактно-бытовым путями. Анализ информации, полученной с разных территорий Российской Федерации, свидетельствует об участившихся случаях возникновения водных и пищевых вспышек [И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, О.Н. Ершова, 2006 г.]. Так, очень крупная пищевая вспышка была зафиксирована в Тверской

области в 2005 г. (г. Ржев, заболело 669 человек). Наиболее масштабная вспышка, имевшая водный путь передачи инфекции, зафиксирована в Нижнем Новгороде в мае 2005 г., когда заболело около 3000 человек. [М.И. Михайлов, 2002 г.].

Рост заболеваемости гепатитом А вызывает особенную тревогу в связи с тем, что в России имеется около 5 млн. больных хроническим гепатитом В и 1,5 млн. больных хроническим гепатитом С. У этих лиц инфицирование вирусом ГА активизирует патологический процесс в печени и заметно утяжеляет прогноз.

Высокие показатели заболеваемости среди работоспособного населения, возрастающая частота регистрации затяжных и рецидивирующих форм обусловливают увеличение экономического ущерба, причиняемого ГА-инфекцией. В США, по данным Р. Апс1гее1а1 (2002 г.), эти затраты составляют 480 млн. долларов в год. В России в 2000 году они составили порядка 1,2 миллиарда рублей. Выполненные И.Л. Шаханиной экономические оценки свидетельствуют о существенном вкладе ГА в суммарные потери от инфекционных болезней (32,4 тыс. руб. - экономический ущерб на 1 случай, число заболевших в 1997 г. - 43367, экономическая значимость - 1,4 млрд. рублей).

Высокая заболеваемость гепатитом А и его социальная значимость вынуждают разрабатывать надежные способы защиты от этой инфекции. Основными задачами по профилактике ГА в настоящее время являются проведение активного надзора за данной инфекцией и улучшение санитарно-коммунального благоустройства населенных мест. Другим важным путем решения проблемы является создание достаточно большой иммунной прослойки среди групп риска населения с помощью вакцикопрофилакгики. Ограниченная доступность вакцины ГА, в частности, из-за ее высокой стоимости, диктует необходимость тщательного подбора контингентов, подлежащих вакцинации. Отсутствие вакцинации против гепатита А в Российском календаре профилактических прививок и высокая цена препарата не позволяют полностью контролировать эту инфекцию, снизив риск возникновения случаев гепатита А. Поэтому вакцинация не может являться единственно эффективным методом профилактики ГА.

Значительная роль в профилактике гепатита А, наряду с вакцинопрофилактикой, отведена «комплексу санитарно-гигиенических и дезинфекционных мероприятий, целью которых является разрыв механизмов путей передачи инфекции» [ Л.С. Федорова, 2002 г.]. Важное значение имеет своевременное проведение текущей и заключительной дезинфекции, направленной на инактивацию вируса гепатита А. Место дезинфекции в профилактике гепатита А определено в Санитарно-эпидемиологических правилах 3.1.95800 «Профилактика вирусных гепатитов» от 01.02.2000 г.

Необходимым компонентом противоэпидемической работы является применение современных методов дезинфекции. Одной из наиболее важных и актуальных задач дезинфектологии являются поиск и создание новых высокоактивных дезинфекционных субстанций, разработка на их основе высокоэффективных дезинфицирующих препаратов, а также научное сопровождение их производства и применения. Для доказательства вирулицидной активности дезинфицирующих средств (ДС) они должны подвергаться вирусологическому исследованию с измерением остаточной инфекционности вируса в обработанных объектах [М.Г. Шандала, 1998г.]. Общепринятым подходом к оценке активности дезинфектантов является использование «вирусов-моделей», которые в соответствии с современным уровнем знаний считаются репрезентативными для возможно большего спектра патогенных для человека видов вирусов, резистентных к физическим и химическим факторам [М.Г. Шандала, 1998 г.]. В соответствии с Европейским стандартом EN 14476 для оценки вирулицидной активности ДС обязательным является испытание на модели полиовируса 1-го типа (вакцинный штамм Sabin LSc-2ab). Полиовирус и ВГА являются РНК-содержащими вирусами и относятся к семейству Picornaviridae. Было принято считать, что полиовирус является адекватной моделью для таких исследований, так как он высокорезистентеп к действию многих дезинфектантов и близок по основпым физико-химическим свойствам к ВГА [P. Gowland, S. Fontana, С. Niedechause, В.М. Taleghani, 2004 г.]. В связи с имеющимися сведениями о том, что по устойчивости к физическим и химическим факторам ВГА превосходит полиовирус возникла необходимость проведения сравнительных исследований по оценке вирулицидной активности ДС в отношении ВГА, в частности, новой в этом отношении группы ДС па основе четвертичных аммониевых соединений (ЧАС). Интерес к этой группе средств обусловлен наличием у них не только высокой вирулицидной, но и широкого спектра антимикробной активности, в частности спороцидной, а также их невысокой токсичности и химической агрессивности. Кроме того, эти ДС не обладают летучестью, они не опасны при ингаляционном воздействии и могут применяться в присутствии пациентов.

Изучение вирулицидной активности ДС в отношении ВГА и полиовируса было проведено согласно «Методическим рекомендациям по определению вирулицидной активности препаратов» J& 1119-73, утвержденным МЗ СССР (06.09.1973 г.) и «Методам испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности й эффективности», утвержденным МЗРФ(1998 г.)

Цель работы

Целью работы является разработка комплексного подхода к изучению и оценке вирулицидной активности современных ДС на основе ЧАС в отношении вируса гепатита А.

Исходя из поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучение влияния ДС на антигенную активность нативпого ВГА из фекалий больных ГА людей, и культурального ВГА, адаптированного к культуре клеток почки зеленой мартышки (линия 4647).

2. Изучение модельных систем для исследования инфекционной активности ДС в отношении ВГА:

2.1 .Изучение влияния ДС прямым методом па инфекционную активпость культурального ВГА в исследованиях in vitro в культуре клеток, адаптированной к ВГА. 2.2.Изучение влияния ДС прямым методом на инфекционную активность нативпого ВГА, выделенного от больного ГА, в исследованиях in vivo с чувствительными лабораторными животными (обезьяны-мармозеты) вида Callithrix jacchus, семейства игрупковых -Callitrichidae.

3. Сравнительный анализ вирулицидной активности ДС на основе ЧАС с различным композиционным составом с использованием 2-х вирусов in vitro:

а) ВГА (штамм HAS-15) в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки 4647.

б) вирус полиомиелита I типа (вакцинный штамм Sabin LSc-2ab) (полиовирус) в перевиваемой культуре клеток НЕр - 2 (Cincinnati).

Научная новизна

1. Впервые в России разработан комплексный подход к изучению вирулицидной активности ДС в отношении ВГА путем определения его антигенной активности в иммунологических реакциях и инфекционной активности в культуре клеток и на чувствительной биологической модели - обезьянах-мармозетах.

2. Получены данные о вирулицидной активности ДС на основе ЧАС отечественного производства при обеззараживании различных объектов, контаминированных ВГА.

3. На основании результатов сравнительного изучения вирулицидной активности ДС на основе ЧАС с различным композиционным составом и хлорамина Б показано, что вирус гепатита А более устойчив к действию дезинфицирующих средств, чем полиовирус.

4. Обоснована необходимость включения ВГА (штамм HAS-15) в перечень тест-вирусов с целью определения вирулицидной активности ДС широкого спектра действия.

Практическая значимость

Согласно результатам выполненной работы:

1. Рекомендовано использование вируса гепатита А (штамм НА8-15) в качестве модельного вируса для определения вирулицидной активности ДС.

2. Рекомендовано применение в испытательных лабораториях при определении вирулицидной активности ДС в отношении ВГА комплексного подхода с определением антигенной активности ВГА в иммунологических реакциях и инфекционной активности ВГА в культуре клеток. Эти рекомендации включены в «Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств» МУ 3.5.243108.

3. Определен порядок обеззараживания различных эпидемиологически значимых объектов, контаминированпых ВГА, восемью новыми ДС на основе ЧАС. Отработанные режимы включены в инструкции по применению ДС для дезинфекции в лечебно-профилактических учреждениях, инфекционных очагах, на предприятиях общественного питания и коммунально-бытового обслуживания, в учреждениях образования, культуры, отдыха, спорта, социального обеспечения. Средства рекомендованы Роспотребнадзором для производства и применения в практике медицинской дезинфекции.

Внедрение результатов диссертационной работы в практику Результаты проведенных исследований нашли отражение при подготовке следующих нормативно-методических документов:

1. «Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств» МУ 3.5.2431-08.

2. Инструкции по применению ДС:

2.1. Инструкция по применению ДС «Септодор» № 001-2/2005 от 12.07.2005, Гос регистрация: № 77.99.1.2.У.8605.7.05. от 26.07.2005. Производитель: ОАО «Хэппи Дэй», г. Москва, ТУ 9392-001-45004662-2002.

2.2. Инструкция по применению ДС «Неоген-Супер» № 042-1/2007 от 12.09.2007. Гос регистрация: № 77.99.1.2.У.3078.4.08 от 18.04.2008. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-042-38965786-2007.

2.3. Инструкция по применению ДС «Эком» № 017-3/2007 от 07.09.2007. Гос. регистрация: № 77.99.36.2.У.2781.4.08 от 09.04.2008. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-017-38965786-2005.

2.4. Инструкция по применению ДС «Эком50» № 018-3/2007 от 07.09.2007. Гос. регистрация: № 77.99.1.2.У.2780.4.08 от 09.04.2008. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-018-38965786-2005.

2.5. Инструкция по применению ДС «Эком-50М» № 019-3/2007 от 07.09.2007. Гос. регистрация: № 77.99.36.2.У.2779.4.08 от 09.04.2008. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-019-38965786-2005.

2.6. Инструкция по применению ДС «Эком-25М» № 020-3/2007 от 07.09.2007. Гос. регистрация: •№ 77.99.1.2.У.2778.4.08 от 09.04.2008. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-020-38965786-2005.

2.7. Инструкция по применению ДС «Экопав» № 008-2/2005 от 29.10.2005. Гос. регистрация: № 77.99.1.2.У.12445.10.05 от 27.10.2005. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-008-38965786-2003.

2.8. Инстркуция по применению ДС «Новодез Форте» № 005-4/2005 от .05.09.2005. Гос. регистрация: № 77.99.19.2.УЛ 1536.10.05 от 11.10.2005. Производитель: ОАО НПО «Новодез», г. Москва, ТУ 9392-005-38965786-2002.

3. Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре дезиифектологии МПФ ППО ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы и публикации по теме диссертации

Материалы работы были доложены на VI Всероссийской научно-практической конференции - «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва, 2005 г., XV съезде Национальной организации дезинфекционистов, Москва, 2006 г., VII Российской научно-практической конференции с международным участием - «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика», Москва, 2007 г., Всероссийской научно-практической конференции, посвященой 75-летию Научно-исследовательского института дезиифектологии Роспотребпадзора - «Актуальные вопросы теории и практики дезиифектологии», Москва, 2008 г. Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Положения, выносимые на защиту.

1. Использование комплексного подхода к исследованию вирулицидпой активности ДС в отношении ВГА с применением методов ИФА и ПЦР. Применение модельных систем для исследования вирулицидной активности ДС в отношении ВГА при определении

антигенной активности ВГЛ в иммунологических реакциях, инфекционной активности ВГА в культуре клеток и на биологической модели - обезьянах-мармозетах.

2. Различия в устойчивости ВГА и полиовируса к ДС с различным композиционным составом.

3. Избирательное вирулицидное действие двух ЧАС - алкиддимстилбензиламмоний хлорида (АДБАХ) и алкилдиметшг(эгил)бензиламмоний хлорида (АДЭБАХ) в отношении ВГА и полиовируса.

4. Вирулицидное действие новых композиций на основе ЧАС и глутарового альдегида, высокоэффективных в отношении ВГА при низкой концентрации действующего вещества (ДВ). Зависимость вирулицидного действия ДС на основе ЧАС от их композиционного состава в отношении ВГА и полиовируса.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 58 источников, опубликованных в России, 57 зарубежных источника. Диссертация изложена на 224 страницах машинописного текста, иллюстрирована 61 таблицей и 9 рисунками.

Собственные исследования Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили ЧАС, которые в зависимости от их состава были условно распределены на четыре группы;

- I группа-ДС, в состав которых входит только одно ЧАС-АДБАХ.

- II группа - ДС, в состав которых входит два ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ. Эта группа была разделена на две подгруппы:

а) ДС, в состав которых входят АДБАХ и АДЭБАХ, с содержанием второго ЧАС мепее 10% (АДБАХ + АДЭБАХ<10%) от 5% до 10%.

б) ДС, в состав которых входят АДБАХ и АДЭБАХ с содержанием второго ЧАС более 20% (АДБАХ + АДЭБАХ>20%) от 20% до 25%.

- III группа - ДС, состав которых представлен также двумя ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ, но с другим количественным составом. Эта груша также была подразделена на две подгруппы:

а) ДС, содержащие АДБАХ и АДЭБАХ с общим содержанием ЧАС (АДБАХ + АДЭБАХ) <50% от 30% до 50%.

б) ДС, содержащие АДБАХ и АДЭБАХ с общим содержанием ЧАС (АДБАХ + АДЭБАХ)>50% от 50% до 70%.

- IV группа - ДС, состав которых представлен одним ЧАС - АДБАХ и глугаровым альдегидом (рис. I).

Были проведены исследования по изучению вирулицидной активности ДС с амфотерпыми ПАВ, входящими в каждую группу, а также хлорсодержащего средства хлорамин Б.

1. Алкилдиметилбензиламмоний хлорид (АДБАХ) СНЗ

[Я—N—СН2 — С6Н5]+ С1-,

СНЗ

где К - алкильпый радикал СпН2п+1, С12 ~ 75%, С14 ~ 25%

2. Алкилдаметил(этил)бетиламмопий хлорид (АДЭБАХ)

СНЗ

[К—М— СН2—С6Н5—С2Н5] + С1-

СНЗ

где Л -алкильный радикал СпН2п+1, С12 ~ 65%, С14 ~ 35%

3. глугаровый альдегид: НОС - (СН2)> - СОИ

4. хлорамин Б: СбН55 02К(КаС|)-Н20

Рис 1. Химическая структура АДБАХ, АДЭБАХ, глутарового альдегида и хлорамина Б.

Комплексный подход к изучению вирулицидиой активности современных ДС на

основе ЧАС в отношении ВГА заключался в использовании нативного ВГА, полученного

из фекалий больного ГА, и культуралыгого ВГА в вирусологических тестах и

иммунологических реакциях. Активность дезинфсктанта в отношении ВГЛ подтверждали или опровергали: 1) косвенным методом - определением в обработанном объекте антигенной активности вируса в иммунологических реакциях (ИФА) и сохранности вирусной РНК в ПЦР, 2) прямым методом - определением инфекционной активности нативпого ВГА при заражении биологической модели - обезьян-мармозет вида Callíthríx jacchus, семейства игрунковых и определение инфекционной активности культурального ВГА, адаптированного к росту в культуре клеток.

В работе использовали адаптированный к культуре клеток РНК-содерх<агций ВГА, штамм HAS-15. Для определения инфекционной активности ВГА при заражении культуры клеток 4647 использовали вирус с инфекционным титром не менее 6,0±0,5 lg / 1 мл. Клетки культивировали в среде роста, представляющей собой среду Игла MEM с двойным набором аминокислот с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), ипактивированной нагреванием до 56°С, с 2 мМ L-глутамипа и антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки выращивали в культуральных флаконах в термостате при +37°С. Жизнеспособность клеток определяли в камере Фукса-Розенталя. Конечная концентрация клеток при посеве составляла 1,4-1,5х105 клеток/мл, пересев клеток проводился на 21-28 сутки. Определение вирулицидной активности ДС и подтверждение снижения инфекционных свойств ВГА под их воздействием в культуре клеток проводили по методике определения инфекционного титра ВГА. Методика определения инфекционного титра основана на выявлении антигена ВГА при титровании методом конечных разведений. Инфекционный титр вычисляли по формуле Рида-Менча или по формуле Кербера.

Нативный вирус ГА был получен из фекалий больного ребенка за день до появления желтухи. В качестве образца для изучения влияния ДС на антигенную активность ВГА служила 10% водная суспензия фекалий. Все изоляты ВГА были аттестованы методом ИФА и имели показатель оптической плотности OD,#¿2,000, т.е. характеризовались высоким содержанием антигена.

Для постановки сравнительных экспериментов в качестве тест-вируса был использован вирус полиомиелита I типа (вакцинный штамм Sabin LSc-2ab) с титром не менее 106,5 ТЦИДзо / 1 мл. Полиовирус размножали в перевиваемой культуре клеток НЕр-2. Для получения вирусной суспензии культуру клеток, инфицированную полиовирусом на стадии 100% поражения монослоя трехкратно замораживали и оттаивали. После удаления разрушенных клеток пизкоскоростным центрифугированием полученную суспензию использовали в экспериментах.

Исследования вирулицидной активности ДС проводили в два этапа. На первом этапе определяли наличие вирулицидной активности ДС in vitro суспензионным методом или методом батистовых тест-объектов. Использовали два варианта суспензионного метода: вирус без органической нагрузки и вирус с органической нагрузкой. В экспериментах с ВГА в качестве органической нагрузки к вирусной суспензии добавляли СКРС (80%).

На втором этапе изучали вирулицщдаую активность ДС при обработке контаминированных ВГА и полиовирусом тест-объектов. Для выявления РНК ВГА пользовались методом ПЦР (набор фирмы «Амплисенс», Россия).

Проведены исследования по изучению влияния ДС на изменение инфекционной активности ВГА при заражении экспериментальных животных - обезьяц-мармозет. В работе использованы шесть мармозет вида Callithrix jacchus. Все животные рождены в неволе в колонии обезьян семейства игрунковых (Callitrichidae) в виварии Учреждения РАМН ИПВЭ им. М.П. Чумакова. Индикаторным ферментом при гепатите у мармозет являются - аланинамшштрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (ACT), изоцитратдегидрогеназа (ИЦД). Определение антител к ВГА класса Ig М проводили иа тест-системе «Вектогеп А класса IgM». Определение проводили в сыворотках крови зараженных обезьян кинетическим методом на биохимическом анализаторе VP Supersystem фирмы «Abbott» (США) с использованием диагностических наборов «Sigma». Для заражения животных был выбран нативный ВГА, выделенный от больного ГА. Определение антигена ВГА проводилось методом ИФА на тест-системе «Вектогеп А-антигсн - стрип». Результаты ИФА регистрировали спектрофотометрически на длине волны 450 нм. Учет оптической плотности выполняли на спектрофотометре MULTISCAN (Titertek, Финляндия).

Статистические методы

При обработке полученных результатов для подсчета ТЦИД50 или LDjo использованы методы полных кумулятивов Рида и Менча и определения «центральной величины» Кербера.

Результаты и их обсуждение

Применение современных методов лабораторных исследований дает возможность в

полном объеме определить вирулицидную активность дезинфектантов. Для определения

вирулицидной активности ДС в отношении вируса гепатита А впервые использован

комплексный подход, включающий прямые и косвенные методы исследования. Наличие

кулътуралькой модели и экспериментальных животных позволило объективно оценить

действие дезинфектанта па ВГА. После обработки вируссодержащего инокулята

раствором ДС признаком инактивации вируса было отсутствие репликации ВГА при заражении культуры клеток и развития экспериментальной ГА-инфекции у зараженных животных. Отсутствие РНК ВГА после обработки ДС служило дополнительным доказательством полной инактивации вируса. Применение ПЦР дало возможность дополнительно определить динамику изменений концентрации РНК ВГА. Этот подход позволяет выполнять дальнейшее исследование ДС с целью поиска новых соединений и создания на их основе средств с вирулицидной активностью в отношении ВГА [L. Leveque, J.M. Crance, С. Bcril, L. Schwartzbrod, 1995].

Проведены исследования влияния «модельного» дезинфсктанта на изменение инфекционной активности ВГА при заражении экспериментальных животных - обезьян-мармозет. Критериями острого гепатита у экспериментально зараженных обезьян считали повышение биохимических показателей в сыворотке крови (в процессе развития ипфекции повышенным считался уровень активности ферментов, превышающий фоповые значения не менее, чем в 2 раза), экскрецию ВГА с фекалетми и появление в крови вирусоспецифических IgM. Все животные бит разделены на три группы (по два животных в каждой группе): 1 группа - обезьяны, зараженные нативцым ВГА, не обработанным дезинфектантом; 2 группа - обезьяны, зараженные тем же вирусом, но уже обработанным дезинфектантом; 3 группа - контрольные обезьяны. Результаты

исследований представлены в таблице 1.

Х°№ групп/чем инфицирова ни №№ обезьян диагноз диагностические маркеры

анти-BHAIgM экскреция ВГА с фекалиями биохимиче ские показатели

I группа, ВГА, обработапны й дезинфектан том №1 острый гепатит + + +

№2 острый гепатит "бессимптомная форма" + - -

II группа, ВГА, обработанны й дезинфектан том №3 отсутствие гепатита _ _ _

№4 отсутствие гепатита - - +

III группа, контрольные обезьяны №5 отсутствие гепатита

№6 отсутствие гепатита - - -

Табл. 1. Экспериментальное заражение обезьян.

У обезьяны №1 из первой группы был отмечен подъем уровня активности всех трех биохимических показателей (AJIT, ЛСТ, ИЦД), превышающий фоновый уровень в 2 и более раз в конце первой и в течение второй недель после заражения. В процессе инфекции изменение активности ферментов совпадали по времени и коррелировали с другими диагностическими маркерами ГА. У данного животного на 5-6 день была обнаружена экскреция ВГА с фекалиями, апти-ВГА IgM в пробах сывороток крови выявлялись, начиная с 14-го дня после заражения. Перечисленные диагностические маркеры однозначно свидетельствовали о развитии инфекционного процесса, связанного с ГА у данного животного, являющиеся аналогом клинически выраженного заболевания. У обезьяны №2 из первой труппы инфекция проявилась в виде гуморального ответа. Анти-ВГА IgM выявлялись, начиная с 16-го дня после заражения. Инфекция, протекающая без повышения биохимических показателей и без экскреции ВГА, являлась аналогом бессимптомной формы инфекции. У двух обезьян из второй группы не было обнаружено «и анти-ВГА IgM, ни экскреции ВГА с фекалиями. Вышеперечисленные маркеры свидетельствовали об отсутствии инфекционного ГА-процесса у обезьян №3, Ns4. Контрольные обезьяны из третьей группы оставались серонегативными в отношепии ГА и по биохимическим показателям в пределах норм в течение всего срока эксперимента.

После этого были проведены исследования по изучению вируляцвдной активности ДС в отношепии вируса ГА и полиовируса.

Исследования проводили в следующих направлениях:

- сравнительное изучение вирулицидной активности ДС различного состава (разные комбинации ЧАС, ЧАС + глугаровый альдегид, хлорамин Б).

- изучение влияния амфотерпых ПАВ на вирулицидную активность ДС.

Все исследованные ДС на основе ЧАС были условно разделены на четыре группы по качественному составу и количеству ДВ.

I группа - АДБАХ(10%-50%)

II группа - АДБАХ + АДЭБАХ (5%-25%)

- На группа - АДБАХ + АДЭБАХ (5%-10%)

- Пб группа - АДБАХ + АДЭБАХ (20%-25%)

III группа - АДБАХ +АДЭБАХ (30%-70%)

- П1а группа - АДБАХ и АДЭБАХ (30%-50%)

- III6 группа - АДБАХ и АДЭБАХ (50%-70%)

IV группа - АДБАХ и глутаровый альдегид

Исследована вирулмшдная активность ДС на основе ЧАС и амфотерного поверхностно-активного вещества (ПАВ) кокоамидопропилбетаина в количестве 6%.

Кроме того, изучали активность одного хлорсодержащего ДС - хлорамина Б.

Исследования вирулицидной активности ДС на основе ЧАС с различным композиционным составом показали, что наиболее активными в отношении ВГА и полиовируса были средства с высоким содержанием в них АДБАХ (от 40%) и глутарового альдегида от (3% до 12,5%), относящиеся к IV группе. ДС, в состав которых входят АДБАХ и глугаровый альдегид вызывали полную инактивацию вируса ВГА при концентрации рабочего раствора 0,1% (по препарату) или 0,03% (по ДВ) - АДБАХ и времени экспозиции 60 мин, а полиовируса при концентрации рабочего раствора ДС 0,05% (по препарату) или 0,08% (по ДВ) - АДЭБАХ и времени экспозиции 60 мин. Из полученных результатов следует, что эти ДС более, чем в в два, четыре раза активнее в отношении полиовируса, чем в отношении ВГА, а также что ВГА значительно более устойчив по сравнению с полиовирусом к воздействию исследованных ДС (рис.2).

. '•"••ИШЬ.'.ЧПОЧ..

авй; •,<;. ■.-т^я»' -• •• л' ("'Увй'Л' <

36%АДБАХ, 16%АДЭБАХ и 3%ГА

37,5%АДБАХ и 12,5%ГА

40%АДБАХ и 11%ГА

□ ПВ ■ ВГА|

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 концентрация, %

Рис. 2. Вируяицидная концентрация ДС IV группы в отношении ВГА и полиовируса (время экспозиции 60 мин).

Следующим этапом исследований было сравнительное изучение вирулицидной активности ДС, относящихся к III группе (рис. 3). Состав ДС из ГО группы был представлен комплексом ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ в суммарной концентрации менее 50% (от 30% до 50%) и комплексом ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ в суммарной концентрации более 50% (от 50% до 70%). Данные ДС, в состав которых не входил

глугаровый альдегид, уступали по вирулицидной активности ДС из IV группы, включавшим наряду с ЧАС глугаровый альдегид.

Дезинфицирующие средства, композиционный состав которых представлен суммой ЧАС менее 50% обладали значительно (примерно в два раза) менее выраженными вирулицидными свойствами в отношении двух вирусов - ВГА и полиовируса. Средства этой группы инактивировали ВГА при концентрации раствора ДС 0,4% (по препарату) 0,18% (по ДВ), и времени экспозиции 60 мин а поляовирус - при концентрации 0,2% (по препарату) 0,09% (по ДВ) и времени экспозиции 60 мин. Сравнение результатов исследований вирулицидной активности позволило сделать вывод о том, что ДС III группы, так же, как и ДС IV группы, обладали при одинаковом времени экспозиции в два, четыре раза более выраженной активностью в отношении полиовируса, чем в отношении ВГА, и подтвердили, что ВГА более устойчив к действию ДС по сравнению с полиовирусом.

Анализ полученных данных позволяет сделать заключение о том, что на инактивацию ВГА оказывало влияние повышение общего процентного содержания ЧАС в препарате за счет увеличения концентрации первого компонента - АДБАХ. Дезинфицирующие средства, композиционный состав которых представлен суммой ЧАС более 50%, обладали значительно более выраженными вирулицидными свойствами в отношении обоих вирусов - ВГА и полиовируса. Они инактивировали ВГА при концентрации раствора ДС 0,2% (по препарату) 0,14% (по ДВ) и времени экспозиции 60 мин, а полиовирус - при концентрации в два раза меньшей, 0,1 % (по препарату) 0,07% (по ДВ) при том же времени экспозиции. Снижение общего количества ЧАС, но увеличение первого компонента ЧАС - АДБАХ, повышало инактивирующие свойства дезинфектанта в отношении ВГА. Дезсредства, относящиеся к III группе, обладали более выраженными вирулицидными свойствами в отношении полиовируса, чем ВГА.

53,80%(48,8%АДБАХ и 5%АДЭБАХ^в 64%(44%АДБАХ И 20%АДЭБАХ) Ця .¿.'у '■■•;!, к! I ШТВ ■ ВГА I

25%(20%АДБАХ и 5%АДЭБАХ) Цщ I

45%(35%АДБАХ и 10%АДЭБАХ) I

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 концентрация, %

Рис. 3. Вирулицидяая концентрация ДС ГО группы в отношении ВГА и полиовируса (время экспозиции 60 мин). -'

На основании проведенных исследований установлено, что ВГА более устойчив к действию ДС по сравнению с тест-вирусом - полиовирусом. Достоинством ДС П1 группы с композиционным составом ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ) менее 50% и более 50% является высокая вирулицидная активность в отношении ВГА при весьма низкой действующей концентрации (0,1%) рабочих растворов. Кроме того, преимуществом этих ДС является отсутствие раздражающего действия, совместимость с различными материалами, стабильность при хранении (до пяти лет), что обусловливает возможность их применения в лечебно-профилактических учреждениях, детских дошкольных учреждениях и т.д. в целях профилактики и борьбы с ГА.

Следующим этапом исследований было проведение сравнительного изучения вирулицидной активности ДС, относящихся ко II группе композиционных соединений. Во П группу вошли соединения, химический состав которых также представлен двумя ЧАС -АДБАХ и АДЭБАХ, причем второе ЧАС присутствовало в композициях в концентрации ' как менее 10%, так и более 20%. Изменение концентрации АДЭБАХ не оказывало заметного влияния на инактивацию ВГА (рис. 4). Полученные результаты позволили установить зависимость инактивации полиовируса от концентрации второго ЧАС -АДЭБАХ. Для инактивации полиовируса ДС с концентрацией АДЭБАХ менее 10% необходимо было повышение концентрации рабочего раствора до 0,8% (по препарату) при времени экспозиции 15 мин. При концентрации раствора 0,2% (по препарату) инактивация вируса происходила за 60 мин. Таким образом, уменьшение процентного

содержания АДЭБАХ в ДС приводило к снижению вирулицидной активности ДС в отношении полиовируса. Для инактивации ВГА по сравнению с инактивацией полиовируса была необходима более высокая концентрация раствора ДС 0,4% (по препарату) и увеличение времени экспозиции до 90 мин, что подтверждает более высокую устойчивость ВГА к ДС.

Мы также установили зависимость условий инактивации полиовируса от концентрации второго ЧАС - АДЭБАХ. ДС с содержанием АДЭБАХ более 20% инактивировапи полиовирус при концентрации раствора 0,1% (по препарату) и времени экспозиции 60 мин, при концентрации 0,2% (по препарату) через 30 мин. Таким образом, ДС с содержанием второго ЧАС - АДЭБАХ более 20% проявили значительно большую вирулицидную активность в отношении полиовируса. Инактивация ВГА наступала при концентрации раствора ДС 0,4% (по препарату) или 0,19% по ДВ и времени экспозиции 60 мин.

Из полученных результатов следует, что ДС, содержащие более 20% АДЭБАХ, в 4-8 раза активнее в отношении полиовируса, чем в отношении ВГА, а также что ВГА более устойчив по сравнению с пояиовирусом. В результате проведенных экспериментов также установлено, что с увеличением концентрации ЧАС с этильной группой (АДЭБАХ более 20%) повышалась вирулицидная активность ДС в отношении полиовируса Изменение концентрации АДЭБАХ не оказывало заметного влияния на инактивацию ВГА, но значительно повышало вирулицидную активность в отношении полиовируса. На рисунке 4 представлены результаты инактивации вирусов гепатита А и полиовируса ДС первой и второй подгруппами второй группы.

Концентрация ДВ для инактивации вируса за 60 минут

50%(25%АДБАХ и 25%АДЭБАХ) 66,5%(44,5%АДБАХ и 22%АДЭБАХ)

68%(44%АДБАХ и 24%АДЭБАХ) 40%(30%АДБАХи 10%АДЭБАХ) 45%(40%АДБАХ и 5%АДЭБАХ)

□ ПВ Я ВГА

53,75%(48,75%АДБАХ и 5%АДЭБАХ)

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 КОНЦЕНТРАЦИЯ, %

Рис. 4. Вирулицидная концентрация ДС в отношении ВГА и полиовируса первой и второй подгрупп II группы.

Следующее направление работы заключало а, в исследовании вирулицидной активности ДС (I группа) на основе только одного компонента ЧАС - АДБАХ (монопрепараты) в сравнении с ДС, вошедшими во вторую, третью и четвертую группы.

Показатель эффективности инактивации ВГА' составил 100% при концентрации раствора 0,3% (по препарату) и 0,15% (по ДВ), и времени экспозиции 60 мик. Исследованные ДС были в 1,6 раза активнее в отношении ВГА, чем в отношении полиовируса. Полиовирус при воздействии монопрепаратов, содержащих в своем составе только одно ЧАС (АДБАХ) (табл. 2) проявлял большую устойчивость по сравнению с ВГА, так как его инакгивировали растворы в концентрации 0,7% (по препарату) и экспозиции 60 мин. Отсутствие АДЭБАХ (с этилыюй группой) в составе ЧАС проявлялось снижением вируотщидной активности ДС в отношении полиовируса и требовало для его инактивации повышения концентрации растворов до 0,5% (по препарату), 0,25% (по ДВ) и времени экспозиции до 90 мин.

инактивация ВГА инактивация полиовируса

№ДС и состав концентрацш раствора по ДВ,% время, мин концентрация раствора поДВ,% время, мин

2{50%АДБАХ) 0,15 60 0,25 90

3-(37,5%АДБАХ) 0,15 60 0,26 60

4-{25%АДБАХ) 0,15 60 0,20 60

5-( 10% АДБАХ) 0,10 60 0,08 60

Табл. 2. Вирулицидная концентрация ДС в отношении ВГА и полиовируса I группы (монопрепараты на основе одного ЧАС - АДБАХ).

Снижение концентрации АДБАХ в ДС не оказывало существенного влияния на инактивацию полиовируса. Для инактивации полиовируса оптимальной концентрацией является 0,7% (по препарату) и время экспозиции 60 мип. В случае препаратов,

содержащих только АДБАХ, ВГА оказался менее устойчивым, чем полиовирус, ввиду отсутствия второго ЧАС - АДЭБАХ, максимально влияющего на инактивацию полиовируса (табя. 2). Для инактивации ВГА важным являлось увеличение концентрации АДБАХ в препарате, а отсутствие второго ЧАС - АДЭБАХ существенного влияния на инактивацию ВГА не оказывало, поэтому инактивация ВГА происходила при более низкой концентрации раствора - 0,3% (по препарату) через 60 мин, а инактивация полиовируса достигалась только при воздействии ДС в концентрации 0,5% через 90 мин или в концентрации 0,7% (по препарату) через 60 мин. В связи с этим, ДС второй группы проявили большую вирулицидную активность в отношении полиовируса по сравнению с ДС первой группы. Таким образом, для инактивации полиовируса следует использовать ДС на основе двух ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ), как наиболее активных средств.

Хотя в наши задачи не входило изучение влияния наличия этильной группы и ее концентрации на вирулицидную активность ДС на основе ЧАС, в ходе нашей работы мы пришли к выводу, что наличие этильной группы в составе ЧАС по-разпому влияет на инактивацию полиовируса и ВГА. Данный феномен указывает, что единственный модельный вирус не может быть основой адекватной системы испытания ДС. Особый интерес представляет фундаментальный аспект проблемы. До проведения данного исследования не было сообщений о том, что два кишечных пикорнавируса человека, обладающие очень сходными физико-химическими свойствами, могут так сильно различаться по чувствительности к ДС.

Полученные нами данные могут быть использованы для создания новых ДС, обладающих вирулипидпой активностью и разработки режимов их применения для инактивации ВГА и полиовируса при обеззараживании различных объектов, в том числе поверхностей в детских дошкольных и школьных учреждениях, лечебно-профилактических учреждениях, медицинского оборудования, предметов ухода за больными, контамипированных данными вирусами. В соответствии с основными положениями «Концепции профилактики ВБИ» (Минздрав РФ, 1999) перспективными средствами для дезинфекции изделий медицинского назначения являются композиции на основе ЧАС и альдегидов, так как, имея широкий спектр антимикробного действия, они обладают более щадящим действием на материал изделий, пе нарушают их функциональных свойств и позволяют использовать их для совмещенной в одном процессе дезинфекции и предстерилизационной очистки изделий медицинского назначения [В.Г. Акимкип, Л.С. Манькович, 2000].

Включение в состав восьми ДС на основе ЧАС амфотерного ПАВ кокоамидопропилбетаина улучшало моющие свойства ДС и усиливало инактивационные характеристики ДС за счет улучшения смачиваемости обрабатываемых поверхностей ДС. В композиции с ПАВ и глутаровым альдегидом ДС проявляли высокую вирулицидную активность. В отношении ВГА инактивация вируса комбинированными средствами достигалась уже в концентрации 0,1% (по препарату) через 60 мин и 0,2% (по препарату) через 30 мин, а в отношении полиовируса (ДС - 36% АДБАХ, 16% АДЭБАХ, 3% глутаровый альдегид) для инактивации требовалась концентрация 0,05% в течение 60 мин, 0,1%-30 мин, 0,3%-15 мин (по препарату). На основании результатов исследований считаем перспективным применение ДС па основе ЧАС в композициях с амфотерными ПАВ, что наряду с повышением вирулицидной активности позволяет сочетать дезинфицирующее действие с моющими свойствами.

Результаты экспериментального изучения вирулицидной активности дезинфектаптов подтвердили наше предположение о том, что включение ПАВ в рецептуру ДС несмотря па различное процентное содержание ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ ДС (60% комплекса ЧАС - 40%АДБАХ и 20%АДЭБАХ+ПАВ) инактивировало полиовирус при меньшей концентрации раствора - 0,1% (по препарату) и времени экспозиции 60 мин, а также при уменьшении времепи экспозиции доЗО мин для раствора 0,2% концентрации и до 15 мин для раствора 0,3% (по препарату) концентрации. Инактивация ВГА происходила при концентрации раствора ДС 0,4% (по препарату) и времени экспозиции 60 мин. ДС с составом (25% комплекс ЧАС - 20%АДБАХ и 5%АДЭБАХ+ПАВ) инактивировало полиовирус при 0,2% (по препарату) концентрации через 60 мин, ВГА в 0,4% - через 90 мин и 0,5% - через 60 мин. ДС с составом (66% комплекс ЧАС-46%АДБАХ и 20%АДЭБАХ+ПАВ) в 0,1% концентрации раствора через 60 мин инактивировало полиовирус, а в концентрации раствора 0,2% через 60 мин - происходила инактивация ВГА. Дезинфицирующее средство, состав которого представлен 52% комплексом ЧАС -36% АДБАХ и 16%АДЭБАХ+ПАВ, проявляло вирулицидную активность в концентрации 0,3% через 60 мин, в 0,6% через 30 мин в отношении полиовируса и в 0,4% концентрации через 90 мин в отношении ВГА. Таким образом, присутствие в этих ДС ПАВ кокоамидопропилбетаина в концентрации 6% (в пересчете на 100%-е вещество) повышало вирулицидные свойства ДС.

Сравнение результатов исследований вирулицидной активности ДС позволяет сделать

вывод о том, что ДС на основе ЧАС и глутарового альдегида (ЧАС+глутаровый альдегид)

обладают более выраженной - в 3 раза (по разнице в концентрации растворов ДС - 0,1% и

0,3%) активностью в отношении ВГА и в 4 раза (по разнице в концентрации растворов -0,05% и 0,2%) в отношении полиовируса при одинаковом времени экспозиции - 60 мин.

Нами было также проведено сравнительное изучение и дана оценка вирулицидной активности in vitro при инактивации ВГА и полиовируса не только ДС с различным композиционным составом ЧАС, а также хлорсодержащего средства хлорамина Б. Изучена. вирулицидная активность растворов хлорамина Б в отношении ВГА и полиовируса в концентрациях 1,0%, 2,5%, 3,0% (по препарату) при экспозиции 60 мин. По данным антигенной и инфекционной активности, после обработки ВГА растворами хлорамина Б оптическая плотность образцов по данным ИФА снижалась до уровня отрицательных контролей при концентрации раствора 3,0% и времени экспозиции 60 мин, что подтверждает его вирулицидиую активность. Установлено также, что полиовирус инактивируют растворы этого ДС в концентрациях 1,0% и 2,5% (по препарату) при экспозициях 60 и 30 мин, соответственно. Результаты сравнительного исследования вирулицидной активности ДС на основе ЧАС и хлорамина Б свидетельствуют о более высокой устойчивости к шш ВГА, чем полиовируса.

Исследованные ЧАС в виде новых ДС показали способность инакгивировать ВГА и полиовирус при низких концентрациях растворов и меньшем времени экспозиции, чем хлорамин Б. Изученные нами ДС на основе ЧАС обладают более выраженной вирулицидной активностью по сравнению с широко применяемым в дезинфекционной практике хлорамином Б. Преимуществом ДС на основе ЧАС является также то, что они не вызывают коррозии металлов, не обесцвечивают и не разрушают ткави после длительного применения, обладают моющими свойствами, хорошо растворяются в воде, что позволяет рекомендовать их для использования в целях дезинфекции.

Учитывая большой набор положительных физико-химических и потребительских свойств ЧАС, в частности, наличие у многих из них моющих свойств, позволяющих объединить в один этап дезинфекцию и мойку, они являются перспективными для разработки комплексных ДС, сочетающих, в том числе, ДВ из разных химических групп [Пантелеева Л.Г., Федорова JI.C., 1998 г.]

Таким образом, на основании полученных нами результатов исследований

вирулицидной акгивпости ДС в отношении ВГА установлено, что ВГА в достаточной

степени резистентен к ДС на основе ЧАС, комплекса ЧАС и глугарового альдегида, а

также к хлорамину Б. Кроме того, оценка активности дезинфектаптов в отношении ВГА

должна носить комплексный характер, предполагающий использование всех доступных

тестов, в первую очередь - культуралыгых исследований. Животная модель (обезьяны) не

могут быть рекомендованы для изучения вирулицидной активности ДС ввиду их высокой стоимости.

Исходя из этого, мы считаем необходимым применение комплексного подхода к изучению инактивирующего действия дезипфектантов на ВГА, дополнение к существующим рекомендациям по оценке вирулицидной активности ДС, и внесение корректив в методы оценки ДС, предназанченных для профилактики ГА. Считаем, что выбор ДС должен осуществляться с учетом данных рекомендаций и комплексной оценки свойств препаратов. Целесообразно включение ВГА (штамм HAS-15) в перечень тест-вирусов, используемых с целью исследования вирулицидной активности ДС, перспективных для дезинфекции при ГА.

Наши рекомендации включены в «Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств» МУ 3.5.2431-08, в которых наряду с тест-вирусами - полиовирусом, аденовирусом при определении вирулицидной активности ДС предложен ВГА (штамм HAS-15) в качестве тест-вируса.

На основании выполненных исследований разработаны и научно обоспованы режимы обеззараживания исследованными ДС эпидемиологически значимых объектов, коитаминированных ВГА. Роспотребнадзором разрешено производство и применение этих ДС в практике медицинской дезинфекции. Режимы обеззараживания различных объектов, коитаминированных ВГА, вошли в инструкции по применению восьми из изученных ДС.

Выводы

1. Разработан и использован комплексный подход к изучешпо вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении ВГА с применением следующих методов:

косвенного метода ИФА для определения снижения антигенной активности культурального и нативного вируса гепатита А и метода ПЦР для подтверждения сохранности вирусной РНК;

прямого метода исследования влияния ДС на инфекционную активность нативного ВГА in vivo в экспериментах па чувствительных лабораторных животных (обезьяны-мармозеты) с использованием высокочувствительных методов ИФА и ПЦР;

прямого метода исследования in vitro влияния ДС на инфекционную активность культурального ВГА в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (линия 4647).

2. Установлены различия в устойчивости ВГА и полиовируса к ДС, отличающихся по составу четвертичных аммониевых соединений. Для инактивации ВГА определяющим фактором является увеличение общей концентрации ЧАС в растворе ДС или увеличение концентрации алкилдиметилбензиламмоний хлорида, тогда как для инактивации полиовируса принципиальным является наличие в ■ составе ДС алкилдиметил(этил)бензиламмоний хлорида и его концентрации. Выявленная избирательная вирупицвдная активность имеет принципиальное значение при разработке новых ДС, активных в отношении ВГА и полиовируса.

3. Наиболее выражена вирулицидная активность в отношении ВГА и полиовируса композиционных ДС на основе ЧАС и глутарового альдегида. Именно такие средства могут быть в первую очередь рекомендованы для широкого применения в целях профилактики и борьбы с ГА.

4. Результаты сравнительного исследования вирулицидной активности ДС на основе ЧАС, а также ЧАС и глутарового альдегида, хлорамина Б свидетельствуют о более высокой устойчивости к ним ВГА, чем полиовируса. Целесообразно использование ВГА и включение его в перечень тест-вирусов, используемых при исследованиях вирулицидной активности ДС на основе различных ДВ.

5. Включение в состав ДС на основе ЧАС амфотерного ПАВ - кокоамидопропилбетаина повышает вирулицидную активность ДС в отношении ВГА и полиовируса в результате улучшения смачиваемости поверхности обрабатываемого объекта и контакта ДС с нанесенным на обрабатываемый объект вирусом.

6. На основании результатов изучения вирулицидной активности дезинфицирующих свойств новых рецептур ДС на основе ЧАС разработаны эффективные режимы обеззараживания различных объектов, контаминированных ВГА, которые включены в утвержденные инструкции по применению восьми ДС. Роспотребнадзором разрешен их выпуск и применение для дезинфекции в целях профилактики и борьбы с гепатитом А. Эти ДС включены в «Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию».

Практические рекомендации

1. Рекомендовано использование вируса гепатита А (штамм НАЭ-Н) в качестве модельного вируса для исследований вирулицидной активности ДС и включение его в «Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств» МУ 3.5.2431-08.

2. Рекомендован комплексный подход для применения в испытательных лабораториях

при исследованиях вирулицидной активности ДС в отношении ВГА с определением

антигенной активности ВГА в иммунологических реакциях и инфекционной активности ВГА в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (линия 4647).

3. Разработаны режимы обеззараживания различных эпидемиологически значимых объектов, контаминированных ВГА, семью новыми ДС на основе ЧАС. Даны рекомендации по применению новых ДС для дезинфекции в лечебно-профилактических учреждениях, инфекционных очагах, на предприятиях общественного питания и коммунально-бытового обслуживания, в учреждениях образования, культуры, отдыха, спорта, социального обеспечения, которые включены в инструкции по применению. Средства рекомендованы Роспотрсбнадзором для производства и применения в практике медицинской дезинфекции.

4. На основании наших исследований были рекомендованы и утверждены Роспотребнадзором новые ДС на основе ЧАС, обладающие высокой вирулицидной активностью в отношения ВГА, которые включены в утвержденные инструкции по их применению.

Публикации, содержащие основные научные результаты диссертации

1. Михайлов М.И., Замятина H.A., Элбакян P.M. Требования к дезинфектантам XXI века // Поликлиника. М., 2005. - № 4. - С. 16-17.

2. Замятина H.A., Элбакян P.M., Полещук В.Ф. Комплексная оценка вирулицидной активности дезинфектантов на вирус гепатита А // Медицинская вирусология. Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. - М., 2006. -Т. XXIII.-С. 137-141.

3. Замятина H.A., Элбакян P.M., В.В. Куприянов, В.Ф. Полещук, К.К. Кюрегян, Т.В. Гуляева, И.П. Титова, Л.И. Коновалова, Л.И. Николаева, Михайлов М.И.,. Комплексная оценка вирулицидной активности дезинфектантов на основе четвертичных аммониевых соединений в отношении вируса гепатита А // Эпидемиология и инфекционные болезни. М., 2007.-Na 1.-С. 37-41.

4. Элбакяп P.M., Замятина H.A., Вазыхова Ф.Г., Михайлов М.И. Влияние дезинфицирующих препаратов на основе ЧАС и хлора в отношении тест-вируса полиомиелита я вируса гепатита А // Актуальные вопросы теории и практики дезинфектологии. Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ дезинфектологии Роспотребнадзора. - М., 2008. - Т. I. - С. 195-198.

5. Элбакян P.M., Замятина H.A., Михайлов М.И., Кудрявцева Е.Е. Сравнительная характеристика дезинфицирующих средств на основе ЧАС с различным композиционным составом и хлорамина Б в отношении вирусов полиомиелита и гепатита А // Дезинфекционное дело. М., 2009. - № 1. - С. 35-39.

6. Замятина H.A., Элбакян P.M., Михайлов М.И. Устойчивость вируса гепатита А к физическим и химическим воздействиям /7 Дезинфекционное дело. М., 2009. - №3. - С. 6064.

Список сокращений

АДБАХ алкилдиметилбензиламмоний хлорид

АДЭБАХ алкилдиметил(этил)бензиламмоний хлорид

АЛТ аланинаминотрансфераза

ACT аспартатаминотрансфераза

ВГА вирус гепатита А

ГА гепатит А

ДВ действующее вещество

ДС дезинфицирующее средство

ИЦД изоцитратдегидрогеназа

ПАВ поверхностно-активное вещество

СКРС сыворотка крупного рогатого скота

ЧАС четвертичное аммониевое соединение

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Элбакян, Радмила Михайловна

Введение.

Часть 1. Обзор литературы.

Глава 1. Эпидемиологические закономерности распространения и особенности современного гепатита А.

1.2. Распространенность вируса гепатита А.

1.3. Патогенность вируса гепатита А, контактные механизмы передачи вируса и клинические проявления вирусной инфекции.

1.4. Характеристика вируса гепатита А и методы его выявления.

1.5. Физико-химическая характеристика вируса гепатита А.

1.6. Устойчивость вируса гепатита А и полиовируса к различным факторам внешней среды.

Глава 2. Современные средства дезинфекции при вирусных инфекциях и методы исследования вирулицидной активности дезинфицирующих средств.

2.1. Дезинфицирующие средства из группы ЧАС.

2.2. Культивирование вируса гепатита А и полиовируса.

Часть 2. Собственные исследования.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Характеристика вирусов - вируса гепатита А и полиовируса.

3.2. Характеристика клеточных культур и условия культивирования.

3.2.1. Приготовление и контроль рабочего банка культуры (4647).

3.2.2. Заражение культуры клеток для получения посевного штамма вируса гепатита А.

3.3. Используемая биологическая модель (лабораторные животные -обезьяны-мармозеты).

3.4. Этапы и методы получения вируса гепатита А из фекалий больного гепатитом А человека и экспериментально зараженных животных.

3.4.1. Обработка фекалий, подлежащих исследованиям.

3.4.2. Определение антигена вируса гепатита А методом ИФА.

3.4.3. Использование ИФА для определения инфекционного титра ВГА

3.5. Характеристика исследованных дезинфицирующих средств.

3.5.1. Основные этапы и методы изучения вирулицидной активности дезинфицирующих средств и субстанций.

Глава 4. Разработка комплексного подхода к изучению вирулицидной активности дезинфицирующих средств на основе ЧАС в отношении вирусов - полиомиелита и гепатита А.

4.1. Изучение влияния «модельного» дезинфектанта на антигенные свойства культурального вируса гепатита А.

4.2. Изучение влияния «модельного» дезинфектанта на антигенные свойства нативного вируса гепатита А.

4.3. Изучение влияния модельного дезинфектанта на инфекционную активность культурального вируса гепатита А.

4.4. Определение изменения инфекционной активности вируса гепатита А при заражении восприимчивых к гепатиту А лабораторных животных с применением высокочувствительных и специфических методов ИФА и ПЦР.

4.5. Изучение вирулицидной активности дезинфицирующего средства №1 при обеззараживании различных тест-объектов, контаминированных вирусом гепатита А.

4.6. Использование методики определения инфекционного титра ВГА для исследования вирулицидной активности средства №1 при обеззараживании различных тест-объектов.

Глава 5. Сравнительная характеристика вирулицидной активности композиций дезинфицирующих средств на основе ЧАС в отношении вирусов -гепатита А и полиовируса.

5.1. Изучение вирулицидной активности дезинфицирующих средств на основе ЧАС, относящихся к первой группе, в отношении вирусов - гепатита А и полиовируса.

5.2. Изучение вирулицидной активности дезинфицирующих средств на основе двух ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ), относящихся ко второй группе, в отношении вирусов - гепатита А и полиовируса

5.3. Изучение вирулицидной активности дезинфицирующих средств на основе ЧАС, относящихся к третьей группе, в отношении вирусов -гепатита А и полиовируса

5.4. Изучение вирулицидной активности дезинфицирующих средств на основе ЧАС и глутарового альдегида, относящихся к четвертой группе; в отношении вирусов - гепатита А и полиовируса.

Глава 6. Сравнительная характеристика вирулицидной активности дезинфицирующих средств на основе ЧАС, глутарового альдегида и «Хлорамина Б» в отношении двух вирусов - гепатита А и полиовируса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексный подход к изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении вируса гепатита A"

Актуальность темы

Одной из серьезных проблем здравоохранения остаются вирусные гепатиты. Актуальной, широко распространенной инфекцией по-прежнему является одна из форм вирусных гепатитов - энтеральный гепатит А (ГА).

Российская Федерация считается территорией, неблагополучной в отношении ГА. Интенсивная циркуляция вируса сочетается с достаточно крупной прослойкой восприимчивого населения. Периодические спады на отдельных территориях отражают лишь волнообразный характер эпидемического процесса, осложненного, к тому же, нарастанием в стране числа зарегистрированных чрезвычайных ситуаций как природного, так и техногенного характера [51].

Следует отметить, что в конце XX и начале XXI века проблеме гепатита А уделялось меньше внимания, чем другим вирусным гепатитам. Во многом это было связано с многолетним снижением заболеваемости ГА, которое отмечалось с середины 90-х годов двадцатого столетия. Однако в это время стал отмечаться сдвиг показателей заболеваемости на старшие возрастные группы, повышающий вероятность развития более тяжелых форм ГА. Смещение заболеваемости ГА на старшие возрастные группы объяснялось сокращением среди взрослых доли лиц с наличием антител к вирусу ГА в крови и увеличением, соответственно, лиц к этому вирусу, что является крайне неблагоприятным фактом [5, 13, 44]. В Санкт-Петербурге, по данным НИИЭМ им. Пастера, в возрастных группах 20-29 лет и 30-39 лет доля лиц с антителами к ВГА сократилась с 62- 64% в 1986-1999 гг. до 26,3% в 2003-2004 гг. [14]. Следует также иметь в виду, что явное смещение заболеваемости ГА в последние годы от детей 3-6 и 7-10 лет к более взрослым категориям населения (прежде всего в возрасте 15-19 и 20-29 лет) привело к тому, что это заболевание чаще протекает в клинически более выраженных формах, с большей частотой осложнений. При оценке широты распространения необходимо помнить, что на один случай заболевания, протекающего с желтухой, приходится, как минимум, пять случаев, протекающих без желтухи, которые не регистрируются. Г.Н. Кареткина с соавторами, характеризуя в 2005 году современные клинические особенности ГА, отметили новый облик «старой» болезни [26].

Как известно, фекально-оральный механизм передачи ГА реализуется в основном водным, пищевым и контактно-бытовым путями. Анализ информации, полученной с разных территорий Российской Федерации, свидетельствует об участившихся случаях возникновения водных и пищевых вспышек [54]. Как правило, загрязнение питьевой воды происходит в результате значительной изношенности и низкого эксплуатационного состояния водоочистных и канализационных систем, неудовлетворительного санитарного состояния объектов общественного питания и санитарного содержания территорий.

Наиболее неблагополучными по ГА остается ряд регионов Восточной Сибири, Дальнего Востока, Северного Кавказа, Центрального и Южного Урала, где показатели заболеваемости в 2 раза и более превышают средние значения по России. Наиболее высокие показатели наблюдаются в Тверской, Калининградской и Псковской областях, в Санкт-Петербурге, Карачаево-Черкесии, Тыве, Коми-Пермяцком и Эвенкийском автономных округах. В вспышках ГА, возникших в конце 2000 г. в г. Серпухове Московской области и г. Ртищево Саратовской области, пострадало свыше 300 человек. В первом полугодии 2005 года было зарегистрировано семь крупных вспышек этой инфекции. Вспышки гепатита А в основном носили пищевой характер. Среди них самая крупная пищевая вспышка зафиксирована в Тверской области (г. Ржев). Источником инфекции послужила газированная вода, заболело 669 человек. Вспышка заболевания гепатитом А была также зафиксирована среди работников магазинов "Пятерочка" в Санкт-Петербурге, где в результате потребления инфицированных салатов пострадали 109 человек. Наиболее масштабная вспышка, имевшая водный путь передачи инфекции, в Нижнем Новгороде в мае 2005 г., когда заболело около 3000 человек. Рост заболеваемости вирусным гепатитом А в 2005 году составил 20,3% [26].

Рост числа заболевших гепатитом А вызывает тревогу и в связи с тем, что во многих странах (и в России в том числе) имеется немало больных хроническими вирусными гепатитами В и С (в РФ около 5 млн. больных хроническим гепатитом В и 1,5 млн. больных хроническим гепатитом С). Их инфицирование вирусом ГА значительно активизирует патологический процесс в печени, заметно утяжеляет прогноз.

Еще один аспект проблемы ГА не может не привлекать к ней сегодня повышенного внимания. Хотя в настоящее время общепризнанно отсутствие у больных ГА формирования хронических форм (проф. Е.С. Кетиладзе считала гепатит А «приличной инфекцией»), высокие показатели заболеваемости среди работоспособного населения, возрастающая частота регистрации затяжных и рецидивирующих форм обусловливают также увеличение экономического ущерба, причиняемого ГА-инфекцией, ведут к очень большим экономическим затратам. В США, по данным F. Andreetal (2002) [59], эти затраты равны 480 млн. долларов в год, в России в 2000 году они составили 1,2 миллиарда рублей [51]. Полученные И.Л. Шаханиной экономические оценки свидетельствуют о приоритетности вклада ГА в суммарные потери от инфекционных болезней. (32,4 - экономический ущерб на 1 случай (тыс. руб.), число заболевших в 2004 г.- 43367, экономическая значимость (руб.) - 1405090800) [51].

На основании данных по заболеваемости вирусным гепатитом А можно более обоснованно и целенаправленно строить работу по профилактике гепатита А. При проведении работы по борьбе с ГА необходимо предусмотреть осуществление комплекса мер, которые должны быть направлены на:

1) воздействие на источники инфекции;

2) разрыв путей передачи вируса-возбудителя;

3) повышение невосприимчивости населения к вирусу ГА.

Комплекс мер по профилактике гепатита А среди населения представлен на рисунке 1.

Профилактика гепатита А

Рисунок 1. Комплекс мер по профилактике гепатита А [28].

Высокая заболеваемость гепатитом А и его социальная значимость определили надежные способы защиты от этой инфекции. Основными задачами по профилактике ГА в настоящее время являются проведение активного надзора за данной инфекцией, улучшение санитарно-коммунального благоустройства населенных мест. Как правило, загрязнение питьевой воды происходит в результате значительной изношенности и низкого эксплуатационного состояния водоочистных и водоканализационных систем, неудовлетворительного санитарного состояния объектов общественного питания и санитарного содержания территорий. Важным путем решения проблемы является создание иммунной прослойки среди определенных групп населения с помощью вакцинопрофилактики. На основании того, что известно о патогенезе ГА (длительный иммунитет после перенесенного заболевания, иммунитет за счет бессимптомных форм, протективное действие пассивной иммунизации материнскими антителами) можно рассчитывать на благоприятный эффект от массовой вакцинации против ГА. Ограниченный доступ вакцины ГА, в частности, из-за ее высокой стоимости, диктует необходимость тщательного подбора контингентов, подлежащих вакцинации [57]. Вместе с тем, отсутствие вакцинации в Российском календаре профилактических прививок и высокая цена препарата не позволяют контролировать эту инфекцию, снизив риск возникновения случаев гепатита А. Поэтому вакцинация не может являться единственно эффективным методом специфической профилактики ГА на данном этапе.

Наряду с активной и пассивной иммунизацией немаловажную роль в профилактике гепатита А играет «комплекс санитарно-гигиенических и дезинфекционных мероприятий, целью которых является разрыв механизма путей передачи инфекции» [19, 44, 45].

Немаловажное значение имеет своевременное проведение текущей и заключительной дезинфекции, направленной на инактивацию вируса гепатита А (ВГА).

Санитарно-эпидемиологическими правилами СП № 3.1.958-00 от 01.02.2000 «Профилактика вирусных гепатитов. Общие требования к эпидемиологическому надзору за вирусными гепатитами» определен основной комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий, которые направлены на эффективность надзора за объектами водоснабжения и канализования. Определены меры, направленные на профилактику кишечных инфекций и вирусного ГА [31].

Необходимым компонентом противоэпидемической работы является применение современных методов дезинфекции. Ставятся и решаются задачи по разработке новых эффективных и безопасных дезинфекционных средств, технологий их применения и оценки целевых результатов их влияния на состояние здоровья и заболеваемость людей. Одной из наиболее важных и актуальных задач дезинфектологии являются поиск и создание новых высокоактивных дезинфекционных субстанций, разработка на их основе высокоэффективных дезинфицирующих препаратов, а также научное сопровождение их производства. К числу рекомендованных и внедренных в практику дезинфектологических технологий относится применение препаратов, обладающих наряду антимикробными также моющими, чистящими, отбеливающими, дезодорирующими и другими полезными свойствами, что позволяет совмещать в один этап дезинфекцию и предстерилизационную очистку изделий медицинского назначения, а также дезинфекцию помещений с их уборкой. Такое совмещение достигаемых эффектов позволяет сокращать трудозатраты, время обработки и экономить средства.

В связи с этим важной задачей является широкое использование современных, высокоактивных дезинфектантов при проведении дезинфекции при гепатите А.

Цель работы

Целью работы является разработка комплексного подхода к изучению и оценке вирулицидной активности современных дезинфицирующих средств (ДС) на основе четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) в отношении вируса гепатита А.

Исходя из поставленной цели были определены следующие задачи: 1. Изучение влияния ДС на антигенную активность нативного ВГА из фекалий больных ГА людей, и культурального ВГА, адаптированного к культуре клеток почки зеленой мартышки (линия 4647).

2. Изучение модельных систем для исследования активности ДС в отношении ВГА:

2.1.Изучение влияния ДС прямым методом на инфекционную активность культурального ВГА в исследованиях in vitro в культуре клеток, адаптированной к ВГА.

2.2.Изучение влияния ДС прямым методом на инфекционную активность нативного ВГА, выделенного от больного ГА, в исследованиях in vivo с чувствительными лабораторными животными (обезьяны-мармозеты) вида Callithrix jacchus, семейства игрунковых - (Callitrichidae).

3. Сравнительный анализ вирулицидной активности ДС на основе ЧАС с различным композиционным составом с использованием 2-х вирусов in vitro: а) ВГА (штамма HAS-15) в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки 4647. б) вируса полиомиелита I типа (вакцинный штамм Sabin LSc-2ab) в перевиваемой культуре клеток НЕр - 2 (Cincinnati).

Научная новизна

1. Впервые в России разработан комплексный подход к изучению вирулицидной активности ДС в отношении ВГА путем определения его антигенной активности в иммунологических реакциях и инфекционной" активности в культуре клеток и на чувствительной биологической модели -обезьянах-мармозетах.

4. Обоснована необходимость включения ВГА (штамм HAS-15) в перечень тест-вирусов с целью определения вирулицидной активности дезинфицирующих средств широкого спектра действия. Практическая значимость Согласно результатам выполненной работы:

1. Рекомендовано использование вируса гепатита А (штамм HAS-15) в качестве модельного вируса для определения вирулицидной активности ДС.

3. Определен порядок обезараживания различных эпидемиологически значимых объектов, контаминированных ВГА, восемью новыми ДС на основе ЧАС. Отработанные режимы включены в инструкции по применению ДС для дезинфекции в лечебно-профилактических учреждениях, инфекционных очагах, на предприятиях общественного питания и коммунально-бытового обслуживания, в учреждениях образования, культуры, отдыха, спорта, социального обеспечения. Средства рекомендованы Роспотребнадзором для производства и применения в практике медицинской дезинфекции.

Положения, выносимые на защиту 1. Использование комплексного подхода к исследованию вирулицидной активности ДС в отношении ВГА с применением методов ИФА и ПЦР. Применение модельных систем для исследования вирулицидной активности ДС в отношении ВГА при определении антигенной активности ВГА в иммунологических реакциях, инфекционной активности ВГА в культуре клеток и на биологической модели - обезьянах-мармозетах.

2. Различия в устойчивости ВГА и полиовируса к ДС с различным композиционным составом.

3. Избирательное вирулицидное действие двух ЧАС -алкилдиметилбензиламмоний хлорида (АДБАХ) и алкилдиметил(этил)бензиламмоний хлорида (АДЭБАХ) в отношении ВГА и полиовируса.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Элбакян, Радмила Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Разработан и использован комплексный подход к изучению вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении ВГА с применением следующих методов: косвенного метода ИФА для определения снижения антигенной активности культурального и нативного вируса гепатита А и метода ПЦР для подтверждения сохранности вирусной РНК; прямого метода исследования влияния ДС на инфекционную активность нативного ВГА in vivo в экспериментах на чувствительных лабораторных животных (обезьяны-мармозеты) с использованием высокочувствительных методов ИФА и ПЦР; прямого метода исследования in vitro влияния ДС на инфекционную активность культурального ВГА в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (линия 4647).

2. Установлены различия в устойчивости ВГА и полиовируса к ДС, отличающихся по составу четвертичных аммониевых соединений. Для инактивации ВГА определяющим фактором является увеличение общей концентрации ЧАС в растворе ДС или увеличение концентрации алкилдиметилбензиламмоний хлорида, тогда как для инактивации полиовируса принципиальным является наличие в составе ДС алкилдиметил(этил)бензиламмоний хлорида и его концентрации. Выявленная избирательная вирулицидная активность имеет принципиальное значение при разработке новых ДС, активных в отношении ВГА и полиовируса.

3. Наиболее выражена вирулицидная активность в отношении ВГА и полиовируса композиционных ДС на основе ЧАС и глутарового альдегида.

Именно такие средства могут быть в первую очередь рекомендованы для широкого применения в целях профилактики и борьбы с ГА.

5. Включение в состав ДС на основе ЧАС амфотерного поверхностно-активного вещества (ПАВ) - кокоамидопропилбетаина повышает вирулицидную активность ДС в отношении ВГА и полиовируса в результате улучшения смачиваемости поверхности обрабатываемого объекта и контакта ДС с нанесенным на обрабатываемый объект вирусом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема вирусного гепатита А по-прежнему остается одной из актуальных для здравоохранения многих стран, в том числе и России. Увеличение количества регистрируемых случаев микст-гепатитов и тяжелых форм этих заболеваний, свидетельства о развитии фульминантных форм гепатита А, высокие показатели заболеваемости среди работоспособного населения, возрастающая частота регистрации затяжных и рецидивирующих форм, значительный экономический ущерб, причиняемый ГА инфекцией, подтверждает актуальность и практическую значимость проводенной нами работы.

Основными задачами по профилактике ВГА в настоящее время являются проведение активного надзора за данной инфекцией, улучшение санитарно-коммунального благоустройства населенных мест. Реализация в полном объеме комплекса мер по разрыву путей передачи вируса гепатита А дает возможность существенно влиять на эпидситуацию с этой инфекцией, добиться резкого уменьшения активности эпидемического процесса. Однако устранение недостатков в санитарно-коммунальном благоустройстве регионов страны требует немалого времени и значительных средств. В связи с этим важным путем решения проблемы является создание иммунной прослойки среди определенных групп населения с помощью вакцинопрофилактики при одновременном совершенствовании мер, направленных на улучшение санитарно-гигиенических условий жизни населения. На основании того, что известно о патогенезе ГА (длительный иммунитет после перенесенного заболевания, иммунитет за счет бессимптомных форм, зависимость невосприимчивости от наличия циркулирующих антител, протективное действие пассивной иммунизации материнскими антителами) можно рассчитывать на благоприятный эффект от массовой вакцинации против ГА всего восприимчивого населения или наиболее угрожаемых контингентов [4]. Существование высокоактивной вакцины против гепатита А позволяет создать протективный иммунитет более, чем на 20 лет. Быстрое появление анти-ВГА (у 95-99% вакцинированных к 14 дню от введения препарата) позволяет применять вакцинацию по экстренным показаниям [29]. Проведение такой работы позволяет снизить уровень последующих случаев гепатита А. Ограниченный доступ вакцины ГА, в частности, из-за ее высокой стоимости, диктует необходимость тщательного подбора контингентов, подлежащих вакцинации. Значение вакцинопрофилактики гепатита А очевидно. Вместе с тем, отсутствие вакцинации в Российском календаре профилактических прививок и высокая цена препарата не позволяют контролировать эту инфекцию, снизив риск возникновения случаев гепатита А. Поэтому вакцинация не может являться единственно эффективным методом специфической профилактики ГА. В профилактике ГА инфекции большую роль играет комплекс санитарно-гигиенических и дезинфекционных мероприятий, целью которых является разрыв механизма путей передачи инфекции [19, 45]. Немаловажное значение имеет своевременное проведение профилактической и очаговой - текущей и заключительной дезинфекции, направленной на инактивацию ВГА. Место дезинфекции (текущей и заключительной) в профилактике гепатита А четко определено в Санитарно-эпидемиологических правилах № 3.1.958-00 от 01.02.2000 «Профилактика вирусных гепатитов», действующих с 2000 г. [28].

Изучение устойчивости ВГА к ДС и разработка средств для обеззараживания различных эпидемиологически значимых объектов является одним из компонентов решения проблемы вирусного гепатита А. Исследования по изучению устойчивости ВГА к ДС необходимы для рациональной разработки противоэпидемических профилактических мероприятий при ГА инфекции. Применение современных средств дезинфекции является необходимым компонентом противоэпидемической работы. Следует отметить, что в последние годы количество дезинфектантов постоянно растет, появляются новые композиционные составы и формы дезинфицирующих препаратов. Ввиду того, что в настоящее время ГА представляет собой социально значимую инфекцию, использование дезинфектантов занимает важное место в системе профилактики и борьбы с ГА инфекцией, а дезинфекционные мероприятия являются важным компонентом неспецифических противоэпидемических мер борьбы с ГА.

Вопрос о выборе методов исследования действия ДС на вирус гепатита А являлся не решенной проблемой на протяжении многих лет. Концепция в отношении тестирования активности ДС в отношении вирусов гепатитов была сформулирована в Германии [111]. Этому вопросу была посвящена Межотраслевая международная конференция, состоявшаяся в октябре 1997 г. Было констатировано, что для обеспечения инфекционной безопасности пациентов и персонала лечебно-профилактических, детских дошкольных, школьных учреждений инструменты, а также поверхности эпидемиологически значимых объектов в вышеперечисленных учреждениях должны обрабатываться вирулицидными ДС. Для доказательства вирулицидности этих средств они должны подвергаться вирусологическому исследованию с измерением в оптимальных клеточных культурах остаточной инфекционности для подтверждения утраты вирусом способности внедрять в клетку свою генетическую информацию и размножаться в ней [48]. Было определено, что из всех вирусов гепатита простым количественным методом в клеточной культуре можно измерить инфекционность только вируса гепатита А [63, 92]. В соответствии с Европейским Стандартом EN 14476 [71] для оценки вирулицидной активности дезинфицирующих средств обязательным является испытание на модели [92] РНК-содержащего полиовируса 1-го типа (вакцинный штамм LSc2ab), который по своей устойчивости близок к ВГА и высокорезистентен к действию многих дезинфектантов [35, 79]. Общепринятым подходом к оценке активности дезинфектантов является использование «вирусов-моделей», которые в соответствии с современным уровнем знаний считаются репрезентативными для возможно большего спектра патогенных для человека видов вирусов, резистентных к физическим и химическим факторам [48]. Но ввиду того, что по параметрам устойчивости к физическим и химическим факторам [71] ВГА превышает вирус полиомиелита, возникла необходимость проведения сравнительных исследований по оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств, в частности малоизученной на вирулицидную активность группы ДС на основе четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) в отношении вируса гепатита А [94].

Изучение вирулицидной активности ДС в отношении ВГА и полиовируса были проведены согласно «Методическим рекомендациям по определению вирулицидной активности препаратов» № 1119-73 от 06.09.1973 г., утвержденные Минздравом СССР [23] и согласно «Методическим испытаниям дезинфицирующих средств для оценки их безопасности и эффективности» от 1998 г.

Для определения вирулицидной активности ДС в отношении вируса гепатита А впервые использован комплексный подход. Для определения вирулицидной активности ДС были использованы - культуральный вирус ГА (штамм HAS-15), адаптированный к культуре клеток 4647 и нативный вирус ГА, выделенный из фекалий больного ГА человека. Комплексный подход по изучению и оценке вирулицидной активности современных ДС на основе ЧАС в отношении ВГА заключался в определении изменений антигенной активности нативного и культурального ВГА в иммунологических реакциях. Изменение инфекционной активности ВГА при заражении культуры клеток и восприимчивых к ГА лабораторных животных (обезьяны мармозеты) исследовали с применением высокочувствительных и специфических методов ИФА и ПЦР. Применение современных методов лабораторных исследований позволило объективно оценить вирулицидную активность дезинфектантов. Эта оценка носит комплексный характер, предполагающий использование всех доступных методов, в первую очередь - культуральных исследований [29]. Самыми надежными методами, подтверждающими инактивацию вируса, является вирусологический и биологический. Активность дезинфектантов в отношении ВГА подтверждали или опровергали либо на чувствительной к ВГА культуре клеток, либо на обезьянах-мармозетах вида Callithrix jacchus семейства игрунковых (Callitrichidae). Наличие культуральной модели позволяет объективно оценить действие дезинфектанта на вирус ГА. Подтвердить эффективность избранных режимов обработки разных объектов исследуемым дезинфектантом позволило проведение экспериментального воспроизведения гепатита А на обезьянах в опытах in vivo [28]. При обработке вируссодержащего инокулята дезинфицирующим раствором в рабочей концентрации с последующим заражением культуры клеток и обезьян, в культуре клеток не происходило репликации ВГА, а у зараженных животных - развития экспериментальной ГА-инфекции. Вирулицидную активность дезинфектантов в отношении ВГА подтверждали или опровергали, используя две группы методов: 1) прямым методом in vitro исследования влияния ДС на инфекционную активность к ВГА в экспериментах в культуре клеток (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки - линия 4647), адаптированной к ВГА и прямым методом исследования влияния ДС на инфекционную активность нативного ВГА in vivo в экспериментах с чувствительными лабораторными животными (обезьяны-мармозеты) и 2) косвенными методами (иммуноферментным анализом и полимеразной цепной реакцией). В работе был использован прием определения антигенной активности ВГА и методический прием, определяющий изменение инфекционной активности ВГА под воздействием различных концентраций ДС. Все образцы, полученные в опытах, были исследованы методом ИФА, а затем ПЦР, который является более чувствительным, чем метод ИФА. Отсутствие РНК ВГА после обработки ДС служило доказательством полной инактивации вируса. В тоже время, наличие вирусного генома не обязательно свидетельствует о сохранении патогенных свойств вируса, так как особенностью метода ПЦР является то, что в качестве генетического материала для репликации может быть использован деструктивный биологический материал. Метод ПЦР не позволяет объективно оценить, потерял ли вирус инфекционные свойства [84, 86]. С другой стороны, применение ПЦР дает возможность определить динамику изменения концентраций РНК ВГА. Это обстоятельство требует дальнейшего расширения исследований среди дезинфекционных средств с целью поиска новых соединений и создания на их основе дезсредств с вирулицидной активностью в отношении ВГА [85].

При определении вирулицидной активности ДС и подтверждения снижения инфекционных свойств ВГА под их воздействием в культуре клеток 4647 применяли методику определения инфекционного титра ВГА. Она основана на выявлении антигена ВГА методом ИФА. Предварительно в экспериментах in vitro проводили титрование методом конечных разведений и наблюдали снижение инфекционной активности ВГА при заражении культуры клеток 4647. Титр вируса определяли в единице объема вируссодержащего материала до и после обработки растворами ДС. Инфекционный титр вычисляли по методу Рида и Менча (приложение 3). Исходный титр вируссодержащего инокулята, используемого для заражения, составлял 6,5-6,0 lg. Показателем вирулицидной активности ДС являлась скорость инактивации, представляющая собой соотношение концентрации вируса, выраженное в десятичных логарифмах, до и после воздействия ДС за определенный промежуток времени (экспозиция). Степень снижения вирусной инфекционности вычисляли в десятичных логарифмах. Вирулицидное ДС должно подавлять инфекционность вируса ГА (то есть степень инактивации должна быть на исследуемых объектах 100%).

Нами изучены 34 ДС на основе ЧАС в отношении ВГА. Проведены исследования по изучению вирулицидной активности in vitro и эффективности ДС при обеззараживании различных объектов, контаминированных данным вирусом. В сравнительных экспериментах эти же средства были изучены и в отношении вируса полиомиелита. Все эксперименты проводились в единых стандартизированных условиях с соблюдением: времени экспозиции, концентрации и температуры растворов ДС. Все опыты повторялись не менее трех раз при получении одинаковых результатов.

Проведен сравнительный анализ вирулицидной активности ДС на основе ЧАС с различным композиционным составом в отношении ВГА и полиовируса.

Все исследованные ДС на основе ЧАС условно поделены на четыре группы по количеству действующего вещества. В целях изыскания ДС, обладающих вирулицидной активностью в отношении ВГА и полиовируса, мы остановили свой выбор на пяти соединениях из группы ЧАС, в состав которых входит лишь одно ЧАС - АДБАХ (I группа). Исследовали семь средств, содержащих ЧАС - АДЭБАХ (менее 10%) и пять средств, содержащих АДЭБАХ, но более 20% (II группа). Исследовали четыре средства, содержащих в своем составе общего количества ЧАС — АДБАХ и АДЭБАХ (менее 50% - от 30% до 50%), девять средств, содержащих в своем составе общее количество ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ (более 50%) (III группа) и три средства, в состав которых включен комплекс ЧАС (АДБАХ) и глутаровый альдегид (IV группа), а также одно хлорсодержащее ДС (хлорамин Б). Данные средства изучены на вирулицидную активность в отношении ВГА. Кроме того, эти средства исследованы на вирулицидную активность в отношении полиовируса. В доступной литературе не удалось найти публикации об устойчивости ВГА к ЧАС. Мы впервые провели исследования по изучению вирулицидной активности ДС на основе ЧАС в отношении ВГА и полиовируса. Определили разницу в устойчивости данных вирусов к ДС на основе ЧАС. Впервые использовали комплексный подход к изучению данной проблемы. Первое практическое знакомство с препаратом группы «Септодор» на основе ЧАС произошло в 1996 году в стационаре Главного военного клинического госпиталя им. академика Н.Н. Бурденко. Было исследовано действие препарата на госпитальный штамм S. typhimurium (стойкий очаг нозокомиального сальмонеллеза). Применение 1% раствора хлорамина или 3% раствора перекиси водорода не давало положительных результатов, и для инактивации S typhimurium требовались 3% раствор хлорамина и 5% раствор перекиси водорода с экспозицией 40-60 минут. «Проводимые дезинфекционные мероприятия являлись крайне трудоемкими, не безвредными для больных и сотрудников, экономически не выгодными» [1]. Препарат на основе ЧАС в концентрации 0,05% обеспечивал гибель возбудителя нозокомиального сальмонеллеза на объектах в течение 10-20 минут. Препарат был экономичен, удобен в использовании и мог применяться в присутствии больных. Это средство является препаратом выбора при использовании его для целей профилактической дезинфекции и текущей дезинфекции, оптимален при использовании его для предстерилизационной очистки медицинского инструментария, изделий медицинского назначения, эндоскопической техники, проведения генеральных уборок, заключительной дезинфекции.

Исследования вирулицидной активности ДС на основе ЧАС с различным композиционным составом показали, что наиболее активными в отношении ВГА и полиовируса были соединения с высоким содержанием в них АДБАХ и глутарового альдегида - ДС (от 40%АДБАХ и от 3% до 12,5% глутарового альдегида), относящиеся к четвертой группе. Интерес к данной группе соединений был обусловлен наличием у ДС не только высокой вирулицидной, но и широкого спектра антимикробной активности, в частности спороцидной, невысокой токсичности. В результате проведенного нами скрининга ДС были выбраны наиболее эффективные в отношении инактивации вируса ГА и полиовируса средства на основе ЧАС и глутарового альдегида. При тестировании вирулицидных свойств ДС на основе ЧАС и глутарового альдегида в отношении ВГА и полиовируса исследовали их зависимость от концентрации ДВ - ЧАС и глутарового альдегида, времени экспозиции (табл. 58, рис. 7). ДС, в состав которых входят АДБАХ и глутаровый альдегид вызывали полную инактивацию вируса полиомиелита при концентрации рабочего разведения ДС 0,05% и времени экспозиции 60 мин (по препарату) и (0,008% по ДВ - АДЭБАХ), а ВГА при концентрации рабочего разведения ДС 0,1% и времени экспозиции 60 мин (по препарату) и (0,03% по ДВ - АДБАХ). Из полученных результатов следует, что эти ДС в 2 раза активнее в отношении полиовируса, чем ВГА, а также, что ВГА более устойчив по сравнению с вирусом полиомиелита.

Данные, приведенные в таблицах 58-59, подтверждают наличие высокой вирулицидной активности исследованных ДС, относящихся к четвертой группе соединений, против ВГА и полиовируса на различных объектах и при различных способах обработки (протирание, погружение).

Следующим этапом работы было сравнительное исследование вирулицидной активности и эффективности ДС, относящихся к третьей группе композиционных соединений. Состав ДС третьей группы был представлен комплексом ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ в суммарной концентрации, близкой к 50%, но менее 50% (от 30% до 50%) и комплексом ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ в суммарной концентрации, близкой к 50%, но более 50%. Данные ДС, в состав которых не входил глутаровый альдегид, уступали по вирулицидной активности ДС из четвертой группы (включающей наряду с ЧАС глутаровый альдегид).

Дезинфекционные средства, композиционный состав которых представлен суммой ЧАС менее 50% обладали менее (в 2 раза) выраженными вирулицидными свойствами в отношении двух вирусов - ВГА и полиовируса. ДС №18-45%ЧАС (35%АДБАХ и 10%АДЭБАХ) -ннактивировало ВГА при концентрации раствора ДС 0,4% и времени экспозиции 60 мин (по препарату) и (0,18% по ДВ), а полиовирус - при концентрации 0,2% и времени экспозиции 60 мин (по препарату) и (0,09% по ДВ). Сравнение результатов исследований вирулицидной активности ДС №18 позволяет сделать вывод о том, что данное ДС на основе ЧАС обладает более выраженной - в два раза (по разнице в концентрации растворов ДС -0,4% и 0,2%) активностью в отношении вируса полиомиелита при одинаковом времени экспозиции - 60 мин. Инактивация вируса полиомиелита в отличие от ВГА происходила при увеличении концентрации раствора и уменьшении времени экспозиции: 0,3% через 30 мин, 0,6% через 15 мин (табл. 51-53). Инактивация ВГА средством №24, композиционный состав которого представлен суммой ЧАС 52% (36%АДБАХ и 16%АДЭБАХ), происходила при концентрации рабочего разведения ДС 0,4% и времени экспозиции 90 мин (концентрация раствора по ДВ - 0,20%-90мин); полиовируса - при концентрации 0,2% через 90 мин (концентрация раствора по ДВ - 0,10%-90 мин) (табл. 54-55). Из полученных результатов следует, что это ДС №24 в 2 раза активнее в отношении полиовируса, чем ВГА, а также, что ВГА более устойчив по сравнению с вирусом полиомиелита.

Снижение концентрации первого компонента ЧАС - АДБАХ в ДС от 49,5% - №29, композиционный состав: 55,5%ЧАС (49,5%АДБАХ и 6%АДЭБАХ) до 30% - №26 (55%ЧАС-30%АДБАХ и 25%АДЭБАХ) вызывало инактивацию ВГА в концентрации 0,3% и времени экспозиции 60 мин (концентрация по ДВ - 0,16%-60 мин), 0,4% и времени экспозиции 30 мин (концентрация по ДВ - 0,20%-30 мин), 0,4%-90 мин (концентрация по ДВ - 0,20%-90 мин), 0,5%-60 мин (конц. по ДВ - 0,27%-60 мин), соответственно (табл. 57). Инактивация вируса полиомиелита происходила при меньшей, чем для ВГА, концентрации растворов этих двух ДС - 0,2% и времени экспозиции 60 мин (0,11%-60 мин по ДВ) (ДС №29) и 0,1%-60 мин (0,05%-60 мин по ДВ) (ДС №26) так как содержание второго ЧАС в ДС №26 было 25%. Снижение концентрации первого компонента ЧАС - АДБАХ не влияло на инактивацию вируса полиомиелита.

Дезинфицирующие средства, композиционный состав которых представлен суммой ЧАС более 50%, обладали более (в 2 раза) выраженными вирулицидными свойствами в отношении обоих вирусов — ВГА и полиовируса. Для инактивации ВГА значимым является увеличение общей концентрации ЧАС в препарате за счет повышения концентрации первого компонента ЧАС. ДС, содержащие в своем составе комплекс ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ), обладали наиболее выраженными вирулицидными свойствами в отношении ВГА и полиовируса при увеличении общей концентрации ЧАС. ДС №28 - 67,5% ЧАС (45,5%АДБАХ и 22%АДЭБАХ) инактивировало ВГА при концентрации раствора 0,2% и времени экспозиции 60 мин (по препарату) и (0,13% по ДВ), а полиовирус - при концентрации раствора в два раза меньшей - 0,1% и времени экспозиции 60 мин (по препарату) и (0,06% по ДВ). ДС №18 - 45%ЧАС (35%АДБАХ и 10%АДЭБАХ) инактивировало ВГА при концентрации раствора 0,4% и времени экспозиции 60 мин (конц. по ДВ - 0,18%-60 мин), а инактивация вируса полиомиелита происходила при концентрации раствора также в два раза мпеныней - 0,2% и времени экспозиции 60 мин (конц. по ДВ - 0,09%-бОмин), при концентрации 0,3% через 30 мин (0,14%-30 мин по ДВ) и 0,6% через 15 мин (0,27%-15мин) (табл. 57). Для инактивации вируса полиомиелита возможно было сокращение времени экспозиции до 15 мин. Для инактивации ВГА вирулицидно активным и эффективным считались ДС, обеспечивающее инактивацию вируса при времени воздействия не менее 60 мин. ДС №18 инактивировало ВГА и полиовирус при концентрации раствора в два раза меньшей 0,2% и времени экспозиции 60 мин. (табл. 52).

В результате наших экспериментов было установлено также, что ДС, содержащие в своем составе комплекс ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ) более 50%, обладали более (в 2 раза) выраженными вирулицидными свойствами в отношении ВГА и полиовируса. Так, ДС №27, композиционный состав которого представлен суммой ЧАС более 50% - а именно 70%ЧАС (46%АДБАХ и 24%АДЭБАХ) ннактивировало ВГА при концентрации раствора ДС 0,2% и времени экспозиции 60 мин (0,14%-60 мин по ДВ), а полиовирус - при концентрации в два раза меньшей 0,1% при том же времени экспозиции (0,07%-60 мин по ДВ) (табл. 57).

Анализ полученных данных позволяет сделать заключение о том, что на инактивацию ВГА оказывало влияние повышение общего процентного содержания ЧАС в препарате за счет увеличения концентрации первого компонента — АДБАХ. Снижение общего количества ЧАС, но увеличение первого компонента ЧАС-АДБАХ, повышало инактивирующие свойства дезинфектанта в отношении ВГА. Так, например, ДС №23 - 66%ЧАС (46%АДБАХ и 20%АДЭБАХ) ннактивировало ВГА при концентрации раствора 0,2% и времени экспозиции 60 мин (конц. по ДВ - 0,13%-60 мин) (табл.57). Однако ДС №27 ннактивировало ВГА при концентрации раствора 0,2% и времени экспозиции 60 мин (0,14%-60 мин по ДВ) (табл. 57). Уменьшение общего процентного содержания ЧАС в ДС не влияло на снижение вирулицидной активности дезинфектанта. Не возникало необходимости повышения времени экспозиции и процентного содержания раствора ДС, влияющего на инактивацию ВГА, из-за присутствия в данном ДС (№23 и №27) первого компонента ЧАС - АДБАХ в высоком процентном содержании (46%). Установлено, что увеличение содержания первого компонента ЧАС - АДБАХ, повышало эффективность дезинфектантов в отношении ВГА. Например, ДС №25, состав которого представлен -64%ЧАС (44%АДБАХ и 20%АДЭБАХ) ннактивировало ВГА при концентрации раствора 0,3% и времени экспозиции 60 мин (по ДВ - 0,2%-60 мин) (табл. 57). ДС №22 с композиционным составом - 53,80%ЧАС (48,8%АДБАХ и 5%АДЭБАХ) инактивировало ВГА при концентрации ДС 0,3% и времени экспозиции 60 мин (по ДВ - 0,16%-60 мин) (табл. 57). В результате присутствия в ДС №22 первого компонента ЧАС - АДБАХ в высоком процентном содержании - 48,80%, чем в ДС №25 - 44% АДБАХ, нет необходимости повышать время экспозиции - 60 мин и процентное содержание раствора ДС, вызывающего инактивацию ВГА. Ввиду этого, концентрации растворов ДС №22 и №25 и время экспозиции, необходимые для инактивации ВГА, одинаковы - 0,3% через 60 мин.

На основании проведенных исследований установлено, что ВГА более устойчив в сравнении с тест-вирусом - вирусом полиомиелита, а также, что для инактивации ВГА важным является увеличение общей концентрации ЧАС в ДС за счет увеличения концентрации первого компонента ЧАС -АДБАХ.

Достоинства предложенной в данной работе серии ДС с композиционным составом ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ) менее и более 50%, а именно высокая вирулицидная активность в отношении ВГА при весьма низкой действующей концентрации (0,1%), и вытекающая из этого экономическая целесообразность применения - отсутствие раздражающего действия, совместимость с различными материалами, стабильность при хранении (до пяти лет) обусловливают возможности их применения в лечебно-профилактических учреждениях, детских дошкольных учреждениях в целях профилактики и борьбы с ГА.

Следующим этапом работы было проведение сравнительного исследования вирулицидной активности и эффективности ДС, относящихся ко второй группе композиционных соединений. Во вторую группу вошли соединения, химический состав которых представлен двумя ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ. Второе ЧАС было представлено в композиции в концентрации менее 10% и более 20%. В результате проведенных исследований установлена зависимость инактивации вируса полиомиелита от концентрации второго ЧАС - АДЭБАХ. Для инактивации вируса полиомиелита ДС с концентрацией второго ЧАС менее 10% необходимо было повышение концентрации раствора до 0,8% и времени экспозиции до 15 мин (табл. 42). Уменьшение процентного содержания АДЭБАХ в ДС вызывало снижение вирулицидной активности ДС в отношении полиовируса. Инактивация вируса полиомиелита ДС с АДЭБАХ менее 10% происходила при концентрации раствора 0,2% и времени экспозиции 60 мин (табл. 41, ДС №8 и табл. 42, ДС №6). Параллельно были проведены исследования по изучению вирулицидной активности ДС с содержанием второго ЧАС-АДЭБАХ менее 10% и в отношении инактивации ВГА. Изменение концентрации АДЭБАХ не оказывало влияния на инактивацию ВГА. Для инактивации ВГА по сравнению с инактивацией полиовируса необходима была большая концентрация раствора ДС и увеличение времени экспозиции (0,4% через 90 мин), что подтверждало более высокую устойчивость вируса гепатита А к ДС по результатам ИФА и инфекционной активности в культуре клеток (табл. 40, рис. 6, ДС №8). Несмотря на низкое содержание АДЭБАХ в композициях ДС №6, №7, №8, №9, №10, №11, №12, исследованные ДС оказались эффективными в низких концентрациях (0,2% и времени экспозиции 30 мин). Для инактивации ВГА, нанесенного на тест-объекты, требовалось изменение режимов обеззараживания в сторону подъема концентрации раствора ДС и времени экспозиции. Режимы дезинфекции, применяемые для инактивации вируса полиомиелита, не подходили для инактивации ВГА, судя по результатам ИФА в иммунологических реакциях и определению инфекционной активности в культуре клеток (табл. 44). При воздействии всех исследованных соединений инактивация ВГА проходила при более высокой концентрации ДС и требовала увеличения времени экспозиции. Инактивация полиовируса наступала при концентрации раствора 0,3% и времени экспозиции 30 мин и при концентрации 0,2% через 60 мин, а для полной инактивации ВГА необходимо было увеличение концентрации раствора до 0,4% и времени экспозиции до 90 минут. В (табл. 45) представлены результаты изучения вирулицидной активности ДС, в состав которых входит комплекс ЧАС -АДБАХ+(АДЭБАХ в концентрации менее 10%), в отношении двух вирусов -ВГА и полиовируса.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было установлено, что ВГА является более резистентным к ЧАС, чем полиовирус. Следовательно, для инактивации ВГА требуются более высокие концентрации ДС и время экспозиции (табл. 43).

По результатам проведенных исследований была установлена зависимость инактивации вируса полиомиелита от концентрации второго ЧАС - АДЭБАХ (табл. 46, ДС №14). ДС с АДЭБАХ более 20% инактивировали вирус полиомиелита при концентрации раствора 0,1% и времени экспозиции 60 мин, 0,2% через 30 мин (табл. 46). ДС с содержанием второго ЧАС -АДЭБАХ более 20% проявили большую вирулицидную активность в отношении инактивации вируса полиомиелита за счет присутствия этильной группы в концентрации более 20%, инактивировали вирус полиомиелита при более низкой концентрации раствора ДС - 0,1% и времени экспозиции 60 мин в отличие от ДС с содержанием АДЭБАХ менее 10% (0,2% через 60 мин, 0,3% через 30 мин). Инактивация ВГА наступала при концентрации раствора ДС 0,4% и времени экспозиции 60 мин (конц. по ДВ - 0,19%-60 мин) (табл. 48, ДС №14). Из полученных результатов следует, что ДС, содержащие АДЭБАХ более 20%, в 4 раза активнее в отношении полиовируса, чем ВГА, а также, что ВГА более устойчив по сравнению с вирусом полиомиелита. Изменение концентрации АДЭБАХ не оказывало влияния на инактивацию ВГА (табл. 49). ДС с содержанием второго ЧАС -АДЭБАХ более 20% проявили большую вирулицидную активность в отношении инактивации вируса полиомиелита за счет присутствия этильной группы в концентрации более 20%.

В результате проведенных экспериментов установлено, что с увеличением концентрации рабочих растворов ЧАС с этильной группой (АДЭБАХ более 20%) повышалась вирулицидная активность ДС в отношении инактивации вируса полиомиелита (инактивация проходила при 0,05% через 60 мин). Снижение концентрации АДЭБАХ (менее 10%) в ДС приводило к увеличению концентрации раствора и времени экспозиции (инактивация происходила при 0,4% через 60 мин, объясняющих вирулицидное действие дезинфектанта). Полученные данные свидетельствуют о том, что ДС, относящиеся ко второй группе (АДЭБАХ более 20%), в 8 раза активнее в отношении инактивации полиовируса, чем ДС, относящиеся к первой группе (АДЭБАХ менее 10%).

Полиовирус оказался менее резистентным к дезинфектантам по сравнению с ВГА. Так, 0,1% растворы ДС с содержанием второго ЧАС более 20% инактивировали вирус полиомиелита за 60 мин. Для инактивации ВГА необходимо было увеличение концентрации ДС в пять раз до 0,5% и при том же времени экспозиции - 60 мин. Следовательно, увеличение процентного содержания АДЭБАХ в ДС приводило к снижению как времени экспозиции, так и концентрации раствора ДС для инактивации полиовируса.

Была исследована вирулицидная активность и эффективность ДС на основе только одного компонента ЧАС - АДБАХ (монопрепараты) в сравнении с ДС, вошедшими во вторую, третью и четвертую группу. Отсутствие в составе второго ЧАС - АДЭБАХ (с этильной группой) влияло на снижение вирулицидной активности ДС в отношении вируса полиомиелита (табл. 27, ДС №2), и требовало повышения концентрации растворов до 0,5% и времени экспозиции 90 мин (по препарату) и (0,25% по ДВ). Показатель эффективности для ДС №3 в отношении инактивации ВГА составил 100% при концентрации раствора 0,4% и времени экспозиции 60 минут (по препарату) и (0Д5% по ДВ) (табл. 25, ДС №3). ДС №2 в 1,6 раза активнее в отношении инактивации ВГА, а ДС №2 в 1,7 раза активнее в отношении инактивации ВГА, чем в отношении инактивации полиовируса.

Снижение общего процентного содержания ЧАС в ДС №4 (25%АДБАХ) в отличие от ДС №3 (37,50% А ДБ АХ) влияло на повышение концентрации раствора ДС №4 (0,6%) в отличие от ДС №3 (0,4%), необходимой для инактивации ВГА. Полиовирус при воздействии монопрепаратов, содержащих в своем составе только одно ЧАС (АДБАХ), проявлял большую устойчивость по сравнению с ВГА - 0,7%-60 мин (табл. 31).

Хотя в наши задачи не входило изучение влияния наличия этильной группы и ее концентрации на вирулицидную активность ДС на основе ЧАС, в ходе нашей работы мы пришли к выводу, что наличие этильной группы влияло на инактивацию полиовируса. На основании этого мы разделили все исследованные ДС на четыре группы согласно их композиционному составу. Наши данные могут быть использованы для дальнейшего изучения вирулицидной активности ДС и рекомендации их для инактивации вируса ГА и полиовируса при обеззараживании поверхностей в детских дошкольных и школьных учреждения, лечебно-профилактических учреждениях, медицинского оборудования, предметов ухода за больными, контаминированных данными вирусами.

Обобщая результаты исследований ДС, являющихся монопрепаратами, в состав которых вошло одно ЧАС - АДБАХ с разным процентным содержанием (№2 - 50%АДБАХ, №3 - 37,5%АДБАХ, №4 - 25%АДБАХ, №5 - 10%АДБАХ) установлено, что снижение концентрации АДБАХ в ДС не оказывает существенного влияния на инактивацию полиовируса. Для инактивации полиовируса рекомендовано использовать оптимальную концентрацию 0,7% и время экспозиции 60 мин для ДС №3. ДС №5 (10%АДБАХ) инактивировало вирус полиомиелита при концентрации 2,5%-60 мин. Несмотря на отсутствие ЧАС с этильной группой (АДЭБАХ), ДС №3 оказалось более вирулицидно активным (в 1,75 раза) в отношении инактивации ВГА, чем полиовируса. По инактивационным свойствам ВГА оказался менее устойчивым, чем полиовирус, ввиду наличия в ДС компонента ЧАС - АДБАХ и отсутствие второго компонента ЧАС -АДЭБАХ, влияющего на инактивацию полиовируса. Для инактивации ВГА важным являлось увеличение концентрации АДБАХ в препарате, а отсутствие второго ЧАС - АДЭБАХ существенного влияния на инактивацию ВГА не оказывало, и поэтому инактивация ВГА проходила при более низкой концентрации раствора - 0,3% через 60 мин, а отсутствие в этих препаратах второго ЧАС - АДЭБАХ приводило к инактивации полиовируса, которая наступала при воздействии ДС в концентраци 0,5% через 90 мин, 0,7%-60 мин, 1,0%-60 мин, 2,5%-60 мин (табл. 38). Доказательством влияния на вирулицидную активность ДС этильной группы (АДЭБАХ), входящей в композицию, являются результаты сравнения ДС второй группы «а» подгруппы с ДС первой группы. Ввиду отсутствия АДЭБАХ в монопрепаратах первой группы инактивация вируса полиомиелита происходила при концентрации раствора по ДВ - 0,25% (по препарату от 0,5% до 2,5% через 90 и 60 минут, соответственно) в зависимости от общего процентного содержания АДБАХ в ДС (табл. 38). Для инактивации полиовируса необходимо было изменить концентрацию раствора по препарату в сторону увеличения (от 0,5% через 90 минут до 2,5% через 60 минут). Включение в рецептуру ДС на основе ЧАС АДЭБАХ даже в малых концентрациях - от 5% до 8% повышало вирулицидную активность ДС в отношении полиовируса, что проявлялось по снижению концентрации растворов (по препарату) 0,2% и 0,3% при экспозиции через 60 и 30 минут, соответственно, до 0,04%-0,16% (по ДВ). В связи с этим ДС второй группы проявили большую вирулицидную активность в отношении полиовируса по сравнению с ДС первой группы. Для инактивации вируса полиомиелита рекомендуется использовать ДС на основе двух ЧАС (АДБАХ и АДЭБАХ), как наиболее эффективных средств.

Инактивация ВГА определяется наличием в ДС первого компонента ЧАС - АДБАХ. Снижение его концетрации в ДС влияет на вирулицидные свойства средства в отношении инактивации ВГА (табл. 38). Однако, присутствие в ДС двух ЧАС - АДБАХ и АДЭБАХ улучшает вирулицидную активность ДС в отношении инактивации ВГА за счет повышения общей концентрации (табл. 49). Это обстоятельство позволяет использовать для инактивации ВГА растворы в меньшей концентрации по ДВ, например, до 0,07% в ДС №8 и до 0,06% в ДС №9 (табл. 49). Концентрация раствора составляет (по препарату) 0,4% при экспозиции 90 минут для ДС №8 и 9 (количество АДБАХ в этих средствах - 17,5% и 15%), соответственно. В отличие от ДС №4 (количество АДБАХ в ДС 25%) инактивация ВГА происходит при воздействии раствора в концентрации 0,6% (по препарату) и экспозиции 60 минут или в концентрации 0,15% по ДВ. Несмотря на низкое содержание АДБАХ в ДС №8 и 9, инактивация ВГА этими ДС идет при меньшей концентрации раствора - 0,4% (по препарату) и 0,07% и 0,06% (по ДВ), при экспозиции 90 минут, чем ДС №4, которое инактивирует ВГА раствором в концентрации по препарату 0,6% через 60 минут и концентрации по ДВ - 0,15%. ДС №20 с содержанием АДБАХ в концентрации 20% инактивирует ВГА при концентрации раствора 0,4% (по препарату) через 90 минут, 0,5% через 60 минут (0,1% и 0,125% по ДВ, соответственно), а ДС №4 с содержанием АДБАХ - 25% (табл. 38) инактивирует ВГА при концентрации раствора 0,6% (по препарату) через 60 минут (по ДВ - 0,15%). Увеличение общей концентрации ЧАС в ДС за счет повышения концентрации первого компонента ЧАС - АДБАХ влияет на снижение концентрации раствора по препарату и времени экспозиции в отношении инактивации ВГА. ДС №30 с содержанием АДБАХ - 50% при общей концентрации ЧАС - 58% инактивирует ВГА при концентрации раствора по препарату - 0,3% через 60 минут, а ДС №18 с содержанием АДБАХ - 35% инактивирует ВГА тоже при концентрации 0,3% через 60 минут (концентрация по ДВ - 0,10%), несмотря на снижение концентрации АДБАХ в ДС №18 в отличие от ДС №2 (50% АДБАХ), которое также инактивирует ВГА при концентрации раствора по препарату 0,3% через 60 минут (концентрация по ДВ - 0,15%), хотя концентрация АДБАХ в ДС №2 находится в высоком процентном содержании. ДС №3 с содержанием АДБАХ - 37,5% (табл. 38) инактивирует ВГА при концентрации раствора по препарату - 0,4% через 60 минут (по ДВ - 0,15%). То есть, снижение концентрации АДБАХ в ДС №2 и 3 (с 50% до 37,5%) влияет на инактивацию ВГА, вызывая постепенное увеличение концентрации раствора по препарату в отличие, например, от ДС №18 с содержанием АДБАХ в 35% концентрации, которое инактивирует ВГА при 0,3% через 60 минут. Несмотря на снижение концентрации АДБАХ в данном ДС оно проявило большую вирулицидную активность в отношении инактивации ВГА в результате присутствия АДБАХ ДС в виде композиции на основе двух ЧАС. Именно ДС с композиционным составом ЧАС более эффективны в отношении инактивации вирусов - ГА и полиомиелита. В связи с этим ДС на основе двух компонентов ЧАС, а именно, ДС второй группы в отличие от ДС первой группы могут быть в первую очередь рекомендованы для инактивации ВГА и полиовируса, так как проявляют большую вирулицидную активность.

На основе полученных результатов можно сделать вывод о том, что вирус гепатита А менее устойчив к действию дезифектантов, в состав которых входит только одно ЧАС - АДБАХ, чем вирус полиомиелита I типа, вакцинный штамм LSc-2ab, так как для его инактивации (ВГА) требуется подбор более низкой концентрации раствора ДС.

Несмотря на присутствие в ДС только одного ЧАС - АДБАХ, ДС, относящиеся к первой группе ЧАС, обладают вирулицидной активностью и в отношении ВГА и вируса полиомиелита (табл. 38).

Изучение динамики инактивации вирусов - гепатита А и полиовируса ДС, в состав которых вошло одно ЧАС, показало, что несмотря на низкое содержание АДБАХ, они оказались эффективными при довольно низком содержании ДВ - ЧАС (10%АДБАХ).

Включение в состав ДС на основе ЧАС амфотерных ПАВ (ДС №9, №13, №14, №17, №24, №25, №28, №29) улучшало моющие свойства ДС и усиливало инактивационные характеристики ДС за счет улучшения смачиваемости обрабатываемых поверхностей ДС. В композиции с ПАВ и глутаровым альдегидом ДС проявляли высокую вирулицидную активность при инактивации ВГА (0,1%-60 мин, 0,2%-30 мин) и в отношении инактивации полиовируса (ДС №33) (0,05%-60 мин, 0,1%-30 мин, 0,3%-15 мин). В настоящее время перспективным считается применение ДС на основе ЧАС в композициях с амфотерными ПАВ, что позволяет сочетать процессы обеззараживания с моющим действием. Кроме того, они не обладают летучестью, не опасны при ингаляционном воздействии и могут применяться в присутствии пациентов [1]. В соответствии с основными положениями «Концепции профилактики ВБИ» (Минздрав РФ, 1999) лучшими средствами для дезинфекции изделий медицинского назначения являются композиции на основе ЧАС и альдегидов, так как, имея широкий спектр антимикробного действия, они обладают наиболее щадящим действием на материал изделий, не нарушают их функциональных свойств, позволяют использовать их для совмещенной в одном процессе дезинфекции и предстерилизационной очистки изделий [1]. Результаты экспериментального изучения вирулицидной активности дезинфектантов подтвердили наше предположение о том, что включение ПАВ в рецептуру ДС несмотря на различное процентное содержание компонентов ЧАС

АДБАХ и АДЭБАХ ДС №14 (60% комплекса ЧАС - 40%АДБАХ и 20%АДЭБАХ+ПАВ) ннактивировало вирус полиомиелита при меньшем рабочем разведении ДС 0,1% и времени экспозиции 60 мин, а также при уменьшении времени экспозиции 0,2%-30 мин; 0,3%-15 мин. Инактивация вируса ГА происходила при концентрации раствора ДС 0,4% и времени экспозиции 60 мин, №20 (25% комплекс ЧАС - 20% А ДБ АХ и 5%АДЭБАХ+ПАВ) ннактивировало вирус полиомиелита при 0,2% через 60 мин, ВГА - 0,4% через 90 мин; 0,5% через 60 мин; №23 (66% комплекс ЧАС-46%АДБАХ и 20%АДЭБАХ+ПАВ) - 0,1% через 60 мин при инактивации вируса полиомиелита и 0,2% через 60 мин - происходила инактивация ВГА, №24 (52% комплекс ЧАС - 36% АДБАХ и 16%АДЭБАХ+ПАВ) - 0,3% через 60 мин, 0,6% через 30 мин в отношении инактивации вируса полиомиелита и 0,4% через 90 мин в отношении инактивации ВГА. Присутствие в этих средствах добавок в виде ПАВ - кокоамидопропилбетаина (в пересчете на 100%-е вещество) улучшало вирулицидные свойства ДС.

Нами было проведено сравнительное изучение и дана оценка вирулицидной активности in vitro ДС при инактивации ВГА и полиовируса не только с различным композиционным составом ЧАС, но и на основе хлорсодержащего средства хлорамина Б.

Изучена вирулицидная активность растворов хлорамина Б (ДС №34) в отношении ВГА и полиовируса в концентрации 1,0% и при экспозиции 60 мин, а также 2,5% и 3,0% концентраций при экспозиции 60 мин. По данным антигенной и инфекционной активности после обработки ВГА растворами хлорамина Б оптическая плотность (OD) образцов по данным ИФА снижалась до уровня отрицательных контролей при концентрации раствора 3,0% и времени экспозиции 60 мин, что подтверждает его вирулицидную активность. Установлено также, что вирус полиомиелита инактивируют растворы этого ДС в концентрациях 1,0% и 2,5% при экспозициях 60 и 30 мин, соответственно (табл. 60).

Инактивация культурального и нативного ВГА по результатам антигенной активности в ИФА, а также и по результатам исследований инфекционной активности (при заражении культуры клеток линии 4647) происходила ДС №31 при концентрации раствора 0,1% через 30 мин. Установлено, что растворы ДС №31 (40% А ДБ АХ и 11% глутаровый альдегид) в концентрации 0,05% при экспозиции 60 мин инактивировали полиовирус, о чем судили по отсутствию цитопатогенного действия в культуре клеток (табл. 60).

При исследовании вирулицидной активности растворов ДС на основе двух ЧАС (ДС №23) инактивация ВГА и полиовируса происходила при концентрациях 0,2% и времени экспозиции 60 мин и 0,3% и времени экспозиции 30 и 60 мин, соответственно.

По данным антигенной и инфекционной активности инактивация ВГА наблюдалась только при обработке поверхностей раствором в 0,3% концентрации и времени экспозиции 60 мин. Инактивация полиовируса происходила при концентрации в 1,5 раза меньшей концентрации раствора ДС - 0,2% при экспозиции 60 мин и при 0,3% концентрации при экспозиции 30 мин (то есть, при времени в два раза меньшем).

Сравнение результатов исследований вирулицидной активности ДС позволяет сделать вывод о том, что ДС на основе ЧАС и глутарового альдегида (ЧАС+глутаровый альдегид) обладают более выраженной - в 3 раза (по разнице в концентрации растворов ДС - 0,1% и 0,3%) активностью в отношении ВГА и в 4 раза (по разнице в концентрации растворов - 0,05% и 0,2%) в отношении полиовируса при одинаковой экспозиции - 60 мин.

Результаты сравнительного исследования вирулицидной активности ДС на основе ЧАС и хлорамина Б свидетельствуют о более высокой устойчивости к ним ВГА, чем полиовируса.

Исследования вирулицидной активности ДС на основе ЧАС показало, что они обладают способностью инактивировать высокорезистентный к действию дезинфектантов и различных физических агентов ВГА. ЧАС в виде новых ДВ показали способность инактивировать ВГА и полиовирус при низких концентрациях и меньшем времени экспозиции в тех ДС, в которых они не являются монопрепаратами, а представлены комплексами, состоящими из двух ЧАС, а также ЧАС и глутарового альдегида.

Критерием выбора ДС на основе ЧАС и глутарового альдегида явились высокие антимикробные свойства [21]. Вирулицидную активность определяет качественный состав ЧАС, входящих в комплекс. Учитывая большой набор положительных физико-химических и потребительских свойств ЧАС, в частности, наличие у многих из них моющих свойств, позволяющих объединить в один этап дезинфекцию и мойку поверхностей, предметов и оборудования, дезинфекцию и предстерилизационную очистку изделий медицинского назначения, они являются перспективными для разработки комплексных ДС, сочетающих, в том числе, ДВ из разных химических групп. Основным направлением совершенствования ДС на основе ЧАС является создание препаратов, имеющих более экономичные рабочие концентрации и не обладающие недостатками существующих кислородсодержащих и хлорактивных средств [35].

Интерес к ЧАС связан с персперктивами создания на их основе выскоэффективных малотоксичных ДС для применения не только в учреждениях здравоохранения, но и в детских школьных и дошкольных учреждениях. За рубежом ЧАС начали активно использовать еще с середины прошлого века для обработки кожи рук медицинских работников, операционного поля [16, 109].

В нашей работе были показаны преимущества дезинфицирующих композиций, в частности, возможность взаимного усиления действия компонентов, заключающееся в повышении биоцидной активности препарата при использовании комплекса ЧАС с различной химической структурой [109].

Ранее были исследованы ДС с композиционным составом, в которых ЧАС представляются незаменимыми ингредиентами: они снижают общую токсичность растворов, расширяют спектр биоцидного действия, придают композиции дополнительные полезные свойства без увеличения нагрузки на рецептуру [16].

Изученные нами ДС не основе ЧАС обладали более выраженной вирулицидной активностью по сравнению с широко применяемым в дезинфекционной практике хлорамином Б. Преимущества ДС на основе ЧАС не вызывают коррозию металлов, не обесцвечивают и не разрушают ткани после длительного применения, обладают моющими свойствами, хорошо растворяются в воде, что позволяет рекомендовать их для использования в целях дезинфекции.

ДС на основе хлорсодержащих соединений также обладают выраженными вирулицидными свойствами, на протяжении многих лет использовались и используются в настоящее время при проведении противоэпидемических мероприятий. Многочисленные исследования свидетельствуют о негативной тенденции влияния хлорсодержащих дезинфицирующих средств на здоровье населения и окружающей среды [46]. Степень опасности токсического воздействия хлорсодержащих веществ в настоящее время приобретает все большую актуальность в связи с изменением социально-экономических условий, с обострением санитарно-эпидемиологической обстановки и недостаточной организацией и проведением дезинфектологического надзора за состоянием эпидемиологически значимых объектов и окружающей среды [58, 99]. Выраженные негативные проявления ограничивают их использование в практическом здравоохранении. Растворы их нестабильны, в сточных водах не разлагаются, а образуют устойчивые галогенорганические соединения, представляющие опасность (канцерогенны, мутагенны, тератогенны.) Они вызывают разрушение медицинской аппаратуры и предметов быта [18, 33,

35, 36, 38, 47, 75]. Бесконтрольное применение дезинфекционных препаратов на основе хлора способствует широкому загрязнению окружающей среды.

По сравнению с хлорсодержащими и перекисными ДС, которые в настоящее время продолжают применяться в дезинфекционной практике, средства на основе ЧАС более эффективны при меньших концентрациях, обладают менее выраженным запахом. Учитывая большой набор положительных физико-химических и потребительских свойств ЧАС, в частности, наличие у многих из них моющих свойств, позволяющих объединить в один этап дезинфекцию и мойку, они являются перспективными для разработки комплексных ДС, сочетающих, в том числе, ДВ из разных химических групп [35].

На основании проведенных нами исследований вирулицидной активности ДС в отношении ВГА установлено, что наибольшей активностью обладают дезинфектанты, состав которых представлен ЧАС и глутаровым альдегидом. Достоинствами альдегидов являются щадящее действие на объекты и антимикробная активность в отношении всех видов и форм микроорганизмов за счет алкилирования амино-, карбоксильных и сульфгидрильных групп протеинов, других органических соединений и подавления синтеза последних [15]. Доказательством вирулицидности ДС на основе ЧАС, протестированных в нашей работе, явилось снижение инфекционной активности вируса гепатита А до нулевых значений (lg=0) в оптимальных клеточных культурах, а также отсутствие маркеров ГА инфекции у экспериментально зараженных обезьян. Вирусы были использованы с максимальным титром (6,5-6,0 lg), так как чем он выше, тем более точные результаты в экспериментах.

Модельным объектом для ВГА является вирус полиомиелита, который по своей устойчивости близок к ВГА и высокорезистентен к действию многих дезинфектантов. Вместе с тем, полученные нами результаты позволяют утверждать, что по некоторым показателям ВГА более устойчив.

На основании проведенных нами исследований и полученных результатов можно сделать вывод, что ВГА в достаточной степени резистентен к применяемым в дезинфекции средствам. Это явление можно объяснить наличием органических веществ в вируссодержащей надосадочной жидкости в приготовленных фекальных экстрактах. В фекалиях больных ГА вирус находится в белковом субстрате, защищающем его от воздействия ДС. Поэтому можно считать условия наших опытов по изучению устойчивости ВГА к ДС с использованием в качестве вируссодержащего материала фекальных экстрактов более близкими к существованию возбудителя в очагах инфекции.

На основании данных научной литературы и проведенного анализа ДС, установлено, что на фоне значительного роста количества ДС наибольшей популярностью при создании новых ДС пользуются - ЧАС, амины и как самостоятельные ДВ, так и в составе композиционных препаратов [15]. Высокая вирулицидная ативность указанных композиций и невысокая токсичность этих дезнфектантов позволили рекомендовать их для практического применения.

Всего в России зарегистрировано около 500 дезинфицирующих препаратов, выпускаемых отечественными и зарубежными предприятиями. Согласно существующим требованиям современные дезинфектанты должны обладать высокой вирулицидной активностью, безопасностью для людей, экологической безопасностью, отсутствием разрушающего действия на обеззараживаемые объекты.

Способность ВГА в течение длительного времени [12] сохранять инфекционные свойства [99, 114] на различных объектах внешней среды [16, 17, 72], а также его более высокая устойчивость к действию физических и химических агентов по сравнению с вирусом полиомиелита определяют необходимость проведения исследований по определению вирулицидной активности дезинфектантов непосредственно на ВГА [98]. Оценка дезинфектанта должна носить комплексный характер, предполагающий использование всех доступных тестов, в первую очередь - культуральных исследований.

Исходя из этого считаем необходимым применение комплексного подхода при изучении инактивирующего действия на ВГА дезинфектантов, пересмотр существующих правил оценки вирулицидной активности дезинфектантов, предназанченных для профилактики ГА. Выбор оптимальных дезинфицирующих средств должен осуществляться с учетом данных рекомендаций и комплексной оценки свойств препаратов. Целесообразно использование ВГА и включения его в перечень тест-вирусов, используемых при исследованиях вирулицидной активности ДС.

Результаты исследований учтены при разработке Методических указаний по изучению и оценке вирулицидной активности ДС.

На основании наших исследований были рекомендованы и утверждены Роспотребнадзором новые ДС (8) на основе ЧАС, обладающие высокой вирулицидной активностью в отношении ВГА, которые включены в утвержденные инструкции по применению.

Разработаны и научно обоснованы режимы обеззараживания исследованными ДС эпидемиологически значимых объектов, контаминированных ВГА (табл. 23, 27, 34, 37, рис.7).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Элбакян, Радмила Михайловна, Москва

1. Акимкин В.Г., Манькович Л.С. Перспективность комплексного использования дезинфицирующих препаратов группы «Септодор» в крупном стационаре Главный военный клинический госпиталь им. ак. Бурденко Н.Н. // Дезинфекционное дело. 2000. № 3. - С. 26-27.

2. Балаян М.С., Анджапаридзе А.Г., Тольская Е.А., Колесникова М.С. О возможности воспроизведения инфекции вируса гепатита А в клеточных системах // Вопросы Вирусологии. 1979. № 6. - С. 675-676.

3. Балаян М.С. Вирусный гепатит А // ВНИИМИ. 1983. № 4. - С. 13-55.

4. Балаян М.С., Полищук В.Ф. Вирусные гепатиты у приматов: экспериментальное воспроизведение и естественная инфекция // «Вирусные гепатиты», Информационный бюллетень. 1998. № 3-4. - С. 3-11.

5. Балаян М.С. Гепатит А: вчера, сегодня, завтра // Медицина для всех (проблемы и решения). 1999. № 2 (19). - С. 22-25.

6. Беляков В. Д. Значение эпидемиологических методов в изучении проблемы вирусных гепатитов // В кн.: Вирусные гепатиты (нерешенные проблемы вирусных гепатитов): Сборник науч. трудов / Под ред. В.М. Жданова, Е.С. Кетиладзе. М. 1984. - С. 12-18.

7. Беляков В.Д. Эпидемиологический надзор за вирусным гепатитом А // В кн.: Жданов В.М., Ананьев В.А., Стаханова В.М. // Вирусные гепатиты. М.: Медицина. 1986. - С. 69-85.

8. Беляков В.Д., Стаханова В.М. // Эпидемиология гепатита А // В кн.: Жданов В.М., Ананьев В.А., Стаханова В.М. Вирусные гепатиты. М.: Медицина. 1986. - С. 49-69.

9. Беляков В. Д. Ретроспективный эпидемиологический анализ при вирусном гепатите А // В кн.: Вирусные гепатиты (гепатиты А, ни А, ни

10. В, В, дельта-инфекция): Сборник научных трудов / Под ред.

11. B.М.Жданова, Е.С. Кетиладзе. М. 1987. - С. 26-30.

12. Беляков В.Д., Яфаев Р.Х. // в кн. Эпидемиология. М.: Медицина. 1989.1. C. 253-255.

13. Блюгер А.Ф., Пакторис Е.А., Яфаев Р.Х. Глава «Вирусные гепатиты» // В кн.: Практическая гепатология. Рига: Звайгзне. - 1984. - С. 175-211.

14. Блюгер А.Ф., Новицкий И.Н. // в кн. Вирусные гепатиты. Рига: Звайгзне. - 1988. - С. 414.

15. Быстрова Т.Н., Макарова П.Г., Блохин К.В., Попкова М.И. Эволюция проявлений эпидемического процесса гепатита А на территории крупного города // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. - № 5 (18).-С. 24-27.

16. Гудкова Е.И., Красильников А.А., Рябцев Н.П. «Прошлое, настоящее, будущее четвертичных аммонийных соединений» // Дезинфекционное дело. -2002. -№ 4. -С. 51-53.

17. Иванова Е.Б., ЗАО «ВЕЛТ», Оренбург. Новые дезинфицирующие средства Велтолен-Экстра и Велтодез на основе четвертичноаммониевого соединения Велтон отечественного производства// Дезинфекционное дело. 2000. - № 3. - С. 28-29.

18. Иваненко А.В., Ибрагимов Р.С., Хизгияев В.И., Шаханина И.Л. Дезинфекция необходимое звено неспецифической профилактики инфекционных болезней // Дезинфекционное дело. - 2002. - № 3. - С. 3843.

19. Кобякова Н.К., Воробьева О.Н. Новое четвертичное аммониевое соединение и дезинфицирующее средство на его основе // Дезинфекционное дело. 2006. - № 4. - С. 27-28.

20. Кудрявцева Е.Е., Манькович Л.С., Железный А.В. Современный подход к выбору дезинфицирующих средств в лечебно-профилактических учреждениях // Мир вирусных гепатитов. 2003. - № 11. - С. 7-14.

21. Методические рекомендации по определению вирулицидной ативности дезинфицирующих средств // Утв. МЗ СССР 06.09.1973. №1119-73. -М. - 1973. - С. 16.

22. Методы испытаний дезинфицирующих средств для оценки их безопасности и эффективности. М. 1998. - С. 25-30.

23. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В. Гепатит А проблемы диагностики, эпидемиологии и вакцинопрофилактики // Лечащий врач. - 2001. - № 8. -С. 50-53.

24. Михайлов М.И. Современное состояние проблемы гепатита А // Бюллетень. Мир вирусных гепатитов. 2002. - № 11. - С. 2-4.

25. Михайлов М.И. Гепатиты с фекально-оральным механизмом передачи возбудителей // Практическая гепатология / Под ред. Н.А. Мухина. М. -2004. С. 13-17.

26. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В. Гепатит А актуальная инфекция для России // Стерилизация и госпитальные инфекции. - 2007. - № I (3). - С. 13-16.

27. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В. Актуальные проблемы эпидемиологии вирусных гепатитов // Матер. IX съезда Всеросс. научно-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2007. - С. 358-359.

28. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г. // «Энтеральные вирусные гепатиты» (этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика). М. 2007. - С. 157.

29. Носик Н.Н., Носик Д.Н., Дерябин П.Г., Желтухин СЛ. Вопросы биобезопасности и вирулицидные свойства дезинфицирующих средств // Дезинфекционное дело. М. 2006. - № 3. - С. 33-38.

30. Онищенко Г.Г. // О государственных мерах по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционными гепатитами // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 3. - С. 4-5.

31. Онищенко Г.Г., Дементьева JI.A. Распространение вирусных гепатитов как угроза национальной безопасности // Журнал микробиология. -2003. С. 93-99.

32. Пакторис Е.А. Эпидемиология и профилактика инфекционного и сывороточного гепатитов // В кн.: Вирусные болезни человека / Под ред. А.Ф. Билибина. М.: Медицина. - 1967. - С. 329-336, 368-272.

33. Пантелеева Л.Г., Федорова Л.С., Цвирова И.М. Вирулицидная, туберкулоцидная, фунгицидная активность новых средств из группы поверхностно-активных веществ // Дезинфекционное дело. 1998. - № 3.- С. 16-17.

34. Пантелеева Л.Г. Вирулицидная активность катионных поверхностно-активных веществ и дезинфицирующих средств на их основе // Дезинфекционное дело. 2006. - № 1. - С. 34-38.

35. Покровский В.И., Поздеева O.K. // в кн. Медицинская микробиология. М. 1999. -С. 120-127.

36. Покровский В.В., Онищенко Г.Г., Чуркасский Б.Л. Инфекционные болезни в конце XX века и санитарно-эпидемиологическое благополучие в России в XXI веке // Журнал микробиология. 2002. - № 3.- С. 16-24.

37. Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Гигиенические нормативы ГН 2.2.5.1313-03 М.: РПОХВ.- 2003. С. 19.

38. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. ВОЗ, Женева. М. 1998. - С. 46-65.

39. Соколова Н.Ф. Современные кислородсодержащие дезинфицирующие средства // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - № 3. - С. 56-58.

40. Соринсон С.Н. Гепатит А // Вирусные гепатиты. ТЕЗА, Санкт-Петербург. 1998. - второе издание, часть III, глава X. - С. 246-261.

41. Федорова JI.C. // Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения В.И. Вашкова, 15-16 октября 2002 года. М. 2002. - С. 27.

42. Хизгияев В.И. Организационные и методические аспекты по совершенствованию контроля за проведением дезинфекционных мероприятий в г. Москве // Дезинфекционное дело. 2002. - № 2. - С. 2126.

43. Цуркан В.А. Бесконтрольное применение дезинфекционных препаратов на основе хлора способствует широкому загрязнению окружающей среды // Дезинфекционное дело. 2004. - № 1. - С. 36-38.

44. Шандала М.Г., Пантелеева Л.Г., Соколова Н.Ф. и др. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности. М. 1998. - С. 25-32.

45. Шандала М.Г. Современное состояние и возможные перспективы решения проблемы тестирования вирулицидности дезинфицирующих средств // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - № 2. - С. 42-43.

46. Шаханина И.Л., Болотовская Т.П., Осипова Л.А. и др. // Актуальные вопросы инфекционной патологии: Сборник науч. трудов. М., 1993. 4.1. С. 30-31.

47. Шаханина И.Л., Осипова Л.А. Экономические потери вследствие гепатита А в Российской Федерации // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1994. - № 4. - С. 22-24.

48. Шаханина И.Л., Осипова Л.А. Экономический ущерб от гепатита А в Российской Федерации // Эпидемиология и инфекционные болезни. -1999.-№4.-С. 22-24.

49. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Попова О.Е. и др. Современные эпидемиологические закономерности и эффективность вакцинации против гепатита А в Российской Федерации // Инфекционные болезни. -2006.-№ 1.-С. 20-27.

50. Шляхтенко Л.И., Речкин В.И., Лебедев Л.И. и др. Методические основы изучения и закономерности вирусного гепатита А // Журнал микробиологии и эпидемиологии . 1997. - № 6. - С. 34-39.

51. Шляхтенко Л.И. Внимание: желтуха! Вирусный гепатит А в России: современное состояние // Медицина для всех. 2001. № 1 (18). - С. 28-32.

52. Юровских А.И. Эпидемиологические особенности и вакцинопрофилактика гепатита А в крупном промышленном регионе: Автореф. дисс. канд мед. наук. М. 2003. - С. 26.

53. Ясинский А.А., Котова Е.А., Перевощикова А.Л. и др. Эпидситуация в Российской Федерации в 2004 году // Эпидемиология и вакционопрофилактика. 2005. - № 2 (21) - С. 6-13.

54. Anderson D.A. Cytopathology, plaque assay, and heat inactivation of hepatitis A virus stain HM175. // J. Med. Virol. 1987. - Vol. 22. - P. 35-44.

55. Andre F., Van Damme P., Safary A., Banatvala J. Infected hepatitis A vaccine: immunogenicity, efficacy, safety and review of official recommendations for use // Expert Rev. 2002. - 1(1): P. 9-23.

56. Armstrong J.A., Froelich E.J. Infctivation of virus by benzalkonium chloride // Appl. Microbiol. 1964. - № 12. - P. 132-137.

57. Babb J. Methods of cleaning and disinfection // Br J Theatre Nurs. 1994 Jan; 3(10): 12-4, 27-9. Zentr Sterilization.

58. Balayan M.S. Natural hosts of hepatitis A virus. // Vaccine. 1992. - Vol. 10. -P. 27-31.

59. Barrett P.N., Meyer H., Wachtel I. Determination of the inactivation kinetics of hepatitis A virus in human plasma products using a simple TCID50 assay // J. med. Virol. 1996. - Vol. 49. - P. 1-6.

60. Chastonay J., Siegl B. The replication of hepatitis A virus in a human diploid cell line (MRC-5) //Experrientia. 1983. - 39, 12. - P. 1427.

61. Costa-Mattioli M, Cristina J., Romero H. et al. Molecular evolution of hepatitis A virus: a new classification based on the complete VPI protein // J. Virol. 2002; (76): P. 9516-9525.

62. Costa-Mattioli M, Di Napoli A., Ferre V. et al. Genetic variability of hepatitis A virus // J. Gen. Virol. 2002. Dec; 84 (Pt 12): P. 3191-3201.

63. Coulepis A.G., Locarnini S.A., Ferris A.A. et al. The polypeptides of hepatitis A virus // Intervirology. 1978; (10): P. 24-31.

64. Coulepis A.G., Locarnini S.A., Westaway E.G. et al. Biophysical and biochemical characterization of hepatitis A virus // Intervirology. 1982; 18 (3): P. 107-127.

65. Daemer R., Feinstone S., Gust I. et al. Propagation of human hepatitis A virus in African green monkey kidney cell culture: primary isolation and serial passage// Infect. Immun. - 1981. - 32, 1. - P. 388-393.

66. Disinfection, sterilization, and preservation. Seymour S. Block. Fifth Edition, by Lippincott Williams SWilkins, Philadelphia, PA 19106 USA. 2001. - P. 1481.

67. EN 14476. Chemical disinfectants and antiseptics- Virucidal quantitative suspension test for chemical disinfectantsand antisepticsused in humanmedicine Test methods and requirements (phase 2/step 1) ICS 11.080.20, april. 2005. - A1:2006.

68. Flehmig B. Hepatitis A vims in cell culture: 1. Propagation of different hepatitis A virus isolates in a fetal rhesus monkey cell line (Frhk-4) // Med. Microbiol. Immunol. 1980. - 168. - P. 239-248.

69. Flehmig B. Laboratory diagnosis of hepatitis A infections // Excerpta Med. Virology. 1980. - 10, 4. - P. 1512.

70. Frosner G.G., Overby L.R., Flehmig B. et al. Seroepidemiological investigation of patients and family dontacts in en epidemic of hepatitis A // Med. Virol. 1977. - Vol. 1: P. 163-173.

71. Frosner G.G., Deinhardt F., Scheid R. Immunoglobulin M anti-hepatitis A virus determination reorienting gradient centrifugation for diagnosis of Acute Hepatitis A. // Infection. J Clin Microbiol. 1979. - Apr; 9(4): 476-478.

72. Frosner G., Deinhardt F., Scheid R. et al. Propagation of human hepatitis A vims in a hepatoma cell line // Zentralbl. Bacteriol. 1980. - 1, 15. - P. 248.

73. Gomara M.J., Riedemann S., Vega I., Ibarra H., Ercilla G., Наго. I. Use of linear and multiple antigenic peptides in the immunodiagnosis of acute hepatitis A vims infection // J. Immunol. Methods. 2000. - V. 234. - № 1-2. -P. 23-34.

74. Gowland P., Fontana S., Niedechause C., Taleghani B.M. Molecular and serologic tracing of a transfusion transmitted hepatitis A vims // Transfusion. - 2004. - Nov; 44(11): P. 1555-1561.

75. Gust I.D., Coulepis A. G., Feinstone S.M. et al. Taxonomic classification of hepatitis A virus // Intervirology. 1983. 20 - P. 1-7.

76. Handbuch der vimswirksamen Desinfektionen. F. v. Rheinbaben, M.H. Wolf. Springer-Verlad, Berlin. 2002. - P. 211-222.

77. Hilleman M.R. Phisical, chemical and morphologic dimensions of human hepatitis A vims strain CR 326 Proc Soc Exp Biol Med. 1975. - 148. P. 532539.

78. Khudyakov Y., Lopareva E., Jue D.L. et al. Antigenic epitopes of the hepatitis A virus polyprotein // Virology. 1999. - V. 260. - P. 260-272.

79. Lemon S., Binn L., Marchwicki R. Radioimmunofocus assaybfor quantitation of hepatitis A virus in cell cultures // J. clin. microbial. 1983. - 17, 5. - P. 834-839.

80. Leveque L., Crance J.M., Beril C., Schwartzbrod L. Virucidal effect of UV light in hepatitis A virus in seawater: evalution with cell culture and RT-PCR //Water Sci. Technol. 1995. - 31: P. 157-160.

81. Li J.W., Xin Z.T., Wang X.W., Zheng J.L., Chao F.H. Mechanisms of inactivation of hepatitis a virus by chlorine // Appl. Environ Microbiol. -2002. Oct; 68(10): P. 4951-4955.

82. Locarnini S.A., Coulepis A.G., Ferris A.A. et al. Purification of hepatitis A virus from human feces // Intervirology. 1978. 10 - P. 300-308.

83. Ma J.F., Straub T.M., Pepper I.L., Gerba C.P. Cell culture and PCR determination of poliovirus inactivation by disinfectants // Appl. Environ Microbiol. 1994. - 60: P. 4203-4206.

84. Mbithi J.N. Springthorpe V.S., Sattar S.A. Effect of relative humidity and air temperature on survival of hepatitis A virus on environmental surfacces // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - № 5. - P. 1394-1399.

85. McCaustland K.A., Bond W.W., Bradley D.W., Ebert J.W., Maynard J.E. Survival of hepatitis A virus in feces after drying and storage for 1 month // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 16. - № 5. - P. 957-958.

86. Melnick J.L. Classification of hepatitis A virus as enterovirus type 72 and of hepatitis А В virus as hepadnavirus type I // Intervirology. 1982. - 18. - P. 105-106.

87. Merianos J.J. Quaternary ammonium antimicrobial compounds. In: Block S.S., editor. Disinfection, sterilization and preservation // Philadelphia: Lea and Febiger. 1991. - P. 225-255.

88. Nissen E., Konig P., Feinstone S.M., Pauli G. Inactivation of hepatitis A and other enteroviruses during heat treatment (pasteurization) // Biologicals. -1996.-Vol. 24.-P. 339-341.

89. Pana A., Patti A., Paroli E. Hepatitis A virus (HAV) cultivation on the cercopyhecus kidney cell line (RC-37) // Ann. Sclavo. 1982. - 4. - P. 344351.

90. Parry J.V. and Mortimer P.P. The heat sensitivity of hepatitis A vims determined by a simple tissue culture method 1984 J of medical virology 14: P. 277-283.

91. Peterson D.A., Wolf L.G., Larkin E.P., Deinhardt F.W. Thermal treatment and infectivity of hepatitis A vims in human feces // J. Med. Virol. 1978. -2(3): P. 201-206.

92. Peterson D.A., Harley T.R., Hoff J.C., Wolfe L.J. Effect of clorine treatment on infectivity of hepatitis A vims // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - Vol. 45.-№1.-P. 223-227.

93. Prince D.L., Prince H.N., Thraenhart O. et al. Methodological approaches to disinfection of human hepatitis В vims // J. Clin. Microbiol. 1993. - № 31. -P. 3296-3304.

94. Provost P.J., Ittensohn O.L., Villarejos V.M. et al. Etiologic relationship of marmoset propagated CR 326 hepatitis A vims to hepatitis in man // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1973. - 142 - P. 1257-1267.

95. Provost P.J., Wolanski B.S., Miller WJ. et al. Physical, chemical and morphological dimensions of human hepatitis A vims strain CR 326 (38578) // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1975. - 148 - P. 532-539.

96. Provost P.J, Hilleman M. Propagation of human hepatitis A virus in cell culture in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1979. - 160, 2. - P. 213-221.

97. Purcell R.H. Hepatitis viruses: changing patterns of human disease. 1994. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - V. 91. - P. 2401-2406.

98. Rey J. F., Kruse A. ESGE/ESGNA Technical Note on Cleaning and disinfection// endoscopy. - 2003. - Vol. 35. - P. 869-877.

99. Rutala W.A. APIC quideline for selection and use of disinfectants // Inc Am J Infect Control. 1996. - 24: P. 313-342.

100. Scott E.M., Gorman S.P. Glutaraldehyde // Disinfection, sterilization and preservation // Block S.S. (Ed.). New-York: Lippincott Williams and Wilkins.- 2001. P. 361-383.

101. Siegl G., Frosner G.G. Characterization and classification of virus particles associated with hepatitis A. II. Type and configuration of nucleic acid. J. Virol. 1978. - 26 - P. 48-53.

102. Siegl G., de Chastonay J., Kronauer G. Propagation and assay of hepatitis A virus in vitro // J Virol Methods. 1984. - Aug; 9 (1): - P. 53-67.

103. Siegl G., Weitz M., Kronauer G. Stability of hepatitis A virus // Intervirology.- 1984.-22-P. 218-226.

104. Thraenhart O., Jursch C. Measures for Disinffection and Control of Viral hepatitis // Med. Microbiol. Immunol. 1997. - P. 585-608.

105. Thraenhart O., Neumann-Haefelin D. Molecular approaches to validate disinfectants against human hepatitis В virus // Med. Microbiol. Immunol. -2002.-Vol. 9.-P. 428-431.

106. Ticehurst J.R. Hepatitis A vims: clones, cultures and vaccines // Semin Liver Dis. 1986. - 6 - P. 46-55.

107. Van Hattum J., Chen X.Q. Hepatitis A: infection, detection, vaccination and immunity // The Netherlands Journal of medicine. 1999. - V. 55. - № 3. - P. 42-50.

108. Wang C.H., Tschen S.Y. Flehming B. Antigenicity of hepatitis A virus after ultra-violet inactivation // Vaccine. 1995. - Jun: 13 (9) P. 835-840.

109. Yokosuka O. Molecular biology of hepatitis A vims: significance of various substitutions in the hepatitis A vims genome // Gastroenterology and Hepatology. 2000. - V. 15. - P. 91-97.

Информация о работе

Элбакян, Радмила Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Комплексный подход к изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств в отношении вируса гепатита A - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы