Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование вирулицидной активности производных пиридина и гемина и создание на их основе композиций с антисептическим действием

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Исследование вирулицидной активности производных пиридина и гемина и создание на их основе композиций с антисептическим действием"



Российская Академия медицинских наук ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

На правах рукописи

Желтухин Сергей Леонидович

Исследование вирулицидной активности производных пиридина и гемина и создание на их основе композиций с антисептическим действием

Специальность 03.00.06 -Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007

003160786

Работа выполненена в ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Носик Николай Николаевич Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Галегов Георгий Артемьевич доктор медицинских наук, профессор Чекалина Ксения Ивановна

Ведущая организация ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии

им Г Н Габричевского Роспотребнадзора РФ

Защита диссертации состоится на заседании Диссертационного

Совета Д001 02001 «V» 2007 г в _ при ГУ НИИ

вирусологии им ДИ Ивановского РАМН (Москва, 123098, ул академика Гамалеи Н Ф , 16)

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН

Автореферат разослан « слм ГЛ^я 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета д м н

Косякова Н П

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Широкое распространение вирусных инфекций, трудности разработки средств их лечения, недостаточность выбора эффективных противовирусных препаратов определяют неослабевающий интерес к разработке превентивных мер по борьбе с вирусами Важнейшим компонентом профилактики передачи инфекционных вирусных агентов является химическая антисептика

В настоящее время в нашей стране разрешено к применению около 450 дезинфицирующих средств, многие из которых обладают недостаточной вирулицидным действием В связи со специфическими требованиями, предъявляемыми к антисептикам с вирулицидным действием (безопасность для организма, быстрое развитие эффекта, моющая способность и др) их выбор еще более ограничен, а потребность в них очень велика Поэтому поиску антисептиков с вирулицидной активностью по отношению к широкому спектру вирусов, нетоксичных и доступных в экономическом отношении уделяется особое внимание

Больше разнообразие вирусов, отличающихся по структуре, размерам, составу и устойчивости к физико-химическим воздействиям требует дальнейшего расширения исследований среди соединений различных классов с целью поиска новых вирулицидных агентов и создания на их основе дезинфицирующих и антисептических средств нового поколения

В качестве потенциальных вирулицидных агентов в настоящей работе исследовались новые производные пиридина и природного порфиринового металлокомплекса - гемина

Критерием выбора производных пиридина явились отмеченные ранее для некоторых соединений этого ряда антимикробные свойства и низкая токсичность В композиции со спиртами они проявляли вирулицидные свойства в отношении некоторых вирусов

Отдельные представители пептидных производных гемина обладали способностью ингибировать протеиназу ВИЧ и катализировать окисление природных органических субстратов (ЫАБН), но вирулицидная активность для них не была известна и не изучалась

Цель работы. Целью настоящей работы явился поиск соединений - новых потенциальных ДВ - обладающих высокой вирулицидной активностью, и создание на их основе новых низкотоксичных и высокоэффективных композиций дезинфектантов и кожных антисептиков

Задачи исследования

- изучение вирулицидной активности синтетического производного пиридина и создание дезинфицирующей субстанции и композиции кожного антисептика на его основе,

сравнительное исследование вирулицидной активности предложенной антисептической композиции и некоторых коммерческих дезинфицирующих средств и антисептиков,

- изучение вирулицидной активности синтетических производных гемина, полученных путем целенаправленного молекулярного дизайна, установление взаимосвязи между структурой и функцией и возможных механизмов их действия, выбор наиболее активных соединений и предложений по дальнейшему развитию и созданию композиций на их основе

Научная новизна

1 Впервые получены данные по вирулицидной активности новых производных гемина и соединений пиридинового ряда

2 Показана зависимость скорости инактивации вирусов от концентрации исследованных соединений, времени экспозиции, вида объектов и способа их обработки

3 Впервые доказана эффективность выбранного производного пиридина против широкого спектра вирусных возбудителей социально значимых инфекций при различных режимах обеззараживания разнообразных объектов и весьма низких концентрациях (0,01-0,001%)

4 Разработана, протестирована и разрешена к применению новая антисептическая композиция на основе производного пиридина

5 Впервые продемонстрирована нуклеолитическая активность производных гемина общей формулы (II) в отношении вирусной ДНК, в том числе в составе цельного вир иона

6 Выявлена взаимосвязь между структурой, физико-химическими свойствами и вирулицидностью в ряду синтетических производных гемина Предложены возможные механизмы их вирулицидного действия и основы рационального молекулярного дизайна более современных вирулицидных агентов на основе производных гемина

Практическая значимость

1 На основании результатов проведенного исследования, получен кожный антисептик - жидкое мыло - на основе пиридинового производного «ДОПД гидрохлорид», который разрешен к применению Роспотребнадзором

2 Предложены вирулицидные агенты нового поколения на основе в составе новых антисептических композиций природного эндогенного соединения - гемина, заложены научные основы дизайна его производных с оптимальным набором свойств, необходимых для практического применения

3 По материалам исследования вирулицидной активности синтетических производных гемина оформлена и подана авторская заявка на изобретение

Основные положения, выносимые на защиту

1 Новая композиция на основе производного пиридина «ДОПД», безопасная и высокоэффективная против широкого круга вирусных возбудителей социально значимых инфекций при низкой концентрации действующего вещества.

2 Производные гемина, модифицированного остатками аминокислот, пептидов и пептидомиметиков в качестве эффективных вирулицидных агентов

3 Нуклеолитическая активность производных гемина в отношении вирусной ДНК

4 Зависимость вирулицидного действия производных гемина от их нуклеолитической активности и способности катализировать окисление ПНЖК мембран Основы рационального молекулярного дизайна новых высокоэффективных вирулицидных агентов данного ряда

Апробация работы

Проведена 21 июня 2007 г на совместной научной конференции отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ вирусологии им. ДИ. Ивановского РАМН Основные положения диссертации доложены на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина», 2006г По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы и 2 инструкции по применению дезинфицирующих средств, утвержденных Роспотребнадзором Результаты исследований внедрены в практику в виде разрешения

Роспотребнадзора на производство и применение дезинфицирующего средств и антисептика на территории Российской Федерации

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, главы «материалы и методы», двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 89 литературных источников, приложения Работа иллюстрирована 24 таблицами и 15 рисунками

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили два ряда синтетических соединений, относящихся к классам производных пиридина общей формулы (I) и производных гемина общей формулы (II)

R1

^V2

-^ CI

Рис 1 Общая формула (I) синтезированных производных пиридина

Ri=-ArgOMe, R2=-ArgOMe (IV)

• Rj=-LysOMe, R2=-LysOMe (V)

• Ri=-y-GluHA, R2=-OH (VI)

• R^-y-GluHA, R 2=-y-GluHA (VII)

• R,=-p-AlaHA, R2=-P-AlaHA (VIII)

CORi COR2

• R,=- ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, R2=-OH (XI)

• R,=-ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, R2=-OH (X)

• R1=-TrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH, R2=-OH (IX)

Рис 2 Общая формула(П) синтетических производных гемина

В качестве препаратов сравнения использовали дезинфицирующие средства (ДС) - кожный антисептик «Маносепт», содержащий 1% ортофосфорной кислоты, 15% этилового спирта, 70% изопропилового спирта, а так же антисептик «Анасепт», содержащий 0,5% дидецилдиметиламмоний хлорида и 96% этиловый спирт

Вирулицидные свойства соединений общих формул I и II исследовали с использованием ряда тест-вирусов полиомиелита, вацинный штамм Сэбин, тип 1, герпеса простого, тип 1, штамм JI2, гепатита С, ВИЧ, гриппа А птиц, штамм H5N1 (получены из Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН) Исследования проводили по методике, применяемой для оценки вирулицидных свойств дезинфицирующих средств («Методы испытаний дезинфекционных средств дня оценки их безопасности и эффективности», без номера, Утв МЗ РФ, М, 1998 г; Методические рекомендации «По определению вирулицидной активности препаратов», МЗ СССР № 1119-73 от 06 09 73 г)

Исследования с вирусом иммунодефицита проводили в лаб Вирусов иммунодефицита человека (зав проф Носик Д Н ), с вирусом гепатита С и вирусом гриппа А птиц в лаб Коллекционных штаммов вирусов (зав проф Дерябин П Г )

В качестве тест объектов для исследования производных пиридина использовали искусственную кожу, линолеум, кафель, стекло, металл (нержавеющая сталь), а также суспензионный тест m vitro Производные гемина исследовали на линолеуме и in vitro.

Учет результатов проводили микроскопически Репродукцию вируса в клетках оценивали по вирусиндуцированному ЦПЭ

Для установления целостности вирусных ДНК суспензию вируса и ДНК фага X, а также изолированные ДНК этих вирусов, после обработки некоторыми производными гемина исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием пары праймеров к гену гликопротеина (UL2) с размером фрагмента 266 п о Наличие ампликонов к ДНК вируса герпеса определяли с помощью гель-электрофореза, сравнение проводили со стандартной ДНК вируса герпеса и фага X, в качестве контроля использовали дистиллированную воду

Цитотоксическое действие производных гемина оценивали на моделях культур лимфобластоидных клеток МТ-4 и клеток Vero в концентрациях Ю'Мо^М

Токсичность производных пиридина исследовали в ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (зав лаб Сажинова В К) согласно методологическим указаниям по оценке токсичности и опасности ДС (МУ 1 2 1105-02) на белых крысах и мышах, кроликах

(шиншилла) и морских свинках Статистическую обработку

полученных результатов осуществляли по методу Стьюдента-Фишера при степени достоверности Р <0,05

Исследование нуклеолитической активности производных общей формулы II по отношению к плазмидной ДНК рвет проводили методом гель-электрофореза по типичной методике [Магнат е1 а1, 1982], в ТАЕ-буфере (рН 8), при напряжении 10 В/см Производные гемина в концентрации М инкубировали с плазмидной ДНК 1

час при 37°С при кислых или нейтральных значениях рН в следующих буферах 50 мМ АсОМН4 (рН 4,5), 5 мМ МпС12(буфер I), или 10 мМ Трис-Нс1 (рН 7,5), 10 мМ МпС12(буфер И) Продукты реакции визуализировали путем окрашивания их бромистым этидием с последующим облучением УФ-светом с X 300 нм и фотографирования с помощью цифровой камеры

Результаты работы и их обсуждение

1.Изучение вирулицидной активности производных пиридина и композиций на их основе. Интерес к данному классу соединений обусловлен наличием у отдельных его представителей антимикробных свойств и сравнительно низкой токсичности

В результате проведенного нами предварительного скрининга новых синтетических производных пиридина общей формулы I было выбрано соединение, наиболее эффективное в отношении ингибирования внеклеточного вируса полиомиелита, обозначенное далее как ДОПД гидрохлорид

ДОПД гидрохлорид обладал оптимальным набором свойств -хорошей растворимостью в воде (10 г/л), изопропиловом и этиловом спиртах, а также низкой токсичностью, являясь умеренно опасным веществом (3-й класс опасности по ГОСТ 12 007-76)

1 1 Вирулщидные свойства ДОПД гидрохлорида При тестировании вирулицидных свойств ДОПД гидрохлорида в отношении вируса полиомиелита исследовали их зависимость от концентрации ДОПД, времени воздействия и присутствия спиртосодержащих добавок (табл 1)

Вирулицидная активность ДОПД при обработке поверхности примерно одинакова в интервале концентраций от 0,1% до 1,0% при равной длительности воздействия независимо от концентрации буфера и присутствия или отсутствия добавок спиртов в различных концентрациях

Таблица 1

Исследование вирулицидных свойств образцов соединения ДОПД гидрохлорида при обработке поверхности, контаминированной вирусом полиомиелита (титр вируса - 6,5 log10 , культура клеток Vero) Объект обеззараживания - кафель Способ обработки -

№ Конц., % Время Степень

опыта обеззараживания, ингибирования,

мин logioTlJUso

1 1,0 30 >3,0

60 4,0

2 ОД 30 >3,0

60 4,0

3 0,1 30 >3,0

4 од 30 >3,0

5 0,8 30 >3,0

оп 1-3 - в 0,023 М фосфатном буфере, оп 4,5 - в 0,015 М фосфатном буфере оп 3 - с добавлением 2% феноксиэтанола оп 4,5 -с добавлением 40% этанола

Наличие выраженного ингибирукяцего действия (4,0 к^ю ТЦД50) в отношении высокорезистентного к физико-химическим воздействиям вируса полиомиелита, низкая токсичность и водорастворимость определили его перспективность как действующего вещества (ДВ) и основы для создания субстанции и нового антисептика

1 2 Дезинфицирующая субстанция на основе ДОПД Для субстанции на основе ДВ ДОПД была выбрана удобная в обращении форма 0,1% водного раствора с минимальной концентрацией ДВ, обеспечивающей вирулицидный эффект, и с добавлением 2% 2-феноксиэтанола и 1% ПАВ - кокопропилдиметишбетаина, для предотвращения контамининации субстанции микроорганизмами и поддержания ДВ в растворенном состоянии

Субстанция относится к 4 классу малоопасных веществ (ГОСТ 12 1 007-76) и не оказывает кожно-резорбтивного и местно-раздражающего действия, не обладает сенсибилизирующими свойствами по реакции гиперчувствительности замедленного типа и кумулятивными свойствами

1 3 Исследование вирулицидной активности дезинфицирующей субстанции на основе ДОПД

Данные исследования, приведенные в таблицах 3-5, установили наличие высокой вирулицидной активности исследуемой субстанции против различных вирусов (полиомиелит, ВИЧ, вирус гепатита С) на различных поверхностях и при различных способах обработки.

Таблица 2

Исследование вирулицидной активности субстанции на основе ДОПД при обработке объектов, контаминированных вирусом полиомиелита исходный титр вируса 6,0 logi0, культура клеток Vero Способ обработки - протирание, орошение

Тест-объект-поверхности Конц. Субстанции*, % Время обработки, мин Степень ингибирования , logio

Кафельная плитка 2,5 60 4,6

Пластик 60 4,3

Металл (нерж.сталь) 60 4,3

* разведение в 40 раз

Таблица 3

Исследование вирулицидной активности субстанции на основе ДОПД при обработке объектов, контаминированных вирусом иммунодефицита человека (исходный титр вируса 6,5 1о§]0, культура клеток МТ-4) и вирусом гепатита С (исходный титр вируса 6,5 к^ю, культура клеток СПЭВ) Способ обработки - протирание, орошение

Тест-объект поверхности Конц субстанции *,% Время обработки, мин Степень ингибирования, logio

ВИЧ гепатит С

Кафельная плитка 2,0 60 5,0 6,5

Линолеум 60 5,0 6,5

Металл (нерж сталь) 60 5,0 6,5

Фаянс 60 5,0 6,5

* разведение в 50 раз

и

При этом достигаются высокие степени ингибирования вируса (4,3-6,5 к^ю) при значительных степенях разведения субстанции (в 40-50 раз)

Учитывая эти данные и низкую токсичность субстанции, нами был предложен состав потенциального кожного антисептика на ее основе. 14 Кожный антисептик Композиция, лежащая в основе потенциального кожного антисептика, обладает еще более высокой вирулицидной активностью и включает ДОПД в еще более низкой концентрации - 0,01%, что соответствует разведению субстанции водой в 10 раз Основанием для выбора такого содержания ДВ послужили данные о сохранении вирулицидной активности субстанции при высоких степенях разведения (таблицы 3-5) Снижение при этом концентрации ДВ и спирта феноксиэтанола в 10 раз (до 0,2%) в композиции является позитивным фактором, учитывая предназначение продукта для кожной антисептики (минимизация раздражающего действия и отсутствие влияния 2-феноксиэтанола на вирулицидную активность ДОПД) Так как наличие моющего эффекта у дезинфектанта и антисептика всегда желательно, то в составе композиции антисептика на основе ДОПД было увеличено содержание ПАВ - бетаина до 5% Выбор в качестве ПАВ кокопропилбетаина обусловлен его промышленной доступностью, природным происхождением (получают из растений), нейтральным (амфотерным) характером, что благоприятно для кожи Кроме того, в состав потенциальной химической композиции были введены обычно применяемые для жидких мыл добавки - глицерин, отдушка, гидроксиэтилцеллюлоза (загуститель)

1 5 Исследование вирулицидной активности потенциальной антисептической композиции на основе ДОПД

Таблица 4

Исследование вирулицидной активности антисептической композиции на основе ДОПД в отношении вируса полиомиелита, исходный титр вируса 6,0 logio, культура клеток Vero__

Время Степень

Тест-объект обработки, ингибирования, Способ

мин logio обработки

Ин витро 0,5 3,25 Смешивание

1,0 4,0

0,5 2,5 Протирание,

орошение

Искусственная кожа 1,0 3,0 Однократное протирание

1,0 4,0 Орошение

Таблица 5

Исследование вирулицидной активности антисептической композиции на основе ДОПД в отношении вируса герпеса простого, исходный титр вируса 5,0 logio, культура клеток VERO__

Тест-объект Время обработки, мин Степень ингибирования, lOgio Способ обработки

Ин витро 0,5 3,7 Смешивание

Искусственная кожа 0,5 2,5 Протирание, орошение

1,0 3,0 Однократное протирание

1,0 4,0 Орошение

Таблица 6 Исследование вирулицидной активности антисептической композиции на основе ДОПД в отношении вируса иммунодефицита человека, исходный титр вируса 6,5 1о§ю, культура клеток МТ-4

Тест-объект Время обработки, мин Степень ингибирования, logio Способ обработки

Ин витро 0,5 4,0 Смешивание

Искусственная кожа 0,5 4,0 Орошение

Таблица 7

Исследование вирулицидной активности антисептической композиции на основе ДОПД в отношении вируса гепатита С, исходный титр вируса 8,5 1о§ю, культура клеток СПЭВ

Тест-объект Время обработки, мин Степень ингибирования, logio Способ обработки

Ин витро 0,5 4,5 Смешивание

Искусственная кожа 0,5 4,5 Орошение

1,0 5,0 Орошение

Таблица 8 Исследование вирулицидной активности антисептической композиции на основе ДОПД в отношении вируса гриппа А птиц (Н5Ш), исходный титр вируса 8,5 культура клеток СПЭВ

Тест-объект Время обработки, мин Степень ингибирования, logio Способ обработки

Ин витро 0,5 7,0 Смешивание

Искусственная кожа 0,5 8,0 Орошение

1,0 8,0 Орошение

Данные, приведенные в таблицах 6,7 и 8, подтверждают соответствие вирулицидной активности, проявляемой антисептичекой композицией на основе ДОПД, требованиям, предъявляемым к антисептикам по скорости достижения эффекта, а именно до 5 минут

Композиции на основе ДОПД - дезинфицирующая субстанция и кожный антисептик были разрешены к применению Роспотребнадзором

Сравнительное исследование эффективности существующих препаратов с вирулицидной активностью - «Анасепта» и «Маносепта» с предложенным кожным антисептиком в отношении ряда вирусов Результаты приведены в таблицах 7,8

Таблица 9

Сводная таблица активности антисептиков против полиовируса Тест вирус вирус полиомиелита, вакцинный штамм, исходный титр -6,5

logio Культура клеток - клетки VERO

Тест-вирус Препарат

«Маносепт» «Авансепт» кожный антисептик

Полиомиелит >4,5 <1,5 >4,0

сравнение проведено на следующем базисе исследования метод применения - втирание, тест-объект - искусственная кожа, время экспозиции 1 минута

Как следует из полученных данных, приведенных в табл (2-13), наиболее эффективным антисептиком является препарат, содержащий дезинфицирующую субстанцию на основе пиридинового соединения ДОПД гидрохлорида Препарат «Маносепт», содержащий комбинацию этилового и изопропилового спиртов с добавкой ортофосфорной кислоты, был также эффективен в отношении вируса полиомиелита «Авансепт», содержащий в качестве ДВ ЧАС и этиловый спирт, не проявил вирулицидного действия по отношению к вирусу полиомиелита, хотя и обладал бактерицидной активностью и ограниченной вирулицидной активностью

Значительное сходство структурных элементов ДОПД и комбилексинов[Ляхов С А., 2003 г] и искусственных низкомолекулярных рибонуклеаз, обладающих противовирусными свойствами[Уаз1иго М, & а1 1996], позволяет предположить у ДОПД наличие способности взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами (НК) и рибонуклеазной активности

Достоинства предложенной в данной работе новой антисептической композиции, а именно широта спектра противовирусной активности при весьма низкой действующей концентрации (0,01%), практическое отсутствие раздражающих добавок (спиртов, окислителей, хлора и т д), безопасность для кожи, совместимость с различными материалами, экономическая целесообразность применения, стабильность при хранении, простота в обращении - обуславливают возможности ее применения в пищевой и фармацевтической промышленности, ЛПУ, ДДУ, быту, а также в составе потенциальных фармакологических композиций с вирулицидным действием, например, для лечения и профилактики желудочно-кишечных, венерических, ЛОР и глазных заболеваний

2. Изучение вирулицидной активности производных гемина. В

последние годы значительно увеличился интерес к природным соединениям в связи с многочисленными отрицательными эффектами, отмеченными при применении синтетических противовирусных препаратов Прогнозируемая для природных соединений низкая токсичность и биодеградируемость особенно важны при создании антисептиков, контактирующих с кожей и слизистыми человека и животных В качестве основы для достижения этой цели были

выбраны производные гемина - металлопорфирина эндогенного происхождения

При выборе данного объекта для исследования учитывалась способность отдельных производных гемина катализировать окислительное расщепление различных природных органических субстратов, в том числе нуклеиновых кислот, проявляя свойства искусственных нуклеаз по отношению к плазмидной ДНК Сам гемин при прочих равных условиях такими свойствами не обладал Кроме того, гемин нерастворим в воде и цитотоксичен[01е1 М, 2006] Отдельные аминокислотные и пептидные производные гемина ингибировали протеиназу ВИЧ, оказывая вследствие этого противовирусное анти-ВИЧ действие при низкой токсичности по отношению к неинфицированным клеткам Однако вирулицидная их активность не была известна.

Приступая к изучению вирулицидной активности новых и известных производных гемина общей формулы (И), мы исходили из предположения о потенциальной нуклеолитической активности этих соединений не только по отношению к плазмидной, но и к вирусной ДНК, что и подтвердилось в дальнейшем на практике (табл 19)

Кроме того, учитывая, что основными механизмами действия дезинфектантов по отношению к вирусам являются не только нарушение целостности их нуклеиновых кислот, но и повреждение белково-липидной оболочки, совместно с Институтом химической физики РАН и ООО «Фарминтерпрайсез» было проведено сравнительное кинетическое исследование способности производных гемина формулы (II) катализировать окисление полиненасыщенной жирной кислоты (ПНЖК), характеризуемое коэффициентом £ и таким образом усиливать перекисное окисление липидов (ПОЛ) и деструкцию липидной мембраны вируса(табл 19)

В настоящее время подходы к синтезу производных гемина общей формулы (И) твердофазным методом и в растворе отработаны, причем некоторые из них могут рассматриваться как препаративные, что делает эти соединения доступными для проведения исследований и перспективными для дальнейшего развития.

Строение новых и известных соединений общей формулы (II) было подтверждено различными физико-химическими методами, в том числе электронной, масс- и ИК- спектроскопией, элементным анализом 2 1 Пути целенаправленного молекулярного дизайна производных гемин

Для установления взаимосвязи между структурой и функцией при синтезе производных гемина общей формулы (II) варьировались - размер заместителя (увеличивается в ряду III - IX),

- основность заместителя (IV,V,VII - основные заместители, IX-XI- несколько основных и 1 карбоксильная группа), VI-VII -цвиттерионная структура, III- содержит неионизируемый аминокислотный остаток,

- аминокислотный состав заместителей (III-XI),

- собственная биологическая активность заместителей (VII, VII, IX-XI)

2 2 Свойства соединений общей формулы (11) Растворимость Часть из синтезированных производных гемина оказалась растворима в воде Водорастворимые производные гемина исследовали в виде растворов в воде, буферах и средах Нерастворимые в воде производные гемина растворяли в минимальном объеме DMSO и доводили водой, буфером или средой до нужной концентраций 10"4М, 10"5М), причем содержание DMSO в конечной пробе составляло 5%-10%

Цитотоксичность Производные гемина, соответствующие общей формуле (И), в концентрации 10"6-10"5 не оказывали цитотоксического действия на культуры диплоидных фибробластов эмбриона человека, клетки Vero и лимфобластоидные клетки МТ-4(табл 10,11)

Таблица 10

Результаты исследования цитотоксичности геминпептидов (IX), (X)

на модели культур лимс юбластоидных клеток МТ-4

Номер соединения, концентрация Жизнеспособность клеток, % количество клеток х 106/мл

контроль клеток (интактные клетки) 90 1,7

X, 10"6 М 76 1,1

X, 10"5 М 85 1,3

IX, 10"5 М 88 1,2

Таблица 11

Результаты исследования цитотоксичности геминпептида (IV) на модели культуры клеток Vero_____

Жизнеспособность клеток, %

Контрольная культура 10"3М* Ю^М* 10"SM*

96,0 47,8 92,0 95,0

* - концентрация вещества (IV) в пробе

2 3 Вирулицидные свойства производных гемина Вирулицидные свойства соединений исследовали при нанесении вирусов полиомиелита и герпеса на линолеум с образованием вирусной пленки и в суспензионном тесте В качестве способа обработки поверхности использовали протирание с избытком раствора исследуемого соединения Полученные результаты представлены в табл 12-15

Таблица 12

Результаты исследования вирулицидных свойств производных гемина в отношении вируса полиомиелита в суспензионном тесте_

Номер соединения Степень ингибирования, исх.титр 5,5 logi0

10"4М ю-5м

30 мин 60 мин 30 мин 60 мин

VII 3,25 3,5 3,0 3,2

XI 3,0 3,6 2,1 2,7

III 3,2 3,2 3,0 3,0

IX 3,5 4,2 3,0 4,0

IV 2,6 4,6 2,6 3,6

V 2,1 4,5 3,0 2,6

VI 3,0 3,75 2,75 3,0

VIII 2,6 2,7 2,4 2,6

Таблица 13

Результаты исследования вирулицидных свойств производных гемина в отношении вируса полиомиелита__

Номер соединения Степень ингибирования вируса полиомиелита, исх титр 5,5 logio

Ю^М 10"5М

30 мин 60 мин 30 мин 60 мин

XI 3,0 2,5 2,0 2,0

IX 2,5 2,5 2,0 2,0

IV 3,5 4,5 3,5 4,5

V 2,0 3,0 2,0 2,75

VIII 3,0 3,75 2,75 3,0

Тест-объект линолеум Способ обработки - протирание избытком раствора вещества

Таблица 14

Результаты исследования вирулицидных свойств производных гемина

в отношении вщ эуса герпеса простого

Номер соединения Степень ингибирования вируса герпеса простого, исх титр 4,5 1о§ю

юЛм 10"5М

30 мин 60 мин 30 мин 60 мин

VII 2,6 2,7 2,4 2,6

XI 3,0* 2,5** - -

III 4,5 4,5 3,0 2,6

IX 2,6 2,75 2,0 2,5

IV 2,75* 2,75** 2,0* 2,5**

V 3,0 3,6 2,1 2,7

Тест-объект линолеум Способ обработки - протирание избытком раствора вещества

* Через 10, ** 15 мин

Таблица 15

Результаты исследования вирулицидных свойств производных гемина в отношении вируса герпеса простого_

Номер соединения Степень ингибирования вируса герпеса простого, исх титр 3,5

Ю^М 10"5М

10 мин 15 мин 10 мин 15 мин

V 2,0 3,0 - -

XI 3,0 2,5 - -

IX 2,5 2,5 2,0 2,0

IV 2,75 2,75 2,0 2,0

VII 2,75 2,75 2,5 2,0

Тест-объект линолеум Способ обработки - протирание избытком раствора вещества

Таким образом, производные гемина, соответствующие общей формуле (II), обладают выраженными вирулицидными свойствами в отношении как оболочечных, так и безоболочечных, РНК- и ДНК- содержащих вирусов с различной степенью устойчивости к воздействию физико-химических факторов

Полученные результаты предполагают, что некоторые соединения в концентрации 10"4М являются перспективными для дальнейшего

исследования их как потенциальных вярулицидных

средств(1У, V, X, Ш, XII).

2.4- Нуклеолитическая активность геминпептидов в отношении плазмцдной ДНК

Результаты электрофоретического исследования

нуклеолитической активности производных гемина в отношении плазмидной ДНК pGem, представленные на рис.3 и в табл. 16, демонстрируют ее наличие и зависимость от структуры заместителя и pH среды.

Очевидно, что для проявления выраженной нуклеолитической активности необходимо присутствие основных заместителей в непосредственной близости от порфиринового кольца, как в соединениях (IV, V, XI, X). Два основных аминокислотных заместителя (Lys или Arg) по обеим протшоново кислым группам в производных гемина уже обеспечивают проявление свойств эффективной искусственной кукле азы.

8 7 6 5 4 ? 2 1 Рис. 3. Анализ нуклеазной активности производных гемина общей формул ы(11) in vitro в 1% агарозном геле. I- ДНК плазм иды pGem, инкубированная в воде 1ч, 2- ДНК плазмиды pGem, инкубированная при рН 4.5 1ч. ДНК плазмиды pGem после инкубации с гем и i ¡пептидам и в течение 1ч при рН 4.5 {буфер I) при концентрациях 1 О^М: 3- соед. (IX), 4- соед. (V), 5- соед. (VIH), 6- соед. (III), 7 - соед. (XI), 8- соед. (VII) Все пробы инкубировали при 37°С.

Цвиттерионные структуры (VI, VII), в которых основные группы (имидазол) компенсированы кислотной группой (карбоксил), а также производные гемина с неионизирусмыми заместителями, как в соединении (III), нуклеолитической активностью не обладают (табл.16).

Таблица 16

Нукле септическая активность производных гемнна_

j4s соед. БуферI pH 4.4 Буфер II pH 7.5

IV + +

V +

XI + +

X + +

IX "Т

VIII + +

VII ч* +

VI - -

III - -

+ расщепление ДНК - отсутствие растепления ДНК

2.5 Нуклеолитическйя активность геминпептидов (X, IX) в отношении вирусной ДИК Дня выявления механизмов вирулицидной активности производных гемина исследовалось влияние геминпептидов (X) и (IX) на целостность ДНК вируса герпеса простого как в составе цельною в ир и о на. так и изолированной с применением метода ПЦР

Кроме того, исследовалось влияние геминпептидов на ДНК фага X. При анализе данных электрофореза в агарозном геле в дорожке с фаговой ДНК после контакта с геминпептидом (X) в течение 1 часа ампликоны к ДНК фага отсутствовали, тогда как при использовании аоды вместо препарата полоса амтшиф ицированного участка ДНК не отличалась от полосы с контрольным образцом ДНК фага (табл. 17, рис. 4).

Аналогичные результаты были получены после контакта ДНК вируса герпеса с геминпептидом (IX) в течение 60 минут.

Рис. 4 Анализ нуклеазной активности производных гемина общей формулы(П) in vitro в агарозном геле, 1- контроль; 2- ДНК фага лямбда з буфере; 3- ДНК фага лямбда лямбда после инкубации с геминпептидом(Х) в (ЮМ) в течение 1 часа (Для наглядности верхняя часть электрофоре граммы не приведена).

Таблица 17

Влияние геминпептида (X) на целостность вирусных ДНК

Вирусная ДНК Воздействие геминпептида (X) Результаты ПЦР анализа

Конц,М Время воздействия, мин

ДНК фага К 00 0 +++

10"4М 30 ++

10"4М 60 -

ДНК вируса герпеса простого 00 0 +++

игЧм 30 +++

ю^м 60 -

+ наличие ДНК - отсутствие ДНК

Проведенные исследования с вирусом герпеса с инфекционным титром 5 ТЦД50 показали, что полная деградация вирусной ДНК происходит лишь при увеличении времени воздействия до двух часов (табл 18) Таким образом, на примере соединений (X) и (IX) показано, что геминпептиды способны расщеплять как изолированную вирусную ДНК, так и ДНК в составе инфекционного вириона

Таблица 18

Влияние геминпептидов (X), (IX) на ДНК вируса герпеса в составе _цельного вириона_

№ проб Конц-я в-ва, М Время воздействия, мин

15 30 60 120

1 10"4 ++++ +++ ++ 0

2 10'5 ++++ ++++ +++ 0

3 Плацебо ++++ ++++ +++ +++

4 Контроль вируса ++++ ++++ +++ +++

2 6 Взаимосвязь между структурой и функцией, выбор наиболее активного соединения Сравнение структурных особенностей заместителей, вирулицидной активности и нуклеолитической активности в отношении вирусной ДНК (табл 17,18) и модельной плазмидной ДНК (табл 16) позволяют сделать заключение о важности присутствия в молекуле производного гемина основных заместителей, особенно остатков аргинина Так, бис-аргининовое производное гемина IV и гемин-октапептид XI, содержащие в своем составе по 2 остатка аргинина, непосредственно связанных с остатком гемина, наиболее эффективны в отношении вируса полиомиелита (степень ингибирования > 4,0 1о§10) и достаточно активны в отношений вируса герпеса (табл 12,13,14) Соединение V, с 2-мя остатками Ьуэ, несколько менее активно, чем соединения IV и XI К тому же способ синтеза V более трудоемок и дорог, как и соединения XI, представляющего собой конъюгат гемина с длинным сложным пептидом Поэтому выбор соединения IV для дальнейшего развития представляется обоснованным вследствие оптимального сочетания его свойств Так, соединение IV - водорастворимое, низкомолекулярное, доступное и экономически целесообразное, так как синтез его отработан и прост, а необходимую вирулицидную активность (>4,0 1о£10) проявляет при низкой концентрации 10"5М

Наиболее высокая вирулицидная активность по отношению к вирусу герпеса выявлена у соединения III, синтез которого несложен, однако оно нерастворимо в воде

2 7 Рекомендации по дальнейшему развитию исследованных соединений и созданию композиций на их основе Учитывая, что в ряду синтетических производных гемина были выявлены как водорастворимые, так и гидрофобные вирулицидные агенты, то на их основе возможно создание большого разнообразия антисептических композиций. Например, водорастворимые производные гемина могут применяться в виде водных растворов, лосьонов, гелей, спреев без добавления спиртов Нерастворимые в воде производные геминов могут применяться в составе суппозиториев, лингвальных таблеток, кремов, гелей, помад

2 8 Краткое обсуждение На основании результатов, приведенных в таблицах 16-18, можно заключить, что нуклеолитическая активность геминпептидов является одним из основных механизмов вирулицидного действия и проявляется как в

отношении изолированной вирусной ДНК, так и в составе

цельного вириона

Действительно, полученные нами экспериментальные результаты свидетельствуют о парадоксально более значительной вирулицидной активности исследованных соединений против устойчивого к физико-химическим воздействиям полиовируса, лишенного оболочки, по сравнению с противогерпетической активностью

По-видимому, наличие основных групп у производных гемина IV, V, XI и -ОН групп у соединения III облегчает взаимодействие с фосфатными группами липидных мембран и нуклеиновых кислот вирусов

Устойчивые, водорастворимые низкомолекулярные биодеградируемые и биосовместимые, получаемые синтетическим путем производные гемина функционально имитирующие нуклеазы, имеют существенные преимущества как противовирусные агенты перед белковыми нуклеазами, выделяемыми для этой цели из организмов животных, которые обладают рядом недостатков (большой молекулярный вес, низкая стабильность и др )

При сравнении вирулицидности по отношению вирусу герпеса, имеющему липидную оболочку, и каталитических по отношению к ЦО ПНЖК свойств(коэффициента f) ряда геминпептидов видна корреляция между ними Так, соединения с высоким значением коэффициента f (III, V) более эффективны против вируса герпеса по сравнению с соединениями, имеющими более низкие значения f (XI, VII, IX), что подтверждает применимость предложенного нами критерия- коэффициента f, - в качестве элемента рационального отбора производных гемина, перспективных для исследований их вирулицидности против оболочечных вирусов (табл 19)

Таблица 19

Сравнительное изучение биологических и физико-химических свойств синтетических производных гемина

Номер соед Нуклеолит. активность* f Вирулиц активность**

рН4 4 pH 7 5 Полио вирус вгч

VII - - > 7,5 3,5 2,7

IV + + 25 4,5 2,75а

V + + >27 4,5 3,6

XI + + 12 4,5 3,0а

24

X + + 9,5 - -

IX + - 1,9 4,0 2,75

III - - >25 3,2 4,5

VIII + + 2,7 -

VI - - 3,75 -

*- по отношению к плазмидной ДНК pGem, **- степень ингибирования вируса lg, при концентрации ГП 10-4 М (лучший результат за 30-60 мин), f - коэффициент, характеризующий эффективность катализа окисления ПНЖК, а - результат получен через 10-15 минут воздействия производного гемина, ВГЧ- вирус герпеса человека, тип I

При этом нужно учитывать сложный состав мембран, разнообразные, в том числе рецепторные взаимодействия с ней веществ, а так же собственную биологическую активность заместителей гемина, как в соединениях (XI, VII, VIII).

Действительно, вряд ли можно утверждать, что в ряду исследованных производных гемина наблюдается совершенно ясная корреляция между физико-химическими и вирулицидными свойствами, но для наиболее активных соединений отмечается хорошее соответствие между предсказываемой на основе данных нуклеолитической активности и коэффициента f и наблюдаемой вирулицидной активностью

Низкая цитотоксичность, высокая вирулицидная активность производных гемина (степень ингибирования вируса 4,0-4,5 log10) делают этот класс соединений привлекательным для дальнейшего развития как в научном, так и в практическом отношении, в том числе для создания вирулицидных препаратов нового поколения для потенциального индустриального применения в составе дезинфектантов, антисептических и терапевтических средств с вирулицидным действием

Выводы

1 Изучены свойства и показана вирулицидная активность производного пиридина «ДОПД»

2 Создана новая композиция антисептического средства на основе «ДОПД», обладающая широким спектром вирулицидной активности при низкой концентрации ДВ (0,01%)

3 С применением целенаправленного молекулярного дизайна получена группа синтетических производных гемина, обладающих высокой вирулицидной активностью

4 Изучены и отобраны производные гемина, обладающие оптимальными для дезинфектанта свойствами-водорастворимостью, устойчивостью, прогнозируемой низкой токсичностью, биосовместимостью и биодеградируемостью

5 Установлена способность исследованных производных гемина расщеплять вирусную ДНК

6 Предложены механизмы вирулицидного действия исследованных производных гемина, заключающиеся в способности катализировать окисление ПНЖК мембран и деструктировать НК вируса

7 На основе выявленной взаимосвязи между структурой, физико-химическими свойствами и вирулицидной активностью предложены основы рационального конструирования более совершенных вирулицидных агентов данного ряда

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1 Перепелкин П Ю, Желтухин С Л , Кондрашина Н Г , Савченко В И, Носик Н Н / Создание на основе пиридинов соединений, обладающих вирулицидной активностью // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина», М, 14-17 марта 2006, с 140, 2. Желтухина Г.А, Лобанова Т Н, Небольсин В Е , Носик Н Н, Носик Д Н, Желтухин С Л / Конъюгаты гемина с пептидам в качестве биосовместимых искусственных нуклеаз и ингибиторов протеиназы ВИЧ // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина», М, 14-17 марта 2006, с 162-163,

3 Носик НН, Носик ДН Дерябин П.Г, Желтухин С Л /

Вопросы биобезопасности и вирулицидные свойства дезинфицирующих средств // «Дезинфекционное дело», М, 2006, № 3, с 33-38.

4 Желтухин С Л, Носик Н Н, Небольсин В Е и др /

Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, композиция и применение Авторская заявка на изобретение // М, 2007

Внедрение

1 Инструкция по применению субстанции дезинфекционной «Акванидин» №1/06 от 05 12 06

2 Инструкция по применению жидкого мыла - кожного антисептика «Доктор Грамс» №2/06 от 19 04 07

Подписано к печати_Формат 60 х 84/16 Бумага

писчая

Тираж 100 экз Заказ №_

Московская государственная академия тонкой химической технологии им М В Ломоносова

Издательско-полиграфический центр 119571, г Москва, проспект Вернадского, д 86

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Желтухин, Сергей Леонидович

Использованные сокращения.

Введение.

Часть I. Обзор литературных данных

1.1. Вирулицидное действие дезинфицирующих средств и антисептиков.

1.2.Антисептики, обладающие вирулицидными свойствами.

1.3. Механизмы антимикробного действия ПАВ.

1.4. Искусственные нуклеазы как основа создания вирулицидных препаратов.

1.5. Методология испытаний дезинфицирующих средств и антисептиков.

1.6. Цели и задачи работы.

Часть II. Собственные данные

Глава 1. Материалы и методы.

1.1. Тест-вирусы.

1.2. Клеточные культуры.

1.3. ДВ, композиции и коммерческие препараты.

1.4. Тест-объекты.

1.5. Методика исследования нуклеолитической активности производных гемина по отношению к плазмидной ДНК.

1.6 Определение целостности ДНК методом ПЦР.

1.7. Структура вирусологического исследования.

1.8. Методы изучения и оценки токсичности и статистическая обработка данных.

Глава 2. Изучение вирулицидной активности производных пиридина и композиций на их основе.

2.1. Краткое введение

2.2. Получение производных пиридина.

2.3. Свойства соединения ДОПД.

2.4. Изучение вирулицидных свойств пиридинсодержащего соединения ДОПД гидрохлорида.

2.5. Создание композиций на основе производного пиридина.

2.6. Краткое обсуждение.

Глава 3. Изучение вирулицидной активности производных гемина.

3.1. Краткое введение.

3.2. Схемы получения производных гемина.

3.3. Пути целенаправленного молекулярного дизайна производных гемина.

3.4. Свойства соединений.

3.5. Изучение вирулицидных свойств производных гемина.

3.6. Исследование нуклеолитической активности производных гемина.

3.7. Описание взаимосвязи между структурой и функцией, выбор наиболее активного соединения.

3.8. Рекомендации по дальнейшему развитию исследованных соединений и созданию композиций на их основе.

3.9. Краткое обсуждение.

Часть III.

Обсуждение результатов.

1.1. возможные механизмы вирулицидного действия производного пиридина ДОПД и композиции на его основе.

1.2. механизмы вирулицидного действия производных гемина

1.3. взаимосвязь между структурой и активностью в ряду исследованных производных гемина.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование вирулицидной активности производных пиридина и гемина и создание на их основе композиций с антисептическим действием"

Несомненны успехи медицинской науки и практики в ликвидации и снижении в десятки и сотни раз заболеваемости от многих инфекций. Однако инфекционные болезни не отошли на второй план и являются актуальной проблемой здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения, из 50 млн. человек, ежегодно умирающих в мире, у более чем 16 млн. причиной смерти являются инфекционные заболевания.

Инфекционные заболевания находятся на первом месте в структуре общей заболеваемости нашей планеты, так как примерно 70% регистрируемых заболеваний имеют инфекционные признаки.

Доказано, что отдельные раковые, сердечно-сосудистые заболевания, а также заболевания органов пищеварения имеют инфекционное происхождение.

Человечеству в 20 веке удалось ликвидировать только одну инфекцию - натуральную оспу и получить тридцать шесть новых инфекционных болезней. В силу многих причин, в мире количество населения, страдающего от инфекционных заболевании увеличивается, а не уменьшается.

Огромное число микроорганизмов, населяющих наш организм, находится с ним в различных отношениях - от взаимовыгодных до антагонистических. Около трех с половиной тысяч видов микробов при попадании в организм могут вызывать патологический процесс, который проявляется в виде инфекционной болезни; при этом не все микроорганизмы изучены.

Возбудителями до 90% инфекционных заболеваний, часто носящих эпидемический и даже пандемический характер, являются именно вирусы. Трудность разработки этиологических средств лечения и ограниченность выбора эффективных противовирусных препаратов заставляет обратить особое внимание на разработку средств, обладающих способностью уничтожать или инактивировать вирусы в окружающей среде, препятствуя распространению инфекций. Поэтому разработка эффективных дезинфицирующих и антисептических препаратов, обладающих вирулицидными свойствами, является важным и необходимым элементом в борьбе с вирусными инфекциями [1].

При выборе дезинфекционных технологий существенным является то, что разные объекты характеризуются различными уровнями вирусной контаминации, и при этом микроорганизмы различных групп и видов обладают различающейся устойчивостью к тем или иным дезинфектантам и антисептикам.

Главной задачей дезинфекционных технологий является предотвращение попадания или инактивация патогенного микроорганизма на этапе его проникновения в организм человека, а именно антисептическая обработка, т.е. система мер быстрого подавления микроорганизмов на коже и слизистых оболочках человека. Основным ее методом является обработка щадящими дезинфицирующими веществами с учетом спектра их антимикробной активности и чувствительности конкретных возбудителей.

Быстрая и эффективная дезинфекция инвазивных и операционных поверхностей на теле пациентов, обработка рук хирургов, слизистых полостей рта и гениталий была и остается одной из первостепенных задач в этой области.

В связи с появлением сложных и дорогих влаго- и хемо-чувствительных многокомпонентных устройств, предназначенных для введения внутрь организма, асептика и антисептика разнообразных медицинских устройств также является одной из самых острых проблем современной дезинфектологии.

Актуальна также проблема обработки ран в условиях ЧС, для решения которой необходим подбор высокоэффективных ДВ и приемлемой формы применения для экстремальных условий (салфетки, распылители и др.).

В настоящее время в нашей стране разрешено к применению около 450 дезинфицирующих средств - химических препаратов, многие из которых обладают лишь слабой, недостаточной вирулицидной активностью или вовсе вирулицидами не являются [2]. При этом более 35% дезинфицирующих средств относится к группе ПАВ-ЧАС. Обладая целым рядом ценных качеств (малая токсичность и экологическая безопасность, наличие моющих свойств, достаточная бактерицидность и др.), такие дезинфицирующие средства характеризуются недостаточной вирулицидной активностью, что ограничивает сферу их применения в современных условиях эпидемиологического неблагополучия и существующей угрозы биотерроризма.

В связи с дополнительными специфическими требованиями, предъявляемыми к антисептикам с вирулицидным действием[1], их выбор еще более ограничен, а так как потребность в них очень велика, то разработке вирулицидных антисептиков уделяется особое внимание.

Целью настоящей работы явился поиск новых соединений -потенциальных ДВ, обладающих высокой вирулицидной активностью, и создание на их основе новых низкотоксичных и высокоэффективных композиций дезинфектантов и кожных антисептиков.

Часть I. Обзор литературных данных

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Желтухин, Сергей Леонидович

95 Выводы

1. Изучены свойства и показана вирулицидная активность производного пиридина «ДОПД».

2. Создана новая композиция антисептического средства на основе «ДОПД», обладающая широким спектром вирулицидной активности при низкой концентрации ДВ (0,01%).

3. С применением целенаправленного молекулярного дизайна получена группа синтетических производных гемина, обладающих высокой вирулицидной активностью.

4. Изучены и отобраны производные гемина, обладающие оптимальными для дезинфектанта свойствами: вирулицидностью, водорастворимостью, устойчивостью, прогнозируемой низкой токсичностью, биосовместимостью и биодеградируемостыо.

5. Установлена способность исследованных производных гемина расщеплять вирусную ДНК.

6. Предложены механизмы вирулицидного действия исследованных производных гемина, заключающиеся в способности катализировать окисление ПНЖК мембран и деструктировать НК вируса.

7. На основе выявленной взаимосвязи между структурой, физикохимическими свойствами и вирулицидной активностью предложены основы рационального конструирования более совершенных вирулицидных агентов данного ряда.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Желтухин, Сергей Леонидович, Москва

1. Носик Н.Н., Носик Д.Н. / Вирусные инфекции и дезинфекция// РЭТ-инфо, 2006, №3, с.13-17.

2. М.Г. Шандала /Оценка вирулицидной активности дезинфицирующих средств и проблемы ее тестирования// Дезинфекционное дело, 2004, №3, с. 41-43.

3. Красилышков А.П., Справочник по антисептике, Минск, изд-во «Высшая школа», 1995.4. «Handbuch der Antiseptic», 1987, т. II, часть 3.

4. Л.Б. Борисов //Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. /М., «Медицинское информационное агенство», 2005.

5. М.Д. Машковский. //Лекарственные средства. Пособие для врачей. / М., «Новая Волна», 2005.

6. Merianos J.J. /Quaternary ammonium antimicrobial compounds// Jn: Desinfection, sterilization and preservation. Block S.S., editor. Philadelphia: Lea and Febirger; 1991, p. 225-55.

7. Фрейдлин Л.А., Голубко М.Н. и др. / Глутаровый альдегид.//, М., НИИТЭХИМ, 1983.

8. Шандала М.Г. «Дезинфекционные средства», ч.1 М., 2001;12. «Химическая энциклопедия.» М., «Советская энциклопедия», 1988, т.1, с. 528.

9. В. Halliwell, J. М.С. Gutteridge / Free radicals in biology and medicine.// Third edition, Oxford, Univ. Press, 1999.

10. C.E. Thomas, S.D. Aust / Reductive release of iron from ferritin by Cation Free Radicals of Paraquat and other Bypiridils // J.Biol. Chem., v.261, № 28, p. 13064-13070,1986.

11. K.C. Bhuyan, D.C. Bhuyan, S.M. Podios. /Free radical enchancer xenobiotic is an inducer of cataract in rabbit.// Free Rad. Res. Commun., 1991, v.12-13, p.609-620.

12. Sigman D.S., Vlasov V.V., Zarytova F.V., Lebedev A.V., Fedorova A.S. / Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives.// Boca Ration: CRC Press, FL, 1994.

13. Han H, Schepartz A, Pellegrini M, Dervan PB. /Mapping RNA regions in eukaryotic ribosomes that are accessible to methidiumpropyl-EDTA.Fe(II) and EDTA.Fe(II).// Biochemistry. 1994 v. 33, № 33, pp. 9831-9844.

14. Smith J, Ariga K, Anslyn E V. /Enhanced imidazole-catalyzed RNA cleavage induced by a bis-alkylguanidium receptor. // J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, pp.362-364.

15. Podyminogin M.A., Vlassov V.V., Giege R. / Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Desing and cleavage of tRNA transcripts.//Nucleic Acids Res., 1993, V. 21, pp. 5950-5956.

16. Vlassov V.V., Zuber G., Felden B., Behr J.P., Giese R. / Cleavage of tRNA with imidazole and spermine imidazole constructs: a new approach for probing RNA structure.// Nucleic-Acids Res., 1995 August 25, 23(16), pp. 3161-3167.

17. Koike T, Kimura E. / Roles of zinc(II) ion in phosphatases. A. model study with zinc(II)-macrocyclic polyamine complexes.// J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, pp. 8935-8941

18. Barbier B., Brack A. / Basic polypeptides accelerate the hydrolysis of ribonucleic acids. // J. Am. Chem. Soc., 1988, vol. 110, no20, pp. 68806882.

19. Komiyama M. / Molecular design of artificial materials for selective cleavage of nucleic acids.// Yuki gosei kagaku kyokaishi, 1991, v. 49, № 8, pp. 762-769.

20. Michalowski D, Wrzesinski J, Krzyzosiak W. / Cleavages induced by different metal ions in yeast tRNA(Phe) U59C60 mutants.// Biochemistry,1996, v. 35, № 33, pp.10727-10734.

21. Strater N., Lipsomb W. N., Klablunder T., Krebs B. / Two-metal ion catalysis in enzymatic acyl- and phosphoryl-transfer reactions.// Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, v. 35, pp. 2024-2055.

22. Taira K; Uebayasi M; Maeda H; Furukawa K. / nergetics of rna cleavage implications for the mechanism of action of ribozymes. // protein engineering, 1990, v. 3 № 8, pp. 691-701.

23. Fothergill M., Goodman M.F., Petruska J., Warshel A. / Structure-Energy Analysis of the Role of Metal Ions in Phosphodiester Bond Hydrolysis by DNA Polymerase I. // J Am Chem Soc. 1995, v. 117, pp. 11619-11627.

24. Stern M.K., Bashkin, J.K., Sall,E.D. / Hydrolysis of RNA by transition metal complexes.// J. Am. Chem. Soc., 1990,112, pp. 5357-5359.

25. Morio Yashiro, Akira Ishikubo, Makoto Komiyama./ Dinuclear Lanthanum(III) Complex for Efficient Hydrolysis of RNA.// J Biochem (Tokyo) 1996, v. 120, pp. 1067-1069

26. Morrow J.R., Buttrey,L.A., Shelton,V.M., Berback,K.A. Efficient catalytic cleavage of RNA by lanthanide(III) macrocyclic complexes: toward synthetic nucleases for in vivo applications. J. Am. Chem. Soc., 1992 v.114, pp. 1903-1905.

27. Weiner D.P., Wiemann T., Wolfe M.M., Wentworth P., Janda K.D./ A Pentacoordinate oxorhenium (v) metallochelate elicits antibody catalysts for phosphodiester cleavage. // Journal of the American Chemical Society,1997, v. 119, № 17, pp. 4088-4089.

28. Bashkin J.K., Frolova E.I., Sampath U./ Sequence-specific cleavage of HIV mRNA by a ribozyme mimic. //J. Am. Chem. Soc., 1994, v.l 16, pp. 5981-5982.

29. Matsumura K., Endo,M., Komiyama,M. / Lanthanide complex-oligoDNA hybrid for sequence-selective hydrolysis of RNA.// J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1994, pp. 2019-2020.

30. Komiyama M. / Sequence-Specific and Hydrolytic Scission of DNA and RNA by Lanthanide Complex-OligoDNA Hybrids. // J Biochem (Tokyo), 1995, v. 118, pp. 665-670.

31. Hall J., Husken,D., Pieles,U., Moser,H.E., Haener,R./ Efficient sequence-specific cleavage of RNA using novel europium complexes conjugated to oligonucleotides.// Chem. Biol., 1994, v.l, pp. 185-190.

32. Magda D., Miller,R.A., Sessler,J.L., Iverson,B.L./ Site-specific hydrolysis of RNA by europium(III) texaphyrin conjugated to a synthetic oligodeoxyribonucleotide.//J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, pp. 74397440.

33. Gobel M.W., Bats J.W., Durner G./ En route to synthetic phosphodiesterases: supramolecular phosphoryl-transfer mediated by amidinium-phosphate contact ion-pairs.// Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1992, v. 31, № 2, pp. 207-209.

34. Shinozuka K., Shimuzu K., Nakashima Y., Sawai H./ Synthesis and rna cleaving activities of polyamine derived novel artificial ribonuclease.// Bioorganic & medicinal chemistry letters. 1994, v. 4, № 16, pp. 19791982.

35. Breslow R., Labelle M./ Sequential general base acid catalysis in the hydrolysis of rna by imidazole.// J. Am. Chem. Soc., 1986, v. 108, № 10, pp. 2655-2659.

36. Breslow R., Doherry J.B., Guillot G., Lipsey C./ Beta-cyclodextrinylbisimidazole, a model for ribonuclease.// J. Am. Chem. Soc., 1978, v. 100, № 10, pp. 3227-3229.

37. Usher D.A., Erenrich Evelyn S., Eckstein F./ Geometry of the First Step in the Action of Ribonuclease-A.// Proc Natl Acad Sci USA. 1972 v. 69, №1, pp. 115-118.

38. Usher DA, Richardson DI Jr, Eckstein F./ Absolute stereochemistry of the second step of ribonuclease action.// Nature. 1970 Nov 14, v. 228, № 5272, pp. 663-665.

39. Lorente A., Espinosa J.F., Fernandez-Saiz M., Lehn J.-M., Wilson W.D., Zhohg Y.Y./ Synthesis of Imidazole-Acridine Conjugates as Ribonuclease A Mimics.// Tetrahedron Letters, 1996, 37, pp. 4417-4420.

40. Tung C.-H., Wei Z., Leibowitz M.J., Stein S./ Design of Peptide-Acridine Mimics of Ribonuclease Activity.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, pp. 7114-7118.

41. Pace, C.N., Heinemann U., Hahn U., Saenger W./ Ribonuclease Tl: Structure, Function, and Stability.// Angewandte Cheni, International Edition, 1991, v.30, pp. 343-360.

42. Endo M., Hirata K., Ihara T., Sueda S., Takagi M., Komiyata M./ RNA hydrolysis by. the cooperation of carboxilate ion and ammonium.// J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, pp. 5478-5479.

43. Muche M.-S., Gobel M.W./ Bis(guanidinium) alcohols as models of staphylococcal nuclease : substratebinding through ion pair complexes and fast phosphoryl transfer reactions.// Angew. Chem., Int. ed. Engl., 1996, v. 35, № 18, pp. 2126-2129.

44. Bashkin J.K., McBeath R.J., Modak A.S., Sample K.R., Wise W.B./ Synthesis and characterization of oligonucleotide peptides.// Journal of organic chemistry, 1991, v. 56, № 9, pp.3168-3176.

45. Kierzek R./ Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides.// Nucleic Acids Res. 1992 Oct 11,20(19), pp.5079-5084.

46. Zimmer Ch./ Effects of the antibiotics netropsin and distamycin A on the structure and function of nucleic acids.// PNAMB. 1980.

47. Thrum H., Haupt I., Bradler G., Zimmer Ch./ Antimicrobial and antineoplastic chemotherapy.//Czech. Med.Press, Prague. 1972. v.I, pp.819-826.

48. Arcamone F., Bizioli F., Canevazzi G., Grein A. German Patent 1,027,667,1958.

49. DiMarco A., Soldati M., Fioretty A./ Influence of netropsin and distamycin A on the secondary structure and template activity of DNAV//Acta Unio Int. Contra Cancram, 1964 v.20, p.423

50. Shuhmarm E., Haupt I., Thrum H., Taubeneck U., Allg Z.I Effect of distamycin A and netropsin on normal cells and wall-less cells of Escherichia coli W 1655 F+J.//Mikrobiol. 1974, v.14, pp. 321-327.

51. Ratuld Y., Werner G.H./ Progress in antimicrobal and anticancer chemotherapy.// Univ. Tokyo Press, Tokio, 1970, v.2, p. 14.

52. Hahn F.E. // Antibiotics./ Springer-Verlag, Berlin and New York, 1974, v.3

53. Hahn F.E. // Antibiotics./ Springer-Verlag, Berlin and New York, 1974, v.3

54. Puschendorf В., Peterson E., Wolf H., Werchau H., Granicke H./ Antimicrobial and antineoplastic chemotherapy.// Czech. Med. Press, Prague, 1972, v.l, p.823.

55. Reinert K.-E. / Physico-chemical properties of nucleic acid.// Academic Press, 1973, New York, v.2, chapter 16, p.319.

56. Waring M.J. / Molecular Basis of Antibiotic Action.// Wiley, New York, 1972, p.173.

57. М.Д. Машковский. «Лекарственные средства». TOO «Медицина», 1992.

58. Makarov A.A. Ilinskaya O.N./ Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets (review).// FEBS Lett., 2003, v. 540, pp. 15-20.

59. Burakova E.A., Silnikov V.N./ Molecular Design of Artificial Ribonucleases Using Electrostatic Interaction.// Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004, v. 23(6/7), pp. 915-920

60. Методические рекомендации «По определению вирулицидной активности препаратов». МЗ СССР № 1119-73 От 06.09.73г.

61. Maniatis Т., Fritish Е., Sambrook J./ Molecular Cloning ( A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor// N.-Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

62. Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Перевод с английского Н.К. Янковского. // М., «Мир», 2002, с. 589.

63. Желтухина Г.А., Евстигнеева Р.П., Лубсандоржиева JI.К., Лукашова Е.А., Соловьева А.Б. / Каталитическая активность геминпептидов в реакции гидроксилирования холестерина. //Журн.физ.химии, 1995, т.69, №11, с. 1972-1974.

64. Евстигнеева Р.П., Лубсандоржиева Л.К., Желтухина Г.А. и др. / Синтез моно-С-аминоацильных производных протогемина IX твердофазным методом .//Биоорганическая химия, 1993, т. 19, №6, с.664-669.

65. Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.36.2.У.5242.7.07 от 11.07.2007 г Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучию человека.

66. Ляхов С.А., Ляхова Е.А., Литвинова Л.А., Андронати С.А. и др. / Синтез и свойства нового типа лигандов ДНК-комбилексина и бисинтерлексинов на основе амиксина// Химико-фармацевтический журнал,2003, т. 37, №9, с. 36-41.

67. Овчинников Ю.А. «Биоорганическая химия», М., 1987, «Просвещение».

68. Сухомлинов Б.Ф., Коробов В.Н., Гончар М.В. и др. / Сравнительный анализ пероксидазной активности миоглобинов у млекопитающих.// Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 1987, т. XXIII, №1, с. 37-42.

69. И.А. Василенко, И.П. Ушакова, Е.И. Феллипович, Г.А. Серебренникова, Р.П. Евстигнеева /Обратимая оксигенация ферропорфиринов в бислойной фосфолипидной мембране// ДАН, 1978, т. 241, №4, с.963-965.

70. Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А, Рожкова Е.А. /Модели пероксидаз./ Кинетика и катализ, Т. 40, №2,1999, с. 256-260.

71. Ениколопян Н.С., Соловьева А.Б. /Катализ металлопорфиринами реакций нецепного окисления олефинов.// Журн.физ.хим., 1988, т.62, №9, с. 2289-2307.

72. M. Glei, S. Klenow, J. Sauer, U. Wegewitz, K. Richer, B.L. Pool-Zober / Hemoglobin and hemin induce DNA damage in human colon tumor cell clone 19A and in primary human colonocytes// Mutation Research, 2006, v. 594, p. 162-171.

73. Е.Б. Морошкина, Н.Г. Юдина, M.A. Кравцова, E.M. Глибин / Взаимодействие ДНК с амфолитами на основе актиномицина.// Молекулярная биология, 1998, т. 32, с. 652-656.

74. Рябинин В.А., Горбунов Ю.А., Синяков А.Н. / Сиквенсинальные конъюгаты малобороздочного лиганда с инозин-содержащими олигодезоксирибонуклеотидами// Биоорган, химия, 1997, т. 23, с. 539-543.

75. Suiyama Н., Kilkuskie R., Hetch S., Van der Marel G., Van Boom J. /An efficient site-specific DNA target for bleomycin.// J. Am. Chem. Soc., 1985, v. 107, p. 7765-7767.

76. Евстигнеева Р.П, Огрель C.A., Желтухина Г.А, Небольсин В.Е. /Синтез псевдопептидов на основе биогенных аминов.// ДАН, 1995, т. 340, №2, с. 260-262.

77. Настоящая работа выполнена в лаборатории онтогенеза вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

78. Искренне благодарен д.м.н., профессору Носику Николаю Николаевичу за ценные советы и неослабное внимание к данной работе на всех этапах ее проведения.

79. Весьма признателен профессору Носику Дмитрию Николаевичу и Калниной Людмиле Борисовне за помощь в проведении исследований с вирусом ВИЧ.

80. Благодарю весь коллектив лаборатории онтогенеза вирусов и особенно в.н.с. Кондрашину Нину Геннадиевну, Черткову Тамару Дмитриевну, Жигулина Алексея Олеговича за практическую помощь в выполнении работы.