Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител

Вечканов, Евгений Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител"

На правах рукописи

00305Б045

Вечканов Евгений Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ HELICOBACTER PYLORI НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 2007

003056045

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный университет» и в лаборатории «Гибридом» Федерального государственного учреждения здравоохранения Ростовского-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Алексеева Л. П.

доктор биологических наук, профессор Лукаш А. И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Терновская Л. Н. доктор биологических наук, профессор Погорелова Т. Н.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

Защита диссертации состоится: <<2ft> апреля 2007 г. в 4&GQ час на заседании диссертационного совета Д.212.208.07. по биологическим наукам в Южном Федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, актовый зал)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного Федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «¡¡0> марта 2007г. Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук > __ В. В. Бабенко

1. Общая характеристика работы Актуальность исследования.

Роль Helicobacter pylori в возникновении гастродуоденальной патологии считается доказанной и подтверждённой современными исследованиями микробиологов, клиницистов и эпидемиологов (Аруин Л. И, 1999). Ежегодные данные ВОЗ, свидетельствующие о стремительном расширении круга лиц, поражённых этим возбудителем, ставят проблему хеликобактериоза в один ряд с важнейшими проблемами мирового здравоохранения. Только в СНГ и России ежегодный прирост заболеваемости хроническими гастритами и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки составляет более 1 млн. случаев, из которых от 60% до 90% составляют хеликобактер-ассоциированные. Особую значимость данной патологии придаёт официальная констатация Helicobacter, pylori как канцерогена I класса, иницирующего запуск патологических реакций, малигнизации тканей (ВОЗ , 1995).

Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Helicobacter, pylori в желудке человека. Однако, в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Helicobacter pylori. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и Helicobacter pylori, это микроорганизм все же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарциномы желудка (Negrmi R et al., 1991). В связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний.

Разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза, сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия, направленные на профилактику хеликобактериоза

Ни один из существующих методов диагностики Helicobacter pylori - инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но, зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания, а также индивидуальных особенностей течения инфекции. Среди наиболее распространённых методов диагностики хеликобактерной инфекции выделяют: бактериологический, гистологический, уреазный тест, молекулярно-биологический (ПЦР-исследованис), серологический методы. Все перечисленные методы имеют свои достоинства и недостатки Из

недостатков приведённых методов можно указать следующие, инвазивность, трудоёмкость и необходимость в специальном оборудовании для бактериологического метода, инвазивность и квалифицированные персонал для I истологичсского исследования, недостаточная чувствительность для уреазного теста, трудности в интерпретации значимости положительного результата в Г1ЦР-иселедовании.

Для выделения и культивирования хеликобактерий в исследовательской практике используются различные питательные срсды. Рецепты применяемых сред известны, однако их воспроизведение в лабораторных условиях затрудняется сложностью приобретения всего перечня добавок и факторов элективности. Трудновыполнимы также жесткие фебования к газовой среде культивирования, которая должна состоять из 5% кислорода, 10% углекислого газа и 85% азота Решению этих проблем служит разработанная в Ростовском ПЧИ питательная среда для выделения и культивирования хеликобактерий элективная (СЭХ) (Ломов Ю. М , Харабаджахяя Г. Д, Мазрухо А Б., Шелохович А И , 2000). В основу идеи создания среды заложен принцип полной комплектности препарата, гарантирующий оптимальный уровень его ростовых свойств. Оценка качества, элективных и рос ювых свойств среды является важной составной частью успешной работы по выделению и наработке биомассы микроорганизма.

Среди диагностических методов особое место занимают серологические методы исследования. Одним из таких методов является метод обнаружения Helicobacter pylori с помощью моноклональных антител (МКА). Использование моноклональных антител, получаемых к белковым антигенам клеток Helicobacter pylon, является оправданным вследствие неинвазивности, чувствительности и специфичности тест-систсмы для обнаружения этого микроорганизма у пациента на их основе. Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных ан пленных детерминант, с другой - повышение чувствительности и специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.

Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой BIO, полученной в лаборатории «гибридом» Ростовского противочумного института.

Цель работы:

Целью настоящего исследования явилось характеристика белковых антигенов Helicobacter pylori па основе моноклональных антител и определение возможности их использования для создания новой гест-системы по обнаружению данного микроорганизма Задачи исследовании:

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Культивирование, получение колоний и наращивание биомассы микроорганизма Helicobacter pylori.

2. Экспериментальная оценка элективной питательной среды для выделения и культивирования Helicobacter pylori (СЭХ), полученной в Ростовском НИПЧИ.

3. Фракционирование и характеристика белковых антигенов методом электрофореза в полиакриламидном геле, денситометрии, спектрофотометрии и флуорометрии.

4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антшенам Helicobacter pylori и характеристика их свойств

5. Выявление белкового антигена Helicobacter pylori, против которого направлены моноклональные антитела гибридом-продуцентов

6. Выделение, очистка и характеристика препарата белкового антигена из клеток Helicobacter pylori путём гель-электрофореза и иммуноблоггинга с использованием полученных моноклональных антител.

7. Исследование возможности использования полученных моноклональных антител в качестве основы тест-системы скрининга Helicobacter pylori - инфекции.

8 Оценка диагностической значимости моноклональных антител в серологическом методе диагностики Helicobacter pylori - инфекции. Научная новизна.

В результате проведенных исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроор!анизма Hchcobactci pylon. Показана эффективность питательной среды в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Helicobacter pylori Питательная среда обладает элективностью в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и протея, позволяя четко дифференцировать колонии возбудителя хеликобактериоза от сопутствующей микрофлоры.

В результате проведённых исследований созданы гибридомы-продуценты моноклональных антител, строго специфичных в отношении белковых антигенов микробных клеток Helicobacter pylori. Показано отсутствие перекрестной активности моноклональных антител гибридомы BIO с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с Helicobacter pylori.

Впервые методом иммуноблотгинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы BIO Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной белковой формой УФ абсорбционного спектра и спектра флуоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

1! теоретическом отношении полученные материалы расширяют имеющиеся представления о белково-антигенной организации Helicobacter pylori.

Впервые оценена возможность применения полученных моноклональных антител гибридомы BIO для изучения антигенной структуры штаммов Helicobacter pylori, и создания тест-системы скрининга Helicobacter pylori - инфекции Паучио-прак!ическаи значимость работы,

В результате исследования показано, что использование среды СЭХ в практических медицинских учреждениях позволит значительно повысить эффективность исследования материала, подозриюльного на обсемепенность хеликобактериями.

Получена коллекция гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к белковым антигенным детерминантам Helicobacter pylori, которая хранится в жидком азо1С в библиотеке гибридом Ростовского противочумного института. Произведено депонирование гибридомы

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой BIO и белков-антш енов Helicobacter pylori, явилась необходимой основой для оценки возможности создания тест-системы скрининга Helicobacter pylori - инфекции.

Ма1сриалы диссертации используются при чтении общего курса «Биотехнология» и спецкурса «молекулярная иммунология» на кафедре биохимии и микроюиологии Ростовского госуниверситета

По материалам диссертации планируется создание и введение в клинико-лабораюрную практику тест-системы скрининга Helicobacter pylori - инфекции. Основные положении, нмиосимые на защиту.

1. В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Helicobacter pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Helicobacter pylori

1. Охарактеризован фракционный состав белков Helicobacter pylori методами гель-электрофореза и денситометрии

3. Получен набор стабильных гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам Helicobacter pylori, не обладающих перекрестной реактивностью с гетерологичными микроорганизмами. Среди

полученного набора по оптимальным характеристикам отобрана для дальнейшего использования гибридная культура BIO

4. Методом иммуноблоттинга идентифицирован белковый антиген, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы BIO Проведено выделение данного белкового антигена Антиген термолабилен, имеет молекулярную массу 30 ± 1 кДа, типичные белковые адсорбционные спектры и спектры флюоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

5. Показана диагностическая значимость полученных моноклональных антител гибридомы BIO.

Апробации диссертационной рабо гы.

Материалы диссертации апробированы на совместном заседании кафедры биохимии и микробиологии Ростовского госуниверситета и лаборатории гибридом ФГУЗ «Ростовского противочумного института» Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две в центральной печати. Личный вклад автора 100%. Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 155 страницах, включая библиографию. Работа состоит из введения и 4 глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы Библиографический указатель включает 142 источника, из них 73 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20 таблицами.

2. Материалы и меюды исследовании. Лабораторные животные.

В работе использовали белых мышей-самок инбредной линии BALB/c в возрасте 6-10 недель с целью получения иммунных сплсноцитов и перитонеальных макрофагов, индукции асцитных опухолей. Бактериальные ш гаммы и ашигены.

В качестве источника микроорганизма Helicobacter pylori использовали референтные штаммы Helicobacter pyloii NCTS 11637, полученные из музея живых культур из числа имеющихся в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, и 4 штамма хеликобактерий, выделенные в

Р11ЧИ из биоптатов слизистой оболочки желудка больных гастритом и язвенной болезнью. Наращивание биомассы микроорганизма и получение колоний осуществляли на питательной среде для выделения и культивирования возбудителя хелякобактериоза, разработанной в РПЧИ

Элекшвнаи iniiaiejiMiau среда для выделения и культивирования Helicobacter pylori.

Среда СЭХ представляет собой комплект, включающий основу среды в стерильной агаризованной форме в бутылях БКЗ-450 и добавки (стимуляторы роста и смесь ан гибиотиков).

Кулыинирование пиаммо» Helicobacter pylori.

Тест-штаммы выращивались в течение 72 ч при 37°С в микроанаэростате с грехкомпоненшой газовой средой (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота) на среде СЭХ. Для получения кокковидной формы микроорганизма, выращенные культуры дополнительно оставляли на 72 ч при 37°С. Оценка качсона среды.

Для проверки ингибирующих свойств среды использовали следующие тест-штаммы Е. coh ЛТСС 25922, S. sonnei 10391, S. flexneri I А 8516, S. typhi 10476 С. albicans АТСС 24433, P. vulgaris NCTC 3132. Клеч очные линии позвоночных.

В работе использовались мышиные миеломные клетки NS0. Культивирование мышиных миеломных клеток NSO проводили в ростовой среде RPMI-1640, дополненной 10% сыворотки плода коровы (СПК), 2тМ L-глутамина и 10 mM Hepes. Иммунизации лабораторных живошмх и получение поликлональиой сыворотки.

Мышей иммунизировали микробными клетками II. pylori, убитых мертиолятом (0,01%). Иммунизацию мышей проводили по следующей схеме, каждому животному трехкратно с интервалом две недели вводили внутрибрюшинно в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) 0,1 мл ипактивированной взвеси II. pylori (108 клеток/мл, то есть 107 клеток/мышь).

Получение гибридных клеюк.

Слияние селезеночных клеток мыши с миеломой NS0 проводили в соответствии с методикой, описанной Fazekas et al (1980). Определение антителопродукции гибридом проводили методом ТИФА. Клонирование и реклонирование клеточных культур осуществляли методом предельного разведения (Goding, 1986).

Фракционирование и выделение белков Helicobacter pylori. Электрофорез белков в иолиакриламидном i еле.

Электрофорез белков в комплексе с SDS проводился в системе, предложенной Лэммли (Laemmli, 1970). Визуализацию результатов электрофореза осуществляли путем окраски геля Coomassie brilliant blue и «Stains-all». Иммуноферментные меюды.

Для обнаружения МКА в еупернатантах гибридом применялся твердофазный иммуноферментный анализ. Тестирование осуществляли иммуноферментным набором для скрининга гибридом (Calbiochem) Иммуноферментный анализ до1-блот.

Проводился аналогично ТИФА, но на нитроцеллюлозе. Результат реакции учитывали визуально (Нго и соавт., 1988).

Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных ашшел (НИФМ).

Мазки Helicobacter pylori обрабатывались нефлюоресцирующими антителами и далее флуоресцирующей антиглобулиновой сыворотко. Препараты просматривались в люминесцентном микроскопе.

Иммупоблопнш

Осуществляли в течение 25 мин, с ограничением по току 2мА/см2. Визуализацию белковых фракций осуществляли Ponceau. Инкубацию иммуноблота осуществляли в растворе моноклональных антител 1:100, 1:250, 1:500 В качестве вторичных антимышиных иммуноглобулинов использовался готовый набор, коанъюгированных с пероксидазой хрена - Goat Anti-Mouse Immunoglobulins-Peroxidase Conjugate Calbiochem® Immunochemicals.

Элюирование белкового ашигена

Осуществляли путем вырезания интересующей нас белковой фракции из пластины полиакриламидного геля. Концентрацию белка во фракции определяли методом Лоури. Исследование спектров поглощении и собственной флуоресценции белка lipenapaia.

УФ-спектры поглощения определяли на спектрофотометре Флюорат-панорама. (Люмекс, Россия) и спектрофотометре 8453Е Spectroscopy в интервале 200 650 нм Денситомегрическнй метод обработки результатов i ельолеюрофореза и используемое программное обеспечение.

Электрофореграмму документировали методом сканирования в отражённом свете и анализировали с помощью денситометрического программно-аппаратного комплекса Videodensitometr SORBFIL Ver. 1 6 0 212. Производился расчет количества белка в каждой фракции. Статистическую обработку результатов и определение необходимого объема выборки проводили по стандартным методам биометрии с привлечением программных средств Statistica v. 6.0

3. 1'езулыаты «L'C.iC'ionannti и их обсуждение .4,1, Культивирование ñjnii L'piiajii.in.rx штаммов Helicofeacter pylori и характеристика

ГОлуЧСОПМХ колоний

][арашинникс биомассы микроорганизма и 40. г.'.д :i kojíoíihй осуществляли на питательной среде для выделения и культивирован ия возбуди чел и хеликобактериоза^ разработанной и 1Ч1ЧИ. Посевы инкубировали при 37°С » течение 6 суток, используя мс глаличсскн г! мнкроана'ЭроСТат с грех компонент ной газовой средой í f (о . I'! % (+ > , ÍÍ5 % Ni).

л ^тт^ к .. <■■. •j_i

1' и С. 1 - 1» u i и yiitíc i'íítt чцшкм I U| ¡ 11: , ii .11111 л i- 11 i'l ко h .и: гг у.1I II i.: 11:1 i.ii'í: II1', па < lili, i и и i ю и HM rail'.......... LiH' lC Í A;. l|.::: I: IJcMcUКШСКГ pylurl (yill'.lH'KII tfl' I llvi'i. окрнска IID Грамму) (b)

Фото полученных колоний показано на рисунке 1. Хеликобактеры - круглые, m.myiini.ic, полупрозрачные, k:ii i диаметром не менее 0.5 мм. При

crcpcoMHKjjucкопировании в косо-падающем свегтс имеют зеленовато-желтый (золотистый)

ottciiok,

3.2. Оценка качества среды элективной хедикобактерной (СЭХ)

Оценку качества питатель ной среды СЭХ производили по физико-химическим !i отологическим показателям: чувствительность^ скоро си, роста, стабильность основных биологических еиойсти колоний, показатель ивгибиции. Физико-химические показатели испытанных серий среды СЭХ представлены в таблице № !.

Гай л ни» Б.

Физико-х ииические показат ели среды

Показан», иг i Jo фармакопеГшон cia ibe Результаты контроля СЭХ

Серия № 3 Серии .Víi 4 Серия JNI» 5

Описание Ос нона нс1 jpmpíiM и ы й а уде11 ь чёрно-ссрого uueja с нкшоченимми актнмиронянного yi ля Соотн. Со от ('(юти.

Рнстиоримосi и llpCVSpH4IIOCT¡. (1 Цнс i ноегь Ci имулнгоры роста № I и А'я 2 должны полностью рзспюряться w 2 мл НОДЫ онишснпои п ic IC1IHC 1 мин. Ci им у ля юр роста № 3 должен ■»мулы WpOAffi ься 11 5 мл поды очищенной течение 15 мин после нрслнаршслыкн о намельчении его. Соо'1». Сооги. Сойти.

!1оспараi , предварительно раенланлешшй. иалтый ч чашку Сеют». Coffin. Соотн.

Ист р 11 слоем 5-6 мм, непрозрачен, чёрно-серого цвета с включениями и осадком активированною у1ля

рн 01 6,8 до 7,0 6,95 6,93 6,94

Аминный азот, % От 0,075 до 0,095 0,082 0,081 0,084

Хлориды, % Оз 0,5 до 0,6 0,53 0,53 0,57

Прочность спудня среды, г О! 180 до 240 220 230 220

TeMiiepaiypa плавления Не менее 80иС Cooi в Cooiö Coo ib

Темпера гура засгудневания Не менее 30 и не более 37 °С Com в. Coo 1В Cooib

Продолжи гельност ь плавления А1 аризованная основа должна 1ЮЛНОС1 ыо расплатишься в кипящей водяной бане в течение 40 +-10 мин Cooib Coo ib Com в

CiepHJibiiocib Препара г должен бы гь с 1ерилен после выдерживания в 1ечеиие 44-48 ч при 1емперагуре (37+-1) "С и последующих 14 суток при температуре 20-25 °С Стерилен CiepHJieii CiepHJieii

Изученные параметры соответствовали аналогичным показателям, заложенным в

Фармакопейной статье. Результаты исследования биологических свойств среды СЭХ представлены в таблице № 2. Хеликобактерии всех пяти взятых в опыт штаммов вырастали из посевной дозы 100 микробных клеток, что соответствует разведению микробной взвеси 10'6 , тогда как чувствительность контрольной среды (хеликобактерный элективный агар) была на порядок ниже (разведение 10~5). Скорость роста Н. pylon и ингибирующая способность обеих сред была одинаковой.

Таблица 2.

Биологические показатели среды

Показатели Штамчы По фармакопейной ста гье Результаты кош роля

СЭХ Серия №3 СЭХ Серия №4 СЭХ Серия №5 ХКЭА

Показатели чувс i ви гельнос i и, скорос1и pocia NCTC 11637 10" Через (72+-2)ч инкубации диаметр колоний не менее 0,5 мм 10"* ю-6 10" 10-'

№ 1 10'6 10" 10" Ю-'

№2 10"6 10" 10 й 10"5

№3 10'6 10' 106 Ю-5

№4 10~" 10" 10" 10'5

Показа! ель ин1 ибиции F. coli 18 10° 10'3 10"' 10"3 10-'

S flexnen 1А8516 10 3 Ю-3 10*3 10 3 10'1

S sonnei 10391 Ю-3 10"3 10'3 Ю-3 Ю-3

S typhi 10476 Ю-3 10-' Ю-3 10"3 10-'

С albicans ATCC 24433 ю-4 10" ю4 Ю-4 10-4

P. vulgaris NC ГС 3232 Ю-5 ю-5 Ю-5 105 Ю-5

Хеликобактеры - круглые, выпуклые, полупрозрачные, каплевидные, диаметром не менее 0,5 мм. При стереомикроскопировании в косо-падающем свете имеют зеленовато-желтый (золотистый) оттенок. Эшерихии - круглые, гладкие, сероватые, диаметром 2-4 мм.

ЦГщеллы - круглые, гладкие, блестящие, полупрозрачные, диаметром 2-3 мм. Сальмонеллы - круглые, гладкие, полупрозрачные, диаметром 2-3 мм. Кандиды - гладкие, белые, плотные, диаметром 3-4 мм. Прочей - беловато-матового uncía, диаметром 2-3 мм, oes роения.

3.4. Получение » первичный скрипит-1 ибридеи-продуцентов моноклинальных hhehicji (МК'л) к белкам Helicobacter pylori

Проводилось слияние иммунных с единичных клеток мыши с миспомой NSO (ем. рисунок. 2 Л),

Гиг. 2. ФиI и юн1 юк мнеломы \Sii (Л) и фото к п11 ч1" гибридом (В)

Проведение гибридшгиши позволило получить и исследовать антител и образующую ¿истинность а общей сложности 384 первичных культур. Наблюдение за ростом клонов; осуществляли с помощью нпверlированио!о микроскопа Reichert. Фото первичной культуры гибридом приведено на рисунке 3 Ь

Определение аптнтелонродукции гибридом проводили методом ТИФА. Первичной тестирование в ТИФА проводили на клетках П.pylori, убитых мертнолятом. Доля антител «продуцентов, выявленных при черничном тестирования) составила 57 культур (15 %). Представление о количестве иммуноглобулинов в кул ы у рал ьн ой жидкости испытуемых гибридом получили па основании интенсивности окрашивания опытных проб и ТИФА; IIa рисунке 3 отражены данные о продукции МКЛ гибридомами, в зависимости tri времени

t j s г 9 н >э ís 17 tu i\ га а н а Ii » » а* » « 45

l'iic. 3. Диаграмм)» Jaunen мости количества air гите лои роду цируютлх клошшот времени.

Большая часть полученных первично положительных клонов в первые не цели после слияния утрачивала способность продуцировать антитела. Этот процесс протекал особенно интенсивно в течение первых трех недель. С целью достижения стабилизации антителопродукции, а также пролиферативной активности, культуры были подвержены неоднократному клонированию.

Представление о количестве иммуноглобулинов в культуральных жидкостях испытуемых гибридом получили на основании интенсивности окрашивания опытных проб в ТИФА, интенсивности свечения хеликобактера с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител.

В таблице 3 приведены показатели конечных титров МКА, обеспечивающих положительную реакцию с исследуемым антигеном. Титры антител в культуральных жидкостях разных гибридом варьировали в весьма широких пределах от 1.2 до 1:500 при сравнительно одинаковых размерах гибридных клонов.

Таблица 3.

Показа юли количественного содержания ашшел в КЖ гибридом

№ МКА гибридо м Титры МКА из КЖ в серологических реакциях

ТИФА 11ИФМ

1 D2 1300 120

2 G12 1500 1 10

3 Е1 1 500 1 10

4 F7 1 50 1 5

5 В10 1500 120

6 А8 1 50 12

7 В4 1 50 15

8 С5 150 1 2

9 С8 1 100 1 5

10 D10 1 10 -

11 Е8 150 15

12 G10 1 10 -

Высокая антителопродукция наблюдалась у гибридом G12, Е1 и В10 (титр в ТИФА ~ 1:500). В результате, из имеющихся гибридом, была отобрана клеточная линия В10, стабильно продуцирующая МКА и характеризующаяся высокой степенью антителопродукции.

3.5. Оценка специфичности МКА гибридом, полученных к Helicobacter pylori, в до1-

бло! ИФА.

Определение специфичности МКА проводили анализом дот-блот. Результаты исследования представлены в таблице 4. Как видно, МКА гибридом D2, G12, El, F7, В10

дают ■ юдожител ь ну га реакцию только с клетками НеНсоЬасГег ру!ЙЙ, т. с. МКЛ них гибридом строго специфичны и отношении белковых антигенов Нс1!СоЬас1вГ ру!оп и не вступают и реакцию с другими антигенами тестируемых микроорганизмов

Тнблнна 4.

Оценка специфичности М КА к попер*посипим детерминантам Н.ру1оп

Л11СЛ гибридом ру1оН V.сЬйЪэдй У ре5(1з 1,. рпоитао-

1)2 + -

т- - -

Е1 + - - -

1)11) - - -

[■7 + -

З.б. Опенке прецин пирующих свойств МКЛ

С цепью оценки плотности эхепонироваиия белковых детерминант, узнаваемых с'лкуii!с1с] вую;|(им им М К \. ставили родвдию нмму нопреципитации й геле. Результаты исследования припедены на рисунке 4 и в таблице 5. Известно, что МКЛ образуют тчронштатат с комяломсй-гаряы'ый! цттоттамга, если посиедаис часто встречаются ь составе биополимеров.

Таблица

Нрецццитирующие свойства МКЛ

IЕри:'Г1; I н с: " " рсилиич (угридохельнод.

Ги;\ 4. ^елулыи 11.1 пмм) |кми>г1:им1! | ;]мт1 в I

Условные обозначении: Л Пе&оЬзсйг ру1ог1.1 <512; 2 НЮ: 3 - 02; 4 5-Г7: й- С8

Полученные МКЛ гибридом 1)2, Е1. Ю. 08 из культураяънаой жидкости не обладают I|реципятирующей аюннностью, н то время как МКЛ гибридом О!2 и ВЮ обладают ярко высиженной нрс1Ш1Штиру)ощсй актишистыо, что свидетельствует о высокой частоте узнаваемых ими эциидетов.

3.7. Определение класса полученных иммуно1лобулинов

Изотипический анализ МКА проводили методом ТИФА с использованием кроличьих моноспецифических антисывороток к тяжелым цепям иммуноглобулинов мыши (СаШюсЬеш).

Таблица 6.

Класс и тигр антител в культуральных жидкостях шбрндом

№ МКА Класс Титры МКА из КЖ в ТИФА

1 D2 IgG 1 300

2 G12 IgG 1500

3 El IgG 1 250

4 Ы IgG 1 50

5 BIO IgG 1 500

Результаты анализа показали, что все МКА полученных гибридом являются иммуноглобулинами класса IgG (таблица 6) Колебания титров антител были в пределах от 1:50 до 1:500. К числу наиболее эффективных гибридом-продуцентов МКА следует отнести BIO отличающейся высокой антителопродукцией и хорошими ростовыми свойствами. Таким образом, на основании экспериментальных результатов, из нескольких стабильных гибридом-продуцентов МКА была выбрана одна линия гибридом BIO, моноклональные антитела которой в дальнейшем получали в препаративных количествах и

использовали в дальнейшей работе, для изучения белков-антигенов Helicobactei pyloii.

3.8. Фракционирование белков Helicobacter pylori

Электрофорез проводился в концентрирующем геле из расчета 10 В/см, в разрешающем 180 В/см, в течение 4-5 часов по достижению лидирующего красителя бромфенолового синего нижнего края геля в 6 повторностях. Всё опыты проводились в идентичных условиях. После проведения электрофореза окрашивание белковых фракций осуществляли с помощью красителя Кумасси R-250. В результате электрофорегического фракционирования были получены «белковые профили», один из которых представлен на рисунке 5. Из приведённого рисунка «белкового профиля» видно, что проведённое электрофоретическое фракционирование выявило 11 основных белковых фракций, имеющих молекулярную массу, находящуюся в пределах 15 - 65 kDa. Видимых различий в составе белковых фракций между кокковидной и вегетирующей формами не выявлено.

№1 Hi 2 ЛЧЗ №4 №5 №7 Ш

1>ис. 5. Результаты ¿лсчарафирстнчссксио фракционировании бел ко» Helicobacter pylori и полнакриламидном геле. п присущ шш детергента SI)S.

Услоииыс обозначения: проба Л? I маркеры молекулярной массы (белкоиые метчики)т проба № 2, № 3, № 4 ли:*ат бактериальной массы Helicobacter pylori коккоаидиый формы, проба № 5. JVs 6, № 7 -лилат бактериальной массы Helicobacter pylori uetxn ирующей формы, проба № X отрицательный контроль. Слепа стрелкой нока шпо направление миграции белковых фрикций и шкала длины.

Полученные данные молекулярных масс белковых фракций по веем опытам, были обработаны программой математической статистики «Statistica» v. 6.0 с целью получения усреднённых значений молекулярных масс белковых фракций. Результаты .статистической обработки представлены и таблице X,

Таблица 8.

Статистическая обработка значении М белковых фракций

Помер фракции Кол-no í ■;:>;'. 11 ¡ ii ( fujii 14 1нйчс1шё M ( i .ni i. otkvl. Стянд. ошибка

K« I 6 20792,00 ,541.« 204,85

,Vb 2 Й 53342,71 1745.31 65Ч,(>6

6 27313,43 1Й2Й.20 й 14,64

№4 6 ЗОЙ t 1,14 858,092 324,32

№5 Й 33794. í 4 1293,86 489,03

Jfl 6 0 35980.00 1552,46 586,77

№7 6 38674,43 1549.05 585,48

Ш 8 6 41898,71 3415,39 1290,84

№ ') 6 47054,57 i 3fi(J5,75 1396,86

№ 111 6 57558.43 I 3375,45 1275.80

All Й 64398.71 1 2Й21,20 490,72

3.9. Денситомегрическое исследование белковых фракций Helicobacter pylori

Для денеи! о метрического исследования проводили гель-электрофорез проб со стандартами бычьего сывороточного альбумина различных концентраций. Ниже на рисунке 6 представлен соответствующий элсюрофоретический профиль.

Jfc 1 Nt 2 M 3 № 4 JVs 5 № 6 №7

Рис. 6. Электрофорез Helicobacter pylori на полнакриламнлном геле а присутствии детергента SDS и белковых «стандартов» бычьего сыиорогочиою альбумина

Условные обозначения; проб» № I белковые метчики; проба № 2. № 3, № 4 белковые «сгнидарги») бычьего иывороточнот альбумина н концентрации 100 wki/mji, 70 мкг/м.т ii 20 мкгАм соответственно; проба № 5 инзат бактериальной массы Helicobacter pylori всгстмрующси формы: проба № 6 лшат бактериальной массы Helicobacter pylori коккопндмыЙ формы, проба jVü 7 огрицатсльнын контроль. стрелкой укатано |>ассто>шнс от белковой фракции до фронта красителя,

Производился количественный расчёт показателей белковой фракции по цифровой (фотографии. В результате были получены данные о количестве белка в каждой ю белковых фракций (рисунок 7) и его % содержании к общей сумме белка (рисунок 8).

0 количество белка н белковой фракции Н. pylori ввгетирующей формы □ количество бепка в белковой фракции Н. pylori кокковидной формы

Рис. 7. Диаграмма количественного содержания белка н каждой фракции

Рис. 8. Диаграмма % содержании белка в белковой фракции к сумме.

10. СраниительвОе Исследование белковых фракции Helicobacter pylori метод ом

Для проведения исследования белковых фракций i lelicobacicr pylori моголом иммуноблоттияга осуществляли перенос фракционированных белков с пластины иолиакриламидиоги геля, полученного i; ходе предыдущего опыта, отображённого на рису [Гко 9, n;t микропористую нитроцеллюлоз ну к) мембрану но методу Bjenum and Sehafer-Nefiseil.

Уелиисиле обозначения; проба J6t 1- маркеры чо.текуллрпой массы i5 0 1 о :iметчики); проба № 1- лили |Ьк.:o:41o,ii.mo{) массы I lelicobQCEC! pyturi коккояццньгё формы, обработанной МКД гнбриломы 1110; npoftn дь 1 лi бактериальной siaccu Helicobacter pyloii коккоиидный формы, otip:i6u гй|Iпой омоцнфи "ccto.t iclihK- ijtмлi.iюй сыиориткой; проба № 4- пни.: :>.|: 10л!.:1о:(о: ч.оо: i.' I Idicohaciuv pylori кокколилпый формы, оЬ^Оопншюй нормальной мылцшоа сыиоротклй. ,t;)u'i.i Л'- 5- I,:ч.■ бяк icp(titjii,]Ki;i МИСС' Helicobacter pylori неге; иочлоией формы, обработанной МКА ¡"ибридоми BIO; н pofia .V ft. литмт бак i?.i..ii' -и массы Helicobacter pyion tteivrnpyюшей формы, обработанной слстиоичесуой поликлоплллпой сьлюроткой; 111 > I' о: i .Y. 7 и i бак. 0;H|:::,| ни массы I leill'olxic'xr pyloti л(легируюл|ск формы, обработанной 11 ■> ,i N- lie..OH Vo. : I' H 11 CbMsupin кои; проба Jft S О нлнл гельныи контроль.

Согласно результатам иммуноблоттинга (см. рисунок 9), монокдональные антитела гибридомы В(0 взаимодействуют с йелкоиай фракцией № 4 Helicobacter pylori, что соответствует белковому аптшену со средней молекулярной массой 30 I кДа. Также показано, что данный белковый антиген присутствует н равной степени как у труднодиагяфег прус мой кокков ид ной, гак и у вегетирующен форм. Антитела сггекафической подиклоналыгой сыворотки взаимодействуют с несколькими белковыми аи'икнгами, а именно с фрахаиямн № ИМ - 2'.Ш2 Да>, К» 2 (М - 23342 Да), ifs 4 (М 30811 Да), № 6 (М - 35980 Да )Л'е 9(М 47059 Да).

3,11. Опенка термолабч лености лIIL .11 он;| Helicobacter pylori, выявляемого МКА гибридомы

шо

Оценивалась термолабклыюсть банкового антигена, к которому были одлучены антитепа гибрид« мы В10, методом дот-блот. Результаты опыта приведены ниже на рисунке 10

и м «VI i oilj to) tни 1 а

x? t !f:i av 1 jv-i & ? *ftk

-agj

PllC, V. Имчуиобло IOI рлмча ООЛКОЛЫХ яншшиы! фракции Jlclicobaettl' ]IV ion

Проба № 1 Проба № 1 а Проба № 2 Проба № 2а Проба № 3

Рис. 10. Оценка термолабильности белкового антигена методом дот-блот.

Условные обозначения: проба № 1- микробные клетки Helicobacter pylon убшые мершоляюм и обработанные МКА в рзведении 1/5, проба № 1а - микробные клетки Ilelicobactei pylon убшые мершоляюм и обрабо!анные МКА в рзведении 1/50, проба № 2- микробные клетки Helicobacter pylon убшые мершолятом и надеванием при 100° С в 1ечение 30 млиу 1. обрабоштые МКА в разведении 1/5, проба № 2а-микробные клетки Helicobacter pylori убшые мер|Иолягом и на!реванием при 100° С н течение 30 MHFiyi, 0браб01анные МКА в рзведении 1/50; проба № 3- отрица1елышй кон|роль

МКА не обнаруживают белковый антиген при термической обработке проб № 2 и 2а. Таким образом белковый антиген является термолабильным.

3.12. Ультрафиолетовые спектры поглощении и флуоресценции белка Из полиакриламидных пластин гелей вырезали полоски, содержащие фракцию № 4 белка-антигена, дающего положительную реакцию с моноклональными антителами гибридомы BIO предыдущих опытов. Белок элюировали из полиакриламидного геля. Определяли концентрацию полученного очищенного белкового антигена по методу Лоури. Концентрация белкового антигена составляла 0,5 мг/мл.

Снимали спектр поглощения в единицах оптической плотности в диапазоне от 220 до 650 нм, с шагом 10 нм. Результаты измерений на рисунке 11. Также снимался спектр флуоресценции от 220 до 700 нм, с шагом 10 нм. Результаты измерений приведены на рисунке 12 Интенсивность флуоресценции измеряли в условных единицах вблизи максимума спектра, кроме того оценивали его положение и форму.

• 280 nmll ООвО AU

Рис. 11. Спектр поглощения белковою npenapaia (фракция №4).

с 200

SM STD 595

Рис. 12. Типичная форма cueKipa флуоресценции белковою препарата, (фракция № 4)

Исследование спектра препарата фракции Ла 4 выявило типичный белковый спектр поглощения, ц диапазоне 210-240 им оптическое поглощение составило 2,00-3,50,

•сто соответствуй спектру поглощения пептидных групп бедка, при (Л,,„,.„) 280 Щ одгическое поглощение составило 1.25. что соответствует суммарному поглощению ароматических аминокислот триптофана, фенил ал анкна и тирозина. В остальном диапазоне (Х.ош) 290-650 им отсутствуют максимумы поглощения. Размытые максимумы поглощения бедка являются следствием светорассеяния (опалесценнии) раствора.

11рсдстапленный па рисунке 15 спектр флуоресценции является типичным для белкового препарата при рН 7,0, положение максимума при длине волны возбуждения Лкио) 280 им и максимуме (л.,,,) эмиссий 350-360 им составила 1Н2 -± 0,1 й соответствуем' максимуму флуоресценции триптофана.

3.13. Определение иебелканьгх. компонентов белконого ипшеш Проводился реэлек грофорез белкового антигена НсНсоЬас1ег ру1ог1, против которого были направлены монркл опальные антитела гибридомы В10. После проведения электрофореза окрашивание фракции бликового антигена осуществляли с помощью красителя |сНЫ1к-а11» Особенностью данного красителя является то, чга гликопротеиДЙ, белки. тиииты и даже нуклеиновые кислоты окрашиваются одновременно, Для краситетя характерна, чщ разные но своей природе биополимеры окрашиваются в различные цвета: гл и ко протеиды ■■ в сипий, белки - в красный, лип иды - в жеято-оранжюшй, ДНК - в сипи и, а РНК - в гол у Вова го-пурпурный.

И результате здектрофореткчсско)'^ фракционирования и окраски была получена злектрофоретическа? картина, представленная на рисунке 13.

H »с. 1.1. IV i\i 1.1 л I m m,1 к" pofflwpeni'wiKOiu фраиишннраыни! белкой I kLi.ulj:u'ii pylori в нолинкрилаяшлпом i l'.ie, и окраски к p й с тел см <;Stflirn-iilb> Исходи из окраски фракций белкового антигена, следует, что белковый антиген представлен белковой составляющей, без выраженной j шпили ой и углеводной части. ЗЛ4. Оценка использования полученных МКЛ в диагностике Helicobacter pylori -

инфекции

i i настоящем исследовании использовался клинический материал от 36 пациентов, страдающих гастродуоденальной патологией. Ike пациенты были мужчинами в возрасте

от 1К до 30 лет. В качестве клинического материала использовались бжн; тты язвенно -зррозииного поражения желудка и двенадцатипсрсгной КИШКИ.

Каждую пробу разделяли на две части. Первую часть пробы использовали для микробиологического исследования на наличие возбудителя Helicobacter pylori. Другую часть биоитата использовали для проведении дот-ифа е МКА гибридомы BIO. Результата исследования приведены в таблице 16 и рисунке 14.

Таблица 16,

Данные по обнаружению Helicobacter pylori разными Методами

мациин 1 Результат ло г-и фа всследоьяпнн Рсзу.Т1.3 я |- мнкроб. и с с.т ^Л 0 ft П1ШЯ

Титр МКА: t/5 Титр МКА 1/5(1

1 ■!■ 4- +

2 ь ■ '£ +

3 - -

4 - - -

5 - -

6 - s ■

7 - - -

к - - -

9 - -

К! - - -

1 1 - - -

12 + + +

13 - - -

14 Н- 4 +

15 - - -

16 - -

17 + + . +__________

Результат

нациепт до г-ифн исследования Результат микроб, исследования

Титр Титр

МКА МКА

1/5 1/5(1

19 - - -

20 - - -

21 - - +

22 -

23 -

24 - - -

25 - - -

26 ■4- + -t-

27 - - -

2Й - - -

29 + .

30 - - -

31 - - -

32 - -

33 - - -

34 + + +

35 - - -

36 - - -

У с. I □ ин ы с оо нпчен и я: + полосе итсльния реакция; - игр И1(!П е. i süaw реякцоя.

Из результатов Исследования, пробы № 1, 2. ¡2. 14, 17, 26, 29, 34 имели положительный результат па наличие белкового антигена Helicobacter pylori. Результаты ИФА дот-Плот соотносились с результатами микробиологического исследования на основе питательной среды СЭХ па наличие микроорганизма Helicobacter pylori. Пробы № 1, № 2, № 12, № 14, № 17, № 21, № 26, № 29, № 34 имеют положительный результат с использованием метода микробиологических сред. Остальные пробы имели отрицательный результат. Результаты исследования показали наличие Helicobacter pylori микробиологическим методом у 9 (25%) человек из 36 пациентов. ИФА анализом, с использованием МКА гибридомьт UI0, был подтвержден положительный результат у Sä (88 %)чслонск из 9 пациентов, с микробиологически подтвержденным диагнозом. .

1 Ы 'I |п Г1 г ' <111пн',111п[ и !11 'Л кп к I „I,-. I. I

И1II. р.,Гй|3 * иццкрмнШ | □Ц.^ЬН- ___

1'нс, 14. Диаграмма обнаружении 11с£1еоЬис(ег ру!ог1 у папистов (."грялаютия »асфонуодензлыго! наголш I'и с домашни КФЛ ,'иот Шип и мцкриЛшцщткки^ \'ЛТТ М'М (Лилружеиим 'лглф''Т'\н '.-ЛШ глл

Вн пКшельиык 1'рецах.

Доля пациентов и отрицательными результатами исследований на наличие возбудителя хсликобактериоза составила 75%, у 25% пациентов было подтверждено наличие возбудителе микробиологическим методом, а у 22% н мну но ферментным методом.

) 1ри проведении сравнительного анализа чувствительности иммуноХимических методов на основе МКЛ и поликионалышх Сывороток был получен результат, заключающийся н том, что в 33,3 % случаев поликлональнаЯ сыворотка не выявила наличие возбудителя I (еМсоЬао1ег ру1оп в образцах, с подтвержденным бактериологическим метолом результатом. Оценена «эффективность» антител на основе поликлопальной сыворот ки и МКА гибридомы В10, приведённая на рисунке 15.

1*|нк 15. Дширшмя эффектинмосгл имнунивмнчеемв методов на основе МКЛ в ПОПНКЛОНЫЬН 1.11 СЫНОрФПЖ.

I (олученные данные коррелируют с тем фактом, что ооликлональные гетерогенные сыворотки содержат большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами. Состав полит (опальной сыворотки, ее анти тельный ((репертуар», во многом завися! от схемы введения антигена и от индивидуальной реакции организма на антиген Таким образом, ожидать от поликлоналыюй сыворотки высокой эффективности и специфичности по

отношению к возбудителю не приходится. Кроме того, у различных пациентов возможны вариации «антигенной представленности» Helicobacter pylori, что в условиях применения поликлональной сыворотки с пулом антител, приводит к снижению эффективности и % выявляемое™ микроорганизма. Препарат же моноклональных антител содержит продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте Helicobacter pylori, причём одинаково представленной у различных штаммов микроорганизма и обладающий всегда одинаковыми физико-химическими характеристиками, и сродством к антигену. При применении гибридомной биотехнологии используются высокоаффинные антитела с заданной нужной специфичностью. Именно поэтому применение моноклональных антител в диагностике позволяет значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-системы и как следствие более высокий процент диагностики.

Таким образом, в результате исследований были получена гибридома, стабильно продуцирующая МКА к эпигонам белкового антигена Helicobacter pylori. Были определены иммунохимические свойства и эпитопная направленность полученных МКА. Охарактеризован белковый антиген Helicobacter pylori, против которого направлены МКА, полученной гибридомы. Доказана возможность использования полученных МКА в клинической практике. Все вышеперечисленное позволяет рекомендовать МКА, продуцируемые гибридомой BIO, в перспективе, как эффективную основу для создания тест-системы, по обнаружению Helicobacter pylori.

Выводы

1. Показана эффективность питательной среды (СЭХ), разработанной в РПЧИ, в обеспечении ростовых свойств Helicobacter pylori, а также сё элективность в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и протея.

2. В результате гибридизации миеломы NSO и иммунных спленоцитов белых мышей-самок инбредной линии BALB/c получены гибридомы-продуценты моноклональных антител к белковым антигенным детерминантам Helicobacter pylori.

3. Установлена возможность использования полученных моноклональных антител для обнаружения Helicobacter pylon в реакциях ИФА, дот-ИФА, непрямой иммунофлуоресценции и иммунопреципитации

4. В процессе исследования выявлена стабильная гибридома BIO с высокой пролиферативной активностью и антителопродукцией, моноклональные антитела которой отвечают диагностическим требованиями и могут быть использованы для разработки новых современных тест-систем.

5. Определён фракционный состав белков Helicobacter pylori методом гель-электрофореза. Выявлено и охарактеризовано 11 основных белковых фракций с молекулярной массой от 20 до 65 кДа.

6. Установлено, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой BIO, отличаются высокой специфичностью в отношении Helicobacter pylori. Методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы BIO.

7. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной формой УФ абсорбционного спектра флуоресценции, характерной для белка.

8. Па клиническом материале показана эффективность использования моноклональных антител гибридомы BIO в диагностике Helicobacter pylori -инфекции.

Список paöoi, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных

ВАК

1. Всчканов Е. М. Изучение антигенных детерминант Helicobacter pylori с помощью моноклональных антител // Известия Высших учебных заведений СевероКавказский регион. Приложение Естественные науки. - 2006. - № 2. - С 38-44., -0,03 п. л.,- личный вклад 60%

Список работ, опубликованных но теме диссертации

2. Вечканов Е. М. Использование моноклональных антител в диагностике и исследовании антигенных детерминант Helicobacter pylori // Электронный журнал "Исследовано в России", - 2005. - № 138, - С. 1396-1402.,- личный вклад 65%

3. Вечканов Е. М Оценка специфической активности моноклональных антител против Helicobacter pylori иммуноферментным анализом // В Сб. тр. 5 межд. конф. «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, РостГМУ., 2006 - С. 2931. 0,084 п. л., - личный вклад 50%

4. Вечканов Е. М. Апробация и характеристика моноклональных антител, полученных к микроорганизму Helicobacter pylori // В Сб. тр. аспирантов и соискателей Ростовского государственного университета. - Ростов-на-Дону: Изд РГУ. - 2005 -т. 11. С. 61-63. -0,09 п. л., -личный вклад 75%

5. Вечканов Е. М. Исследование белковых антигенов Helicobacter pylori с помощью метода иммуноблоттинга. // В Сб. тр 3 межд. конф. «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, РостГМУ, 2003. - С. 30-31. - 0,084 п л., -личный вклад 50 %

Список использованных сокращений.

МКА моноклональные антитела

АОК - антителообразующие клетки

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

^ - иммуноглобулин

ИФА - иммуноферментный анализ

КЖ - культуральная жидкость

ПААГ - полиакриламидный гель

ЗОБ - додецилсульфат натрия

СЭХ - среда элективная хеликобактерная

ХКЭА - хеликобактерный элективный агар

ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

РПЧИ - Ростовский противочумный институт

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вечканов, Евгений Михайлович

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы.--------------------------------------------------------------------------------------------и

1.1. Бактериологические особенности Н. pylori

1.2. Роль белково-антигенных комплексов в патогенности Н. pylori.

1.3. Проблемы диагностики Н. pylori.

1.4. Микробиологические и серологические методы диагностики Н. pylori.

1.5. Методы получения моноклональных антител и их практическое использование

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Лабораторные животные

2.2. Бактериальные штаммы и антигены

2.3. Приготовление элективной питательной среды для выделения и культивирования Н. pylori (СЭХ) и её экспериментальная оценка

2.4. Культивирование штаммов Н. pylori

2.5. Клеточные линии позвоночных

2.6. Оборудование и реактивы, схема этапов работы

2.7. Получение гибридом

2.7.1 Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки

2.7.2. Гибридизация клеток

2.7.3. Клонирование гибридом

2.7.4. Культивирование гибридом in vitro и in vivo

2.7.5. Криоконсервирование гибридом

2.8 Метод очистки иммуноглобулинов

2.9. Выделение и фракционирование белков Н. pylori. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.9.1. Подготовка и проведение электрофореза

2.9.2. Визуализация белковых фракций методом окрашивания геля Coomassie brilliant blue R250

2.10. Иммуноферментные методы

2.10.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

2.10.2. Иммуноферментный анализ дот-блот

2.10.3. Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител

2.10.4. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони

2.10.5. Конкурентный иммуноферментный анализ

2.11. Иммуноблоттинг

2.11.1. Электроперенос фракционированных белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану

2.11.2. Визуализация белковых фракций на фильтре

2.11.3. Проведение иммуноблоттинга

2.12. Характеристика белкового антигена методом спектрофотометрии

2.12.1. Элюирование белкового антигена----------------------------------------------------—

2.12.2. Определение концентрации белка по Лоури

2.12.3. Исследование спектров поглощения и собственной флуоресценции белка препарата.

2.13. Денситометрический метод обработки результатов гель-электрофореза и используемое програмное обеспечение

2.14. Методы статистической обработки результатов исследования

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. Результаты культивирования бактериальных штаммов Н. pylori и иммунизации лабораторных животных

3.2. Исследование и оценка ростовых и элективных свойств среды (СЭХ) для выделения и культивирования Н. pylori.

Характеристика полученных колоний Н. pylon.

3.3. Иммунизация

3.4. Получение и первичный скрининг гибридом-продуцентов МКА к белкам Н. pylori

3.5. Оценка специфической активности МКА в серолоических методах

3.6. Определение эпитопной направленности МКА к Н. pylori

3.7. Определение класса полученных иммуногобулинов

3.8. Получение препаративных количеств МКА, их очистка

3.9. Фракционирование и построение белкового профиля Н. pylori

3.10. Денситометрическое исследование белковых фракций Н. pylori

3.11. Сравнительное исследование белковых фракций Н. pylori методом иммуноблоттинга.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------ЮЗ

3.12. Оценка термолабильности белкового антигена Н. pylori, выявляемого МКА гибридомы В10

3.13. УФ спектры поглощения и флуоресценции белка.

3.14. Определение небелковых компонентов белковых фракций.

3.15. Оценка возможности использования полученных МКА в диагностике

Н. pylori - инфекции.

3.16. Сравнительный анализ чувствительности иммунохимических методов на основе МКА и поликлональных сывороток.

Обсуждение результатов исследования.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител"

Актуальность исследования

Роль Н. pylori в возникновении гастродуоденальной патологии считается доказанной и подтверждённой современными исследованиями микробиологов, клиницистов и эпидемиологов. Ежегодные данные ВОЗ, свидетельствующие о стремительном расширении круга лиц, поражённых этим возбудителем, ставят проблему хеликобактериоза в один ряд с важнейшими проблемами мирового здравоохранения. Только в СНГ и России ежегодный прирост заболеваемости хроническими гастритами и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки составляет более 1 млн. случаев, из которых от 60% до 90% составляют хеликобактер-ассоциированные (Аруин Л.И., 1999). Особую значимость данной патологии придаёт официальная констатация Н. pylori как канцерогена I класса, иницирующего запуск патологических реакций, малигнизации тканей (ВОЗ., 1995).

Впервые упоминания о наличии в желудочном содержимом изогнутых и спиралевидных бактерий относятся к концу XIX-века. Однако связь между этими микроорганизмами и гастродуоденальных патологий была установлена лишь в 1983г., когда австралийские учёные Уоррен и Маршалл выделили чистую культуру этих микробов и выдвинули предположение об их влиянии на деструкцию эпителиального барьера в желудке. Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Н. pylori в желудке человека. Однако в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Н. pylori. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и Н. pylori, это микроорганизм всё же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарциномы желудка (Negrini R., Lisato L., Zanella I et al., 1991). В связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний.

Разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза, сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия, направленные на профилактику хеликобактериоза.

Тем не менее, ни один из существующих методов диагностики H.pylori- инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но, зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания, а также индивидуальных особенностей течения инфекции. Среди наиболее распространённых методов диагностики хеликобактерной инфекции выделюят: бактериологический, гистологический, уреазный тест, молекулярно-биологический (ПЦР-исследование), серологический методы. Все перечисленные методы имеют свои достоинства и недостатки. Из недостатков приведённых методов можно указать следующие: инвазивность, трудоёмкость и необходимость в специальном оборудовании для бактериологического метода, инвазивность и квалифицированные персонал для гистологического исследования, недостаточная чувствительность для уреазного теста, трудности в интерпретации значимости положительного результата в ПЦР-исследовании.

Для выделения и культивирования хеликобактерий в исследовательской практике используются различные питательные среды. Рецепты применяемых сред известны, однако их воспроизведение в лабораторных условиях затрудняется сложностью приобретения всего перечня добавок и факторов элективности. Трудновыполнимы также жесткие требования к газовой среде культивирования, которая должна состоять из 5% кислорода, 10% углекислого газа и 85% азота. Решению этих проблем служит разработанная в Ростовском ПЧИ питательная среда для выделения и культивирования хеликобактерий элективная (СЭХ). В основу идеи создания среды заложен принцип полной комплектности препарата, гарантирующий оптимальный уровень его ростовых свойств. Оценка качества, элективных и ростовых свойств среды является важной составной частью успешной работы по выделению и наработке биомассы микроорганизма.

Среди перечисленных методов особое место занимают серологические методы исследования. Одним из таких методов является метод обнаружения Н. pylori с помощью моноклональных антител (МКА). Использование моноклональных антител, получаемых к белковым антигенам клеток Н. pylori, является оправданным вследствие неинвазивности, чувствительности и специфичности тест-системы для обнаружения этого микроорганизма у пациента на их основе. Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных антигенных детерминант, с другой - повышение чувствительности и специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.

Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой В10, полученной в лаборатории «гибридом» Ростовского противочумного института.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось характеристика белковых антигенов Н. pylori на основе моноклональных антител и определение возможности их использования для создания новой тест-системы по обнаружению данного микроорганизма. Задачи исследования.

1. Культивирование, получение колоний и наращивание биомассы микроорганизма Н. pylori.

2. Экспериментальная оценка элективной питательной среды для выделения и культивирования Н. pylori (СЭХ), полученной в Ростовском НИПЧИ.

4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам Н. pylori и характеристика их свойств.

5. Выявление белкового антигена Н. pylori, против которого направлены моноклональные антитела гибридом-продуцентов.

6. Выделение, очистка и характеристика препарата белкового антигена из клеток Н. pylori путём гель-электрофореза и иммуноблоттинга с использованием полученных моноклональных антител.

7. Исследование возможности использования полученных моноклональных антител в качестве основы тест-системы скрининга Н. pylori - инфекции.

8. Оценка диагностической значимости моноклональных антител в серологическом методе диагностики Н. pylori - инфекции.

Научная новизна.

В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Н. pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Н. pylori, обладает элективностью в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и протея, позволяя четко дифференцировать колонии возбудителя хеликобактериоза от сопутствующей микрофлоры.

В результате проведённых исследований созданы гибридомы-продуценты моноклональных антител строго специфичных в отношении белковых антигенов микробных клеток Н. pylori. Показано отсутствие перекрёстной активности моноклональных антител гибридомы В10 с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с Н. pylori.

Впервые методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной белковой формой УФ абсорбционного спектра и спектра флуоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

Впервые оценена возможность применения полученных моноклональных антител гибридомы В10 для изучения антигенной структуры штаммов Н. pylori, и создания тест-системы скрининга Н. pylori - инфекции.

Научно-практическая значимость работы.

В результате исследования показано, что использование среды СЭХ в практических медицинских учреждениях позволит значительно повысить эффективность исследования материала, подозрительного на обсемененность хеликобактериями.

Получена коллекция гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к белковым антигенным детерминантам Н. pylori, которая хранится в жидком азоте в библиотеке гибридом Ростовского противочумного института. Произведено депонирование гибридомы.

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой В10 и белков-антигенов Н. pylori, явилась необходимой основой для оценки возможности создания тест-системы скрининга Н. pylori - инфекции.

Материалы диссертации используются при чтении общего курса «Биотехнология» и спецкурса «молекулярная иммунология» на кафедре биохимии и микроюиологии Ростовского госуниверситета.

По материалам диссертации планируется создание и введение в клинико-лабораторную практику тест-системы скрининга Н. pylori -инфекции.

Основные положения выносимые на защиту.

1. В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Н. pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Н. pylori

2. Охарактеризован фракционный состав белков Н. pylori методами гель-электрофореза и денситометрии.

3. Получен набор стабильных гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам Н. pylori, не обладающих перекрёстной реактивностью с гетерологичными микроорганизмами. Среди полученного набора по оптимальным характеристикам отобрана для дальнейшего использования гибридная культура В10.

4. Методом иммуноблоттинга идентифицирован белковый антиген, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Проведено выделение данного белкового антигена. Антиген термолабилен, имеет молекулярную массу 30 ± 1 кДа, типичные белковые адсорбционные спектры и спектры флюоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

5. Показана диагностическая значимость, полученных моноклональных антител гибридомы В10.

Апробация диссертационной работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях биолого-почвенного факультета Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону, 2003-2006), а также были представлены на 2, 3, 4 международной межвузовской конференции молодых учёных «Обмен веществ при адаптации и повреждении» Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2003-2005). Материалы диссертации апробированы на совместном заседании кафедры биохимии и микробиологии Ростовского госуниверситета и лаборатории гибридом ФГУЗ «Ростовского противочумного института» Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две в центральной печати. Личный вклад автора 100%.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Вечканов, Евгений Михайлович

Выводы

1. Показана эффективность питательной среды (СЭХ), разработанной в РПЧИ, в обеспечении ростовых свойств Helicobacter pylori, а также её элективность в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и протея.

3. Установлена возможность использования полученных моноклональных антител для обнаружения Helicobacter pylori в реакциях ИФА, дот-ИФА, непрямой иммунофлуоресценции и иммунопреципитации.

4. В процессе исследования выявлена стабильная гибридома В10 с высокой пролиферативной активностью и антителопродукцией, моноклональные антитела которой отвечают диагностическим требованиями и могут быть использованы для разработки новых современных тест-систем.

6. Установлено, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой В10, отличаются высокой специфичностью в отношении Helicobacter pylori. Методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10.

-1398. На клиническом материале показана эффективность использования моноклональных антител гибридомы В10 в диагностике Helicobacter pylori - инфекции.

- 140

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вечканов, Евгений Михайлович, Ростов-на-Дону

1. Абелев Г.И. Моноклональные антитела // Соросовский образов, журн. -1998.-№1-С. 16-20.

2. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков.- М.: Мир. 1983. -263 с.

3. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ./Под ред. Д. Кэт-А72 ти. — М.: Мир, 1991.—287 с, ил.

4. Аруин JI. И. Helicobacter pylori в патогенезе язвенной болезни: что известно и что узнать предстоит//Матер. 6-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Омск,- 1997. - С. 82-85.

5. Аруин JI. И. Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе язвенной болезни // Матер. 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Нижний Новгород, 1998. - С.6-11.

6. Аруин JI. И. Роль Helicobacter pylori в формировании морфологического субстрата язвенной болезни // Матер. 8-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Уфа, 1999. - С. 711.

7. Аруин JI. И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам. 1993. - 362 с.

8. Аруин JI. И., Капуллер Л.Л., Исаков В. А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М.: Триада-Х, 1998. -496с.

9. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JI.: Медгиз. - 1962. - 180 с.

10. Ю.Барановский А. Ю., Щукина О. Б., Назаренко JI. И. Эрадикационная терапия Helicobacter pylori // Клинич. фармакология и терапия. 1999. -№1. - С. 54-58.

11. П.Баранская Е.К. История открытия Helicobacter pylori // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999. - №4. - С. 61-66.

12. Баранская Е. К. Язвенная болезнь и инфекция Helicobacter pylori // Болезни органов пищеварения. 2000. - №1. - С. 8-14.

13. Белая 10. А. с соавт. Частота встречаемости специфических антигенов Helicobacter pylori при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. // "Журнал микробиологии",- 2004,- №6, -с. 63 69.

14. Биотехнология / Под ред. Н.С.Егорова, В.Д. Самуилова. Кн.З: Клеточная инженерия/ Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф.Киркин, Т.Г. Корженевская, Е.Н.Маркарова. М.: Высш. шк. - 1987. - 127 с.

15. Битти А. Д. Диагностические тесты в гастроэнтерологии (пер. с англ.).- М.: Медицина, 1995. 65 с.

16. Блинов И. А. Проблема H.pylori: миф и реальность // Клиническая медицина. 1997, № 12. - С .71 - 74.

17. П.Васильев В. С., Комар В. И., Цыркунов В. М. Практика инфекциониста.- Мн.: Высш. шк. -1994. 495 с.

18. Демченко А. П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и Структура белков // Наукова думка,- Киев, -1981.

19. Домарадский И. В. Бабин В. Н. О взаимоотношениях эпителиальных клеток слизистыз оболочек с микробами—внутриклеточными паразитами. // Мед. паразитол. и паразитарные броезни.—1996.—№ 4.—С. 3-8.

20. Домарадский И. В.Вирулентность бактерий, как функция адаптации Ж. микробиол.—1957,—№4.—С. 16-20

21. Домарадский И. В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Ж. микробиол.—1957.—№ 4.—С. 3135

22. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высшая школа.- 1991. С. 288

23. Ивашкин В. Т., Лапина Т. JI. Н. pilori от научных исследований к клинической практике. Диагностика и лечение // Русский медицинский журнал.- 1996.-т.4„ №4.-с.149-150.

24. Ивашкин В. Т. Н. pylori: биологические характеристики, патогенез перспективы эрадиации // Росс, журнал гастроэнтерологии, гематологии. -1997, №10.- С. 77-78.

25. Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. М.: "Триада-Х", 1999. - 255с.

26. Иммунология инфекционного процесса / Под ред. В.И. Покровского, С. П. Гордиенко, В. И. Литвинова. М.: Наука. - 1993. -308 с.

27. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т. Нго, Г. Ленхоффа. М.:Мир. -1988. - 446с.

28. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. И53 с нем. А. П. Тарасова. — М.: Медицина.- 1987,- 472 с.

29. Калинин А.В. Язвенная болезнь: диагностика, современные принципы лечения и профилактики // Метод рекомендации. М,- 1999. - 30с.

30. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т. Дж., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. М. Медицина. -1983.-416 с.

31. Конорев М. Р., Литвяков А. М., Крылов Ю. В. Диагностика H.pylori в желудочном содержимом // Клиническая лабораторная диагностика, 2000, №1.- С.-41-43.

32. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб: Спец. лит-ра. - 1998. - 592 с.

33. Кудрявцева JI.B., Минаев В.И., Минушкин О.Н., Васильева Н.Ю. Оценка быстрого визуального теста для скрининга хеликобактериоза // Клин. лаб. диагн: состояние и перспектива. С-Пб, 1996. - С. 95-96.

34. Кудрявцева JI. В., Щербаков П. JI., Иваников И. О., Говорун В. М. "Helicobacter pylori- инфекция: современные аспекты диагностики и терапии". // Пособие для врачей,- М.- 2004

35. Кузнецов А. С., Фолина И. Г., Тарзиманова А. И. Н. pylori свидетель или виновник? // Клиническая медицина. - 2001, №6. - с. 68-70.

36. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/ В.В.Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая и др.; Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 386с.

37. Логинов А. С., Васильев Ю. В., Сиваш Э. С., Фарбер А. В. Диагностика и лечение пенетрирующих язв желудка и двенадцатиперстной кишки. // Российский гастроэнтерологический журнал. 1996,- №3. - С. 20-29.

38. Логинов А. С., Аруин Л. И., Ильченко А. А. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии / М.-1993.-230 с.

39. Логинов А. С., Васильев Ю. В., Касьяненко В. И. Слизистая оболочка желудка и обсемененность ее хеликобактер пилори при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у подростков // Российский гастроэнтерологический журнал. -1997,- №2.- С.27-31.

40. Ломов С. Ю. Роль факторов патогенности в механизмах хеликобактерных поражений желудка. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997, №6. - С. 108-111.

41. Медицинская иммунология. / Д.К. Новиков, И.И. Генералов, Н.В. Железняк, В.К. Окулич. Витебск, 1998. - 147с.

42. Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского, О. К. Поздеева -М.: ГЭОПАР Медицина. 1999. - 1200 с.

43. Методы исследований в иммунологии. / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса М.: Мир.-1981.-485 с.

44. Методы практической биохимии. / Под ред. Б. Уильямса, К. Уилсона. — М.: Мир, 1978. —260 с, ил.

45. Пасечников В. Д., Чуков С. 3. Воспалительный и иммунный ответы слизистой оболочки желудка на инфекцию Helicobacter pylori. // Клиническая медицина. 2000, №11. - С. 50-56.

46. Пасечников В.Д. Полимеразная цепная реакция в диагностике Н pylori-ассоциированных заболеваний. // Материалы конференции «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori.".-М., 1998.-С. 8-10.

47. Проблемы диагностики Н. pylori при гастродуоденальных заболеваниях. / В.И. Минаев, Ю.В. Несвижский, А.А. Воробьёв и др. // Матер. 6-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. -Омск, 1997.-С. 10-18.

48. Ройт А, Бростофф Дж„ Мейл Д. Иммунология. М.:Мир.-2000.-590 с.

49. Сафонова Н.В., Жебрун А. Б. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз. // Санкт-Петербург, 1995, 35с.

50. Теория и практика иммуноферментного анализа /Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. М.: Высш. шк., 1991. - 288с.

51. Фишелева E.Jl. Н. pylori и злокачественная опухоль желудка. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 1996, №4. - с. 5-7.

52. Циммерман Я. С., Зинатуллин М. Р. Концепция взаимосвязи организма человеа и Helicobacter pylori. // Клиническая медицина. 1999, №2. - с 52-56.

53. Циммерман Я.С. Язвенная болезнь и проблема Н. pylori-инфекции: новые факты, размышления, предположения. // Клиническая медицина. 2001, №4. - с. 67-70.

54. Черныш В.А., Воробьев А.И., Солошенко Д.Д. Практическое руководство по иммунологическим методам исследований. М.: МТГТ. 1985. - 126с.

55. Шептулин А.А., Мурадов Н.Н. Обсуждение проблемы геликобакгерной инфекции в докладах 5-й Объединённой европейской недели гастроэнтерологии. // Клиническая медицина. 1997, №10. - с. 77-78.

56. Эльштейн Н.В. Ошибки в гастроэнтерологии. Диагностика и лечение. -Таллин.- 1991.- 189с.

57. Aim R. A, Ling L. S, Moir D.T et at. Genomic-equence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature.—1999. Vol.397.—P. 176-180

58. Alkout et al. Isolation of a cell component of H. pylori that binds human type 2 Lewis (a) and Lewis (b) antigens. // Gastroenterology. -1997, vol. 112.-p. 1179-1187.

59. Amano et al. Reactivities of Lewis antigen monoclonal antibodies with the lipopolysaccharides of H, pylori strains isolated from patients with gastroduodenal diseases in Japan. // Infection and immunity. -1997, №5, vol. 4. p.540-544.

60. Apel, I., E. Jacobs, M. Kist, and W. Bredit. 1988. Antibody responsw of patients against a 120 kDa surface protein of Campylobacter pylori. // Zentralbl. Bacterid. Hyg. 268:271-276

61. Archimandritis A. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by HpSA test. //Lancet 1999; ii:1209.

62. Blanchard T G. McGovern K.J, Younginan P et al. Gamma-glutamyl transpeptidase essential for infection of the gastric mucose by H. pylori? Gut.— 1999,—Vol. 45.—Suppl. .p. 27

63. Blaser M. Ecology of Helicobacter pylori in the human stomach— J. Clinical Investigation. —1997.—Vol. 100,—P. 759-762

64. Blaser, M. // Hypothesis: the changing relationships of Helicobacter pylori and humans: implications for health and disease. J Infect Dis, 1999. 179(6): p. 1523-30.

65. Braden B, Teuber G, Dietrich CF, et al. Stool test may defeat breath test: new faecal antigen detects Helicobacter pylori infection and eradication. // BMJ 2000;320:148.

66. Chevalier C, Thiberge J. M, Ferrero R.L, Labigne A. Essential role of Helicobacter pylori gamma-glutamyl transpeptidase for the colonization of the gastric mucosa of mice. Mol. Microbiol —1999. Vol. 31:—P.1359-1372.

67. Chey WD, Murthy U, Shaw S, et al. A comparison of three fmgerstick, whole blood antibody tests for Helicobacter pylori infection: a United States, multicenter trial. // Am J Gastroenterol 1999;94: 1512-1516.

68. Covacc A„ Falkow S., Censini S.et al. The cag pathogenicity island of Helicobacter pylori: origin, molecular biology and relevance to virulence In.:

69. Pathogenesis and Host Response in Helicobacter pylori Infectionsio Ed. By A. P. Moran C. A. O'Morain.—Galway.: National University of Irland.—1997.—P. 88-100.

70. P. Doig, T.J.Trust Identification of surface-exposed outer membrane antigens of HL pylori. // Infection and immunity. 1994, №10, vol. 62. -p. 4526-4533.

71. Drouet et al. Partial characterization of an external polysaccharide of H. pylori by using an immunoglobulin M monoclonal antibody. // Infection and immunity. 1993, №6, vol. 61.- p. 2732-2736.

72. Duodenogastric reflux before and after surgical or medical therapy for duodenal ulcer /А. Avgerinos, G. Stabropoulos, A. Yalouris et al. //Amer. J. Gastroenterol. 1990.- Vol. 85, №2.- p 150-153.

73. Faigel DO, Magaret N, Corless C, et al. Evaluation of rapid antibody tests or the diagnosis of Helicobacter pylori infection. //Am J Gastroenterol 2000; 95:72-7.

74. Fazekas de St., Groth S. Production of monoclonal antibodies: strategi and tactica. //J. immunol. Meth.- 1980/-.-Vol.35.-P. 1-21

75. Graham D. Y. Complete genomic sequence of Helicobacter pylon: implications for the clinician. Current opinion in gastroenterology .—1998.—Vol. 11.—Suppl.l.—p. S7-S8

76. Gunn M.C, Stephens J.C, Stewart J.A, et al. The significance of cagA and vacA subtypes of Heficobacter pylori in the pathogenesis of inflammation and peptic ulceration. J Clin Pathol —1998.—Vol. 51:—P.761-764.

77. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice. Academic Press Inc. (London) Ltd. - 1986. - 315 p.

78. Hasty DL, Mainardi CL. Production and preliminary characterization of monoclonal antibodies to rat plasma fibronectin. // Biochim Biophys Acta. 1982 Dec 20;709(2):318-24.

79. Hawthorne AB, Morgan S, Westmoreland D, et al. A comparison of two rapid whole-blood tests and laboratory serology, in the diagnosis of Helicobacter pylori infection. // Eur. J Gastroenterol Hepatol 1999; 11:863-865.

80. Hogenraad N.J., Wraght C.J. The effect of pristan on ascites tumor formation! and monoclonal antibody production //Methods in Enzimology. -1986.-Vol. 121. -P.375-381.

81. Holt P G. Immune and inflammatory function in cigarette smokers. // Thorax 1987;42:241-249.

82. Huer, M., J. T. R. Parr, R. E. W. Hancock. And W. J. Page. 1986. Outer membrane porin of Campylobacter jejuni. // FEMS Microbiol. Lett. 37:247250

83. Josenhans CH. and Suerbaum S. Flagella and motility of Helicobacter pylori In.: Pathogenesis and Host Response in Helicobacter pylori Infectionsio Ed. By A. P. Moran C. A. O'Morain.—Galway.: National University of Irland.— 1997.—P. 6-15

84. Kohler G., Milstien C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion //Eur. J. of Immunol. 1976. -Vol. 6.-P.511-519

85. Kostrzynska, M„ P. W. (TToole, D. E. Taylor, and T. J. Trust. Molecular characterization of a conserved 20-kilodalton membrane-associated lipoprotein antigen of H. pylori. // J. Bacterid., in press.

86. Laine L, Knigge K, Faigel D, et al. Helicobacter pylori antibody test: better than laboratory serological testing? // Am J Gastroenterol 1999; 94:3464-7.

87. Lee A. The Helicobacter pylori genkme: the bacteriologist's viewpoint. Current opinion in gastroenterology .—1998.—Vol. 11.—Suppl.l.—p. S5-S6.

88. Lee A., Megraud F. Helicobacter pylori. Techniques for clinical diagnosis and basic re-search. Saunders London. Sec. Print., 1996,- 305 p.

89. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature.- I970.-Vol. 227.P. 680-685.

90. Logan, S. M., and T. J. Trust. 1983. Molecular identification of surface protein antigens of Campylobacter jejuni. // Infect. Immun. 42:675-682

91. Loy CT, Irwig LM, Katelaris PH, et al. Do commercial serological kits for Helicobacter pylori infection diVer in accuracy? A meta-analysis. // Am J Gastroenterol 1996;91:1138-44.

92. Mai et al. Surface proteins from H. pylori exhibit chemotactic activity for human leukocytes and are present in gastric mucosa. // Journal of experimental medicine. 1992, vol. 175. - p. 517-525.

93. Makristathis A, Pasching E, Schutze K, et al. Detection of Helicobacter pylori in stool specimens by PCR and antigen enzyme immunoassay. // J. Clin Microbiol 1998;36:2772-4.

94. Manes G, Balzano A, Iaquinto G, et al. Accuracy of the stool antigen test in the diagnosis of Helicobacter pylori infection in the pre-treatment assessment and in patients on omeprazole therapy. // Aliment Pharmacol Ther 2000 (in press).

95. Morris A., Ali M.R., Brown P. et al. Campylobacter pylori infection in biopsy speciments of gastric antrum: laboratory diagnosis and examination of sampling error // J. Clin.Patol., 1989;42:727-732.

96. Negrini R., Lisato L., Zanella I et al. Helicobachter pylori infection induces antibodies cross-reacting with human gastric mucosa. //Gastroenterology 1991; 101:437-45.

97. Newell, D. G. 1987. Identification of the other membrane proteins of Campylobacter pyloridis and antigenic cross-reactivity between C. pyloridis and C. jejuni. // J. Gen. Microbiol. 133:163-170.

98. Nishizono et al. Serological assessment of the early response to eradication therapy using an immunodominant outer-membrane protein of H. pylori. // Clinical and diagnostic laboratory immunology. 1998,№6, vol. 5. -p. 856-861.

99. Molecular microbiology. 1999, №5. - p. 1537-1548.

100. Oderda G, Rapa A, Ronchi B, et al. High accuracy of the Helicobacter pylori stool antigen test for detection of the infection in children. A multicentre Italian study. // BMJ 2000;320:347-8.

101. Olbe L, Hamlet A, DalenbKck J, FKndriks. A mechanism by which Helicobacter pylori infection of the antrum contributes to the development of duodenal ulcer // Gastroenterology.- 1996.-V.110. -P. 1386-1394.

102. СГToole, P. W., J. W. Austin, and T. J. Trust. 1994. Identification and molecular characterization of a major ring-forming surface protein from the gastric pathogen H. mustelae. // Mol. Microbiol. 11:349-361.

103. Ouchterlony O. Antigen-antibody reaction on gels // Acta path microbial. Scand. -1949.-Vol.49.-P.5007-5017.

104. Poundeyr R.E., Ng D. Те prevalence of Helicobacter pylori infection in different countries //Aliment. Pharmacol. Ther. 1995. - V.9 (Suppl. 2), 3339.

105. Ransom J.H., Haspel M.V. Selection of groth factors and myelomas to enhance monoclonal antibody-producing hybridoma formation. New Jersey: Humana Press, Inc. -1987. - P. 195-208.

106. Reading C.L. Theory and methods for immunization in culture and monoclonal antibody production //J. Immunol. Meth. 1982. - Vol.53,№3. -P. 261-291.

107. Shepherd AJ, Williams CL, Doherty CP, et al. Comparison of an enzyme immunoassay for the detection of Helicobacter pylori antigens in the faeces with the urea breath test. // Arch Dis Child 2000;83:268-70.

108. Shulman, M., C. D. Wilde, and G. Kohler. 1978. A better cell line for making hibridomas secreting specific antibodies. Nature (London) 276:269270

109. Skouloubris S, Thiberge J. M, Labigne A, De Reuse H. The He/icobacter pylorii Urel protein is not involved in urease activity but is essential for bacterial survival in vivo. Infect Immun.—1998;—Vol. 66.—P.:4517-4521.

110. Suerbaum S., Chin Hur, Ch. Josenhans, P. Michetti. Pathogenesis and virulence factors of Helicobacter pylori. Current Opinion in Gastroenterology—1999 .—Vol. 15.—Suppl. 1.—P.S11-S16.

111. Sung JJY, Chung SCS, Ling TKW. Antibacterial treatment of gastric ulcers associated with Helicobacter pylori // N Engi J. Med.- 1995.V.- 332. P.-139-142.

112. Trevisani L, Sartori S, Ruina M, et al. Helicobacter pylori stool antigen test. Clinical evaluation and cost analysis of a new enzyme immunoassay. // Dig Dis Sci 1999;44:2303-6.

113. Tufano, M. A., F. Rossano, P. Catalanotti, G. Luguori, C. Capasso, M. T. Ceccarelli, and P. Marinelli. 1994. Immunobiological activities of H. pylori porins. // Infect. Immun. 62: 1392-1399.

114. Wirth H.P, Beins M. H, Yang M, et al. Experimental infection of Mongolian gerbils with wild-type and mutant Helicobacter pylori strains. Infect Immun —1998.—Vol. 66.—P.:4856-4866

115. H. pylori lipopolysaccharides characterized by reactivity with sera fromhumans with natural infection. // Infection and immunity. 2000, №1, vol.68.-p. 151-159.

116. Yokota et al. human antibody response to Helicobacter pylori lipopolysaccharide: presence of an immunodominant epitope in the polysaccharide chain of lipopolysaccharide. // Infection and immunity. -1998, №6, vol. 66. p. 3006-3011.

117. Veijola L, Myllyluoma E, Korpela R, Rautelin H. Stool antigen tests in the diagnosis of Helicobacter pylori infection before and after eradication therapy. // World J Gastroenterol. 2005 Dec 14;11(46):7340-4.

Информация о работе

Вечканов, Евгений Михайлович
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно