Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакции пероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и уреазы в неводных средах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Реакции пероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и уреазы в неводных средах"

АКАДЕМИЯ ШК БЕЛАРУСИ ПГ2 ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ

? Р Г)''';?;

На правах рукописи

УМ 577.152.1. +.577.152.3. »■ 577.158.52.02. + 541.128.135.

ПУЧКАЕВ Андрей Витальевич

РЕАКЦИИ ПЕРОКСШЗЫ, ГЛЮКОЗО-б-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И УРЕАЗЫ В НЕБОДНЫХ СРЕДАХ

03. 00.04. - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Л. И. Метелица

Минск - 1993

Работа выполнена в лаборатории прикладной знзимологии Института биоорганической хииии АН Беларуси, г. Шнек.

Научный руководитель: доктор химических наук

профессор Д.И. МЕТЕЛИЦА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.Н.НИКАНПРОВ кандидат химических наук 11.А.КИСЕЛЬ

Ведущая организация - Биологический факультет Белорусского

Государственного Университета (кафедра биохимии)

Защита диссертации состоится " 25 " ноя&ря 1993 Г.

в "_" часов на заседании специализированного совета

Д oo6.22.oi. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии АН Беларуси по адресу: 220141. Ыинск, Академгородок, ул. Жодинская , 5/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН Беларуси.

Автореферат разослан " И " ок>т>я£ря 1993 Г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

н.м. литшнко

ОБШАЯ ХАРШШКЯЖА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современная биохимия. биотехнология и инженерная этимология выдвигают трз&хщщя по использованию ферментов в неводных средах. Органические среды дают преимущества при синтезе пептидов и получении эфиров. поди Лидировании ферментов труднорастворимыми в воде соединениями, которые могут быть объектами биоаналитического определения В щшунохимических методах с использованием ферментных конадэгзтов, трансформации плохо растворимых в воде биологически активных веществ (стероиды. канцерогены, токсиканты окружающей среда).

Ожидается, что использование неводных сред для проведения ферментативных реакций станет новым крупным шагом в биотехнологии, исследовании аналитических свойств ферментов и при разработке методов тонкого органического синтеза.

Наряду с большой практической значимостью изучение ферментативных процессов в нетрадиционных средах имеет фундаментальное значение, так как эти процессы часто сопровождаются изменением скорости, субстратной специфичности и региоселективности биокатализаторов, диссоциацией олигоыерных - белков на субъединицы. Важной задачей исследователей становится предотвращение нежелательных процессов инактивации и денатурации белков органическими растворителями.

В качестве нетрадиционных сред для ферментативвных реакций в последнее время особенно интенсивно изучаются водно-органические смеси, микрозиульсии и обращенные мицеллы ПАВ в органических растворителях.

Объектами данного исследования в перечисленных средах стали три фермента, различающиеся молекулярной массой, строением, типом катализируемых реакций и свойствами субстратов: лероксидаза хрена С КФ 1.11.1.7.). глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1,1. 49) и уреаза (КФ 3.5.1.5).

Пероксидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и уреаза широко применяются в ИФА. Практические потребности очистки сточных вод определяют необходимость изучения воздействия органических растворителей на уреазу. Способность пероксидазы трансформировать широкий ряд ароматических соединений может быть ИСПОЛЬЗО-зана при разработке методов тонкого органического синтезе 9

неводных средах.

В литературе отсутствует систематические данные о каталитической активности трех вышеперечисленных ферментов в органических растворителях. Поэтому изучение каталитических свойств пе-роксидазы. глвкозо-6-фэсфатдегидрогеназы и уреазы в различных неводных средах является весьма актуальным и представляет значительный фундаментальный интерес.

Работа выполнялась в соответствии с заданиями Государственной научно-технической программы "Новейшие методы биоинженерш" и Республиканской научно-технической программы 69.оз р "Здоровье".

Цель работы. Целью настоящего исследования было сравнительное изучение каталитической активности пероксидазы. глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы и уреазы в различных неводных средах. Для достижения дели были поставлены следующие задачи:

- Изучить влияние полярных органических растворителей на каталитическую активность ПХ, ГбФДГ и уреазы в водно-органических смесях;

- Исследовать реакции ПК, П5ФДГ и уреазы в бездетергент-ных микроэмульсиях "гексан-спирт-вода" и найти оптимальные условия проведения этих ферментативных процессов;

- Изучить каталитическую активность Г6ФДГ и уреазы в обращенных мицеллах ПАВ разной природы в органических растворителях;

- Выявить общие закономерности и дать практические рекомендации по использованию ПХ, П5ФДГ и уреазы в водно-органических смесях и микроэмульсиях в неполярных органических растворителях.

Научиая новизна. Определены кинетические параметры ферментативных реакций в водно-органических смесях дтаетилформа-мида (ДЩ>), диметилсульфоксида (ДМСО), формамида, изопропанола, диоксана к предложен механизм действия этих органических растворителей на каталитическую активность ферментов.

Проведено пероксидазное окисление орто-фенилендиамина и лю-минола и уреазный гидролиз мочевины в бездетергентных микроэ-ыульсиях. Доказано, что использование тройной системы "гексан-изопропанол-вода" предпочтительнее системы "гексан-трет. бута-нол-вода".

Оптидозированы условия реакции уреазы и глвкозо-6-фосфатде-гидрогеназы в обращенных мвделлах ПАВ разного состава в органических растворителях и показано, что максимальная эффективность этих ферментов достигается в сметанных мицеллах анионного и нейттралыюго ПАВ.

Практическая значимость работы. Изучено пероксидазное окисление в неводных средах люминсяа и орто-фенилендиамина (о-ФДА). о-ФДА применяется в ИФА для регистрации пероксидазной метки, а люминол широко используется в ХИФА и люминесцентных процессах. Данные, полученные при изучении каталитической активности пероксидазы, глхжозо-6-фосфатдегидрогеназы и уреазы в различных неводных средах могут бить использованы при разработке аналитических систем с участием этих ферментов и методов тонкого органического синтеза (перонсидааа). Полученные в {»боте результаты представляют интерес для специалистов в области инженерной и мицеллярной энзимодогии.

Ап[;пй.1Ц1!я Основные результаты работы доложены на

8-ой Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Латвия, Рига, гээо) и на 9-ом Международном симпозиуме по поверхностно-активным веществам в растворе (Болгария. Варна. 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и тезисы з-х докладов.

Структура л объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (х глава), экспериментальной части Сч главы), заключения, выводов, списка цитируемой литературы и списка работ автора по теме диссертации. Работа изложена на 197 страницах, включает 14 таблиц и 56 рисунков. Библиография - 178 названий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объекты исследования: пероксидаза хрена (ГЮ со спектральным показателем чистоты «г : г,? , гемин. глюкозо-6-фэсфатде-

гидрогеназа из микроорганизмов Laucones toe sp. и уреаза из соевых,бобов.

Пероксидазное окисление орто-фенилендиамина (о-ФДА) и люминала проводили в цитратном <Рн 4.7-5.0) и боратном буфере СрН 8,5-9,5) в присутствии перекиси водорода. При окислении о-ФДА за реакцией следили спектрофотометрически по накоплению продуктов реакции. Реакцию окисления люминола характеризовали величиной максимальной интенсивности хемилюминесценции в условных единицах, ссответствудах показаниям рекордера в вольтах.

Дегидрирование глюкоз о-6-фосфата с участием Г6ФДГ проводили в o,i М Каон-глшцшовом буфере с рн 9,1 при го°. За реакцией следили спектрофотометрически по росту оптической плотности образующегося НАДО'К.

Активность уреазк определяли спектрофотометрически двумя способами - по увеличению концентрации образующегося аммиака с использованием реактива Неослера или по образованию ивдофеноль-ной сини в реакции Бертло. В бездет&ргентных мккрозиульсиях и обращенных мицеллах ПАВ в октане использовали только второй метод.

Все ферментативные процессы (кроме перскскдазвого окисления люшнола) характеризовали начальными скоростями б М/с.

При обработке Г6ФДГ бифункциональными сшивающими реагентами использовали глутаровый диальдегид, диметиладипимидат и диме-тилсуберимидат.

Микроэмульсионные системы готовили встряхиванием необходимых количеств воды и органических компонентов до образования оптически прозрачных смесей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

КИНЕТИКА ПЮКеВДАЗНЫХ РЕАКЦИИ В НЕВОДНЫХ СРЕДАХ

Водно-органпческпе средь;. В качестве органических сораст-ворителей при пероксидазном окислении о-ФДА были выбраны изо-пропанол, ДЦ4>, ДМСО, формаыид и диоксан. Независимо от природы органического компонента среды каталитическая активность ИХ уменьшается в 4-5 раз с ростом содержания органического растворителя до 20-25* и затем монотонно снижается при дальнейшем увеличении концентраций сорастворителей.

Показано, что зависимости начальной скорости пероксидазного

окисления от начальных концентраций о-ФДА и нгог во всех водно-органических смесях, содержащих до зох органического компонента. описываются уравнением Йихаэлиса-Уентен. Из анаморфоз этих зависимостей в координатах Лайнуивера-Берка вычислены значения каталитических констант (ккат) и констант Ыихаэлиса

Значения к^„„ снижаются с увеличением концентрации органи-кат

ческих компонентов смесей до зох. Константы Ыихаэлиса в тех же условиях не изменяются. Таким образом, для большинства смесей (кроме "буфер-формамид") проявляется неконкурентное ингибирова-ние ферментативного процесса органическим растворителем, то есть реализуется связывание молекул растворителя с ПХ вдали от ее активного центра (иначе ингибирование было бы конкурентным). При больших концентрациях органических растворителей происходит инактивация пероксидазы..

Бездетергентные мпкроэмудьспп

Окисление орто-фенилендчамчна. Окисление о-ФДА проводилось в двух типах бездетергентных ыикрозмульсий: гексан-изопропанол-вода и гексан-трет.бутаьол-вода. Полученные кинетические характеристики процесса представлены в.таблице 1.

Каталитическая активность (к„_„) в бездетергентных микро-

Ка *

эмульсиях составляет вх по сравнению с активностью в водном раствора. Эффективность фермента, выраженная отношением ккат/\,. б бездетергентных микроэмульсиях двух типов меньше, чем в воде. Тройная система гексан-изопропанол-вода предпочтительнее для ферментативного катализа чем система гексан-трет. бута).^л-вода (см. табл.1). Этот вывод подтверждается при сравнении каталитических параметров пэроксидазного окисления о-ФДА в разных микроэмульсиях по перекиси водорода (данные представлены в таблице 2).

Окисление люнпнола. В бездетергентных ыикроомульсиях ПХ и геммн являются эффективными катализаторами окисления люминола (см. табл.з). На рис. 1 представлена зависимость каталитической активности гемина (в х по отношению к воде) в тройной системе гексан-изопропанол-вода. Как видно из рисунка, максимальная каталитическая активность наблюдается именно в области микроэмульсий. Аналогичные зависимости наблюдаются для всех изучен^ ных нами ферментов.

Таблица 1

Кинетические параметры пероксидазного окисления орто-фенилендиа-ыина в разных средах при го°с.

к Среда пероксидазной ю^-Ку. 10~3'ккат, ю"6-СккатхКм),

реакции Ы с"1 ' Г^с*1

X 0,1 и цитрвтно-фос- 1,5 ± 0,1 21,4 ± 0,9 14,30

фатный буфер. рН 4,7

2 йикроэыупьсия, содержащая 8% 0,01 М щгт- 1,5 1 0,3 1,7 ± 0,2 1,10 ратного буфера с рН

5,0 в смеси гексан-ИЗОПрОПаНОЛ (1:1)

3 Ыикроэмульсия. содержащая 4* 0,01 и ЦИТ- 2,610,8 1,6 ± 0,2 0,62 ратного буфера с рН

5,о в смеси гексан-трет. буТанОЛ (1:1)

Изопропанол

Вода

н-Гексан

Гч»с..1. Зависимость активности гемина (в X от активности в водной растроре ЫаОН ) в тройной системе ге кс 8 н--и эо п ро л&нол-0,04 МИеОН. Кониентрации компопентоп да ни в мольных до -дя л . А - расслоение. Б - 6 ездегерге н т ные микро&щльсиа, Б - ассоииаги воды л изопропанола. Г - истинные тройные растворы. Гранины областей определены кондуктометричес-клм титрованием (ЗахЪЬ С.В., 1962).

Тайяйай г

Кинетические параметры пероксидазного окисленш ©рто-фенилен-диамина в микроэмульсиях по перекиси водорода <?<й®е).

Состав . .

микрозмульсии. 1о3Л •

объемные про- и с-1 *1Г1'С~1

цента

Гексан - 47,1

йзопропа-

нол 45.2 0,17 ± 0,02 1,0 * 0,05 6.1

Вода 7,7

Гексан - 50.0 Трет.бута-

нол - 46,0 1,90 ± 0,30 0,8 1 0,07 0,4

Вода -4,0 '

Интенсивность хемиллминесценции при пероксидазном окислении в бездетергентных микроэмульсиях фиксированных концентраций люми-нола в з раза выше по сравнению с водным раствором. Гемин сохраняет 80* каталитической активности в этом процессе (см. габл. з). Скорость достижения максимальной интенсивности у. биолюминесценции в 5-6 раз вше, чем в воде. Введение в реакционную среду циклогексанола (4-юх) вместо изопропанола увеличивает интенсивность хемилсминесценции на 20-50% для ПХ и в 2 раза для гемина. Стимулирующая роль циклогексанола может быть связана с реакцией окисления вторичного спирта радикалами но- .то есть никлогексанол в процессе окисления выводит из реакции радикалы НО- . которые ингибиругт окисление лсиинода из-за образования аминофенолов.

Инактивация ПХ в бездетергентных микроэмульсиях гексан-изо-лропанол-вода при малых Рн (окисление о-ФДА при рН 5.0) намного меньше, чем при высоких (окисление люминола при рН 9,5). При щелочных Рн наблюдается сильная диссоциация гема из ПХ, которой сам по себе является эффективным катализатором окисления лцод-

Таблица з

Эффективность терокеидазы хрена С ПК) и гекина в пероксидазном окислении лшинола в разных средах: 1ШКС приведено в расчете на 2,5 н!£ биокатализатора.'

Катализа- Среда реакции Лхшинол. нг°2» 1ыа]

тор Ш и!1 В

да Буферный раствор* 1 ,8 2.0 0,2

пх Гексан - 4ах Изопропанол-45* Буферный раствор - 4.5* Ж» - -1,5* 2.0 2.0 0.6

пх Гексан - 49% Изолропанол-45% Водный раствор - 4.5% Циклогексанол-5,о* ДМСО - 1,5* 2.0 2,0 -1.1

Гемин Водный раствор" 0.06 2,0 0,6

Гемин Гексан - 48.зх Кзопропаиол - 4о* Водный раствор-7,4Х 0,06 2,0 0,5

* - 0,02 Ы боратный буфер С рН 9,5 ; *« - ВОДНЫЙ раствор 0,04 11 ЫаОН.

нола. Следует отметить, что в бездетергентных иикроэиульсиях при окислении о-ФДА гемин не проявлял каталитической активности.

КИНЕТИКА ГЛШОЗО^-<ЮСФАТдаЩЩРОГЕНАЗНОИ РЕАКЦИИ В НЕВОДНЬК СРЕДАХ.

Водно-органические смеси. В случае Г6ФДГ влияние органических растворителей на кинетические параметры реакции носит более сложный характер, чем.для ПХ. Помимо ингибирурщего действия, добавка органических растворителей в водный раствор вызывает изменение физико-химических характеристик среды, которые в свор очередь могут воздействовать на ферментативный процесс. Показано, что с уменьшением диэлектрической проницаемости реакционной среды, то есть при увеличении концентрации органических сорастворителей в водно-органических смесях (кроме формаыида), происходит систематическое уменьшение константы Михаэлиса К^ по субстрату. Ка рис.2 показана линейная зависимость логарифма константы Михаэлиса по субстрату от обратной величины диэлектрической проницаемости водно-органических смесей. Этот факт свидетельствует о том, что в связывании полярного заряженного субстрата глюкозо-6-фосфата (ГФ) с активным центром ГБФДГ важную роль играют электростатические взаимодействия, что отражается на сродстве субстрата к фэрненту. Величина,1в Ку рассматривается как мера разницы энергии свободного субстрата и субстрата, связанного с ферментом.

обратной величины дивлоктрическоЯпроницаемости смесей буфера е о ДМФ (1), ДМСО !2). диоксаном (3) в «аопро-лаполом <4 ) .

Изменение в широком интервале диэлектрической проницаемости смесей "буфер-диоксан" практически не влияет на К^ по кофактору НАДФ+, что подчеркивает гидрофобный характер связывания ко-• фактора с ферментом. Уменьшение К^ по ГФ наблюдается в сравнительно узких интервалах концентраций органических растворителей (до 15-18*). Дальнейшее увеличение содержания органического компонента в системе приводит к резкому возрастанию К^ и инактивации фермента (до 25-27%). Так как при добавлении органических сорастворителей в водный раствор происходит уменьшение ккат, а значения К^, сначала уменьшаются, а затем увеличиваются, эффективность фермента Ск^^Л^) имеет максимумы. На рис. з видно, что эффективность фермента максимальна при одном и том же значении с независимо от природы органического сорастворителя.

Обработка фермента тремя бифункциональными реагентами ( глу-таровым диальдегидом. .даметилсуберимидатом и диметиладипими-дагом ) не меняет каталитических свойств Г6ФДГ при содержании ДМФ в смесях выше 15%. Из этого следует, что при наличии' ДМФ в среде (выше 15*) происходит инактивация субъединиц фермента, а затем его диссоциация на мономеры.

i

35

íf

Е-«

К К

(О I о

Рнг-,3. Зависимости отновеиня от диэлектрической прони-

цаемости с не ce ti при дегидрировании и глюкозо- 6-фосфатв: I - ДМ4>, g - дисо, = Дфонсан, 4 - формвмид и 5 - изо-

Обраценные мицеллы ПАВ. Каталитическая активность- ГбФДГ исследована в обращенных мицеллах ПАВ разной природы: анионных (Аэрозоль ОТ), катионных (ЦТАБ), нейтральных (Тритон х-юо) и смешанных (АОТ+Тритон х-45). Кинетика ГбФДГ-зного процесса в обращенных мицеллах ПАВ в октане подчиняется уравнению Иихаэ-лиса-1!ентен. Иногда наблюдались сигмоидные зависимости начальной скорости реакции от концентраций субстрата и кофактора, как. например, в случае смешанных обращенных мицелл для НАДФ+ (рис. 4). Сигмоидная зависимость, представленная на рис.4, не спрямляется в координатах Лайнуивера-Берка. так как субстрат и кофактор сложным образом распределяются между полярной фазой мицелл и органическим растворителем и при больших концентрациях могут участвовать в формировании мицелл. При добавлении малых в реакционную среду (рис.4) кофактор первоначально принимает участие в мицеллообразовании и поэтому плохо доступен для фермента. При дальнейшем увеличении концентрации кофактор попадает в водную полость мицеллы и становится доступным для биокаталитической реакции. Этим объясняется порого-

г>"

о

1,2

0.8

я

о

0,4

Перенос *

начала оси

абсцисс

.....

-Концентрацио*

ный порог ч ' 1 1 . . , V --------- -»-

0,4 0,8

1,2 1,6 2,0 Ю5-[НДПФ+], м

Рис.4. Зависимость начальной скорости дегидрогенаэноЯ реакции от концентрации кофактора ь смешанных мииеллах АОТ и тритона Х-45 : О, 1 М ЛОТ + О, 1 М Тритон Х'45 в октане, 12% полярной фазы, 0,1 «кг/мл ГбФДГ, 0,06 мМ ГФ. Символ (» ) обозначает "ио ди<$>и ииро в а н н у »" систему координат.

вый характер зависимости на рис.4. Линеаризация зависимости начальной скорости реакции от концентрации НАДФ+ в обратных координатах возможна, если учесть "концентрационный порог" - количество кофактора, недоступного для ферментативной реакции. Для этого необходимо перенести начало оси абсцисс на величину "концентрационного порота" (рис. 4). В "модифицированных" двойных обратных координатах возможна удовлетворительная линеаризация зависимости.

Тот факт, что ГФ может участвовать в мицеллобразовании, был непосредственно наш доказан. На рис.ь представлена зависимость начальной скорости ферментативной реакции в смешанных мицеллах от концентрации ГФ при высоком содержании воды в системе (16%). При уменьшении концентрации субстрата наблюдалось разрушение микроэмульсий, ■ то есть не хватало дополнительного ПАВ для стабилизации мицеллярной системы. Нам не удалось изучить каталитическую активность Г6ФДГ в бездетергентнкх микроэмульсиях, так как добавление даже очень малых концентраций ГФ в систему вызывало агрегацию субстрата, вследствие чего эмульсии теряли оптическую прозрачность. Мы не можем точно охарактеризовать распределение кофактора и субстрата между растворителем и полярной фазой мицелл, а такое распределение, как известно, сильно сказывается на кинетических параметрах ферментативных процессов в обращенных мицеллах.

о

s >Ъ

ZN' О

1,5 2,0 2,5 [глюкозо-б-фосфат], М

Р и с .5. За в и с и мое т ь на ч ал ьноИ скорости деги д р и ров а н и я Г<5>от его концентрации с участием Г6ФДГ в смешанных мицеллах при Бвсоком содержании водного компонента :0,1 И АОТ + 0,1 N Тритон Х-45 в октане, Х6Ж полярной фазы, 100 мкг/мл Г6ФЛГ. 0.1 мМ НАДФ .

Заштрихована область разрушения мицеллярной системы.

В таблице 4 и 5 представлены кинетические характеристики дегидрирования ГФ в буферном растворе в в обращенных мицеллах ПАВ разной природа. Как правило, константы кихазлиса К^ по субстрату (табл.4) в мицеллах разного состава существенно ниже их значений в водном растворе. Это связано с концентрированием водорастворимого субстрата в полярном ядре мицелл.

•Таблица 4

Кинетические параметры дегидрирования ГФ по субстрату в обращенных мицеллах ПАВ в органических растворителях при 20°С: полярная фаза обращенных мицелл включала о,1 К ыаон-глициновый буфер с рН 9,1

Среда 1о5'*м . и ккат . с"1 нГ6-(к Ж ),

Водный р-р 41 .0 ± 3,0 533 1 15 1 .30

ЦГАБ - - -

о,2 М в смеси октан -октанол (7:2)

АОТ 0,2 Ы б октане 7% полярной фазы 18.0 1 4,0 2. 1 ± 1,0 0.01

Тритон Х-100 0,2 М б смеси ок- 1,5 0.2 14,6 1 0.9 1. 00

тан -октанол (7:1)

5% полярной фазы

АОТ + Тритон х-45 1,2 1 0.3* 177 2 15* 14.75 *

0,1 Ы + 0,1 Мб 01стане 12х полярной фазы

Символ * указывает использование модифицированных систем координат.

Константы Михаэлкса по кофактору НАДФ+ (табл. 5) в буфзрном растворе и в мицеллярных системах отличаются не столь существенно и характеризуются одним порядком величин * ю-5 И. По нашему мнению, нельзя переоценивать истинность величин К^ в таблицах 4 и 5, помеченных символом (*) из-за сложной природы

Таблица 5

Кинетические параметры дегидрирования ГФ по кофактору в обращенных мицеллах ПАВ в органических растворителях при го°с: полярная фаза обращенных мицелл включала од II неон-глициновый буфер с рН 9,1

Среда ю5-^ . и ккат ' с"1 1Г с

Водный р-р 3,11 0,2 527 * 4 18,61

ЩАБ • - -

0,2 Ы в смеси октан -октанол (7:2)

АОТ 0,2 11 в октане ?% полярной фазы -9,0 ± 2,0 2,6 А 0,2* 0,03*

Тритон Х-100 о,2 У в смеси ок- 1.4 * 0,2 17,9 1 0,9 1.27

ТаН-ОКТанСО) (7:1) У /

5% полярной фазы

АОТ + Тритон х-45 0,7 ± 0.1* 191 1 14* * 27,29

о.1 11 1 о,1 и в октане' 12% полярной фазы

Символ * указывает использование модифицированных систем координат

распределения субстрата и кофактора в мицеллярных системах, что отмечено выше.

Сравнение каталитических констант показывает, что активность ПзФДГ в мицеллах возрастает в зависимости от их состава и увеличивается в последовательности: мицеллы АОТ < мицеллы Тритона х-юо < смешанные мицеллы АОТ-Тритон х-45 < од И ыаон-глициновый буфер с рН эл. В смешанных мицеллах ккат почти вдвое ниже его значения в водном растворе.

Сравнение параметра ккат/Км по субстрату (табл.4) показы-

вает, что в смешанных мицеллах эффективность ГБФДГ в - 11 р^з выше, чем в буферной растворе. Это означает, что окру^евде смешанных мицелл создает более благоприятную для катализатора среду в сравнении с обычным буферным раствором. Полученные зонные подчеркивают важность создания вокруг определенного фермента специфически действующего на него окружения. В кощфетном случае Г6ФДГ такое окружение создается сочетание^ шяонного СЛОТ) и нейтрального (Тритон х-45) ПАВ.

КИНЕТИКА УРЕАЗНОЙ РЕАКЦИИ В НЕВОДНЬК СРЕДАХ.

Водно-органпческпе смеси. Добавление органических растворителей в реакционную среду вызывает падение начальных скоростей уреазного гидролиза мочевины. При этом наблюдается ингибирование ферментативного процесса по неконкурентному типу, то есть уменьшается каталитическая константа. ккат и не изменяется константа Мкхаэлиса Кн (см. табл.б). Очевидно, что в случае ПХ и уреазы диэлектрическая проницаемость среды не влияет на кинетические параметры реакции.

Для всех изученных нами ферментов при больших концентрациях органических сорастворителей в реакционной среде наблюдается инактивация и денатурация белков. Следует отметить, что только уреаза обладает высокой устойчивостью к растворителям, фермент проявляет высокую каталитическую активность при содержании органического компонента вплоть до бох.

Бездетергентные шкроэмульснп. Каталитическая активность уреазы сильно зависит от содержания воды в органической среде. Резкое возрастание ферментативной активности наблюдается выше зх воды, то есть необходим некоторый минимум воды, расходующейся на создание гидратной оболочки вокруг белка с большой молекулярной массой (590000) и при его высокой концентрации в реакционной системе (-40 ыкЫ<нл). Использование больших концентраций белка в бездетергентных микроэнульсиях (визе 4Р мкМ/мл) нежелательно из-за агрегации белка и потере : микроэмульсиями оптической прозрачности. Другими словак, <5ез-детергентным микроэмульсиям не хватает солюбилизационно^ емкое- . ти для растворения достаточно больших концентраций фермента,

Зависимость начальной скорости уреазно^ реакций гидролиза

Таблица 6

Кинетические параметры уреазного гидролиза мочевины в различных неводных средах

Реакционная среда Ккат> 10 ~?(IwV

X с"1 и \Г^с-1

0,05 U фосфатный буфер с

рН 7,0 100 118 i 2 6,8 1 0,4 17,4 i 0,7

Водно-органические смесьг (0.05

U фосфатный буфер как водный

компонент):

ДМФА.х 15Х 85 107 i 2 6,5 1 0,7 16.4 Jt 1,5

25Х 75 89 i 4 6,9 i 0,8 12,9 i 0,9

35Х 65 67 ! 2 6,7 i 0,6 10,0 i 0,6

Изопропанол.х юх 90 115 i 5 7,2 t 0,6 16,0 J 0,6

20* 80 96 1 3 6,7 i 0,6 14,3 i 0,8

30* 70 81 1 6 6 . 5 ± 0,9 12,5 1 0,8

40* 60 58 ± 3 7 . 1 i 0,4 8,2 ± 0,1

Без детергенты ые мтсроамульсни:

49Х гексана. 45* изопропанола, ь is±i 12.2 i 1,2 3.8 i о,з ex 0,02 U боратного буфера

Обращенные мицеллы ПАВ С о,04 U боратно-фосфатный буфер с рН 7,о как водный компонент).

APT. 0,05 U в октане, w =23 2.1 63 ± 4

--о

ЦТАБ, о,136 U в смеси октан-хлоро-форм-гексанол (6:4:1). *о = 4,9 1,2 Тритон Х-100 0,05 U в смеси

октан-гексанол Сst1). w = 17 1,5 81 ± 7 13,5 ± 2,5 APT + Тритон X-10P (по 0.025Ш в октане с sx гексанода. w =20 1,8 59 1 2

8,4 ± 2,0 16 1 1 16,8 ± 2,1

7,5 ± 1,1

0,9 ± 0,1

6,0 1 0,6 3,6 1 0.5 16.4 ± 1,7

мочевины подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен (данные представлены в таблице €).

Обращенные мицеллы ПАВ. Уреаза проявляет достаточно высокую каталитическую активность при гидролизе мочевины в обращенных мицеллах ПАВ в октане (см. табл. е). Как и в случае с Г6ФДГ. смешанные обращенные мицеллы анионного и нейтрального' ПАВ создают наиболее благоприятное окружение вокруг биокатализатора. что отражается на сродстве субстрата к ферменту (Ку). Эффективность уреазы (к1;йТ/Км) в смешанных мицеллах АОТ и Тритона х-юо практически совпадает со значением в водном растворе. Гексамер уреазы диссоциирует в обращенных мицеллах АОТ на каталитически активные димеры (194000). Это заключение сделано на основании сравнения размеров мицелл АОТ. при которых уреаза проявляет максимальную каталитическую активность, с размерами гексамера. тримера, димера и мономера фермента.

В бездетергентных микроэмульсиях и обращенных мицеллах АОТ в октане паленке ферментативной активности происходит одинаковым образом. Фермент' достаточно активен в течение г-з часов, после чего активность резко падает, что связано с инактивацией белка.

Данная работа показала, что при проведении ферментативных реакций к неводных средах необходимо учитывать много факторов: природу используемого фермента (мсномерная или субъединичная структура, свойства белковой поверхности), полярность субстрата. Это усложняет общее решение проблемы. На примере уреазы и ПХ ьидно. что конформационная лабильность белковой глобулы, по-видимому, является одним из определяющих факторов стабильности ферментов в неводных средах. Если белок достаточно устойчив в водно-органических смесях, можно ожидать его довольно высокой активное™ в бездетергентных микроэмульсиях и обращенных мицеллах ПАВ в органических растворителях.

вьводы

1. Изучено влияние пята органических растворителей (ДМФ, ДОСО, изопропанол, формамид и диоксан) на каталитическую активность пероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и уреазы и определены кинетические параметры ферментативных реакций в водно-органических смесях. В случае пероксидазы и уреазы органические сорастворители неконкурентно ингибируют ферментативный процесс.

2. Доказано сильное влияние диэлектрической проницаемости среды на константы Михаэлиса г.о субстрату в реакции глюкозо-Ь-фосфатдегидрогеназы. Км снижается с уменьшением диэлектрической проницаемости среды, но эффективность фермента, выраженная отношением г-кат/К.1,, максимальна при одном и том те значении о независимо от природы органического сорастворителя.

3. Для эффективного проведения ферментативных реакций б водно-органических смесях необходимо использовать концентрации органических растворителей не выше 35-40* для пероксидазы, 2025* для глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и бон для уреазы.

4. Впервые изучена каталитическая активность пероксидазы (окисление орта-фенилендиадана и люминола) е бездетергентных микроэмульсиях. Система "гексач-изопропанол-вода" предпочтительнее системы "гексан-трет. бутанол-вода" е реакции окисления-орто-фенилендиамина.

5. Показана возможность успешного использования пероксидазы и гемина в бездетергентных микроэмульсиях в качестве катализаторов окисления люминола, обеспечивающих Еысокую интенсивность хекилюминесценции.

6. На примере глхкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции в обращенных мицеллах ПАВ в октане продемонстрировано, что субстрат (или кофактор) способны принимать участие в мицеллообразовании. Показано, что глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа наиболее эффективна в смешанных мицеллах АОТ и Тритона х-45 с максимально возможным содерханием водной фазы.

7. Впервые проведена уреазная реакция в бездетергентных микроэмульсиях "гексан-изопропанол-вода" и обращенных мицеллах ПАВ разного состава в октане и определены кинетические параметры процесса. Показано, что максимальная эффективность уреазы достигается в смешанных мицеллах АОТ и Тритона Х-100.

8. Даны практические рекомендации по использованию перокси-дазы, глюкозо-6-фэсфатдегидрогеназы и уреазы в неводных средах.

1. Puchkaev А.V., Metelitza D.l. Catalytic activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase in water-organic aedia //Abstracts to 8th Conference of Young Scientists on Organic and Bioor-ganic Chemistry (Latvia,Riga) - November 2-9, 1990. - P.282.

2. Puchkaev A.V.. Metelitza D.l.. Catalytic activity of glucoses-phosphate dehydrogenase in water-organic media //Bio-chem.Biotechnol.Electronic Express. (BBEE) -1991. -V.l. N 4. -P.251-260

3. Пучка е-в А. В.. Метелица Д. И. Каталитическая активность глв-козо-6-фосфатдегидрогеназы в водно-органических средах // ПрИКЛ. биСХНМ. ХМКробиОЛ. -1992. -Т.28. Н 1. -С.27-32.

4. Пучкаев А.В., Метелица Д. Я Каталитическая активность глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы в обращенных мицеллах поверхностно-активных веществ разного состава /"/Биохимия. -1992. -Т.57. N 3. -С.410-417,.

5. Puchkaev A.V., Metelitza D.I. Catalytic activity of glucose-€-phosphate dehydrogenase in reversed micelles of various composition //Abstracts to 9th International Symposium on Surfuctants in Solution (Bulgaria, Varna) - June 10-15. 1992. - P.163.

6. Пучкаев А.В., Иетелица Д. К Каталитическая активность перок-сидазы в водно-органических средах /ЛЬв. АН БССР. сер.хим. наук. -1992. -N 1. -С.78-83.

7. Puchkaev. A.V., Metelitza D.l. Catalytic activity of horseradish peroxidase in detergentless nicroenylsions //Abstract Books of 6th European Congress on Biotechnology (Italy. Firenze) -June 13-17, 1993. -V.2. -P.304.

8. Пучкаев А. В. , Метелица Д. И. Окисление люминола в бездетер-гентных микроэмульсиях (гексан-изопропанол-вода), катализированное пероксидазой или гемином //Биохимия. -1993. -т.58. N 10. -С.1538-1547.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах: