Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori

Вартанова, Нунэ Оганесовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori"

На правах рукописи

Вартанова Нунэ Оганесовна

Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Алексахина Нина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Катосова Любовь Кирилловна

доктор медицинских наук,

профессор Лиходед Владимир Гаврилович

Ведущее учреждение: Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией Московской Медицинской Академии имени И.М.Сененова.

Защита состоится «¿3 - (ЛЮклЛ 2005 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН по адресу: г.Москва, Малый Казенный пер., 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Автореферат разослан

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Яковлева И.В.

ZOO&'V ¿/-/V33</</

fSâfi-

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Helicobacter pylori - микроаэрофильные, неспорообразующие,

грамотрицателыше, изогнутые палочковидные или кокковидные бактерии, населяющие слизистые оболочки нижних отделов желудка и двенадцатиперстной кишки [Marshall В.J., 1984]. В настоящее время принято считать, что H.pylori ассоциирован с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, а также является фактором риска при развитии карциномы желудка [Perez-Perez G.I., Blaser M.J, 2003]. Присутствие H.pylori не всегда подразумевает наличие болезни - носительство среди здоровой части популяции составляет 20-84% [Axon А., 1999]. Есть мнение, что H.pylori может играть позитивную роль для человека, поскольку его удаление имеет и отрицательные последствия [Blaser M.J., 1997; Blaser M.J., 1999; Labenz J. et al., 1997; Chow W.H. et al., 1998; Wermuller B.F. et al., 1997]. Однако конкретных гипотез и доказательств возможной положительной роли H.pylori в доступной литературе до сих пор не представлено. Какой бы ни была роль данных бактерий в организме здоровых и иммунокомпрометированных носителей, диагностика хеликобактериоза остается актуальной.

Существующие методы диагностики включают бактериологические,

гистологические, биохимические (разновидности уреазного теста),

иммунологические и молекулярно-генетические методы [Лапина Т.Л., 1999].

Обычно для клинической диагностики проводят эндоскопию с последующим

исследованием образцов биоптатов слизистой оболочки: посевом на

селективную среду, окрашиванием мазков-отпечатков по Граму, качественным

определением уреазной активности. Уреаза Н. pylori составляет до 10% от

общего белка клетки [Bauerfeind P. et al., 1997]. Этот фермент разлагает

мочевину с образованием гидроксил анионов, обеспечивая бактериям

возможность персистенции в агрессивной среде желудка, и является одним из

главных антигенов Н. pylori. Количественный метод определения активности

ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

уреазы в разных вариациях используется

в иссМПМНГОегаских ц|лях для оценки СЛмербуаг О» Ю$Яжт1

активности суспензий клеток различных микроорганизмов и препаратов фермента разной степени очистки [М.-Plaza I., R.-Herrera J., 1967; Юодвалыште С.-Д., 1983], однако, до сих пор не был разработан для биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

При проведении скрининговых эпидемиологических исследований, а также в случаях невозможности проведения эндоскопии, чаще всего в мировой практике используют иммунодиагностику. За рубежом создан ряд коммерческих препаратов для иммунной диагностики, основанный на использовании антигенов H.pylori. Первое поколение антигенных препаратов из H.pylori, используемых и в настоящее время, включает: целые бактериальные клетки; кислотно-глициновые экстракты биомассы; клетки, обработанные формалином; ультразвуковые экстракты клеток [Perez-Perez G.I., Blaser MJ, 2003]. Известны антигенные белки клеток H.pylori: Vac А - вакуолизирующий цитотоксин (мол.масса 87 кДа); Cag А - цитотоксин ассоциированный белок (140 кДа); субъединицы уреазы - Ure А (29.5 кДа) и Ure В (66 кДа); Hsp 60 -белок теплового шока (59-60 кДа); жгутиковый флагеллин - Fla (55 кДа); мембранный белок - аналог флаводоксина Fid А (19 кДа) и др. В новом поколении антигенных препаратов используют комплекс высокоочищенных белков - клеточных антигенов H pylori. Известны также специфичные антигены, выделяемые H.pylori в окружающую среду, набор которых значительно уже, чем клеточных [Lindholm С. et al, 1997].

Важным звеном при получении антигенсодержащих препаратов для последующей разработки диагностикумов являются питательные среды и процессы культивирования. Учитывая, что некоторые высокоспецифичные антигены Н. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве, очень актуально использование синтетических сред определенного химического состава. В доступной литературе описаны такие среды, однако, все они содержат бычий или лошадиный сывороточный альбумин [Albertson N. et al., 1998; NedenskovP., 1994; Reynolds D.J. and Penn C.W., 1994; Testermann T.L. et al., 2001]. Более или менее значимый прирост биомассы H.pylori отмечен лишь при невысокой степени очистки данного белка. Очевидно, что до сих пор

не найден тот основной компонент синтетической среды, который дал бы возможность культивировать H.pylori с высоким выходом биомассы.

Изложенное свидетельствует о том, что для усовершенствования диагностики Н pylori необходимо наличие чувствительного экспресс-метода определения уреазы и высококачественных антигенных препаратов, получаемых с помощью синтетической питательной среды.

Цель исследования:

Исследование активности уреазы и оценка влияния состава питательной среды на накопление биомассы и образование клеточных и внеклеточных белоксодержащих антигенов H.pylori.

Задачи исследования:

1. Создание коллекции штаммов H.pylori.

2. Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

3. Разработка новой синтетической среды для культивирования H.pylori.

4. Получение клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из Нpylori при культивировании на полноценной и синтетической средах.

5 Оценка методами ИФА и иммуноблоттинга специфических IgG-антител в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров с использованием полученных антигенсодержащих препаратов из H.pylori

Научная новизна

С помощью разработанного количественного метода показано, что уреазная активность биоптатов коррелирует с активностью уреазы выделенных их них культур H.pylori. Уреазная активность культур зависит от фазы роста, в фазе замедления она в 1,4-10 раз выше, чем в стационарной фазе

Сопоставление количественной уреазной активности и тяжести течения заболевания в группе больных язвенной болезнью показало отсутствие корреляции между этими показателями.

Метод дает возможность оценить продукцию хеликобактером гидроксил анионов в желудке и, таким образом, судить об участии бактерий в поддержании кислотно-щелочного баланса.

Обнаружено, что именно гемоглобин является тем принципиальным компонентом синтетической среды, который дает возможность культивировать H.pylori с высоким выходом биомассы. Практическая значимость

Создана лабораторная коллекция клинических изолятов, насчитывающая 30 штаммов H.pylori.

Разработан количественный метод определения уреазной активности применительно к биоптатам слизистой оболочки желудка и клеточным суспензиям H.pylori, основанный на регистрации изменения pH в реакционной смеси. Метод прост в исполнении и дает полезную информацию в течение 1040 минут, в отличие от нескольких часов при определении активности уреазы на качественном уровне. В группе из 51 больного язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки данным методом показано наличие H.pylori у 87.7% пациентов.

Создана синтетическая среда для культивирования H.pylori, содержащая минеральные соли, витамины, антибиотики, аминокислоты, гемоглобин, глутамин в качестве основного источника углерода и энергии, 0,1% агарозы для адгезии клеток.

Установлено, что антигенсодержащий препарат из культуральной жидкости после выращивания H.pylori на синтетической среде является более перспективным для создания диагностикума, чем препараты, полученные из клеток H.pylori, выращенных на синтетической или полноценной среде, поскольку содержит минимум антигенов, не имеющих значения для диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан количественный высокочувствительный метод определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori, основанный на учете скорости продукции гидроксил анионов.

2. Разработана новая эффективная синтетическая среда для культивирования H.pylori, содержащая в качестве основных органических компонентов глутамин и гемоглобин.

3. Культивирование H.pylori на разработанной синтетической среде обеспечивает получение внеклеточных специфических диагностических антигенсодержащих белков без дополнительной очистки.

4. Экспериментально обосновано предположение о роли H.pylori в качестве биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки на основании соотнесения скорости продукции гидроксил анионов клетками Нpylori со скоростью выделения протонов слизистой оболочкой желудка.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (2001); на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (2003); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Москве (2003); на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2004). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 4 марта 2005 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 работы в центральной печати.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальной части, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста, включают 17 рисунков и 15 таблиц, список литературы включает 134 наименования.

Собственные исследования

Объекты и методы исследования

Исследование проводили в группе пациентов из 51 человека (16 женщин, 35 мужчин) в возрасте от 17 до 72 лет с язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки и находящихся на лечении в ЦНИИ Гастроэнтерологии г. Москвы и ГУ НИИ Геронтологии г. Москвы.

Сыворотки крови и биоптаты получены от одних и тех же больных. Сыворотки крови здоровых доноров получены на Московской станции переливания крови.

Взятие проб биоптатов слизистой оболочки пилорического отдела желудка проводили во время эндоскопического обследования пациентов. Свежевыделенные биоптаты помещали в стерильный физиологический раствор (pH 6.9 ± 0.1) на время транспортировки в лабораторию (1 час). О присутствии Н pylori судили по результатам микроскопии окрашенных по Граму мазков-отпечатков биоптатов, качественному определению уреазной активности в биопсийном материале и получению культур.

Чистые культуры Н pylori выделяли путем посева биопсийного материала на чашки Петри с плотной средой Columbia agar base («ICN») с добавлением 5% эритроцитарной массы донорской человеческой крови и раствора антибиотиков. Чашки инкубировали в специально сконструированном анаэростате с газовой смесью, состоящей из 10% углекислого газа, 6% кислорода и 84% азота, при 37°С в течение 3-7 суток. Выращенные культуры идентифицировали по типу колоний, свойствам клеток в окрашенном по Граму

и неокрашенном (подвижность) мазках, а также качественных реакций на наличие уреазной, каталазной и оксидазной активностей [Определитель бактерий Берджи, 1997].

Культивирование в жидких средах проводили во флаконах объемом 100 и 500 мл, содержащих 10-50% среды. Солевую основу (кроме фосфатов) и некоторые органические компоненты вносили во флаконы в виде раствора, после чего среду во флаконах барботировали указанной выше газовой смесью. Флаконы укупоривали силиконовыми пробками и алюминиевыми головками на резьбе, стерилизовали 30 мин при давлении 0.5 атм. Стерильные растворы витаминов, антибиотиков, кровь, гемсодержащие добавки, фосфаты и посевной материал вносили после стерилизации с помощью шприцев. Посевы во флаконах инкубировали при 37°С в 1ермостате в стационарном режиме. Уровень кислорода поддерживали тем, что через 1 сутки в силиконовую пробку вставляли шприцевую иглу диаметром 0 6 мм со стерильным ватным тампоном и продолжали культивирование.

Концентрацию биомассы определяли по оптической плотности (ОП) культур с помощью фотоэлектроколориметра KF-77 ("Zalimp", Poland) при длине волны 535 нм в кюветах с оптическим расстоянием 10 мм.

Определение уреазной активности проводили с использованием среды Закса [Лабинская A.C., 1978] . Каталазную активность определяли с использованием 3% перекиси водорода. Для определения оксидазной активности использовали 1% раствор N,N,N, N - тетраметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида (ТМФД) [Определитель бактерий Берджи, 1997].

Содержание белка определяли методом Лоури [Lowiy О.Н., 1951]. Аминокислотный анализ проводили на анализаторе 2021 Maxicoldlab ("LKB", Швеция) в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов, Пущино-на-Оке. Растворы гемоглобина готовили суспендированием сухого коммерческого препарата в дистиллированной воде (1:6), затем центрифугировали 15 мин при 5000 об/мин и супернатант пропускали через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Определение концентрации гемоглобина в среде и

культуральной жидкости проводили по калибровочной кривой, построенной с использованием раствора гемоглобина в воде: на оси абсцисс - содержание белка гемоглобина, на оси ординат - величина поглощения при 550 нм на спектрофотометре СФ-26 («Ломо», С-Петербург). Выделение низкомолекулярной фракции гемоглобина проводили на колонке 2,5x40 см в геле сефадекса G-100 ("Serva"), элюирующий буфер - калий-фосфатный 0,05 М рН 7,0.

Определение специфических IgG-антител в сыворотках крови проводили методом твердофазного ИФА на базе Лаборатории иммунохимических методов диагностики ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН [Гервазиева В.Б. с соавт., 1986]. Иммуноблоттинг проводили на базе Института диагностики и профилактики социально значимых заболеваний (Москва) под руководством к.б.н. Сердюк О.А. [Towbin Н. et al, 1979; Смирнова Е.Я. с соавт., 1990; Цыциков Э.Н. с соавт., 1988; Hong C.S et al, 1986]. Для электрофореза белков в градиенте 5-20% полиакриламидного геля пользовались методом Лэммли [Laemmly U.K., 1970].

Коэффициент линейной корреляции Пирсона, стандартное отклонение и другие показатели рассчитывали по программе, вложенной в Microsoft Excel, пользуясь пособием Платонова [Платонов А.Е., 2000].

Результаты и обсуждение Создание коллекции штаммов Н. pylori

На протяжении всего периода работы исследован 51 биоптат. Свежевыделенные штаммы были идентифицированы по совокупности тестов как Helicobacter pylori и обладали следующими одинаковыми признаками: грамотрицательные извитые подвижные палочки длиной 1.5-5.0 мкм, положительные в оксидазном, каталазном и уреазном тестах. Штаммы сохраняются в 20% растворе глицерина в дистиллированной воде при -30°С или в сахарозо-желатиновой среде в лиофилизованном или замороженном состоянии. Таким образом, создана лабораторная коллекция, состоящая из 30 клинических штаммов Н. pylori с порядковыми номерами №1, №2, №3 и т.д.

Видовая принадлежность штамма № 2 подтверждена путем тестирования по 23 признакам, заложенным в коммерческую тест-систему "Api Campy".

Разработка метода количественного определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

Известны и используются в микробной биотехнологии следующие количественные методы определения уреазной активности -колориметрический [Sumner J.B. et al., 1953], титриметрический [Юодвальките С.-Д.Ю., 1983] и метод, основанный на измерении величины pH [M.-Plaza J., R.-Herrera J., 1967]. Прототипом нашего метода явился 3-й метод. Модификация заключалась в использовании метода не только для суспензий клеток, но и для биопсийного материала, что потребовало 10-кратного уменьшения объема реакционной смеси за счет использования портативного рН-метра. В пробирку, содержащую 1.5 мл незабуференного физиологического раствора (pH 6.9 ± 0.1), помещали биоптат и погружали электрод рН-метра (Piccolo-2, фирма Hanna) диаметром 12 мм. Пробирку термостатировали при 37°С 10-15 минут, после чего дважды измеряли величину pH с интервалом 10 минут, не вынимая пробирку из термостата, но перемешивая реакционную смесь. При этом значения pH регистрировали как исходные (7.0 ± 0.2). Затем в пробирку добавляли 80 мкл раствора мочевины (конечная концентрация 600 мкг/мл) и сразу измеряли pH. Измерения проводили каждые 1-10 минут (в зависимости от активности) в течение 10-40 минут, после чего биоптат взвешивали. На рис.1-А представлены типичные кривые изменения pH во времени, отражающие уреазную активность биоптатов. Активность уреазы рассчитывали как начальную линейную скорость изменения pH: разность значений pH, взятых в начале и в конце прямолинейного отрезка кривой, относили к массе биоптата и ко времени. Величину уреазной активности выражали в ДрН/ час х мг биоптата.

С помощью количественного метода было показано носительство Я. pylori в группе из 49 больных язвенной болезнью в 87.7% случаев, а с помощью качественного - в 73.1% случаев. Можно утверждать, что количественный

метод более чувствителен, чем качественный, поскольку даже при очень низкой активности (пологая кривая зависимости величины pH от времени) в течение 1 часа можно с уверенностью констатировать наличие уреазы, тогда как при качественном тесте необходимо значительное изменение величины pH (и, соответственно, время), чтобы краситель феноловый красный поменял цвет с желтого на малиновый.

Данным методом оценивали уреазную активность культур H.pylori, выращенных на кровяном агаре. Для измерения использовали суспензии клеток, дважды отмытых физиологическим раствором. Для получения достоверных данных объем вносимой суспензии подбирали таким образом, чтобы начальный линейный участок кривой зависимости pH от времени проходил через 4-5 точек-значений pH, измеренных с интервалом в 1 минуту. После того, как был подобран оптимальный объем аликвоты, проводили по меньшей мере 3 измерения, из которых рассчитывали среднее значение уреазной активности. Уреазную активность культур выражали в АрН/мин х мг белка. На рис. 1-Б изображены типичные кривые изменения pH во времени, отображающие уреазную активность культур Н. pylori.

В серии экспериментов сравнили активность уреазы 3-х биоптатов и полученных из них культур H.pylori. Сравнение полученных величин уреазной активности для культур (18.47 ± 2.04; 2.50 ± 0.30 и 28.07 ± 3.02 АрН/мин х мг белка соответственно) с величинами уреазной активности соответствующих биоптатов (0.875; 0.086 и 2.676 ДрН/час х мг биоптата) показало наличие линейной корреляции: коэффициент Пирсона г = 0,934. То есть, чем большей активностью уреазы обладает культура Н. pylori, тем выше таковая и в биоптате. На этом основании можно предположить, что общее количество выделяемых бактериями гидроксил анионов в желудке в большей степени зависит от активности штамма, чем от степени обсемененности слизистой оболочки.

9,0

7,0

8,5 8,0 7,5

8,5

6,5

0 20 40 80 80 100 время, инн

вреня, инн

Рис. 1. Изменение pH реакционной смеси, отражающее уреазную активность: А - биоптатов, Б - культур Н pylori', ♦ - высоко-активный биоптат/культура, ■ - биоптат/культура со средним уровнем активности, А -неактивный биоптат/культура.

Разработанным методом исследовали уреазную активность культур 5 коллекционных штаммов Н.pylori, выращенных на плотной полноценной среде до фазы замедления скорости роста (3 суток) и стационарной фазы (7 суток). Оказалось, что, уреазная активность более молодых культур варьировала в пределах от 18,5 до 63,6 ДрН/мин х мг белка, причем в фазе замедления роста активность уреазы была в 1,4-10 раз выше, чем в стационарной фазе. Такая закономерность характерна для многих микробных ферментов [Перт С.Дж., 1978] и объясняется тем, что в стационарной фазе происходит исчерпание субстратов, необходимых для биосинтеза ферментов. Полученные данные могут иметь значение при целенаправленном получении фермента (антигена) уреазы Н.pylori.

В группе из 19 больных язвенной болезнью провели сопоставление тяжести течения заболевания, рассчитанной по сумме значимых критериев (продолжительность заболевания, частота обострений и данные эндоскопии -Никольская К.А., ЦНИИ Гастроэнтерологии), и количественной уреазной активности биоптатов: коэффициент корреляции Пирсона составил г = 0,183. Эти данные свидетельствуют об отсутствии корреляции между тяжестью течения язвенной болезни и активностью уреазы, измеренной количественно.

Рис. 2. Схема создания синтетической среды для Н.ру1огг

на основе полноценной среды. Основными конечными компонентами синтетической среды являются глутамин и гемоглобин.

Разработка новой синтетической среды для культивирования Н.ру1оги

Для разработки синтетической среды была принята следующая схема (рис.2). Исходной основой явилась полноценная среда, содержащая в качестве источников углерода и азота пептон, а в качестве источника органического железа - кровь. Из имеющихся в собранной коллекции штаммов был выбран один (№ 2), обладающий наиболее высокой скоростью роста на плотной полноценной среде с кровью. Накопление биомассы на среде с пептоном оказалось в 2,3 раза ниже в сравнении со средой с казаминовыми кислотами, по-видимому, из-за более высокого содержания в последней свободных аминокислот. Для замены казаминовых кислот простыми компонентами исследовали рост Н.ру1оп на среде, содержащей 40 г/л казаминовых кислот и 1% крови в течение 7-ми суток. Провели аминокислотный анализ исходной среды и культуральной жидкости (рис. 3).

12000

■g

s 10000

н" 2

5 а 8000

1 6000

i 4000

Я о: 2000

-GUi

-У8 . JtopL

^ lin fililí

Pro

1« Val «. Ï Fl» il lïl l:ï

Рис. 3 . Потребление аминокислот при росте H.pylori на среде с

казаминовыми кислотами (40 г/л) и кровью (1%):

- темные столбики - содержание аминокислот в исходной среде;

- светлые — во внеклеточной жидкости после культивирования в течение 7 суток; Lys - лизин, His - гистидин, Arg - аргинин, Asp - аспарагин, Тге -треонин, Ser - серин, Glu - глутамин, Pro - пролин, Gly - глицин, Ala -аланин, Val - валин, Met — метионин, Не - изолейцин, Leu - лейцин, Tir — тирозин, Phe - фенилаланин

Оказалось, что 27% от суммарного содержания аминокислот в исходной среде и в конечной культуральной жидкости составил глутамин. Потребление наиболее представленных индивидуальных аминокислот в течение 7-ми суток составило от 49.2 до 59.1%. Таким образом, для будущей синтетической среды основным источником углерода и азота был выбран глутамин, а остальные аминокислоты, необходимые для роста H.pylori, добавлены в микроколичествах.

Обычно в среду для культивирования хеликобактера добавляют 5-7% крови. При исследовании концентраций крови в диапазоне от 0.25% до 5% на фоне 40 г/л казаминовых кислот установлено, что существенное лимитирование роста происходило при содержании крови в среде менее 1%, поэтому в дальнейшем использовали данную концентрацию крови - 1%.

Известно, что для микроаэрофильных микроорганизмов, каковым является Н.pylori, необходимо поддерживать хотя и относительно низкий, но постоянный уровень кислорода в среде. Дополнительную аэрацию обеспечивали введением шприцевой иглы в пробку флакона после 1 суток культивирования. Для дальнейшего упрощения состава среды важно было установить, какие компоненты крови наиболее необходимы для роста хеликобактера. В таблице 1. представлены основные аминные и гемовые компоненты сред, апробированных в процессе создания синтетической среды. Постепенная замена крови на более простые аналога на фоне казаминовых кислот показала, что рост H.pylori зависит от содержания гемового железа в среде. Сыворотка и аминокровин (не! емовый компонент эритроцитов) содержат следы гемового железа, поэтому рост в этом случае минимальный. Простые гемсодержащие соединения - гемин и цитохром с - также не обеспечивали заметного роста кулыуры. Наиболее эффективным соединением оказался гемоглобин.

Важным моментом при культивировании H.pylori явилось внесение в среду агарозы. При добавке агарозы в концентрации 0,1% (таблица 1) выход биомассы при культивировании на синтетической среде становился сравнимым с таковым на полноценной среде с кровью. Очевидно, что клеткам H.pylori необходима адгезия на поверхности твердой фазы, аналогичной их природному экотопу.

На рис. 4 представлены кривые роста Нpylori на полусинтетической среде с кровью (1%) и синтетических средах с бычьим и лошадиным гемоглобином. Очевидно, что использование гемоглобинов обеспечивало значительное сокращение экспоненциальной фазы (15 часов) и увеличение выхода биомассы в 2,5 раза по сравнению с полусинтетической средой. Из двух изученных гемоглобинов животного происхождения предпочтительным оказался лошадиный. Длительность экспоненциальной фазы, описанная в работах других авторов, составляла от 22 до 120 часов, а накопление биомассы, выраженное в КОЕ/мл культуры, было на 1-2 порядка ниже, чем в случае

Таблица 1. Значимость компонентов крови, азотсодержащих компонентов и твердой фазы для роста Н.ру1оп в жидкой среде

Характеристика среды Кровь и её составляющие Источник аминного азота Наличие твердой фазы (агароза) Максимальный прирост биомассы, ОП 535

Полноценная Кровь 1% *** Казаминовые кислоты * - 0,660 ± 0,05

Полноценная Сыворотка 1% Казаминовые кислоты - 0,015 ± 0,004

Полноценная Аминокровин 1% Казаминовые кислоты - 0,005 ± 0,002

Полусинтетическая Гемип *** Казаминовые кислоты - 0,015 ± 0,003

Полусинтетическая Гемин Казаминовые кислоты + 0,032 ± 0,007

Полусинтетическая Цитохром С*** Казаминовые кислоты - 0,030 ±0,005

Полусинтетическая Цшохром С Казаминовые кислоты + 0,100 ±0,015

Полусинтетическая Кровь 1% Глутамин ** - 0,125 ±0,02

Полусинтетическая Кровь 1% Глутамин + 0,260 ± 0,03

Синтетическая Гемоглобин *** Глутамин - 0,290 ±0,024

Синтетическая Гемоглобин Глутамин + 0,660 ±0,06

Синтетическая Цитохром С Глутамин + 0

* - концентрация казаминовых кислот равна 40 г/л; ** - концентрация

глутамина 20 г/л; *** - концентрацию всех гемовых компонентов уравнивали

по содержанию гемового железа путем измерения оптической плотности раствора при длине волны 550 нм.

100

150 200

-Кровь ■Hb бычий -Hb лошади.

Время, ш

Рис. 4. Рост Н.ру1оп на полусинтетической среде с кровью и синтетических средах с гемоглобином

использования разработанной среды [Albertson N. et al., 1998; Nedenskov P., 1994; Reynolds DJ. and Penn C.W., 1994; Testermann T.L. et al., 2001].

Проверка данной рецептуры среды (с лошадиным гемоглобином при указанном режиме аэрации и наличии агарозы) обеспечивала высокий уровень накопления биомассы 6-ти штаммов из нашей коллекции. Среда превосходит зарубежные аналоги по скорости роста в 1,6-8 раз и накоплению биомассы, выраженной в КОЕ/мл, на 2-3 порядка.

Таблица 2. Влияние концентрации гемоглобина в среде на накопление биомассы Н.ру1оп к 48 часам культивирования

Исходная концентрация гемоглобина в среде, мг/л Потребленный гемоглобин, мг/л Прирост биомассы, мг белка/л Удельный выход, мг белка биомассы на 1 мг потребленного гемоглобина

696 393 420 1,07

1392 755 616 0,82

2784 1631 1064 0,65

5567 3503 1251 0,36

Характер зависимости накопления биомассы от концентрации гемоглобина (таблица 2) свидетельствует о том, что этот субстрат являлся лимитирующим рост [Перт С.Дж., 1978]. Используемый способ оценки утилизации гемоглобина клетками - по величине оптической плотности бесклеточного супернатанта при 550 нм - позволяет сделать вывод о том, что в процессе роста клетки H.pylori потребляли именно гемсодержащий белок, причём в значительной концентрации, а не в микроколичествах. Нами рассчитано, что на 1 мг биомассы Нpylori клетки утилизировали от 1.3 до 3.5 мкг гемового железа в зависимости от содержания гемоглобина в среде. Такой высокий расход данного субстрата может быть обусловлен наличием у H.pylori железосодержащих ферментов дыхательной цепи - цитохромов [Smith М. et al., 2000] и накоплением в цитоплазме ферритина, обеспечивающего клетки в условиях лимитирования железа в среде [Waidner В. et al., 2002].

На основании экспериментальных данных нами подсчитана примерная скорость потребления гемоглобина в пилорическом отделе желудка за счет метаболизма H.pylori - она может составлять от 2 до 4 мг в сутки. Концентрация гемоглобина в крови человека составляет 120-150 мг/мл. Таким образом, само по себе наличие Нpylori не может быть причиной развития железодефицитной анемии, как предполагают некоторые авторы [Choe Y.H. et al., 1999; Choe Y.H. et al., 2003; Milman N. Et a]., 1998].

Получение клеточных и внеклеточных антигенсодержаших препаратов из H.pylori и их оценка методами иммуноблотгиш а и ИФА.

Получено три антигенсодсржащих препарата: препарат I - из клеток H.pylori, выращенных на плотной полноценной среде с кровью до стационарной фазы; препарат II - из клеток H.pylori, выращенных в жидкой синтетической среде; препарат III - из культуральной жидкости, взятой после выращивания H.pylori в жидкой синтетической среде. Препарат I получали путем ультразвуковой обработки отмытых клеток в течение 40 мин с частотой 50 Гц при температуре 10-15 градусов, фильтрования через мембранный фильтр (0.2 мкм) и лиофилизации. Аналогично получали препарат II. Препарат III получали путем лиофилизации культуральной жидкости.

Проведено исследование полученных антигенных препаратов методом иммуноблоттинга с 17 сыворотками крови больных язвенной болезнью -носителей H.pylori После проверки данных сывороток с препаратом I, выбрали 4 сыворотки, содержащие антитела к максимальному числу антигенов. Эти сыворотки исследовали на наличие антител ко всем трем препаратам (рис. 5). При сравнении препаратов можно наблюдать заметное уменьшение количества антигенных белков в ряду «I - II - III препарат». Проверка лошадиного гемоглобина на наличие антигенных белков с теми же сыворотками дала отрицательные результаты. Для сыворотки № 2, содержащей антитела к наибольшему числу белков, рассчитали молекулярные массы антигенных белков в трех изучаемых препаратах из H.pylori.

№ .К

1- 1 2 3 4 II- 1 2 3 4 5 III- 1 2 3 4 5

Рис. 5. Иммуиоблоттинг сывороток крови с антигенсодержащими препаратами из H.pylori: I - препарат I, II - препарат II, III - препарат III;

I - положительная контрольная сыворотка, проверенная ранее с тест-системой "ИммуноХром-анти НР-Экспресс"; 2,3,4 - сыворотки от больных-носителей, 5 - сыворотка от бессимптомного донора

Оказалось, что препарат I содержит минимум 39 антигенных белков, препарат

II - 15 антигенных белков; препарат III - 9. Три белка из препарата III по молекулярной массе соответствуют специфическим антигенам H.pylori-. UreB-66 кДа; NapA - 26 кДа; FldA - 19 кДа По данным литературы из примерно 20 известных антигенных белков H.pylori лишь 8 являются высокоспецифичными, в том числе приведенные 3 антигена [Lindholm С. et al., 1997; Chang C-S. et al., 1999; Mobley H.L.T., 2001; Yan J. et al., 2001].

Оценка сывороток крови 29 пациентов и 27 бессимптомных доноров методом ИФА с клеточным препаратом I показала следующее' 41,4 ± 9,1 % сывороток пациентов и 40,7 ± 9,5 % сывороток доноров содержали специфические иммуноглобулины класса G (р > 0.5). Отсутствие разницы в результатах можно объяснить высоким содержанием неспецифических (перекрестно реагирующих) белковых антигенов в изученном препарате Аналогичное исследование, проведенное на 25 сыворотках крови больных язвенной болезнью и 25 сыворотках доноров с использованием внеклеточного

препарата П1, выявило наличие положительных результатов в 68,0 ± 9,3 % и 32,0 ± 9,3 % случаев соответственно (р = 0.01). Вероятно, высокий процент положительных сывороток среди доноров обусловлен частым носительством этих бактерий в популяции здоровых людей [Axon А., 1999].

На основании совокупных данных по иммуноблоттингу и ИФА можно заключить, что полученный с помощью синтетической среды внеклеточный антигенный препарат является более перспективным для создания диагностикума, нежели клеточный, так как содержит большую долю специфических бежов и не требует специальной очистки.

Расчет скорости выделения [ОН ] ионов в пилорическом отделе желудка за счет метаболизма H.pylorL

Из всех отделов желудка H.pylori колонизирует преимущественно пилорический. Пилорический отдел желудка человека в спокойном состоянии представляет собой полый цилиндр с внутренним диаметром в среднем 2 см и высотой 4 см. Таким образом, можно посчитать площадь поверхности слизистой оболочки пилорического отдела:

впил. = 2етхh = 2х3.14 х 1 х4 = 25,12см2 =2512мм2 Скорость (V) образования гидроксил ионов пилорическим отделом желудка равна: V = ( А [ОН ] /Д t) х ( впил. /Ббиопт.),

где Л [ОН ] - изменение концентрации гидроксил ионов образуемых биоптатом, нМ; At- промежуток времени, в течение которого происходило линейное изменение рН, мин; S биопт. - площадь биоптата, мм2.

Учитывая, что 1 мг биоптата по площади равен примерно 1 мм2, можно рассчитать скорость продукции гидроксил анионов пилорическим отделом желудка при всех возможных значениях уреазной активности, оцененных разработанным методом (таблица 3).

Таблица 3. Расчетная скорость продукции гидроксил анионов в пилорическом отделе желудка средней величины за счет функционирования уреазы Н.pylori.

Уреазная активность, АрН /часхмг биоптата Частота встречаемости (в %) пациентов с данной уреазной активностью биоптатов п = 44 Скорость образования гидроксил ионов V, мкмоль ОН" / мин

0.04 - 0.1 23.5 0.4-1.1

0.1 - 0.5 45.2 1.1 -9.0

0.5- 1.0 11.7 9.0- 37.7

1.0- 1.5 9.8 37.7- 128.1

1.5 - 2.0 3.9 128.1 - 414.2

2.0-2.5 5.9 414.2- 1318.9

Из данных таблицы 3 видно, что скорость выделения гидроксил анионов за счет метаболизма клеток H.pylori варьирует в пределах от 0.4 до 1318.9 мкмоль ОН'/мин и у определенных групп носителей сравнима со скоростью продукции протонов в желудке человека, которая находится в пределах от 114.2 до 238.4 мкмоль Н+/мин [Физиология. Основы и функциональные системы. «Медицина», 2000].

Таким образом, на основании полученных результатов можно судить об участии этих бактерий в регуляции кислотно-щелочного равновесия в желудке. Вероятно заселение хеликобактером именно пилорического отдела желудка имеет особое значение для носителя. Пилорический отдел находится в преддверии двенадцатиперстной кишки, рН содержимого которой близок к нейтральному. Роль механического барьера между желудком и двенадцатиперстной кишкой выполняет двустворчатая валикообразная складка (заслонка). На основании полученных данных можно заключить, что одной из составляющих биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки, служит именно Helicobacter pylori. Кроме того, можно предположить, что носительство Нpylori более полезно при активной продукции кислоты в желудке, нежели при пониженной

функции желудочных желез. Вполне вероятно, что именно в последнем случае носительство этих микроорганизмов является фактором риска в развитии таких заболеваний, как карцинома. В этой связи именно уреазу можно рассматривать как фактор, обусловливающий роль H.pylori в качестве биохимического барьера в микроэкологии желудка здорового носителя.

ВЫВОДЫ

1. Разработан количественный метод определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток Helicobacter pylori. Метод дает возможность быстро (в течение 10-40 минут) установить факт носительства и оценить продукцию гидроксил анионов данным штаммом H.pylori.

2. С помощью предлагаемого метода показано, что в группе из 49 пациентов с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки 87.7% человек являлись носителями Н. pylori. Показано, что величины уреазной активности биоптатов не коррелировали с тяжестью течения заболевания, рассчитанной по сумме значимых критериев (г = 0,183). Установлена корреляция между величинами уреазной активности биоптата и соответствующей ему культуры Н. pylori (г = 0,934).

3. Создана новая синтетическая среда для культивирования H.pylori, содержащая аминокислоты, соли, витамины, антибиотики, агарозу и гемоглобин. С помощью данной среды выявлена потребность клеток H.pylori в значительных количествах гемоглобина. Среда превосходит зарубежные аналоги по скорости роста и накоплению биомассы.

4. Получены клеточные и внеклеточные антигенсодержащие препараты из H.pylori при культивировании на полноценной и синтетической средах. Методом иммуноблоттинга установлено, что спектр антигенных белков внеклеточного препарата, получаемого при культивировании H.pylori на разработанной синтетической среде, значительно уже, а доля в нем специфических белков выше, чем в клеточных антигенных препаратах.

гг

5. Оценка сывороток крови больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки и бессимптомных доноров методом ИФА с клеточным препаратом, показала наличие специфических иммуноглобулинов класса G в 41,4 ± 9,1 % и 40,7 ± 9,5 % случаев соответственно (р > 0,5). Исследование аналогичных сывороток с внеклеточным препаратом, полученным на синтетической среде, выявило наличие положительных результатов у 68,0 ± 9,3 % больных и у 32,0 ± 9,3 % доноров (р = 0,01).

6. Впервые рассчитаны скорости продукции гидроксил анионов бактериями H.pylori в пилорическом отделе желудка на основании данных по количественной уреазной активности биоптатов. Эти величины соизмеримы со средними скоростями продукции протонов в желудке человека.

Публикации по теме

1. Мельникова В.А., Вартанова Н.О. Helicobacter pylori при желудочно-кишечных заболеваниях и у здоровых лиц. //Жур. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2000. - № 6: С. 108-112.

2. Вартанова Н.О., Арзуманян В Г., Баснакьян И.А., Каверина К.Г., Чулок Т. А. Метод количественного определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток Helicobacter pylori. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002. - Т. 133, № 2: С. 234-236.

3. Вартанова Н.О., Арзуманян В.Г., Баснакьян И.А., Каверина К.Г., Чулок Т.А. Количественный экспресс-метод определения уреазной активности биоптатов и клеточных суспезий Helicobacter pylori. //Материалы VII Всероссийского Съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва. ИНЭКС. 2002. С. 239-240.

4. Вартанова Н.О., Никольская К.А. О значимости количественного уреазного теста в обследовании больных язвенной болезнью на хеликобактериоз. //Жур. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2005. - № 1: С. 68-70.

5. Вартанова Н.О., Арзуманян В.Г., Сердюк О.А., Темпер P.M. Создание новой синтетической среды для культивирования Helicobacter pylori. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005. - Т.139 - № 5: С. 538-544.

Принято к исполнению 17/05/2005 Исполнено 18/05/2005

Заказ № 868 Тираж' 100 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferal ru

IP 1 0 8 9 4

РНБ Русский фонд

2006^4 5892

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вартанова, Нунэ Оганесовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 2.1. Общая характеристика Helicobacter pylori.

2.1.1. История открытия рода Helicobacter.

2.1.2. Виды Helicobacter spp.

2.1.3. Морфологические и физиолого-биохимические свойства рода Helicobacter.

2.1.4. Методы диагностики H.pylori.

2.1.5. Значение H.pylori в экологии и патологии человека.

Глава 2.2. Уреаза H.pylori.

2.2.1. Фермент - характеристика и свойства.

2.2.2. Методы определения уреазной активности микроорганизмов.

2.2.3. Идентификация H.pylori с помощью уреазы.

Глава 2.3. Культивирование H.pylori

2.3.1. Культивирование на полноценных средах.

2.3.2. Анализ известных синтетических сред для культивирования H.pylori

Глава 2.4. Антигены H.pylori.

2.4.1. Белки и липопротеины.

2.4.2. Липополисахариды.

Глава 2.5. Заключение по обзору литературы.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3.1. Объекты и методы исследования.

Глава 3.2. Создание коллекции штаммов H.pylori

Глава 3.3. Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

3.3.1. Разработка метода.

3.3.2. Сравнение уреазной активности биоптатов и культур

H.pylori.

3.3.3. Изучение уреазной активности культур H.pylori в разных фазах роста.

Глава 3.4. Разработка новой синтетической среды для культивирования

Н. pylori.

3.4.1. Разработка среды.

3.4.2. Влияние концентрации лошадиного гемоглобина на рост H.pylori.

Глава 3.5. Получение клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из H.pylori и их оценка методом иммуноблоттинга.

Глава 3.6. Исследование бактериологических, биохимических и иммунологических показателей, связанных с носительством H.pylori в группе больных язвенной болезнью.

3.6.1. Изучение взаимосвязи между количественной уреазной активностью биоптатов и тяжестью течения заболевания.

3.6.2. Оценка наличия IgG-антител к H.pylori методом ИФА в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров.

3.6.3. Расчет скорости выделения [ОН ] ионов пилорическим отделом желудка (в случае наличия H.pylori в слизистой оболочке).

3.6.4. Расчет потребления гемоглобина хеликобактером в пилорическом отделе среднестатистического желудка.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori"

Актуальность проблемы

Helicobacter pylori - микроаэрофильные, неспорообразующие, грамотрицательные, изогнутые палочковидные или кокковидные бактерии, населяющие слизистые оболочки нижних отделов желудка и двенадцатиперстной кишки [Marshall В.J., 1984]. В настоящее время принято считать, что H.pylori ассоциирован с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, а также является фактором риска при развитии карциномы желудка [Perez-Perez G.I., Blaser M.J, 2003]. Присутствие H.pylori не всегда подразумевает наличие болезни - носительство среди здоровой части популяции составляет 20-84% [Axon А., 1999]. Есть мнение, что H.pylori может играть позитивную роль для человека, поскольку его удаление имеет и отрицательные последствия [Blaser M.J., 1997; Blaser M.J., 1999; Labenz J. et al., 1997; Chow W.H. et al., 1998; Werdmuller B.F. et al., 1997]. Однако конкретных гипотез и доказательств возможной положительной роли H.pylori в доступной литературе до сих пор не представлено. Какой бы ни была роль данных бактерий в организме здоровых и иммунокомпрометированных носителей, диагностика хеликобактериоза остается актуальной.

Существующие методы диагностики включают бактериологические, гистологические, биохимические (разновидности уреазного теста), иммунологические и молекулярно-генетические методы [Лапина Т.Л., 1999]. Обычно для клинической диагностики проводят эндоскопию с последующим исследованием образцов биоптатов слизистой оболочки: посевом на селективную среду, окрашиванием мазков-отпечатков по Граму, качественным определением уреазной активности. Уреаза Н. pylori составляет до 10% от общего белка клетки [Bauerfeind P. et al., 1997]. Этот фермент разлагает мочевину с образованием гидроксил анионов, обеспечивая бактериям возможность персистенции в агрессивной среде желудка, и является одним из главных антигенов Н. pylori. Количественный метод определения активности уреазы в разных вариациях используется в исследовательских целях для оценки активности суспензий клеток различных микроорганизмов и препаратов фермента разной степени очистки [M.-Plaza I., R.-Herrera J., 1967; Юодвальките С.-Д., 1983], однако, до сих пор не был разработан для биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.

При проведении скрининговых эпидемиологических исследований, а также в случаях невозможности проведения эндоскопии, чаще всего в мировой практике используют иммунодиагностику. За рубежом создан ряд коммерческих препаратов для иммунной диагностики, основанный на использовании антигенов H.pylori. Первое поколение антигенных препаратов из H.pylori, используемых и в настоящее время, включает: целые бактериальные клетки; кислотно-глициновые экстракты биомассы; клетки, обработанные формалином; ультразвуковые экстракты клеток [Perez-Perez G.I., Blaser M.J, 2003]. Известны антигенные белки клеток H.pylori: Vac А - вакуолизирующий цитотоксин (мол.масса 87 кДа); Cag А - цитотоксин ассоциированный белок (140 кДа); субъединицы уреазы - Ure А (29.5 кДа) и Ure В (66 кДа); Hsp 60 - белок теплового шока (59-60 кДа); жгутиковый флагеллин - Fla (55 кДа); мембранный белок - аналог флаводоксина Fid А (19 кДа) и др. В новом поколении антигенных препаратов используют комплекс высокоочищенных белков - клеточных антигенов H.pylori. Известны также специфичные антигены, выделяемые H.pylori в окружающую среду, набор которых значительно уже, чем клеточных [Lindholm С. et al, 1997].

Важным звеном при получении антигенсодержащих препаратов для последующей разработки диагностикумов являются питательные среды и процессы культивирования. Учитывая, что некоторые высокоспецифичные антигены Н. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве, очень актуально использование синтетических сред определенного химического состава. В доступной литературе описаны такие среды, однако, все они содержат бычий или лошадиный сывороточный альбумин [Albertson N. et al., 1998; Nedenskov P., 1994; Reynolds D.J. and Penn C.W., 1994; Testermann T.L. et al., 2001]. Более или менее значимый прирост биомассы H.pylori отмечен лишь при невысокой степени очистки данного белка. Очевидно, что до сих пор не найден тот основной компонент синтетической среды, который дал бы возможность культивировать H.pylori с высоким выходом биомассы.

Изложенное свидетельствует о том, что для усовершенствования диагностики H.pylori необходимо наличие чувствительного экспресс-метода определения уреазы и высококачественных антигенных препаратов, получаемых с помощью синтетической питательной среды.

Цель исследования:

Задачи исследования:

1. Создание коллекции штаммов H.pylori.

3. Разработка новой синтетической среды для культивирования H.pylori.

4. Получение клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из H.pylori при культивировании на поноценной и синтетической средах.

5. Оценка методами ИФА и иммуноблоттинга специфических IgG-антител в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров с использованием полученных антигенсодержащих препаратов из H.pylori

Научная новизна

С помощью разработанного количественного метода показано, что уреазная активность биоптатов коррелирует с активностью уреазы выделенных их них культур H.pylori. Уреазная активность культур зависит от фазы роста: в фазе замедления она в 1,4-10 раз выше, чем в стационарной фазе.

Практическая значимость

Создана лабораторная коллекция клинических изолятов, насчитывающая 30 штаммов H.pylori.

Разработан количественный метод определения уреазной активности применительно к биоптатам слизистой оболочки желудка и клеточным суспензиям H.pylori, основанный на регистрации изменения рН в реакционной смеси. Метод прост в исполнении и дает полезную информацию в течение 10-40 минут, в отличие от нескольких часов при определении активности уреазы на качественном уровне. В группе из 51 больного язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки данным методом показано наличие H.pylori у 87.7% пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту

4. Экспериментально обосновано предположение о роли H.pylori в качестве биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки на основании соотнесения скорости продукции гидроксил анионов клетками H.pylori со скоростью выделения протонов слизистой оболочкой желудка.

Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 2.1. Общая характеристика Helicobacter pylori

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вартанова, Нунэ Оганесовна

5. ВЫВОДЫ

2. С помощью предлагаемого метода показано, что в группе из 49 пациентов с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки 87.7% человек являлись носителями Н. pylori. Показано, что величины уреазной активности биоптатов не коррелировали с тяжестью течения заболевания, рассчитанной по сумме значимых критериев (/* = 0,183). Установлена корреляция между величинами уреазной активности биоптата и соответствующей ему культуры Н. pylori (г = 0,934).

6. Впервые рассчитаны скорости продукции гидроксил анионов бактериями Hpylori в пилорическом отделе желудка на основании данных по количественной уреазной активности биоптатов. Эти величины соизмеримы со средними скоростями продукции протонов в желудке человека.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаружение Маршаллом и Уорреном [Warren J.R. and Marshall В.J., 1983] в 1983 году грамотрицательных обитателей слизистой оболочки желудка человека - H.pylori - послужило началом для целого ряда открытий в области гастроэнтерологии. Несмотря на обилие публикаций, посвященных данной теме (к настоящему времени свыше 19000 источников в поисковой системе Medline), многие вопросы остаются до сих пор неясными. Для нас наиболее интригующим моментом является микроэкологическая роль H.pylori в организме носителя. Участие этих бактерий в развитии различных заболеваний интенсивно изучается - проводят статистические исследования частоты встречаемости, изучают факторы патогенности H.pylori [Josenhans С. and Suerbaum S., 2001], иммунный ответ носителя [D'Elios М.М. and Del Prete G., 2001], антигенный состав бактерий и их геномы [Banerjee S. and Michetti P., 2001; Tomb J.-F. et al., 1997]; созданы экспериментальные животные модели [Eaton К.А., 2001]. Однако частое обнаружение Helicobacter spp. у здоровых людей наводит на мысль об определенной экологической функции этих бактерий в организме человека (таблица 3). Об этом же косвенно свидетельствуют данные об отрицательных последствиях элиминации H.pylori [Blaser M.J., 1997b; Blaser M.J., 1999b].

Один из наиболее популярных методов диагностики основан на оценке активности фермента уреазы - основного белка клеток H.pylori, разлагающего мочевину с образованием аммиака и гидроксил анионов. Мы предполагаем, что скорость продукции гидроксил анионов уреазой H.pylori может быть сравнима со скоростью выделения протонов в желудке. Для определения скорости экскреции гидроксил анионов необходимо располагать количественным методом оценки уреазной активности. Известны и используются ь в микробной биотехнологии следующие количественные методы опребделения уреазной активности - колориметрический, титриметрический и метод, основанный на измерении рН. Последний метод применяется в клинической лабораторной диагностике для качественного определения уреазы с помощью рН-индикатора. Мы модифицировали третий метод. Модификация заключалась в 10-кратном уменьшении объема реакционной смеси (по сравнению с исходным количественным методом) за счет портативного рН-метра, что позволило использовать метод не только для суспензий клеток, но и впервые для биопсийного материала. Как диагностический этот метод отличается, например, от дыхательного теста простотой используемого оборудования: рН-метр Piccolo-2 вместо масс-спектрометра или сцинтилляционного счетчика. В отличие от качественного теста с феноловым красным (2-24 часа) наша модификация позволяет провести анализ в течение 10-40 минут.

Разработанный метод позволил получить новые данные о взаимосвязи уреазной активности биоптатов и полученных из них штаммов H.pylori. Показано, что чем более активной уреазой обладает штамм Н. pylori, тем выше таковая и в биоптате (коэффициент линейной корреляции Пирсона г = 0,934). На этом основании можно предположить, что общее количество выделяемых бактериями гидроксил анионов в желудке в большей степени зависит от активности штамма, чем от обсемененности слизистой оболочки. Кроме того, изучение активности уреазы в процессе роста культур Н. pylori на плотной среде показало, что в фазе замедления роста активность уреазы в несколько раз выше, чем в стационарной фазе. Такая закономерность характерна для многих микробных ферментов [Перт С.Дж., 1978] и объясняется тем, что в стационарной фазе происходит исчерпание субстратов, необходимых для биосинтеза ферментов. Этот факт может иметь значение в технологии получения фермента или антигена уреазы из клеток H.pylori.

В процессе отработки метода на клинических образцах биопсийного материала антрального отдела желудка была собрана коллекция штаммов, идентифицированных классическими методами как Helicobacter pylori. На сегодняшний день описано изучено уже более 20 видов Helicobacter, 9 из которых связаны с человеком, и только 3 из них встречаются в слизистой оболочке желудка - H.pylori, H.heilmanii и H.felis (таблица 1). Эти виды филогенетически близки между собой, причем, в большинстве случаев из слизистой оболочки желудка человека выделяют Helicobacter pylori [Versalovic J. and Fox J.G, 2001]. Нельзя исключить, что реидентификация коллекционных штаммов молекулярно-генетическими методами покажет некоторые видовые различия, однако, для такого типирования необходимо иметь референс-культуры.

Во многих странах проводится мониторинг носительства H.pylori в больших выборках здоровых людей и больных с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта (таблица 3, 4). Одним из основных методов оценки носительства является иммунологический, основанный на использовании иммунологических тест-систем, с помощью которых можно проводить масштабные скрининговые исследования такого рода. При разработке диагностикумов очень важным моментом являются питательные среды и процессы культивирования. Многие высокоспецифичные антигены Н. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве (Глава 2.4.), следовательно, для их получения целесообразно использовать синтетические среды определенного химического состава. Нами проанализированы составы сред (таблица 11) [Albertson N. et al, 1998; Nedenskov P, 1994; Reynolds D.J. and Penn C.W, 1994; Testermann T.L. et al., 2001] и показано, что их основными компонентами являются соли, аминокислоты, альбумин и носители типа циклодекстрина, обеспечивающие адгезию клеток H.pylori. Однако ни одна из предлагаемых сред не обеспечивает значительного прироста биомассы. Более того, чем выше была степень очистки альбумина, тем хуже рост культуры H.pylori. В этой связи мы сделали предположение о том, что при очистке альбумина терялся именно тот основной компонент синтетической среды, который дал бы возможность культивировать H.pylori с высоким выходом биомассы. Для поиска данного компонента была разработана схема (рис.3). За основу нами была взята полноценная среда, содержащая в качестве источников углерода и азота пептон, а в качестве источника органического железа - кровь. Из имеющихся в собранной коллекции штаммов были выбраны два, обладающие наиболее высокой скоростью роста на плотной среде с кровью.

Накопление биомассы на среде с пептоном оказалось в 2.3 раза ниже в сравнении со средой с казаминовыми кислотами, по-видимому, из-за более высокого содержания в последней свободных аминокислот. Для замены казаминовых кислот более простыми компонентами исследовали рост H.pylori на среде, содержащей 40 г/л казаминовых кислот и 1% крови в течение 7-ми суток. Провели аминокислотный анализ исходной среды и культуральной жидкости (рис. 8; рис. 9). Оказалось, что 27% от суммарного содержания аминокислот в исходной среде и в конечной культуральной жидкости составил глутамин, а потребление наиболее представленных индивидуальных аминокислот в течение 7-ми суток составило от 49.2 до 59.1%. В интервале от 0 до 48 часов потреблялось 18.31 г/л (43.6%) суммы всех аминокислот, а в интервале от 48 до 168 часов - еще 4.15 г/л (9.9%), что соответствует таким показателям, как скорости роста и скорости метаболизма (таблица 8). Двухфазный характер потребления аминокислот, наряду с отсутствием преимущественного потребления какой-либо из них, может свидетельствовать о наличии в среде двух неизвестных нам факторов роста, которые утилизируются поочередно. Таким образом, в будущей синтетической среде основным источником углерода и азота был выбран глутамин, а остальные аминокислоты, необходимые для роста H.pylori, добавлены в фоновых концентрациях.

Изучение влияния компонентов крови - сыворотки и эритроцитов - показало, что более значимым компонентом являются эритроциты (таблица 7). Установлено также, что внесение в среду культивирования негемовой фракции эритроцитов (препарата «аминокровин») также не дает значительного прироста биомассы. Замена крови на простые гемсодержащие аналоги - гемин и цитохром с - не привела к сколько-нибудь значимому росту. Оказалось, что наиболее эффективным компонентом, содержащим органическое железо, является гемоглобин.

Из двух изученных гемоглобинов животного происхождения предпочтительным оказался лошадиный. Характер зависимости плотности популяции клеток от концентрации данного субстрата свидетельствует о том, что он является лимитирующим рост [Перт С.Дж., 1978]. Используемый способ оценки утилизации гемоглобина клетками - по величине поглощения бесклеточного супернатанта при 550 нм - позволяет сделать вывод о том, что в процессе роста клетки H.pylori потребляли именно гемсодержащий белок, причём в «субстратных», а не в микроколичествах. Нами рассчитано, что на 1 мг биомассы H.pylori клетки утилизировали от 1.3 до 3.5 мкг гемового железа в зависимости от содержания гемоглобина в среде (таблица 10). Такой высокий расход данного субстрата может быть обусловлен двумя причинами. Во-первых, H.pylori - это микроаэрофильные бактерии, имеющие примитивную (неразветвленную) дыхательную цепь с цитохромами b, с и сЪ типов - ферментами, содержащими железо [Smith М. et al., 2000]. Остается неясным вопрос: почему H.pylori не использует предшественники гемоглобина - цитохром с и гемин? Можно лишь предположить, что отсутствие белковой составляющей в гемине и конформационные и аминокислотные отличия белковой компоненты в цитохроме с от таковой в гемоглобине являются принципиальными моментами. Во-вторых, есть данные литературы о том, что хеликобактер запасает большие количества ферритина в цитоплазме, обеспечивая клетки на случай лимита железа в среде [WaidnerB. etal., 2002].

На основании экспериментальных данных нами подсчитана примерная скорость потребления гемоглобина в пилорическом отделе желудка за счет метаболизма H.pylori - она может составлять от 2 до 4 мг в сутки (таблица 15). Концентрация гемоглобина в крови человека составляет 120-150 мг/мл. Таким образом, само по себе наличие H.pylori не может быть причиной развития железодефицитной анемии, как предполагают некоторые авторы [Choe Y.H. et al., 1999; Choe Y.H. et al., 2003; Milman N. Et al., 1998].

Важным моментом при культивировании H.pylori является внесение в среду агарозы. При добавке агарозы в концентрации 0,1% (таблица 7) выход биомассы при культивировании на синтетической среде становится сравнимым с таковым на полноценной среде с кровью. Очевидно, что клеткам H.pylori необходима адгезия на поверхности твердой фазы, аналогичной их природному экотопу. К такому же выводу можно прийти, анализируя данные литературы [Testerman et al, 2001].

Как и прочие микроаэрофильные микроорганизмы, H.pylori нуждается в невысокой, но постоянной концентрации кислорода в среде. Без дополнительной аэрации рост H.pylori затруднен, однако, рис.6), вставка шприцевой иглы в пробку флакона после 1 суток дала возможность избежать лимитирования роста кислородом. Этот прием известен [Deshpande М. et al., 1995], хотя авторы публикации использовали замену резиновой пробки на ватную.

Итак, упрощение полноценной питательной среды, содержащей пептон и кровь, позволило: избежать использования высокомолекулярных сывороточных белков неизвестного состава; обнаружить высокую потребность H.pylori в гемовой и белковой составляющих гемоглобина; увеличить прирост биомассы, выраженной в КОЕ/мл, на 2-3 порядка по сравнению с результатами других авторов.

Созданная синтетическая среда, наряду с полноценной, была использована для получения клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из H.pylori. Перечень основных антигенов H.pylori представлен в таблице 5. Оценка полученных нами препаратов с сыворотками больных - носителей H.pylori показала следующее. Все препараты содержат антигенные белки. Препарат из клеток, выращенных на полноценной среде, содержит минимум 39 антигенных белков. Препараты из клеток, выращенных на синтетической среде до фазы замедления роста, содержат 15 антигенных белков; а до стационарной фазы - 13. Препараты из культуральной жидкости после выращивания H.pylori на синтетической среде содержат 9 антигенных белков независимо от фазы роста. Три из этих 9 белков соответствуют молекулярным массам и являются предположительно: 19 kDa -мембранным белком Fid А , 26 kDa - алкилгидропероксид редуктаза (NapA), 66 kDa - Ure В (субъединица уреазы). Данные согласуются с исследованием [Lindholm

С. et al, 1997], где показано наличие 26 kDa белка во внеклеточной жидкости после культивирования H.pylori в жидкой полноценной среде на качалке. Таким образом, разработанная синтетическая среда дает возможность сузить спектр антигенных белков в препарате, увеличить в препарате долю специфических белков и получать антигенный комплекс H.pylori без специальной очистки.

С помощью полученных из H.pylori антигенсодержащих препаратов оценивали наличие специфических IgG-антител в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров. Оценка сывороток крови 29 пациентов и 27 бессимптомных доноров методом ИФА с препаратом из клеток H.pylori, выращенных на полноценной среде, показала следующее: 41,4 ± 9,1 % сывороток пациентов и 40,7±9,5 % сывороток доноров содержали иммуноглобулины класса G (р > 0.5). Отсутствие разницы в результатах можно объяснить высоким содержанием неспецифических (перекрестно реагирующих) белковых антигенов в изученном препарате. Аналогичное исследование, проведенное на 25 сыворотках крови больных язвенной болезнью и 25 сыворотках доноров с использованием внеклеточного препарата из культуральной жидкости после выращивания H.pylori на синтетической среде, выявило наличие положительных результатов в 68,0 ± 9,3 % и 32,0 ± 9,3 % случаев соответственно. Вероятно, высокий процент положительных сывороток в данном случае обусловлен частым носительством этих бактерий среди популяции здоровых людей (см.таблицу 3).

Совокупные исследования носительства (по данным микроскопии и высевам) и количественной уреазной активности, проведенные в группе из 49 больных (таблица 13), показали невысокую степень корреляции между этими показателями: г = 0.360. Однако при полном отсутствии уреазы носительство ни в одном случае не было подтверждено (12.3% из 49 обследованных). Кроме того, средняя величина уреазной активности у пациентов с неподтвержденным носительством (0,15 ± 0,17 АрН /часхмг биоптата) была очевидно ниже, чем таковая у явных носителей (0,79 ± 0,59 ДрН /часхмг биоптата). Суммируя все полученные данные можно заключить, что даже отсутствие различимых клеток в мазке-отпечатке и колоний на кровяном агаре при положительном количественном уреазном тесте имеет смысл рассматривать как носительство. Значимость различных вариантов уреазного теста в диагностике хеликобактериоза в сравнении с мазками/высевами обсуждается в литературе, причем, есть указания на целесообразность совокупной оценки носительства по всем трем показателям [Лапина Т.Л, 1999]. В нашем случае необходимо учесть, что уреазный тест проводился на количественном уровне. С помощью количественного метода было показано носительство Н, pylori в группе больных язвенной болезнью в 87.7% случаев, а помощью качественного в 73.1% случаев. Можно утверждать, что количественный метод более чувствителен, чем качественный, поскольку даже при очень низкой активности (пологая кривая зависимости рН от времени) в течение 1 часа можно с уверенностью констатировать наличие уреазы, тогда как при качественном тесте нужен значительный перепад рН, чтобы краситель феноловый красный поменял цвет с желтого на малиновый.

Считают, что уреаза является одним из факторов вирулентности Hpylori [Eaton et al, 1991]. Использование количественного метода определения уреазы в клинике позволило нам соотнести данный показатель с тяжестью течения заболевания и, таким образом, косвенно судить о степени участия H.pylori в патологическом процессе. В совместных исследованиях с Никольской К.А. (ЦНИИ Гастроэнтерологии) разработана схема количественной оценки тяжести заболевания с учетом следующих значимых критериев: длительность заболевания, частота обострений, субъективные показатели - боли, изжога, тяжесть в желудке, тошнота, отрыжка; а также данные эндоскопии 12-перстной кишки и пищевода. Сравнение величин уреазной активности с суммой всех (1) и объективных (2) критериев свидетельствовало об отсутствии корреляции между тяжестью течения язвенной болезни и активностью уреазы: коэффициент Пирсона в первом случае был равен г i = 0,183 , а во втором г 2— 0,273.

На основании вышеизложенного можно заключить, что метод количественного определения уреазной активности дает возможность быстро установить факт носительства и оценить скорость продукции гидроксил анионов данным штаммом H.pylori, однако, сама по себе величина этого показателя, очевидно, не может рассматриваться как мера патогенности этих бактерий.

Обобщая данные литературы можно заключить, что H.pylori, как таковой, не является главным в патогенезе язвенной болезни, поскольку присутствие бактерий не всегда подразумевает наличие болезни, а их элиминация вовсе необязательно заканчивается излечением. Более того, носительство H.pylori может быть полезным для человека, поскольку его удаление зачастую имеет отрицательные последствия [Blaser M.J., 1997b; Blaser M.J., 1999b Labenz J. et al., 1997; Chow W.H. et al., 1998; Werdmuller B.F. et al., 1997]. Предположения о некоей положительной роли H.pylori в организме носителя довольно часто обсуждаются в литературе последних лет, однако, нам нигде не встретились конкретные гипотезы по данному вопросу.

Известно, что скорость образования протонов [Н^] в среднестатистическом здоровом желудке колеблется в пределах от 114.2 до 238.4 мкмоль Н+/мин [Физиология. Основы и функциональные системы. «Медицина», 2000]. На основании данных по величине уреазной активности биоптатов, полученных при эндоскопическом обследовании больных, были рассчитаны возможные скорости продукции гидроксил анионов в пилорическом отделе среднестатистического желудка взрослого человека за счет функционирования уреазы хеликобактера (глава 3.6.3.) По нашим данным скорость выделения [ОН"] может достигать 1318.9 мкмоль/мин, тогда как скорости, соответствующие средним величинам уреазной активности, варьируют в пределах 37.7 - 414.2 мкмоль/мин. Таким образом, скорость образования гидроксил ионов H.pylori соизмерима со скоростью продукции протонов, следовательно, участие этих бактерий в регуляции кислотно-щелочного равновесия вполне вероятно. Можно предположить, что заселение хеликобактером именно пилорического отдела желудка имеет особое значение для носителя. Пилорический отдел находится в преддверии двенадцатиперстной кишки, рН содержимого которой близок к нейтральному. Роль механического барьера между желудком и двенадцатиперстной кишкой выполняет двустворчатая валикообразная складка (заслонка). Нельзя исключить, что одной из составляющих биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки, служит именно Helicobacter pylori. Кроме того, можно предположить, что носительство H.pylori более полезно при активной продукции кислоты в желудке, нежели при пониженной функции желудочных желез. Вполне вероятно, что именно в последнем случае носительство этих микроорганизмов является фактором риска в развитии таких заболеваний, как карцинома.

На основании полученных данных именно уреазу можно рассматривать как фактор, обусловливающий роль H.pylori в микроэкологии желудка здорового носителя.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вартанова, Нунэ Оганесовна, Москва

1. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П.// Амстердам. - 1993.

2. Баранская Е.К. История открытия Helicobacter pylori. Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под. ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М. - 1999. - Триада-Х. - С. 243-255

3. Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Райкис Б.Н. Иммуноферментный метод определения аллергенспецифических IgE антител // В кн. Актуальные вопросы клинической и экспериментальной аллергологии.- Каунас.- 1986.- С.58-59.

4. Домарадский И.В. Вопросы патогенности Helicobacter pylori. //Ж. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - №2.- С. 45-47.

5. Ивашкин, В.Т., Положенцев С.Д., Султанов В.К., Блинов В.Д., Соломахин С.В., Крецу А.П., Калинин В.К., Спесивцев В.Н. О патогенной роли Helicobacter pylori. //Тер. Арх. 1993. - Т.65. -№2. - С.11-13.

6. Кудрявцева Л.В., Минаев В.И., Маликов В.Е., Зайцева С.В., Синяев В.П., Ерофеева Ю.А., Щербаков П.Л., Минаева Н.З., Исаков В. А. Комплексная диагностика хеликобактериоза. Учебное пособие под ред. Е.В. Никушкина. М.- 1999.

7. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. Изд. 4-ое, перераб. и доп. «Медицина». Москва. -1978.

8. Лапина Т.Л. Основные принципы диагностики H.pylori. Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под. ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М. - 1999. - Триада-Х. -С. 107-116.

9. Маянский А.Н. Микробиология для врачей. Н.-Новгород.- 1999.

10. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1: Пер. с англ. Под ред. Дж. Хоулта и др. М.- «Мир». - 1997.

11. Пасечников В.Д. Полимеразная цепная реакция в диагностике Н.ру1ог1-ассоциированных заболеваний. Материалы конференции «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori». М. - 1998. - с. 8-10.

12. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Москва. «Мир». - 1978.

13. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. Москва.-Изд-во РАМН,- 2000.

14. Смирнова Е.Я, Лебедин Ю.С, Сердюк О.А, Василов Р.Г. Использование моноклональных антител к IgE человека для определения уровня аллергенспецифических IgE. //Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1990.- № 9.-С. 93.

15. Физиология. Основы и функциональные системы.// Москва.-«Медицина».- 2000.

16. Цыциков Э.Н, Втюрина И.Ю, Галанина О.Е. // Биотехнология.-1988.- Т.7.- № 3.- С. 32.

17. Юодвальките С.-Д. Ю. Отбор продуцента, изучение биосинтеза и некоторых свойств уреазы Staphylococcus saprophytics. Дисс.канд.биол.наук.- Москва.- 1983. МГУ.

18. Albertson N, Wenngren I, Sjostrom J.-E. Growth and survival of Helicobacter pylori in defined medium and susceptibility to Brij 78. // J.Clin.Microbiol.- 1998.- V.36.- N 5.- P. 1232-1235.

19. Allan E., Mullany P., Tabaqchali S. Construction and characterization of a Helicobacter pylori clpB mutant and role of the gene in stress response. //J. Bacterid.-1998. -V.180.- №2. P. 426-429.

20. Atherton J.C. Non-endoscopic tests in the diagnosis of Helicobacter pylori infection. //Aliment. Pharmacol. Ther. 1997. - №11. - Suppl. 1. - P. 11-20.

21. Axon A. Helicobacter pylori is not a commensal. //Curr. Opin. Gastroenterol. 1999.- №15. - Suppl. 1. - S1-S4.

22. Banerjee S. and Michetti P. Development of Helicobacter pylori vaccine. // In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001.-P.263-274

23. Bauerfeind P., Garner R., Dunn B.E., and Mobley H.L.T. Synthesis and activity of Helicobacter pylori urease and catalase at low pH. //Gut. 1997. - №40. - P.25-30.

24. Blaser M.J. Ecology of Helicobacter pylori in the human stomach. //J. Clin. Invest. 1997a. - V.100. - №4. - P.759-762.

25. Blaser M.J. Not all Helicobacter pylori strains are created equal: should all be eliminated? //Lancet. 1997b. - №349. - P. 1020-1022.

26. Blaser M.J. Hypothesis: the changing relationship of Helicobacter pylori and humans: implications for health and disease. //J. of Infect. Diseases. 1999a. - №179. - P. 1523-1530.

27. Blaser M.J. Where does Helicobacter pylori come from and why is it going away? //JAMA 1999b. - №282. - P.2260-2262.

28. Blaser M.J. and Atherton J.C. Helicobacter pylori persistence: biology and disease. //J. Clin. Invest. 2004. - №113. - P.321-333.

29. Blum A.L., Talley N.J., O'Morain C. Lack of effect of treating Helicobacter pylori infection in patients with nonulcer dispepsia. //N.Engl. J. Med. 1998. - №339. - P. 1875-1881.

30. Buck, G.E. and J.S. Smith. Medium supplementation for growth of Campylobacter pyloridis. //J. Clin. Microboiol. 1987. - №25. -P.597-599.

31. Cao J., Sun Y., Berglindh Т., Mellgard В., Li Z, Mardh В., Mardh S. Helicobacter pylori-antigen-binding fragments expressed on the filamentous M13 phage prevent bacterial growth. Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1474. - № 1. - P. 107-113.

32. Chang C-S., Chen L-T., Yang J-C., Lin J-T., Chang K-C., Wang J-T. //Isolation of a Helicobacter pylori protein, FldA, associated with mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma of the stomach. Gastroenterology. 1999.- V.l 17. - №1. - P.82-88.

33. Cheli R., Crespi M., Testino G. Gastric cancer and Helicobacter pylori: biologic and epidemiologic incosistencies. //J. Clin. Gastroenterol. 1998. - V.26. - №1. - P.3-6.

34. Choe Y.H., Kim S.K. and Hong Y.C. The relationship between Helicobacter pylori infection and iron deficiency: seroprevalence study in 937 pubescent children. //Arch Dis Child. 2003. - №88. -P.178.

35. Choe Y.H., Kim S.K, Son B.K, Lee D.H, Hong Y.C, Pai S.H.

36. Randomized placebo-controlled trial of Helicobacter pylori eradication for iron-deficiency anemia in preadolescent children and adolescents. //Helicobacter. 1999. - V.4. - №2. - P.135-139.

37. Chow W.H., В laser M.J., Blot W.J., Gammon M.D. An inverse relation between cagA+ strains of Helicobacter pylori infection and risk of esophageal and gastric adenocarcinoma. //Cancer Res. -1998. -V.58. №4. - P.588-590.

38. Claassen, V.P., T.W. Tuinder, J.C.M. Zandvlet. Growth of Campylobacter pylori in fermentors. //Klin. Wochenschr. 1989. -№67.-P. 10.

39. Cohen H. and Laine L. Endoscopic methods for the diagnosis of Helicobacter pylori. //Aliment. Pharmacol. Ther. 1997. - №11. -Suppl. 1.-P.3-9.

40. Cover T.L. and Blaser M.J. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori. //J. Biol. Chem. 1992. -№267. - P.10570-10575.

41. Crabtree J.E. Cytokine responses in Helicobacter pylori infection. // In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001.- P.63-84

42. Cuoco L., Cammarota G., Jorizzo R.A., Cianci R. and Gasbarrini G. Iron deficiency anaemia, helicobacter pylori infection and delayed pubertal growth. //Arch Dis Child. 2000. - №83.- P.456.

43. D'Elios M.M. and Del Prete G. Role of Thl/Th2 cells in H.pylori-induced gastric disease. // In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001. - P.85-98.

44. Deshpande M., Calenoff E., Daniels L. Rapid large-scale growth of Helicobacter pylori in flasks and fermentors. //Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V.61. - №6. - P.2431-2435.

45. Drumm, В., G.I. Perez-Perez, M.J. Blaser and P.M. Shermann. Intrafamilial clustering of Helicobacter pylori infection. //N. Engl. J. of Med. 1990. - V.322. - №6. - P.359-363.

46. Dunn B.E., Campbell G.P., Perez-Perez G.I., Blaser M.J. Purification and charactirization of urease from Helicobacter pylori. //J. of Biol. Chem. 1990. - V.265. - №16. - P.9464-9469.

47. Eaton K.A. Animal models for Helicobacter pylori gastritis. // In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. -2001.-P.113-131

48. Eaton K.A., Brooks C.L., Morgan D.R., Krakowka S. Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. //Infect. Immun. 1991. - №59. - P.2470-2475.

49. Farinati F., Foschia F., Di Mario F. Helicobacter pylori eradication and gastric precancerous lesions. //Gastroenterology. 1998. -№115-P.512-514.

50. Ferrero R.L., Thiberge J.M., Kansau I., Wuscher N., Huerre M., Labigne A. The GroES homolog of Helicobacter pylori confersprotective immunity against mucosal infection in mice. //Proc. Natl. Sci. USA. 1995. - №92. - P.64996505.

51. Fiedorek, S.C., H.M. Malaty, D.L. Evans, C.L. Pumphrey, H.B. Casteel, D.J. Evans and Jr. D.Y. Graham. Factors influencing the epidemiology of Helicobacter pylori infection in children. //Pediatrics. 1991.-V.88. -№3.-P.578-82.

52. Fox J.G. and Lee A. The role of Helicobacter species in newly recognized gastrointestinal tract diseases of animales. //Lab. Anim. Sci. 1997. - №47. - P.222-255.

53. Handbook of Microbiological media. //First edition by R.M. Atlas. Ed. By L.C. Parks. C.H.I.P.S. - 1993.

54. Но, В and S. Vijayakumari. A simple and efficient continuous culture system for Helicobacter pylori. //Microbios. 1993. - №76. - P.59-66.

55. Hong C.S, Stadler B.M., Walti M, De Week A.L. Dot-immunobinding assay with monoclonal anti-IgE antibodies for the detection and quantitation of human IgE //J. Immunol. Methods.-1986.- V. 95.-P. 195

56. Hudson, M.J. and D.G. Newell. Continuous culture of Campylobacter pylori. //In: F. Megraud and H. Lamouliatte (ed.), Gastroduodenal pathology and Campylobacter pylori. Elsevier Science Publishers, Amsterdam. - 1989.-P. 11-15

57. Josenhans C. and Suerbaum S. Helicobacter motility and Chemotaxis. //In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001.-P. 171-184.

58. Jyotheeswaran S, Shah A.N, Jin H.O. Prevalence of Helicobacter pylori in peptic ulcer patients in greater Rochester, NY: is empirical triple therapy justified? //Am. J. Gastroenterol. 1998. - V.93. - №4. -P.5746-5748.

59. Kangatharalingam, N. and P.S. Amy. Helicobacter pylori comb. nov. exhibits facultative acidophilism and obligate microaerophilism. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. - №60. - P.2176-2179.

60. Kostryznska M, O'Toole P.W, Taylor D.T, Trust T.J. Molecular characterization of a conserved 20-kilodalton membrane-associated lipoprotein antigen of Helicobacter pylori. //J. Bacteriol. 1994. -V.176. - №19. - P.5938-5948.

61. Labenz J., Blum A.L., Bayerdorffer E. Curing Helicobacter pylori infection in patients with duodenal ulcer may provoke reflux esophagitis. //Gastroenterology. 1997. - №112. - P.1442-1447.

62. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterial fage T4. //Nature.-1970.- V.227.- N 5259.-P.680-685.

63. Lin, J.T., J.T. Wang, M.S. Wu, Т.Н. Wang, Т.К. Lee and C.J. Chen. Seroprevalence study of Helicobacter pylori infection in patients with gastroduodenal diseases. //J. Formos. Med. Assoc. 1994. - V.93. -№2.-P. 122-127.

64. Lindholm C., Osek J., Svennerholm A-M. Quantification of conserved antigens in Helicobacter pylori during different culture conditions. Infect. Immun. 1997. - V.65. - №12. - P.5376-5380.

65. Loeb, D.S., N.J. Talley, D.A. Ahlquist, H.A. Carpenter and A.R. Zinsmeister. Long-term nonsteroidal anti-inflammatory drug use and gastroduodenal injury: the role of Helicobacter pylori. //Gastroenterology. 1992. - V.102. - №6. - P. 1899-905.

66. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent //J. Biol. Chem.- 1951.-V.193.- P.265-275.

67. M.-Plaza I., R.-Herrera J. Mechanisms of regulation of urease biosynthesis in Proteus rettgeri. //J. Bacteriol. 1967. - V.93. - №4. -P.1294-1301.

68. Marchini A, D'Apolito M, Massari P, Atzeni M, Copass M, Olivieri R. Cyclodextrins for growth of Helicobacter pylori and production of vacuolating cytotoxin. //Arch. Microbiol. 1995. -V.164. - №4. - P.290-293.

69. Marshall, B.J, McGechie, D.B, Rogers, P.A. and Glancy, R.J. Pyloric Campylobacter infection and gastroduodenal disease. //Med.J.Aust. 1985. - V.142. - №8. - P.439-44.

70. Marshall, B.J, H. Royce, D.I. Annear, C.S. Goodwin, J.W. Pearman, J.R. Warren and J.A. Armstrong. Original isolation of Campylobacter pyloridis from gastric mucosa. //Microbios. Lett. 1984. - №25. -P.83-88.

71. Maxton, D.G, E.D. Srivastava, P.J. Whorwell and D.M. Jones. Do non-steroidal anti-inflammatory drugs or smoking predipose to Helicobacter pylori infection? //Postgraduate Med. J. 1990. - V.66. -№779. - P.717-719.

72. McNulty C.A.M. and Wise R. Rapid diagnosis of Campylobacter-associated gastritis.// Lancet i. 1985. - P. 1443.

73. Megraud F. How should Helicobacter pylori infection be diagnosed. //Gastroenterology. 1997. - №113. - P.S93-S98.

74. Mendall, M.A, P.M. Goggin, N. Molineaux, J. Levy, T. Toosy, D. Strachan, A.J. Camm and T.C. Northfield. Relation of Helicobacter pylori infection and coronary heart disease. //Brit. Heart J. 1994. -V.71. - №5. -P.437-439.

75. Mobley H.L.T. Helicobacter pylori Urease.// In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001. - P. 155-170.

76. Mobley H.L.T. Helicobacter pylori Urease.// In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S.

77. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001. - P. 155-170.

78. Monteiro L., Birac C., Megraud F. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polimerase chain reaction. //In: Helicobacter pylori: techniques for clinical diagnosis and basical research. Ed. by A. Lee, F. Megraud. 1996. -P.l 12-120.

79. Moran A.P. Structure-bioactivity relationships of bacterial endotoxins. //J. Toxicol.-Toxin Rev. 1994. - №14. - P. 47-83.

80. Moran A.P. Cell surface characteristics of Helicobacter pylori. //FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. - №10. - P. 271-280.

81. Moran A.P. The role of lipopolysaccharide in Helicobacter pylori pathogenesis. //Aliment. Pharmacol. Ther. 1996a. - №10. - SUPPL. 1. - P.39-50.

82. Moran A.P. Pathogenic properties of Helicobacter pylori. //Scan. J. Gastroenterol. 1996b. - №31. - SUPPL. 215. -P.22-31.

83. Moran A.P. Helicobacter pylori lipopolysaccharides. // In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. -2001. - P.207-226.

84. Moran A.P. and Aspinall G.O. Unique structural and biological features of Helicobacter pylori lipopolysaccharides. //Prog. Clin. Biol. Res. 1998. - №397. - P.37-49.

85. Morgan, D.R., R. Freedman, C.E. Depew and W.G. Kraft. Growth of Campylobacter pylori in liquid media. //J. Clin. Microbiol. 1987. -№25. - P.2123-2125.

86. Nedenskov P. Nutritional requirements for growth of Helicobacter pylori. //Appl. Environ. Microbiol. 1994. - №60. - P.3450-3453.

87. Pantoflickova D. and Blum A.L. 2001. Helicobacter pylori: A Historical Overview. //In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular

88. Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001. - P. 1-14.

89. Pantoflickova D., Talley N.J., Koelz H.R., Blum A.L. Helicobacter pylori and nonulcer dyspepsia: comments on a flawed meta-analysis. //Letter. BMJ. 2000. - №320. - P. 1208.

90. Parsonnet, J., G.D. Friedman, D.P. Vandersteen, Y. Chang, J.H. Vogelman, N. Orentreich and R.K. Sibley. Helicobacter pylori and risk of gastric carcinoma. //N. Engl. J. Med. 1991. - V.325. -№16. -P. 1127-31.

91. Perez-Perez G.I., Blaser M.J. Campylobacter and Helicobacter // In: Baron's Medical Microbiology Textbook. 2003. http://www.md.huji.ac.il/microbiology/book/toc.htm

92. Phadnis S.H., Parlow M.H., Levy M., liver D., Caulkins C.M., Connors J.B., Dunn B.E. Surface localization of Helicobacter pylori urease and heat-shock protein homolog requires bacterial autolysis. //Infect. Immun. 1996. - №64. - P.905-912.

93. Putsep, K., C-I. Braden, H.G. Boman and S. Normark. Anibacterial peptide from Helicobacter pylori. //Nature. 1999. - №398. - P.671-672.

94. Reynolds D.J., Penn C.W. Characteristics of Helicobacter pylori growth in a defined medium and determination of its aminoacid requirements // Microbiology. 1994. - V.140. - P.2649-2659.

95. Romaniuk P.J., Zoltowaska В., Trust T.J., Lane T.J., Olsen D.J., Pace N.R. and D.A. Campylobacter pylori, the spiral bacterium associated with human gastritis, is not a true Campylobacter sp. //J.Bacteriol. 1987. - №169. - P.2137-2141.

96. Schraw W., McClain M.S., Cover T.L. Kinetics and Mechanisms of Extracellular Protein Release by Helicobacter pylori. //Infect. Immun. 1999. - V.67. №10. - P.5247-5252

97. Seeker, D.A., D.S. Tompkins and G. Alderson. Gas-permeable Life cell tissue culture flasks give improved growth of Helicobacter pylori in a liquid medium. //J. Clin. Microbiol. 1991. - №29. - P. 10601061.

98. Shadowen, R.D. and C.V. Sciortino. Improved growth of Campylobacter pylori in a biphasic system. //J. Clin. Microbiol. -1989. №27. - P.1744-1747.

99. Shahamat, M., U.E.H. Mai, C. Paszko-Kolva, H. Yamamoto and R.R. Corwell. Evaluation of liquid media for growth Helicobacter pylori. //J. Clin. Microbiol. 1991. - №29. - P.2835-2837.

100. Sidebotham, R.L. and J.H. Baron. Hypothesis: Helicobacter pylori, urease, mucus and gastric ulcer. //Lancet. 1990. - №335. - P.193-95.

101. Smith M.A., Finel M., Korolik V., Mendz G.L. Characteristics of the aerobic respiratory chains of the microaerophiles Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori. //Arch. Microbiol. 2000. - V.174. -№1-2. - P.l-10.

102. Sonnenberg A. Temporal trends and geographical variations of peptic ulcer disease. //Aliment. Pharmacol. Ther. 1995. - V.9. -Suppl. 2. - P.3-12.

103. Steer H.W. Ultrastructure of cell migration through gastric epithelium and its relationship to bacteria. //J.Clin.Pathol. 1975. -№28. - P.639-646.

104. Sumner J.B., Somers G.F. Chemistry and methods of enzymes, 3rd ed. Academic press. New York. 1953. - P. 136.

105. Talley N.J., Janssens J., Lauritsen K., Racz I. Eradication of Helicobacter pylori in functional dispepsia: randomised double blind placebo controlled trial with 12 months follow up. //BMJ. -1999a. -V.318. №7187. - P.833-837.

106. Talley N.J., Vakil N., Ballard E.D. 2nd, Fennerty M.B. Absence of benefit of eradication Helicobacter pylori in patients with nonulcer dispepsia. //N. Engl. J. Med. 1999b. - V.341. - №15. -P.l 106-1 111.

107. Talley, N.J., J.E. Ormand, C.A. Frie and A.R. Zinsmeister. Stability of pH gradients in vivo across the stomach in Helicobacter pylori gastritis, dyspepsia and health. //Am. J. Gastroenterol. 1992. - V.87. - №5. - P.590-594.

108. Testerman T.L, McGee D.J, Mobley H.L.T. Helicobacter pylori growth and urease detection in the chemically defined medium Ham's F-12 nutrient mixture //J. Clin. Microbiol. 2001. - V.39. - №11. -P.3842-3850.

109. Towbin H, Gordon U, Staehelin T, Electrophoretic transfer of proteins from poly acrylamid gels to nitro cellulose sheets procedure and some //Proc. Nat. Acad. Sci. (USA). 1979. - V 76,- №9.- P. 4350-4354.

110. Tucci, A, R. Corinaldesi, V. Stanghellini, C. Tosetti, G. Di Febo, G.F. Paparo, O. Varoli, G.M. Paganelli, A.M. Labate, C. Masci, et al. //Gastroenterology. 1992. - V. 103. - №3. - P.768-74.

111. Tytgat G.N. Helicobacter pylori-reflections for the next millennium. //Gut. 1999.-V.45. - Suppl. 1. - P. 145-147.

112. Versalovic J. and Fox J.G. Taxonomy and Phylogeny of Helicobacter. //In: Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology. Ed. By Achtman M. and S. Suerbaum. Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. - 2001. - P. 15-28.

113. Walsh E.J. and Moran A.P. Influence of medium composition on the growth and antigen expression of Helicobacter pylori. //J. of Appl. Microbiol. 1997. - №83. - P.67-75.

114. Warren, J.R. and Marshall, B.J. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active gastritis. //Lancet i. 1983. - P.1273-1275.

115. Werdmuller B.F. and Loffeld R.J. Helicobacter pylori infection has no role in pathogenesis of reflux esophagitis. //Dig. Dis. Sci. 1997. -V.42. №1. - P.103-105.

116. Worst D.J., Otto B.R., De Graaf J. Iron-repressible outer membrane proteins of Helicobacter pylori involved in heme uptake. //Infect. Immun. 1995.-V.63. - №10.-P.4161-4165.

117. Xia, H.X., L. English, C.T. Keane and C.A. O'Morain. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid medium. //J. Clin. Pathol. -1993. №46. - P.750-753.

Информация о работе

Вартанова, Нунэ Оганесовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Культивирование, уреазная активность и белоксодержащие антигены Helicobacter pylori - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно