Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексообразование и спектроскопия гемина, гемсодержащих белков в мицеллярных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Комплексообразование и спектроскопия гемина, гемсодержащих белков в мицеллярных системах"

о

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И. К. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ГИОРГАДЗЕ Автандил Геннадьевич

УДК 577.158

КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ И СПЕКТРОСКОПИЯ ГЕМИНА, ГЕЛ1СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ В МИЦЕЛЛЯРНЫХ СИСТЕМАХ

Специальность 03.00.02 — Биофкзича

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Ордена Ленина Институте химической физики АН СССР.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

4',-шита состоится « 1 1990 г. в

. час. на заседании Специализированного совета К.053.05.68 в Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова (Москва, Ленинские горы, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета' МГУ имени М. В. Ломоносова.

доктор химических наук Давыдов Р. М.

доктор физико-математических наук Шаронов Ю. А.; кандидат биологических наук Тимофеев К. Н.

Институт экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического центра АМН СССР.

Автореферат рязослсш

1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

ГУЛЯЕВ Б. А.

.ош?. [

- ! ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ш

Актуальность проблемы. Известно, что многие ферментативные процессы протекают на поверхности Сиомембран в составе сложных ансамблей, где Еода выполняет, по-видимому, ре^ляторную роль и определяет надмолекулярную структуру этих ансамблей. Немал.' зажная роль отводится также структуре воде в области локализации простетической группы в; г/три кол скули фермента. Поэтов изучение механизмов влияния мембранного микроокружения на структуру белков и других биологически активных веществ и их реакции является одной из ваазшх задач современной биологической физики. Сложность молекулярной организации природных мембран и их микрогетерогенность существенно затрудняют изучение механизма'их действия н* клеточные процессы. Поэтому в последнее время ккрокое развитие получили исследования »о ферментативным реакциям в обращенных мицеллах, образуемых по-зерхиоА'НО-активными веществами- /ПАВ/ и липвдьми в неполярнкх растворителях. Интерес к отим системам, в частности, объясняется тем, что согласно результатам физико-х1ь/'"веских исбледо-ваний микроокружение веществ в полярной ядре мицелл по ряду физических параметров /полярность, вязкость, структура водного окружения, распределение поверхностных зарядов/ сходно с таковыми на поверхности клеточных мембран и в области локализации простетической группы внутри молекулы фермента, т.е. обращенные мицеллы являются относительно простой и удобной физической моделью некоторых биосистем. Цель работы состояла в изучении 1/влияния .систем обрьгёггкю; мицелл на структуру солюбилизоЕаннкх генболнов и гената и

2/ термодинамических к кинетических особенностей процессов кокплексообразования в организованных молекулярных средах на примере реакции геысодержащих белков и гемина с низкоыолеку-ЛЯрНШИ лиганцами.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематические термодинамическое исследование комплексообразования гемина и гемсодержащих белков с низкоыолекулярнши лигандами в системах обращенных мицелл. Установлено, что константы стойкости комплексов гемина и гембелкоЕ с низкомолекулярными лигандами н о г их системах зависят от степени гидратации поверхностно-активного вещества, строения и заряда его полярной группы и и о гут значительно отличаться от соответствующих констант в водно-органических смесях. Показано, что физико-химические свойства белков б системах сбешенных мицелл ногу? зависеть от их относительного содержания в мицеллярной фазе, что объясняется ее микро.гетерогенностью. Епервые изучена спектральные характеристики гемина и его комплексов с низконолекуляр-нши лигандаыи в системах обращенных мицелл. Изучено действие мицеллярного микроокружения на диыеризацию гемина и влщ иио димеризации геш-ша на его взаимодействие с низ коболе ку-лярныии лигандами.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результат! расширяют представления с механизмах влияния молекулярно организованных систем на физико-хкмкческу.е свойства белков, г< мина и реакций их ксмплексообразованкя с ниэномолекулярнкми лигадцами. Они могут быть использованы при разработке практ! чески важных биошшегических процессов и в исследованиях по механизма; регуллторного действия биологических мембран на

клеточные процесса.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Ш Всесоюзном симпозиуме "Цитохрсм' Р-450 и защита окружающей средь"" /Новосибирск, 1987/' и на ежегодных научных конференциях в Институте химической физики АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Б первой главе приведен обзор литературных данных по строению обращенных мицелл и каталитическим свойствам солюбилизогзлных в них ферментов и низкомолекулярных соединений. Приведены данные по спектроскопии железопорфириновых комплексов и гем-белков. Во второй главе подробно описаны методы получения ыи-целлярных систем и включения в лих белков, используемые материалы и методы исследования. Экспериментальные результат! к их обсуждение изложены в остальных двух главах. Диссертация изложенагна 166 страницах машинописного текста, иллюстрирована 66 рисунками и 25 таблицами. Библиография включает 166 наименований,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава Ш. Спектральные характеристики гемсодеркащих белков, Гчлша и гема и их комплексов с низксмолекулярными лигэядами в мкцеллярных системах поверхностно-активных веществ

В этой главе изложены результаты исследований по спектроскопии поглощения, ЭПР и кругового дихроизма гензелков, же-лезо/Ш,П/порфкринов и их комплексов с низ комол екуллрнши ли« гаидами в мицеллярннх системах.

Влияние обращенных мицелл на спектральные свойства ци-тохрома с зависит от заряда полярк эс групп ЛАВ, знутриьшлл-

'-•4 -

лярного содержания воды и рН.

В сильногидратирозанных мицеллах катнонгюго бромистого цетилтриметиламмония /ЦТАБ/ при нейтральных рН спектры поглощения и КД окисленного цитохрома с совпадают с таковыми в водных растворах. При низких значениях степени гидратации ГЬ-З /Л < 10/ в спектре поглощения белка исчезает так называемая "наганная полоса" при 695 ш, обусловленная электронным переходом с переносом заряда от ■ серы ыепчюн>ша-ЕО к гемсвсму железу /Ш/, и сильно изменяется '¡.'0{>ма наведенного эффекта Коттона простетической группу б области полосы Соре. Сильные спектральные изменения в сла-богидратированных мицеллах, по-видимому, являются следствием структурных перестроек в молекуле белка за счет частичного удаления прочно связанной воды слабогидратированньши молекулами ПАВ ыицеллярной поверхности, уменьшения активности вода-и полярности м/.кроокрукения солюбилиэовашюгб белка, которые влияют на величину рК различных ионизуемых групп полипептидной цепи и изменения активности протоков и ионов гадроКсвда. Спектры поглощения, ЗД и ЭПР, образующегося при низких рН высокоспинового конформера цитохрома с практически не зависят от величины £ .

Мицелдлргше системы анионных ПАВ /додецилсульфат натрия (дЦСУа),

диоктилсульфссукцинат натрия (АОТ) / оказывают более рначительное влияние на конформаци» цитохрома с, чем мицеллы Щ'АЕ, В/мицеллярных системах ДДС^а при в спектрах поглощения солтошшзовмшого белка отсутствует полоса поглощения при 6У5 им, что свидетельствует об отсутствии серы ивъюнкш-еО в координационной сфчре геиового железа /Ы/.

■При Р.4 Ю преобладает конформер цитохрома с с гемовыи железом в низкоспиновом состоянии.- Увеличение содержания вода приводит к возникновению нового конформера белка о гемовым железом /Ш/ в высокоспнновом состоянии с характерным спектром ЗПР.Образование высокоспинового конформера г. сильногидрати-рованных мицеллах объясняется электростатическими взаимодействиям!' ме:кду солюбилизованным цитохрсмом о и отрицательно заряженной поверхностью мицеллы, которые усиливаются за счет диссоциации противоионов. Аналогичны?.! образом влияет на спектральные свойства солюбилизовонного цитохрома с микроокружение мицелл АОТ. Еключение цитохрома с в обрушенные мицеллы анионных ПАВ сопровождается сильными изменениями формы наведенного эффекта Коттона, характер которых зависит от химического строения молекулы ПАВ и с .епени ее гидратации /&/ в ми-цоллярных ансамблях /рис. I/.

п «[

IV-

Рис Л Зависимость спектрсв КД цигохроьа с, еолюбилкзо-вакнсго обращенными мипеллш-и 0,1 М ДДСУя, от содержания внутрлшцелллрнпй зоды: I.- £ = 7; 2.- (I =»10; 3.- Я «151 4.-30

... б -

В мицеллярных системах ДЦС//а при изменении X в спектрах кругЬвого дихроизма еолюбилизоваиного белка сохраняются дво иэоэллиптичоские точхи в области 392 нм.и 412 нм /рис.1/ сто свидетельствует о переходе между днумя кокформерами с ростом содержания воды в мицеллярной системе. В обращенных мицеллах ДЦС^Уа относительное содержание отих конформеров зависит также от соотношения между концентрациями белка и мицелл. При увеличении концентрации цитохрома с /концентрация и степень гидратации ПАЗ при этом поддерживаются постоянными/ возрастает относительное содержание одного из конформеров. Аналогичный еффект вызывает уменьшение концентрации ПАВ при постоянной концентрации белка и степени гидратации ПАВ, Подобный, но менее выраженный эффект наблвдается а обращенных мкцеллах ЛОТ. сто явление находит простое объяснение в рамках представлений о гетерогенности мицеллярных систем, если предположить, что сродство беЛка к мицеллам и его конформацкя зависят от их размеров.

Резулматы спектроскопических исследований феррйпарок-сидазы и метгемоглоО'ина в системах обращенных мицелл анионных и катионных ПАВ показали, что .влияние мицеллярного ыик-' роокружениия на солюбилизованный белок существенно зависит от его природы. Солюбилизация феррипероксадазы «ицеллярннми ансамблями ЦГАБ.и ДЦСЛ/а при И больше практически не влияет на ее спектры поглощения, ВПР и кругового дихроизма. Аналогичное влияние оказывают обращенные мицеллы на спектральные характеристики фторидного и цианидиого комплексов пероксидазы.

В отличие от пероксидазы солюбилизшдия гемоглобина сб-

' ращенными мицеллами оказывает заметное влияние на его спектральные свойства. Включение оксигемоглоС'ила в мицеллы катион-ного и анионного ПАБ приводит к быстрому автоокислекип с образованием метгемоглобина. В мицеллярных системах ЦТАБ спектры поглощения низкоспинового /рН > 9,0/ и высокоспинового /рН ^ 5,5/ конформеров заметно отличаются от соответствующих спектров в водных растворах. Спектр поглощения высокоспинового конформера метгемоглобина в системах сйре-щвнних миселл катионного ПАВ характеризуется максимумами в области 395, 510, 545 /плечо/ и 649 нм, в то время как в буферных растЕорах /рН 5,0/ максимумы поглощения этого конформера расположены при 402, 527 /плечо/, 610 и 634 нм. В спектре поглощения низ-ксспинового конформера /рН 9,0/ в той хв мицеллярной система максимумы расположены в облай .1 402, 571 и 620 нм, в тс время как в водных растворах - при 406, 564 и 506 нм. Величиш ' £ слабо влияет на спектральные характеристики гембелка. рК перехода Яеггемогло'бта из низкоспикоеого в шсокоспиновое состояние в обращенных мицеллах ЦТАБ на 2,0 единицы меньше, чем в водной фазе и составляет 6,0+0,15. Смещение рК метгемоглобина в мицеллярной фазе, по-вид!э?оыу, в основном обусловлено изменением его конформационного состояния.

В обращенных мицеллах ДДСЛ'а метгемоглобин дает спектр поглощения гемохроиогенного типа, характерный для гемового железа /Ш/, координированного двумя гистидиковыми остатками. Солюбилизация имидазольного комплекса метгемоглобина не влияет на его спектральные характеристики. Предполагается, что структурные изменения в солюбилизованноы гемоглобине ягляк/г-ся следствием совокупного действия следующих факторов: а/спе-

цинического, взимодействия между мономерами ПАВ. и белком; б/ диссоциации тетрамера на лабильны-з оС- и £ - субъедини-цн и в/ частичной дегидратации белка.

Спектры поглощения и 5ПР гемина, гема и Их комплексов в шцеллярных системах зависят от рН, его концентрации, приводы ПАВ и степени его гадрат^ии. Б мицеллярных растворах ЦТАБ в смеси октан- хлороформ спектр поглощения гемина при, концентрациях ниже 0,о мкМ характеризуется полосами при 399, 481 и 582 нм и совпадает со спектром мономзрной формы гемина в вод-но-отанольном растворе. При повышении концентрации гемина его спектр поглощения трансформируется в спектр, характерный для ¿Х -оксодимера. .Цимерная форма гемина дает сигнал ЗПР с 6,[55, Ц-о « 5,75 и " 2,0, характерный для высокоспиновой Форш гемового железа /Ш/ в окружении ромбической симметрии, которая является следствием ассиметрии аксиальных лиган-дов - ОН" и -оксогруппа. Понижение рН до 3,5 сопровождается сильными изменениями в спектрах поглощения и ЗПР. Спектр Поглощения в этих условиях характеризуется полосами при' 651, 546, 519, 365 им. (.пектр Ы1Р типичен для высонослиновых железо /Ш/порфкрипов в лигандном окружении аксиальной симметрии /^«2,05, ^ =6,0/. При низких значениях рЯ, в отличие-от щелочных рН, форма спектра солюбклизованного гемина практиче-•ски не завжшт от .его концентрации, ото обгоняется диссоциацией ^ -оксидидера на мономеры, В ыонсыерной форме гемина, / *

кото1>ая реализуется при кизиле значению рН, аксиальными ли-.гандаки является 2 ыолекулк воды, в то время как при высоких значениях - Н^О и ОН", Спектральные характеристики димепной .формы гвдиа но зависят от 11 в интервале иогду 10 и ¿0,' При

уменьшении R," от 10 до 1,5 спектр поглощения димерной формы :е-мкка трансформируется в спектр, характерней для моно- или ди-аква- комплекса .телезопорфирина. Изменение концентрация ДАВ не влияет на спектральные свойства солгоо'илизсбеошого гемина. Аналогичным образом влияет на спектральные свойства гемина егю солюбилизация системами обращенных мииелл АОТ. Ековчениа гемина в обращенные мицеллы ДСС.У а сопровождается резким уменьшением констгщты его димеризации. Следует отметить, что сгрсе-нке полярной группы и углеводородной части молекулы ПАВ практически не влияют на спектральные сеойствд мономергай и демер-ных форм железо /И/протопорфкрина IX.

Было установлено, что спектральные характеристики всех форм гейша /димер, мономер, щелочной и кислый хонфсрморы / в обращенных мицеллах изученных ПАВ при > 10 совпадают с таковыми з водных мицеллярных системах отого ПАВ, т.е. структура мицелл практически не влияет на электронную структуру яелзэо-порфирниоэого комплекса. : •

Химическое строение ПАВ и структура мицеллярных агрегатов /мицеллы в водной фазе и неполярных растворителях/ оказывают заметное влияние на рК и константы димеризации /табл.1/. В водных мицеллярных системах рК перехода метду щелочным и кис-лчм конформерями гемина уменьшается в следующем ряду ДЖУа> ' >ЦТА6 > Твкн-60. 3 обращенных мицеллах рК гемина сыещзотол на 1,0*-1,5 относительно к p!i в роднтд мицеллярных системах соответствующих ПАВ, a знак изко:тнич рК зависит от заряда полярной группы ПАВ. 2арисимость рК гемина от укряда поляр:группы ПАВ и ртстуоригеля /ЯоО, углегспород/ i. ^/слон/гена, и чп<: . -¡ости, изменением ..отглльнсго p}¡ у уицогляг»**:!! ного^хшсл» и оО-о-

Таблица I. Константы димеризации и величины рК геыина в ии-целлярных-растворах ПАВ / Кд - константа димеризации в расчете на полный объем системы} Кд - константа димеризации в расчете на объем мицеллярной фазы /

Кицеллярная система

величина

рК

,кдг1

0,1 М ЦГа.Б

ь фосфат,бу- 4,5+0,3 /2,5+0,3/х феро, рН 7,0 " х105

0,1 М ЦТАБ обращенные

мицеллы, 5,6+0,5 /9,8+1,0/х

рИ 7,0,(1 «15 ~ х*1СГ' 0,1 М ДЦ&Уа

в фосфат.бу- 6,2+0,Й /1,0+0.1/х

фере, рН 7,0 ' х103

0,1 М ДДОЛГа

. обращенные мице , "

целлы.рН 7,0 5,0+0,2 /2,7+С.4/х

■ Я - 20 х7о

0,1 М АОТ обращенные мицеллы, рН 7,0 г £•» 20

I* Твин-60 £ фосфат.бу-

фере, рН 7,0 / 3,9+0,15 водно-

слиртовый ра- 6,6+ 0,6 25 створ,рН 7,0

рК-экспе-/1,8+0,2/х рименталь-хЮ4 но, Кд -лит.данные

рК, Кд -/2,6+0,3/х акспери-х10^ менталььо рК-экспэ-50+5,6 . риыонталъ-но,Кд-лит. данные

рХ,. Кд -76+11 экспериментально

Кд - экс-

/2,0+0,2/х /2,2+0л2/х перкуен-хЮ х1Сг тально

/1,3+0.3/х х!0

рК -экспе-рименталь-/3,7+0,9/х но, Кд -хЮ4 лкт.данные рК - зкс-перим-зн-

ТбЛЬНО

ти локализаций гемина.

Из данных, представленных-в табл.1, <;ледует, что б мицеллярных системах ДЦС_|Уа константа димеризации ьшлезо/Ш/про-топорфирина IX на 2-3 порядка меньше, чем в мицеллярных системах других-ПАВ. Б работе эта особенность объясняется специфическим взаимодействием ДЦС с гемовым железом /Ш/.

В конце этого раздела рассмотрены спектры поглощения и сПР комплексов гемина с иыидазолом, цианидом, азидом, фторидом и глутатионои в мицеллярных системах. Показано, что на спектральные свойства комплексов гемина не влиярт химическое строение мицеллообразователя, содержание внутримицеллярной вода и замена нополярного органического-растворителя водой. Обнаружено спектральное сходство между диимидазольным комплексом гемина в обращенных мицеллах и цитохромом и глутатио-новым комплексом гемина и феррицитохромом Р 450.

Изложенные я отом разделе данные свидетельствуют о том, что мицеялярное микроокруженке оказывает слабое влияние на спектральные свойства железо/Ш/псрфиркна, но вызывает заметные изменения в константах равновесия мономер-днмер и "кис-лнй"-ицелочноЙ" конформзр гемина.

Спектры поглощения гема и его комплексов в мицеллярных сист8-я. х. Солюбилизация гема водными мицеллярными системами оказывает довольно сильное влияние на его спектры поглощения, причем величина эффекта зависит от строения полярной группы ЛАВ. На рис.2,3 представлены спектры поглощения гема в водных (Мицеллярных растворах Твика-80 и ДЦСЛг'а. В мицеллах ионогенных ПАВ /ДЦСЛ'а, ЦТАБ/ спектры поглощения гема характеризуется хорошо Еыряженн1мт Оэд- и й^-полосами при 572 и 578 нм и рас-

■-'12 -

цзпленно?. В-полосой. Подобного типа спектры дает гем.в бензо-дн и дихлорэтане, которые не оо'ра~уг<т координационной связи с Fo(i). Спектр гема в кицелллрних системах неионогениых Г1АВ состоит из широкой полосы в видимой области со паборазрешенными

Рис,2 Спектр поглощения гема в водном шстворе 0,1 М ДДСУа, рН 8,0

- 13 -

qq- и Оф^-переходами и интенсивной полосы Соре.. Аналогичны!? пектр имеет геи в 5С# водно-спиртовом растворе. Спектры по-обного. типа характерны для пентакоординировшшых производных вма с Ft|í) в внсокоспиновом состоянии. Можно полагать, 'ко пним из аксиальных лигандов металла являются оксиэтилсновие

Pinna Tbhh,.-6G. Предполагается, что у гема в мицеллярних

р.

истомах ионогенного ПАВ спин иона Ус равен 0 или I.

Природа мицеллообразозателя практически не-влияет на чектры поглощения диимидазольного и дицианидного комплск-эв reui.

saca 1У.Особенности реакции комплексообразовалия геша а

змсодержаших белков в мицеллярных системах поверхностно-

ктивных веществ.

- В этой главе, изложены результаты исследований по комп-

;кгообравоЕанш: гемина и геисодержащих белков с низкомолоку-

фныхи лиганд-ил-; /цианид, кмидпзол, азид, фторид, глутати-

(/' a ciicTr-yait обращенных и водных мицелл ионсгеннж и не-

?;:огешшх ПАВ. :;

Анализ экспериментальна* данннх по' титрованию гемина

:гаг,";>.г.м показал,.ч?о ег'О комплексы с f", -У 3" и глутдги-

юн имеют стохиометрн» 1:1, а с иммдазопом и CjV" -• Ij2.

1гу£иеся константы расковесия / Кк= е- ^^в лгь '

L' о ~ "J L«-*J

¡ученных реакций гемина /Г /с имидазолом 71 т.

~, F и глутатионси в системах сбрацешшх мицелл зависят • рН, хтшческого строения ПАВ и его концентрации, молярно-| отношения ft « [HgOj / ["iIABj s ср,зестап;я гс)шк?.

Для всех изученных комплексов в мицеллярных системах >афик зависимости константы стойкости /f^/ от рН имеет коло-

- 14 -

колообраэиую форму с максимумом в области рН 7,0-8,0. В ми-целлярных растворах всех изученных ПАВ,, за исключением ДЦСУа величина Кк возрастает /до 4 раз/ при уменьшении концентрации гемина от 50,0 мк\1 до 1,0 мкМ и практически не изменяется при дальнейшем уменьшении его содержания вплоть до 0,05' мкМ. В растворах ДЦСЛ' а в указанном диапазоне концентраций гемина Кк не зависит от ега содержания. Влияние концентрации гемина на величину константы стойкости комплексов объясняется тем, что мономерная форма железо/Ш/протопорфирина IX значительно эффективнее, чем токсо-димер связывает низкомолекулярные- лиганды,

В обращенных мицеллах, образуемых ЦТАБ в смеси хлороформ-октан Кк реакции комплексообразования гемина уменьшается с ростом Я- и концентрации ПАВ /при постоянном »качении Я /. Для реакций гемина с Л'д", Р~ и глутатионоц Н^ обратно пропорциональна Я- и концентрация ПАВ /при постоянном эначе нии Я. /. Дггя реакции гемина с имидазолои и цианидом зависимость от И и концентрации ПАВ спрямляется в координатах Кк - £ "2 и ^ - [ПАВ] "2. \\

Очевидно, что экспериментально'определяемая кажущаяся константа равновесия реакции /Кд/ в мицеллярных системах не является термодинамической функцией, а некоторым параметром, характеризующим распределение продуктов и рейтингов в услови ях, когда скорости прямой и обратной реакций одинаковые. В р боте было получено уравнение, свяэыванцее кажущуюся констант равновесия с истинной константой равновесия в мкцелляр-ной фазе'/Кц/ для реакций мелду водорастворимыми реагентами» К* ж1<м /VM [И]. /I /

це Ку- константа равновесия реакции комплексообразования в ицелляр..ой фазе, V - молярный объем мицелл, [м] - концинт-ация мицелл. Б условиях, когда концентрации каждого кэ реа-ентов меньпе полной концентрации мицелл, в выражении / I / ¡¡пользуется концентрация незаполненных мицелл, т.е. мицелл, г содержат-« ни одного реагента. Если концентрация хотя бы иного из реагентов больше полной концентрации мицелл, то в сражение / I / подставляется полная концентрация мицелл, хя бидентатных комплексов гемина с имидаоолом и цианидом

Кк в Км Г у 2 ['0 2 / 2 '

Уравнения / I / и / 2 / удовлетворительно описывают экс-

фкментальные данные по зависимости К^. от объема ыицеллярной

1зы. Кспольеуя формулы /1/и/2/мы оценили константы

бойкости комплексов для мономэрной формы гемина б мицелляр-

)й фазе Кк при различных значениях К, /табл 2/. Из табл.2

1блица 2. Константы равновесия реакции комплексообразования »номерной формы гемина с ниэкомолекулярныйи ли.андами в ■цоллярной (разе системы ЦТАБ / октан-хлороформ / буфер >Н 8,0; 20°С

О/ПАВ Лиганд 2,5 .5,0 • 10 25 вода- 'ШфТ /иг/

эдазол /е,е^1,7/х /3,2+0,5/х /1,5+С.З/х /7,6+1,1/х /2 5+03/ х7о хТо6 Х106 хТо5 хЮС

ид 64+15 59+5,0 42+7,3 42+6,8 36+2,5

орид утатион 10+1,5 7+1,2 76+12,5 5,0+0,8 57+7,5 4+0,55 49+5,6 комплекс не образует

-16 - •

следует, что Ку всех-изученных комплексов в мицеллах с низки содержанием воды /И^ 5,0/ от 1,5 до раз выше, чем в умеренно или сильно гидратироваяных мицеллярных системах. 'При Я выше 10 величина практически не зависит от степени гидратации ПАВ. Повышенное значение ¡^ при низких И может быть • следствием как изменения электронного состояния геыового железа /Ш/ /о чем свидетельствуют результаты спектральных изые рений/ и реакционной способности лигандов вследствие низкой активности воды и пониженной полярности микроокружения, кото рыо,сказывают влияние на гидратацию реагентов и продуктов, т. и относительно низкой относительно низкой точностью оценок, поскольку в этих условиях объем полярных групп ПАВ сравнил с объемом внутримицеллярной воды; Константы стойкости азидного и, особенно, фторидного комплексов гемина в мицелла." с высоким содсрканием воды значительно больше, чем в водно-спиртовом растворе, в то время как соответствующие константы для дтншдазольного и глутатионового комплексов гемина в носколь ко раз меньше, чем в гомогенном растворе. Поветеггые значен;! К^ фторидного к азидного коыплепов могут быть обусловлены, частности, концентрированием лнгандоз в области катионных. групп ПАВ, вблизи которых локализуется плохо растворимый в иоде гемин. В зтой ситуации распределение реагентов внутри мицеллы является неравномерны;.) и при оценке Км следует учиты вать объем не всей мицеллярной ^азы, "а лишь той области, в к торой расположены оба реагента. Соответствующие расчеты с уч том эффекта концентрирования реагентов у мииелЛярной поверхности показали, что для азидного комплекса Ку приближается к значению константы стойкости в водно-спнртоеом растворе, и т

ремя как для фторидного комплекса эта разница в kohctühiojí тойкоси остается достаточно большой. Повкаеннья етойнгсть торидного комплекса в мицеллярной фазе объясняется а/ его окализацией в монослое ПАВ о пониженными полярностью и ак-квностью воды и б/ разной природой транс-лигалдов гемоього елоза /Ш/ по отношению к Г" в мицеллах и Еодпо-спиртоиом

створах. Действием первого фактора в сочетании с поекшсни-м локельного pH в области расположения гемина объясняется ониженная стабильность иивдазольного и глутатионового кодексов гемина.

В об;зщенлкх мицеллах анионных ПАВ гемнн образует конп-ексы не со всеми лигэедамк: в мицеллах ДЦО а он fie реагнру-т с. Г", ар мицеллах ACT - с Г и jY . Существуют две воз-огннс причины слабого взаимо,действия rej/лна с этими лиганда-л: I/ пониженная доступность гемина для гидрофильных анионов а его локализации в монсслсе .анионных ПАБ; 2/ на комплек-ообразованиб година в мицеллярной фазе может оказывать суще-тьенное влияние природа замещаемых аксиальных лигандов. fe/И/ ли лигандов, расположенных в транс-г.оло-теа:«.' т: связываемому :ону. Предполагается, что в иицсллярних. снстс-ках ДДСЛ'а т?ким гшесаеикм лигандом является молекулы ПАБ и 1-гзхсг>иол?.. С тпм предположением согласуется результаты киштичеетех изме-■etíüñ: константы скорости второго поргдк.ъ реакций гемпна с шдазолоч !* азидом'в гвп^лигрнш: скитам«. ДЦС,1Уи ьа нэ-•ЗДК» вше, чоч в раствор^:: Щ.Ц и atpcc ¿at> ОТ.

Константа стойкости имидаяолыюго комплекса гемина в ми* ;елллрной фаз о. аэрозоля ОТ, рассчитанная с учетом объема то.ль-о -полярной части ПАЗ и полного объема водной фазы, при 5'

- 18 -

О О '

равна /1,2+0,2/хЮ'М" . При уменьшении £ до 2,5 К^ имидазо. ного комплекса гемина возрастает до 1,7х10%"*\ Более высок значение Н^ в мицеллах аэрозоля ОТ по сравнению с ее величи ной в мицеллах катионного ПАВ и водно-спиртовом растворе, ni видимому, обусловлено разной природой аксиальных лигандов л мового железа /Ш/ в сравниваемых системах и может быть сдвигом локального рН в области локализации гемина. Причины пов1 шения стойкости этого комплекса в мицеллах АОТ, по-видимому те же, что и в вышерассмотренных мицеллах катионного ПАВ.

Несколько иначе влияет степень гидратации ПАВ на конст; нту стойкости комплексов гемина в обращенных мицеллах MCJYi Константа стойкости имидаэольного комплекса гемина в мицелл; ной фазе увеличивается от 2,5x10® до 5,6хЮ^Г^ при изменений Нот 10 до 40. Ну азидного комплекса гемина, ныротив, с ростом степени гидратации ПАВ уменьшается: при Ü * 10,20,30 и 40 Кц рашы 91,б,. 40, 21,5 и I8.M"*, соответственно. Зав1 симость К^ комплексов гемина в мицеллярных системах от Я

объясняется совокупным действием сл'едупцих факторов; а/ измс

^ i - ;

нение расположения гемина в моьлслое ПАВ, сопровождающееся

■ \ ■ ^

ростом полярности его михроокружения; 6/ изменение локального рН в области локализации желеэопорфирина; в/ понижение локальной концентрации азида, у мицеллярной поверхности с рос том R. из-за увеличения ее поверхностного заряда, вызванного ростом диссоциации противоионов и г/ влияния содержания вну-тримицеллярной воды на взаимодействие ге'мика с гексанолом, присутствущ1ш в данной мицеллярной системе,.

д "м образования иивдазольного Комплекса гемина в обращв ных мицеллах ДЦС^а и АОТ равны 52м 55 кдж/моль /Si-20/ и

о величине близко лН в мицеллах ЦТАВ. но заметно меньше, ем б во„но-спиртовом растворе /л Н=40 кдж/моль/. Различит в еличинах Ку в сравниваемых мицеллярных системах в основном бусловлены разницей в энтропийном члене, л Н ид5 реакции емина с азидом в мицеллах ДДСЛ'а по величине близки соотват-твующим пгтаметрам в водно-спиртовом растЕсре, но заметно тличаюгся от таковых в мицеллах катионного ПАВ, что являет-я следствием различий в микрокружении гемина в сравниваемых ицеллярных системах. В мицеллах анионных и катионных ПАВ ермодинанические величины д Н и А £ процесса, вычисленные з данных :о зависимости Ку ст температуры, зависят от содер-&ния воды, что объясняется влиянием содержания воды на микрокружение и температурную зависимость распределения между водим ядром,и мицеллярной поверхностью.

'омплекссобразовакие гемина п водных мицеллярных системах юверхностно-активных веществ. По спектральным параметрам и ¡техиометрическоцу составу.комплексы гемина в водных раство->ах ПАБ и обращенных мицеллярных системах практически совпа-гают.

¡еличина' К^имидазольного комплекса гемина в 0,05 М ЦТАВ при !зменешти рН от 7,0 до 8,0 повышается от величины /2,9+0,6/х :10^Г2 до /2,0+0,3/хЮ"4!,^ / 1 -20°С/. При уменьшении концентрации гемина от 2 мкМ до 10 мкМ' в 0,1 М ЦТАВ величина К^ г-величивается от /1,4+0,2/хЮ4 до /б'.О+О.б/хХО'^Г^. Увеличе-ше концентрации ПАЗ сопровождается ростом как для имида-юльного комплекса, так и для азидного комплекса.

Кажущиеся константы стойкости диимидаэольного и моисими-»азсльного комплексов гемина в водных мицеллярных системах

ДЦСЛ'а на ~ 2 порядка вьше и на ~ 2 порядка ниже, чем в вод! растворах ЦТЛБ, соответственно. В отой системе ^ не завиои: от концентрации гемина и уменьшается с ростом концентрации МСУа.

Увел:гчение Кк азидного и имидагольного комплексов гемина с ростом концентрации ЦТАБ в основном обусловлено увеличением относительного содержания более реакционноспособной мономерной формы гемина. Частично наблюдаемое изменение К^ имидазо; ного комплекса связано с понижением эффективного зчачения р! мицеллярной поверхности в связи с уменьшением степени мицеллярной ионизации за счет увеличения концентрации противоиош при повышении ПАВ.

Оценка, проведенная в работе, дает ыицеллярную консташ равновесия для азидного комплекса гемина в водных растворах ЦТАБ, равную 500+200 что близко значению соответствующей величины в обращенных мицеллах ЦТАБ и выше, чем в гомогенных растворах. Совпадение Кц азидного комплекса, гемина в сравниваемых мицеллярных системах указывает на близость ми кроокружения реагентов в обраще'ышх и водных мицеллах ЦТАБ,

Изменение Кк комплексов геминаг"в мицеллярных растворах с разным содержанием ДЦС обусловлено повышением локального рЧ на мицеллярной поверхности с ростом концентрации ПАВ всле ствие уменьшения степени мицеллярной концентрации, поскольку константы стойкости обоих комплексов понижаются с ростом рН.

Результаты кинетических исследований показали, что ми-•деллярное микроокружение влияет как на скорости образования, так и на скорость диссоциации комплекса. Диссоциация диилгида вольного комплекса геиина описывается кинетикой первого поря

а / I ,./. В бодьшс растворах 0,05 М ДЦС.Уа, 0,05 М ЦТАБ я

" I т -г

одно-сп ртовой смеси /50:50/ равны /б,2+2/с"-1,/45^8/с х

/400+100/с"^, соответственно.

Величина наблюдаемой константы скорости второго порядка бразования гемина с N в водных мицеллярных растворах 0,05 ЦТАВ /рН 8,0; 20°С/ равна /б.г+Х^/хЮ2!,!"^м"1. В водных ас^йорах ДЦСЛ'а и водно-спиртовой смеси реакция протекает за семя меньше 2 мсек., т.е. бимолекулярные константы скорости тих процессов превышают 10 МГ^см-^. Для швдаэольнсго комп-екса гемина /„н«/2+0,5/М~~см~^. В мицеллярных системах ДСЛ'а & , на 5 порядков вше - /4-5/хЮV1 см .

Таким образом, мицеллярное микроокружение может отзывать ущеетвенное влияние на константы комплексов гемина и коистан-ы скорости реакций взаимодействия ге~киа с лигандами и рьс-зда комплексов. Процессы комплекссобразования гемина зависни г химического строения мицеллообразователя, структуры мицел-гршя агрегатов и строения воды а системах обращенных мн-злл, что слабо отражается на 'спектральных свойствах »елезо-зрфирша и его кокпяексоз.

энстанты равновесия реакций ксмплсксообразоланкя гсмсодетжа-ос белков с низкомолекулярннми лигандами. Изучение реакций згплексоо¿разевания пероксидазы с .Уд" и Г в мицеллах ЦТАБ метгемоглобина с имидазолсм в обращенных мицеллах ЦТАБ покато, что солвбклизацня бзлнев ио:гхт отагг^'дть сущестае:с:'» ;ан:иэ на их взаимодействие с н:-.Г5::омоле.\уляряи<и "¡«гз.'^.и.::!',» зличина и знак изменений константы стойкости комплексов за-1сят от химического строения ПАВ и структуры мицеллярных Т?егатов. Так,например, в системах обращенных мицелл ЦТАВ,

ACT и ДЦС, и отличие от буферных растворов, цитохром с не об разует комплексов с CJ/ }•/£. Перокси^аза и иетгемоглобин н связывают С//" и в обращенных мицелла:-: ДДСЛ'а. Важной ос бенностью реакций кокплексообразования гембелков в обращении мицеллах является слабая зависимость Кк от концентрации ПАВ и содержания воды в системе. При изменении концентрации Щ'АЕ от 0,04 М до 0,16 М Кк комплекса й р с f изменяется всего лишь в 1,5 раза, Со фторидом в аналогичных условиях величина Кк уменьшается в 1,3. В случае реакции гемоглобина с ими-дьзолоы соответствующее изменение не превышает 1,8 раз.

Кроме тоге, было обнаружено, что величина Kjj цианидного и фторидного комплексов пероксидаз'ы уменьшается приблизитель но в 2,7 и 2,2 раза, соответственно, при увеличении концентрации белка от 2 мкМ до 7 мкМ, что дает основание предполагать, что одной из главных причин слабой зависимости Кк от концентрации ПАВ может быть гетерогенность мицеллярной систе мы. отот вывод подтверздается данными кинетических измерений

ВЫВ О д',ы

J. Показало, что солюбилизация гемина мицеллярными системами поверхностно-активных веществ в неполярных растворителях и водэ приводит к изменению его агрегационного состояния и . константы равновесия между гидроксидными и аква-комллексами жолезо /Г'порфирина. Константа димеризаций солюбилизованного геыина и величина Ка зависят от химического строения мицел-лооС'разователя.

2. В соответствии с результатами спектральных исследований

) обращенных мицеллах с низким содержанием воды [к^.о]/[ПАЕ)<1/ вменяет я лигандныЯ состав гемоього железа /Ш/, Спектра пог-ющения и ЕПР гемина и его комплексов в мицеллкрных системах ;лабо зависят от структуры ыицеллярных агрегатов, строения ии-деллообразователя и содержания воды в обращенных мицеллах при [Н£0]/[ПАВ]^5. Установлено, что спектрально имидазольный и глу'гатионовый комплексы гемина подобны феррицитохрому ^ и жтохрому Р 450, соотЕетственнс.

3. Установлено, что в водных мицеллярннх системах в заьисимос-гн от строения поверхностно-активного вещества могут реализоваться двг формы гема с разным спиновым состоянием железа /II/, обладание различными спектрами поглощения.

4. В соответствии с результатам спектральных исследований /оптическая и ЭПР спектроскопия, круговой дихроизм/ включение цитохрома с и ыетгемоглобина в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ оказывает заметное влияние на их конфор-иацию. Величина эффекта зависит от строения мицеллообразова-геля, рН и степени гидратации ПАВ в мицеллярной системе. Включение пероксидазы и ее комплексов'в обращенные мицеллы кэтион-ных и анионных ПАВ слабо влияет на их спектры поглощения кругового дихроизма и 511?.

5. Показано, что е мицеллярных системах мономерная форма гемина значительно эффективнее, чем димер гемина, связывает низкомолекулярные лиганды. Получено выражение, устанавливающее связь между константами равновесия реакций ■.комплексообразоза-ния в мицеллярной фазе и соответствующим экспериментально из-

"яемым параметром. Константы нестойкости комплексов гемша 'ц^ллярной фазе заметно отличаются от ооответствупцих кон-■ • - ■ в водно-спиртовых растворах и сильно зависят от хини-

- 24 -

ческого строения мицеллообразователя к молярного отношения [pi о О] / [ИЛЕ) и структуры мииеллярных агрегатов /мицеллярные си стемы ИВ в чеполярных растворителях и воде/.

6, Сблюбилизация геисодержащих белков /пероксидаза, метгемог добин, цктохром с/ системами обращенных мицелл оказывает сил ное влияние на равновесие реакций их комплексообразования с низкомолекулярными лигандами. Константы равновесия етих реакций зависят от строения мицеллообразователя, содержания воды и поверхностно-активного вещества в мицеллярной скзтеме.

7. Показано, что спектральные свойства цитохрома с и константы стойкости комплексов пероксидазы и метгемоглобина в некотс рих мицеллярных системах зависят от отношения концентраций белок/ПАВ. Этот ¡эффект объясняется гетерогенностью мицеллярных систем.

Список работ, опубликованных по тема диссертации

1. Георгадзе А.Г. .Давьвдов P.M. Комплексы гемина в обращешпк мицеллах как модели гембелков. Тезисы Ш Всесоюзной конференци "Цятохрои Р 450 и охрана окружа**тцей 'среды? Новосибирск, 1967

2. Гкоргадзе А.Г. „Цавццов P.M. Моделирование действия мемб-рачного окружения на комплексообразование гембелков. Тезисы Ш Всесоюзной конференции "Цитохром Р 450 и охрана окружающей среды", Новосибирск,1987

3. Георгадзе А. Г. »Давыдов P.M. Спектроскопия и комплексообра-вование гемина в обращенных мицеллах поверхностно-активных веществ. Моделирование гембелков. Биофизика.1988. Т. 33, ¡К;,с.383

4. Пгоргадзе А,Г. »Давыдов P.M. Спектроскопия и комплексообразование пероксидазы и гемоглобина в обращенных мицелл,ах псвср-хностио-активнш^веществ. Енофизика.1586. Т.33,124, с.382