Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и свойства уреазы Staphylococcus saprophyticus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка и свойства уреазы Staphylococcus saprophyticus"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ЩПЩг^ЮЬШИ им. А.Н.БАХА

На правах рукописи

ЛйКИНА Валентина Богдановна

УДК 577.152.351+377.151

ОЧИСТКА И СВОЙСТВА УРЕАЗЫ вТАРНХЪОООССаЗ бАРНОРЕПГЮТа Специальность 03.00.04 - биологическая хишя

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в лаборатории аналитических систем отдела ферментов для анализа НПО "Фермент"

Научный руководитель: доктор оиологических наук,

профессор А-А.^лемжа

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

С.И.Безбородова

кандидат химических наук, И.Б.Уткин

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский

технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения

Защита диссертации состоится " с&У " о м 1990г.

в Ю час. на заседании специализированного Совета К 002.96.01 но црясувдеяию ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (IX? 071, Москва, Ленинский пр., 33, корп.2)

С диссертаций, можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (117 071, Москва, Ленинсюш пр.,33, корп. I). ___

Автореферат разослан " Х9Э0 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений современной биотехнологии, в особенности для ее внедрения в лщевую, химическую промышленность, является получение и применение микробных ферментов. Их узкая специфичность и высокая каталитическая эффективность делают привлекать тюк идею использования ферментов в качестве биокатализаторов.

Актуальность проблемы эффективной очистки сточных вод различных производств, тонкого анализа биологических жидкостей дало толчок для опробования 'ферментов и в этих целях.

Так,-уреаза монет быть использована для освобождения различных жидкостей от мочеви"ы~ трудноудаляемого вследствие хорошей растворимости продукта азотного обмена живых организмов.

Реакторные колонки, содержащие иммобилизованную уреазу и применяемые для очистки сточных вод от мочевины, описаны в литературе. Широкое применение-уреаза нашла в медицинском микроанализе. Она входит в набор ферментов, применяемых для анализа мочи и крови.

4 В СССР исследуется возможность применения уреазы в аппарате искусственной"почки, в ферментном анализаторе для определения мочевины. Эти работы проводятся с уреазой э.варго-рЬу~ь1сие, производство которой впервые налажено в НПО "Фермент". Во ВНИИ ГО разрабатываются отечественные наборы для определения мочевины в биологических жидкостях, в которых используется препарат уреазы 8.варгорЬуг1сиа.

Практическое применение фермента требует знания его • свойств. Подробное изучение структурных и каталитических свойств уреазы Б.еаргорЬуНсиа явилось целью настоящей

работы.

Цель и задачи работы, целью настоящего исследования явилось всестороннее изучение свойств фермента уреазы а.в&р-горЬуНсиэ ° перспективой ее использования в ферментных анализаторах и в медицинском микроанализе.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

; I. Разработка способа очистки уреазы до гомогенного состояния.

2. Изучение структурных характеристик фермента.

3. Изучение .каталитических свойств фермента и влияния на них неблагоприятных факторов: температуры,колебания рН, присутствия в реакционной среде различных примесей.

4. Стабилизация каталитической активности уреазы в растворе.

Hayчная/новизна работы. Разработана достаточно эффективная методика очистки уреазы до гомогенного состояния из впервые полученного во ВНИИ ПЭ продуцента S.saprophyticxis^ Определены основные структурные и каталитические характеристики фермента. Определены стабилизаторы каталитической активности в растворе.

Практическая ценность работы. Разработана производственная методика получения препарата фермента, пригодного для использования в наборах для определения мочевины в биологических жидкостях (уреазно-буферная смесь). Изученные структурные и каталитические характеристики фермента позволяют грамотно использовать его в практике.

Апробация Работы. Результаты работы были представлены на конференции Литовского биохимического общества (Вильнюс, 1983), на Всесоюзной конференции "Применение ферментов в биохимических анализах" (Паланга, 1984), на Международной конференции Европейского биохимического общества (Москва, 1984), на 14-ом Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988), на 4-ой Всесоюзной конференции по ферментам микроорганизмов (Ташкент, 1988).

Дубликашм. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных статей и получено одно авторское свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 126 стр.машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 14 таблицами. Список литературы включает 164 наименования, в том числе 154 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объектом исследований служил фермент уреазы (уреаамидо-

гидролаза, EC-3.5.I.5.), выделенный из клеток staphylococcus saprophytics штамма 'L-I.I0 . В ШО "Фермент" на-

лажено производство технического препарата уреазы из этого штамма.

За единицу уреазной активности принямали такое количество фермента, которое катализирует образование1,0 мкмоль аммиака за I мин при•30°С,применяя в качестве субстрата мочевину.

Для определения уреазной активности к 1,0 см3 3%-novo раствора мочевины добавляли 1,0 см3 исследуемого раствора фермента. Реакцию прободали в Термостате при 30°С в течение 5 мин при рН= 6,8, затем реакцию останавливали добавлением 1,0 см3 1,0 N HCl . Из реакг'юнной среды отбирали пробу объемом 0,1 см3 разбавляли в 45 раз и добавляли 0,5 см3 реактива Нееслера. Количество выделившегося аммиака определяли по калибровочному гранку. Для построения калибровочного графика использовали растворы хлористого аммония.

Определение белка осуществляли методом Брадфэрда ( Bradford, 1976).

Определение кинетических параметров уреазы s.sapro-phyticus осуществляли титриметрически. В инкубируемую при

кювету ТИТрОВЗЛЬНОЙ установки ETS 822 'Ridioteter" (Дания) вносили 10,0 см3 раствора субстрата, затем добавляли 0,1 см3 раствора фермента. О скорости реакции судили по расходу 0,01 N HCl на нейтрализацию продуктов реакции.

Влияние ионов тяжелых металлов на уреазу определяли для интервала концентрации 5.10"^ - 10~2М. В опыте использовали нитраты металлов.

Изофокусирование уреазы проводили на приборе 1KB. 8101 (Швеция) на колонке объемом НО см3 в зоне ПН амфолинов от 4,0 до 8,0. Для образования градиента плотности использовали сахарозу (0-50$).

Ультрацентрифугирование осуществляли на аналитической центрифуге ? Beckman " модель Е (США) с адсорбционной фотоэлектрической сканирующей системой и мультиплексором. Опыты по седиментации осуществляли "высокоскоростным методом" о применением- "сверхскоростной скорости" (Черняк В.Я., 1982).

Определение аминокислотного состава проводили на автоматической аминокислотном анализаторе с ЭВМ "Hitachi 835"

(Япония). Предварительно осуществляла гидролиз пептидных овяэед с N ЕС1 или смесью, состоящей кз равного ком-, чества соляной л три^оруксуснои кислот. 1

Гомогенность препарата уреазы при очистке проверяли о помощью электрофореза в 7,0/5 полиакриламидном геле по методу Девиса С Davis , 1964).

Определение молекулярной массы субъединицы уреазы осуществляли с помощью электрофореза в 10,0 % полиакршшмидном геле в присутствии додещисульфата натрия по методу Веоера ( Weber et. al , 1972).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ

Получение гомогенного препарата уреазы s.Bnprophyticua

Коммерческий препарат уреазы из клеток S.eaprophyticuB, получещшй'после механического их разрушения и осаждения охлажденным этанолом, содержащий 200-350 ед. уреазы на I мг белка, служил источником урвазы. Попытки хроматографически фракционировать,полученный препарат на анионшсных сорбентах и на сефарозе сь -4В оказались малоэффективны?«!, поэтому с целью повышения эффективности хроматографическах методов очистки осуществляли предварительное фракционирование раствора уреазы охлажденным этанолом. Полученный раствор технического • препарата фермента насыщали на холоду этанолом до 40/S, оставляли. на ночь для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин, а надо-садочную жидкость насыщали этанолом до 60%, вновь оставляли на холоду для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 10000 oö/мин в течение 20 мин и растворяли в 0,06 М калий-фосфатном буфере рН= 6,8, содержащем 1,0 мМ ЭДТА и 1,0 мМ 2-мвркаптоэтанола, нерастворившиеся частицы, удаляли центрифугированием при 13000 об/мин в течение 20 мин. Подученный раствор уреазы содержал 74,5$ фермента, специфическая активность которого была в 4,1 рэз выше, чем исходного препарата и достигала 1000 ед/мг.

Для дальнейшей очистки ферментный раствор наносили на колонку с ДЕАЕ-салозоЙ. Несорбировавшиеся примеси смывали с колонки стартовым 0,06 М калий-фосфатным буфером pH 6,8, содержащим 1,0 мМ ЭДТА и 1,0 мМ 2-меркаптоэтанола. Десорбцию

уреазы осуществляли градиентом НаС1 от О до 0,5 М.

Специфическая активность уреазы после десорбции с колонки ДЕАЙ-салозы возрастала до 2500 ед/мг. Электрофорети-ческий анализ десорбированного препарата фермента обнаружил две белковые полосы, одна из которых принадлежит уреаэе, а другая - примесному белку.

Для отделения примесного белка осуществляли гельфильт-рации полученного препарата уреазы на сефарозе сь -4В. Ъ результате гельфальтрации получали препарат уреазы, электрофоре-тический и седиментационный.анализ которого свидетельствовал о его гомогенности. Схема очистки уреазы й.8аргорЬуг1сив до гомогенного состояния приведена в таблице I.

Таблица I

Схема очистки уреазы ь.заргорЬуНсиз

ед. мг |ед/мг I степень {очистки % выхода

Технический пре-. парат 115410,0 594,7 •> 194,1 100,0

Освоение этанолом 111947,7 347,5 310,6 1,6 97,0

Освоение этанолом 85980,5 116,5 737,6 3,8 74,5

Ионообменная хроматография 48587,6 20,8 2334,2 12,0 42,1

Гельфильтрация 27236,8 8,7 31X4,4 16,0 23,6

Молекулярная масса уреазы

Определенная методом седиментационного равновесия молекулярная масса уреазы 8.еаргорЬУ'Ысиз равна 294000^8000 Да. По молекулярной массе она не отличается от бо;-дшнства бактериальных уреаз, молекулярная масса которых колеблется в зависимости от источника от 130000 до 380000 Да.

Для анализа субъединичной структуры уреазы Б.варгорЬу-•ьЗ-сив осуществляли электрофорез в додецилсульфате натрия. Этим методом было установлено, что молекулярная масса уреазы равна 74000 - 500 Да. Предположительно, что уреаза 6.варгорЬуЫсиа состоит из четырех идентичных субьедшвщ. Субъединичная структура характерна как для бактериальной, так и для растительной

уреазы. В основном они состоят из одинаковых субъединиц, но уреааа К. aerogenes состоит из трех видов субъединиц, различных по молекулярной массе С Todd et all, 1987).

Аминокислотный состав и яэоалвктигтеоквя точка уреазы S.saprophyticus

Аминокислотный состав уреазы S.saprophytious незна-' чительно отличается от уреазы из источников, приведенных в таблице 2. •

Таблица 2

Сравнение аминокислотного состава уреазы S.saprophy-tlcus с уреазами из других источников

Аминокислоты моль/% уреазы Jg^nes } 1 Brevi- j jack Ъеал bacte- I(Oanavalia rium {enzifortaia) ammonia-| genes J Soy- IStaphy-Ъеап jlococcus (Gly-jбаргорЬу cine jticus max) |

ЦПС 1,44 0,38 1,79 0,47 2,20

АСП 9,23 11,60 10,60 12,76 11,70

ТРЕ 6,90 7,23" 6,55 5,28 5,40

СКР 6,05 3,64 5,48 5,79 3,80

глю 10,32 10,22 8,22 10,09 11,80

ПРО 5,50 4,66 5,00 , 6,09 ■ 4,00

глл 12,35 9,66 9,40 10,35 10,50

АЛА 10,45 10,68 8,80 7,44 9,70

ВАЛ 7,46 7,80 6,55 6,34 6,00

МЕТ 1,66 i.Vb 2,50 2,04 3,90'

ИЛЕ 5,72 7,13 7,86 6,16 5,40

Мг 6,92 7,46 8,21 8,17 6,3

ТИР 2,00 1,17 2,50 2,43 3,0

2,57 3,02 2,86 4,23 3,0

гас 3,00 2,91 2,98 2,09 2,6

ЛИЗ 3,44 4,87 5,71 5,64 7,0

АРГ 3,96 4,89 4,52 4,62 3,6

ТОФ 0,99 0,90 0,48 не сооб-118 общается нару-жено

Как видим из приведенных в таблице 2 данных, уреазы содержат большое количество аспарагиновой и глютаыиновой аминокислот, глдцина, аланина, незначительное количество цикли-

ческих аминокислот.

Данные аминокислотного анализа позволяют сделать вывод, что уреаза является кислым белком, pl=4,42*0,1.

Каталитические свойства уреазы S.sapropbyticua

Уреаза S.' eaprophyticus обладает каталитической активностью в широком интервале значений рН с максимумом активности в зоне нейтральных рН, Активность уреазы значительно зависит от состава буферной среды (рис. I), 8 молярность буфера почти не влияет на уровень ее активности.

При увеличении температуры.скорость гидролиза мочевины . уреазоа возрастает прямо пропорционально' в интервале температур 25 - 60°С QI0 =1,28. Инкуоация при более высокой температуре ведет к снижению скорости гидролиза, вероятно, из-за инактивации фермента рис.2, график 2. Следует заметить, что воздействие высокой температуры непродолжительное время (рис. 2, график I) ускоряет процесс гидролиза, не затрагивая молекулу фермента, поэтому мы не наблюдаем снижения скорости реакции даже при температуре 75°С.

Судя по литературе, уреазы из микробных источников нетер-мостабильны, они начинают инактивироваться при температуре 40-45°С. Лить уреаза В.; »■■oniaeine« проявляет максимум каталитической активности при 60-65°С ( Nafamo et all, 1984).

По основным кинетическим параметрам уреаза S.saprophy-ticusHe отличается от большинства уреаз. ^ = 7,4-0,7 мМ, 3,1 - 0,1 мМ/мг.мин. Продукт реакции гидролиза мочевины, ионы' аШлшя, слабое ингибирующее воздействие на уреазу S.saprophyticua , к± » 0,39 - 0,01 М, рис.3.

Влияние тяжелых металлов на уреазу S.gaprophytioviB

Уреаза, независимо от источника выделения, ингибируется ионами тяжелых металлов. Наиболее сильное ингибирующее воздействие на уреазу s. saprophytics оказывают ¿г^Л^ 8,0 . I0-6M. Ионы Ag44 оказывают сильное ингибирующее влияние на растительную уреазу ( 6hau , 1954, Chandra , 1963) и на уреазу из тканей улитки Otala ( nc»on*id «t ш , 1980). Ионы Ms**, cd**, Со\ Cu4"*' также ингибируют уреазу из названных источников. Иягибирупцее воздействие они оказывают и на

0.1Н 0.05М 0.0 25Н

0.025Н 0.05Н 0.1 Н-

ы о

5 5.5 В 65 7 7.5 В рН °В 6.5 7 7.5 6 8.5 5 ' 9.5 рН

Рис. I. Зависимость рН-оптимума и активности уреазы от состава среды: а-фосфатко-

цитратн^й буфер, С - ТРЙС-НС1 буфер, в - калий-фосфатный буфер, г - аеронало-вый (диэтилбвроитуратный) буфер)' '

мШз

мщ-мг 5.0

4.0

30

2.0

10

О

20 30 40 50 60 70 30 #

Рис. 2. Зависимость скорости гидролиза мочевины

от температуры: I - продолжительность реакции 2,5 мин, 2 - продолжительность реакции 10,0 шн.

уреаву Б. 8аргорЬуЬ1сив , таблица 3.

Таблица 3

Влияние ионов тяжелых металлов на уреаэу Б.еаргорЬу-исив

Ионы Ме

м

N1

са

Со'

Сц' гп рь

■и

44 44 4+ 44 44 44

8,0. КГ3 1.5.10"5

2.0.Ю"5

3,5.10-5 б.О.Ю"5

2,5.10'

Рис. 3. Влияние ионов аммония на каталитическую

активность уреазы -<■

Ингиоирующий эффект всех изученных ионов начинает проявляться при их концентрации в реакционной смеси Ю""^— 2,5.1СГ6М и достигает 100$ при концентрации 5,0.Ю~4М (для ионов А-б4") и.-10_3М (для ионов Мй44', Си , 2п э РЬ-^) 5 рис. 4. Дрис}¿отвив гтих ионов в реакционной среде в кон- ' центрацыях превышающих (за исключением ионов Си** ) •

приводит к денатурации фермента и полной потере его каталитической активности. Ионы N1**, ся**, со++ не вызывают 100^-ной ингибиции уреазы даже если присутствуют в реакционной среде в концентрациях выше ДГ^М, рис. 4.

Влияние органических растворителей на активность уреазы Б. ватэгорЬуЬ1сив__у

Присутствие органических растворителей $ реакционной среде может изменять скорость гидролиза субстрата ферментом. Они могут воздействовать как на исходные вещества - фермент и субстрат, так и на фермент - субстратный комплекс. И чем больше полярность растворителя, тем сильнее его влияние на

Рис. 4. Зависимость активности уреазы от концентрации ионов тяжелых металлов: I - ингиби-рование уреазы ионами Ае+ , 2 - ингибиро-вание уреазы ионами Со*"*".

на реакцию (Терней, 1980).

Было испытано влияние ацетона, этанола, тетрагидро-фурана и димешпсульфоксида на уреазу з.варгорЬуисивтаб-ллца 4,

Как видно из приведенных в таблице 4 результатов, ацетон и этанол активируют уреазу, примерно в 1,6 а 1,2 раза увеличивая ее каталитическую активность. Тетрагидрофуран и диметилсульфоксвд подавляют активность фермента црн больших концентрациях.

Изучение субстратной специфичности уреазы 8.8аргорЬуг1сиа

Растительная уреаза способна гидролизовать не только мочевину, но а такие субстраты, как гидроксишчевина ( 51вЬЪв1л , 1965), ыетшшо чевина, ацетамид, форыашд (Диксон с соавт., 1980).

Таблица 4

Изменение активности уреазы з.варгорЬуИси8 в присутствии органических растворителей

Растворитель j Роотворитель:вода 1 Активность уреазыцн, . »ПМОЛЬ 3 /мин

Контроль 100,0*3,1

Ацетон I : 9 157,0-2,2

3 : 7 158,6-1,8

.5:5 142,0*2,7

Этанол I : 9 121,4*3,9

3 : 7 122,9*1,9

5:5. 121,4*3,1

Тетрагидрофурэн I : 9 84,4*3,1

3 : 7 21,9*3,0

5:5. 0,0

Диметилсульфоксад I : 9 80,7*1,6

3 : 7 35,9*0,4

5:5 5,4*0,1

Уреаза БаргорЪугз.сив также не обладает абсолютной специфичностью по отношении к мочевине. Она способна гидролизовать ■а.помочевгну, биурет, ыетилмочевину, ацетиладо-чевину, таблица 5.

Таблица 5

Сравнение основных кинетических параметров гидролиза мочевины и ее аналогов уреазой 8. еаргорйзгМсив

Субстрат

V

мкыоль nej /иг .мин,

Мочевина

Тиомочевина

Биурет

Метилмочевина

Ацетилмочевина

Гидроксимочевина

0,007 0,008 0,06 0,004 0,0045

3,14 0,25 1,77 0,17 0,15

449

32 30 42

33

не гидролиэуется

Как видим из результатов, приведенных в.таол.5, только Оиурет гидролизуется уреазой б. заргорЬу^сив со скоростью того же порядка, что и мочевина, скорость гидролиза других производных на порядок нике, чем мочевины.

, Гвдроксямочевина уреазой З.БаргорЬуг1сия не гидролизуется.

Влияние производных мочевины на скорость гидролиз мочевины уреазой гаргорЬу^сив

Присутствие в реакционной среде тиомочевшш, .биурета, метилмочеканы, ацетилмочевины не.оказывает влияния на скорость гидролиза мочевины уреазой э.еаргорЬу-Ысиз , таблица 6.

Таблица 6

Влияние производных мочевины на ее гидролиз уреазой

Субстрат |концент-;рация, М V.i« / мин.мг V м

Мочевина Контроль 3,2 0,01

Тиомочевина 0,125 3,13 0,011

' 0,025 2,7 0,0108

0,005 2,7 0,011

Мочевина Контроль 3,18 0,01

Биурет 0,125 3,4 0,0086

0,025 1 3,05 0,0098

0,005 3,0 0,011 .

Мочевина Контроль 3,14 0,0108

Метилмочевина 0,125 3,14 0,0102

. 0,025 3,06 0,0101

0,005 2,93 0,0106

Мочевина Контроль 2,98 0,0121

Ацетилмочевина 0,125 2,95 0,006

0,025 2,9 0,0064

0,005 2,95 0,0086

Из полученных производных мочевины только гидроксимоче-вина оказывала ингибирущее влияние на уреазу ß.saprophy-ti«ua.

Таблица 7

Ингиоированне гидролиза мочевины гидроксимо чевиной

! Концент-I рация ингиби-| рования, М ^/млн.мг, ^ каж.,М

Контроль 3,12 0,0076

Гидроксимо чевина 0,005 3,2 .0,3

0,001 3,22 0,055

0,0002 3,22 0,016

Судя по данным, приведенным в тасш. 7 она является конкурентным ингибитором ураазы, Кх =» 1,5.Ю"4 1^0,17.10"%.

{^висимость стабильности уреазы ьъ температуры

Уреаза в.еаргорЬуисие является термостабильным ферментом. Инкубация ее при температуре 50-55°С в течение I часа не приводит к сколько-нибудь заметному падению каталитической активности. Начиная с 60°С найлюдалось падение активности, которое усиливалось с ростом температуры, рис. 5. С ростом температуры на 5°С константа инактивации возрастала на порядок.

Зависимость стабильности уреазы от рН

Изучали стабильность уреазы в растворе при различных рН и температуре 65°С. Результаты опытов, приведенные на рис.6 позволяют сделать вывод, что уреаза з. еаргорЪуисив наиболее стабильна в интервале близких к нейтральным рН. Однако значения рН-оптдмума и интервала наибольшей стабильности не совпадают. Если рН-оптимум каталитической активности находится в интервале рН 6,8 - 7,0, рис. I, то наибольшая стабильность уреазы 8»варгорЬуг1сив наблюдается при рН 6,0-6,5, рис.6. Инкубация уреазы в этом интервале рН при 65°С в течение 3-х часов приводит к потере около 40$ активности, а при рН 5,05,5 и 7,5 - 8,5 за это время инкубации сохраняется не более 10% от исходной активности фермента.

Г 17 -

Рис. 5. Зависимость константы инактивации от температуры

Изучение активности уреазы при длительном хранении ее растворов

В связи с тем, что уреаза 8,заргорЬуг±сиа производится для практического применения в наборах для определения мочевины в биологических жидкостях, вопрос сохранения ее каталитической активности в растворе является актуальным.

Если в лиофилизированном состоянии уреаза хранится на протяжении нескольких лет без потери активности, то в растворе она нестабильна, как, впрочем, и другие бактериальные уреазы. Для стабилизации каталитической активности уреазы а.варгорЬу-Ы.сив было опробовано 76 вариантов сред. Уреазу хранили в незаоуфервкных и в буферных растворах различной полярности со стабилизирующими добавками, в качестве которых использовали 2-ыеркаптоэтанол, ЭДТА, азид натрия, этанол, глицерин, сахарозу, бутанол, мертиолат, бен-зоат калия, хлорид натрия. Растворы уреазы хранили при комнатной температуре и в холодильнике (при 4°С) на протяжении 140 суток.

Эксперимент показал, что для хранения уреагы в раство-

Рис. 6. Зависимость константы инактивации от рН

ре в течение 2-4 недель в холодильнике вполне достаточно добавить в буфер I мМ ЭДТА и I мМ 2-меркаптоэтанола,'либо 20% этанола. Однако хранение фермента в растворе более 4-х недель приводит к потере его каталитической активности из-за микробного заражения, поэтому при необходимости доитачьного хранения уреазы в растворе обязательно присутствие антимикробных агентов.

Яз опробованных вариантов стабилиэируицих смесей наиболее пригодными для длительного хранения уреазы в растворе оказались смеси, приведенные в таблице 8.

Хранения уреазы в этих же растворах при комнатной температуре позволяв'* сохранить 10056 активность не более чем в течение 2-х недель.

¿аолица о

Среды, в которых уреаза б. ¡заргорьуисив не теряет активность при длительном

лОг

хранении при температуре 4иС, активность уреазы в мкмоль

см3, мин

&

среда

Сутки

К 10 20 30 40 50 60 20 80 90 100 110 120 130 140

234 194 225 231 217 195 206 207 214 212 191 194 202 193 195

232 232 240 215 210 181 228 206 194 202 215 211 195 203 210

225 192 192 233 230 217 213 223 250 227 229 221 217 230 223

202 202 198 197 202 195 206 211 2II 214 207 200 199 195 .199

228 225 218 182 176 215- 201 206 198 198 181 179 203 194 200

182 182 176 154 171 176 177 196 190 194 188 182 174 165 175

* 10 » 12 Л 47 Л 48 * 70 X 72

ы

Среда Л 10: 0,02% азида натрия, 1,0 мМ 2-меркаптоэтанола в 0,02 М калий-фосфатном буфере Среда £ 12: тоже, что и № 10 + 1,0 мМ ЭДТА

Среда Я 47: 0,005% ыертиолата, 1,0 мМ 2-меркаптоэтанола в 0,05 М калий-фосфатном буфере

Среда * 48: тоже, что и А 47 + 1,0 мМ ЭДТА

Среда А 70: 1,0 мМ бензоата калия, 1,0 мМ 2-меркаптоэтанола в 0,05 М калий-фосфатном буфере

Среда Я 72: тоже, что и А 70 + 1,0 мМ ЭДТА.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема очистки уреазы из технического , препарата, включающая фракционирование этанолом и две хро-матографияеские стадии - ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию, я получек гомогенный по данным элэктрофоратичес-кого а свдаментацаонного анализа ферментный препарат.

2. Методом седиментацйонного равновесия определена молекулярная масса уреазы равная 300000 Да, методом диск-электрофореза установлено, что она состоит из 4-х идентичных субъединиц с молекулярной массой около 75000 Да. Определен аминокислотный состав.

3. Определены основные кинетические параметры гидролиза мочевины к « 7,4 Ш, ^х» 3,1 ^лМ/мг.мин гри 30°С. Установлено, что рН-оптимум уреазы находится в узком интервале близком нейтральному рН, максимальная скорость гидролиза мочевины достигается при 60°С, скорость гидролиза зависит от состава буфера.

4. Изучена субстратная специфичность уреазы. Установлено, что она гидролизует биурет (Кщ = 60,0 ыМ, ^пах = 1,77 ^М/мин.мг), метилмочевину ( Кщ = 4,0 мМ.У^^. «= 0,17 ^¡М/иян. иг), ацетилмочевину (Кщ в 4,5 иМ,тшх = .0,15 ^аМ/мин.мг), ^ЩШШР * ^та * 8,0 мМ' Утах = 0,25^1М/мин.мг), но ско-ростьэтих субстратов (кроме биурета) на порядок ниже, чем мочевины.

5. Установлено, что ингибирующее воздействие на уре-' азу оказывают ионы тяжелых металлов: Аб*, ш.**^ са**» Со**» Из**, Си** гп** гь** » гидроксимочевина и = 1,5.Ю"4М, ионы аммония » о,39 М.

6. Уреаза не теряла активности в водных растворах ацетона и этанола, а в растворах тетрагидрофурана и диметилсуль-фоксида скорость гидролиза подавлялась.

7. Уреаза Бг. еаргорЬуНсив является термостабильным ферментом, она наиболее устойчива к воздействию повышенной температуры в интервале рН 6,0 - 6,5.

б. Длительное хранение уреазы в растворе (до 140 суток) возможно при наличии 2-ыеркаптоэтанола, ЭДТА и антимикробного агента в качестве стабилизирующих добавок.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Ковзан В,Б., Глемжа А.А., Юодвальките Д.Ю. Некоторые свойства урееаы Staphylococcus saprophyticus L -

- IЛО.//Съезд Литовского биохимического общества: Тез. докл. - Вильнюс, 1983. С.126.

2. Ковзан В.Б., Глемжа А.А., Кракенайте Р.А., Юодвальките Д.Ю. Аналитические системы,с применением уреазы и глу-таматдегидрогеназы//Всесоюзная конференция "Применение ферментов в биохимических анализах'1: Тез.докл. - Паланга, 1984. С.179.

3. Глемжа А.А., Ковзан Р.Б., Юодвальките Д.Ю. Ввделе-ние и некоторые свойства уреазы из Staphylococcus варго-.phyticue //Международная конференция Европейского биохимического общества: Тез.докл. - М., 1984. С.108.

4. Глемжа А.А., Ковзан В.Б., Юодвальките Д.Ю. Уреаза Staphylococcus saprophyticus • . Некоторые свойства и ннгибирование ионами металлов//Биохимия. 1984. Т.49. № 12. С. 2045-2049.

5. А.с. I270I72 (СССР).Штамм Staphylococcus saprophyticus L- 1.10. V. - продуцент уреазы. Юодвальките Д.Ю.,

Глемжа А.А., Ковзан В.Б., Барейкене И.В., Капсукас А.В., Карпавичюс В.В., Реклайтене С.И. Б.И.М2, 1986. - 4 с.

6. .Дякина В.Б., Глемжа А.А. Уреаза Staphylococcus saprophyticus , выделение и некоторые свойства// 14-ый Международный конгресс по биохимии: Тез.докл. - Прага, 1988. С. 209.

7. Дякина В.Б., Глемжа А.А. Некоторые физико-химические и каталитические характеристики уреазы из staphylococcus

saprophyticus //4-ая Всесоюзная конференция'по ферментам микроорганизмов: Тез.докл. - Ташкент, 1988. - С.218.

8. Glemza А.А., liakina V.B. Isolation and Purification of игеаве from Staphylococcus saprophyticus. Bkapsrlmentini» biologija ( Лит. ССР ). 1990. Nr. 2. С. 68-?4.

9. Дякина В.Б., Глемжа А.А. Изучение стабильности уреазы Staphylococcus saprophyticus //Прикл.биох. И микробиол. - в печати.

10. Ликина В.Б., Глемаа A.A. Кинетические и структурные характеристики уреазы ßtaphylococcus saprophyticus( . //Биохимия - в печати.

T-S9242.Подписано к печати 33.SS.98 г.

lyKGBCKSS типография. Заказ 17.Тирам 1£8.