Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции

Махова, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции"

На правах рукописи

Махова Мария Александровна

Мол скул я рно-би о логические методы в диагностике хеликобактериой инфекции

03.00.07-микроб иология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им, академика И.Н. Блохи но« Министерства Здравоохранения Российском Федерации.

Научный руководителе.:

Кандидат биологических наук Мазепа В.Н.

Оф и цнал ы( ые он п 01 генты:

Доктор биологических наук, профессор Баспакьян И.А., Доктор биологических наук Григорьева Г.И.

Ведущее научное учреждение:

Военно-медининекая академия им. С.М. Кирова.

Защита диссертации состоится «_»_2003 г, в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Москоь-«-м научно-исследовательском институте эпидемиологии и м»!.,, ■'•.!- < им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, г. Москва, ул. Аш* 'поп.1,

Д. Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мое;.» (И

эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Комбарова (.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

В настоящее время не вызывает сомнения, что Helicobacter pylori является этиологическим фактором: 70-80% гастритов, 95% язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, 70-80% язвенной болезни желудка и 60-70% случаев рака желудка (Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П., 1993; Pretolani S., Bonvicini F., Gasbarrini G„ 1998). Международное агентство no изучению рака ВОЗ признало инфекцию Н. pylori канцерогенной для человека (Татар и нов П.А., Грацианская А.Н., 1998; Аруин Л.И., 2001). Риск развития пептической язвы в 30 раз, а рака желудка — в 3-6 раз выше у хеликобактер - положительных индивидуумов по сравнению с лицами, не инфицированными этим возбудителем (Ивашкин В.Т., 1997),

В связи с признанием роли Я. pylori в этиологии гастродуоденальных заболеваний, появились многочисленные работы по изучению //. pylori, разработке методов его индикации и ндогтификации. В настоящее время диагностика хеликобактериоза в большинстве отечественных лечебных учреждений базируется на методе выявления уреазной активности биопсийного материала слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки, морфологических и гистологических методах, основанных на микроскопии. Эти методы просты, малозатратны, но недостаточно объективны, чувствительны и специфичны, дают значительное количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Классическое бактериологическое исследование недоступно большинству клиник из-за высокой стоимости необходимых оборудования и реактивов. Из современных технологий наиболее перспективны для диагностики и изучения хеликобактериоза методы, основанные на выявлении уникальных фрагментов генома возбудителя. Наиболее доступны и приемлемы для практики среди комплекса молекул яр! ю-биологических методов различные модификации полимеразиой цепной реакции (ПЦР) (Пасечников В. Д., 1998)i^fg^j^Jf 51-04н°

фонд научной литературы

прост и универсален - по единой схеме исследуется любой клинический материал; высокочувствителен — выявляется 10-100 микробных клеток в образце; специфичен — узнавание патогена осуществляется в реакции гибридизации гомологичных ДНК; экспрессе» - исследование проводится в течение I рабочего дня. Использование метола нолимеразной ценной реакции для выявления Я. pylori позволит усовершенствовать и значительно повысить эффективность диагностики хсликобактерной инфекции, своевременно .проводить адекватную терапию.

К настоящему времени появились молекул я рно-биологи веские методы, позволяющие наряду с детекцией возбудителя изучать его свойства и проводить дифференцировку его клинических изолятов. Разработаны экспериментальные тесты для выявления генов факторов патогенности. Апробируются днфференцировочвые тесты, основанные на сравнении фрагментов генов изолятов Я. py lori с высокой гетсрогенi]остью. Существуют большие возможности использования молекулярно-биологических методов (нолимеразной цепной реакции, гетеродуплексного анализа и др.) для решения диагностических задач, связанных с эпидемиологией хеликоСактсриоза.

. .. Имеются успехи в создании приборной базы для оснащения лабораторий, использующих метод. нолимеразной цепной реакции -разработаны отечественные ДНК-амплификагоры - «Тсрцик МС-2», цифровая система обработки видеоинформации «Biotest». Данные приборы существенно дешевле и не уступают по рабочим характеристикам зарубежным аналогам.

. Таким образом, имеется насущная необходимость развития н внедрения в практическую диагностику хелнкобактерноза мол екулярно-биологических методов и появились предпосылки для решения этой проблемы.

Цель работы: усовершенствование комплекса молекул криобиологических методов детекции, внутривидового тнлирования Я, pylori, основанных на принципе нолимеразной цепной реакции, разработка полу количественного варианта нолимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальное материально-техническое обеспечение для детекции //. pylori методом полимеразной ценной реакции. Адаптировать метод к практическому применению при диагностике хеликобактериоза.

2. Изучить особенности выявления Н. pylori методом полимеразной ценной реакции в различных биологических материалах; бноптатах слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочном соке, фекалиях.

3. Провеет сравнительный анализ результатов детекции //, pylori, полученных методом полимеразной цепной реакции и традиционными микробиологическими методами диагностики хелнкобактеркоЙ инфекции.

4. Исследовать распространение Н. pylori у больных с гастродуоденальной патологией в разных возрастных группах.

5. Разработать полу кол ичесгаен ны й вариант _ полимеразной цепной реакции для детекции Н. pylori, позволяющий проводить оценку эффективности антихеликобактерной терапии.

. 6. Изучить возможность применения метода полимеразной цепной реакции для выявления факторов иатогенности И. pylori и разработать метод для типпрования его пзолятов.

Научная новизна работы:

На обширном контингенте больных с различными типами гастродуоденальной патологии установлена высокая степень ннфицированности И, pylori. Применение современных молекулярное биологических методов диапюстики позволило получить новую, объективную научную информацию о циркуляции Н. pylori.

Предложен полуколичественный вариант полимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии, с его использованием проведены исследования по контролю за проведенным лечением.

Разработан метод, основанный но гетеродунлексном анализе фрагмента гена CagA, позволяющий дифференцировать изоляты Н. pylori.

Практическое значение работы:

Предложенный комплекс молекул ярко-генетических методов выявления И. pylori является перспективным для внедрения и практическую медицину. Высокая чувствительность, специфичность, относительная простота и невысокая стоимость метода позволяет широко использовать его как при первичной -диагностике хеликобактерной инфекции, так и для оценки эффективности лечения. Использование полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогеииости И. pylori и гстеродуплексного анализа дзет возможность получить штаммовую характеристику ПЦР-изолятов возбудителя. Полученные данные могут быть использованы в системе эпид надзора за хеликобактерной инфекцией. Применение предложенного комплекса методов позволит значительно улучшить диагностику инфекции //. pylori, повысить ее эффективность, проводить своевременную терапию и сократить затраты на лечение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Алгоритм обследования пациентов с гастродуодснальной патологией, основанный на методе полимеразной цепной реакции, разработанный в данной работе, позволяет выявлять Н. pylori с минимальной иивазивностью к оценивать эффективность знтихеликобактерной терапии.

2. Метод полимеразной цепной реакции дает возможность получить более объективные данные о распространении //. pylori у больных с различными типами гастродуоденалыюй патологии по сравнению с наиболее распространенными в практике морфологическими методами выявления хели кобактера.

3. Использование молекулярно-генетнческих методов (нолимеразной цепной реакции, гетеродуплексного анализа) позволяет получать информацию о присутствии генов факторов патогенностн Н, pylori, о различиях в нуклеотидных последовательностях этих генов, осуществлять эпидемиологический мониторинг за хеликоСактсриозом.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Ш международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с //. pylori» (Москкц, 2001), 111 Российском научном форуме «Гастро-2001» (Санкт-Г 1етербург, 2001), IV Российском научном форуме с международным участием «Гзетро-2002» (Санкт- Петербург, 2002), Ш съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 4-й Всероссийской научно-I фактической конференции «Геподиатостика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), V, VI Нижегородских сессиях молодых ученых. (HL Новгород, 2000, 2001), заседании Ученого совета н межлабораторных научных конференциях Нижегородского НИИ эпидемиолога и и микробиологии им. акад. h.h. Блохиной МЗРФ.

Публикации. По теме дисссрташш опубликовано 9 печатных работ, перечень которых прилагается.

Объем ti структура работы.

Работа изложена на 140 стр. компьютерного текста. Включает 9 таблиц и 22 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих изложение материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка Л1ггературы, содержащего 59 отечественных и 115 зарубежных источников.

содержание: равоты

Материалы и методы.

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярно-генетичсских методов надзора за инфекционными заболеваниями Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. H.H. Влохиной МЗ РФ. Разработка и выполнение нолуколичественного варианта иолимеразной цепной реакции, гстсродунлекеного анализа проводились лично автором, отдельные стадии метода полимератион цепной реакции ныполнялись совместно с сотрудниками лаборатории: к.б.н. 1 Гер невской О.М., к.б.н. Мазепой В.Н., к.м.н. Бруснигиной

Н.Ф., Скобло Л.Е., Орловой К.Л. Научное консультирование по основным положениям диссертационной работы осуществлялось д.б.п., профессором Дегтевой Г. К. Консультативная помощь но совершенство на ми ¡о метода поли мераз ной цепной реакции для выявления //. pylori оказывалась Шипулнным Г.Л. (Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ).

Исследования проводились совместно с сотрудниками медицински к учреждений г. Нижнего Новгорода; к.м.н. Бокаревым A.A., к.м.к. I Терфиловой K.M. — осуществлялось ведение больных; к.б.н. Деречинской ЕЛ. и Щелоковой Е.И.- проводилось выявление И, pylori методом световой микроскопии (клиника Нижегородского НИИ эпидемиологам и микробиологии МЗ РФ), к.м.н. Катышевой A.B. (санаторий им. ВЦСПС) - осуществлялось ведение больных, забор проб желудочного сока, к.м.н. Солодухо В.И. (Нижегородский областной диагностический центр) осуществлялся забор проб биоптатов слизистой оболочки желудка, сотрудниками кафедры внутренних болезней военно-медицинского института федеральной пограничной службы при Нижегородской государственной медицинской академии д.м.н. Белоусовыи С.С. и Ахмад A.M. и кафедры общей и клинической фармакологии Нижегородской государственной медицинской академии, а также сотрудниками Нижегородского НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ, областной клинической больницы им. RH. Семашко - обеспечивался подбор больных.

Материалом для исследования служили образцы биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочный сок, копро материал от больных с гастродуоденальной патологией.

Объем исследования: В ходе работы обследовано 724 больных с гастродуоденальной патологией, проведено 1485 ПЦР-исследований с целью

• ■. I ч t •• ■1

выявления ДНК Я. pylori (исследовано 748 проб желудочного сока, 310 образцов биоптатов, 40 проб копроматериала),'130 образцов исследовано на

t'i: ■)• .-I .

наличие гена CagA - маркера острова патогенности, 50 образцов исследовано

. I •

на наличие гена вакуол из нрую utero цнтотоксина (VacA), 24 пробы проанализировано с использованием метода гетеродуплексного анализа.

Метопы исследования: Подготовка клинических проб к проведению нолимеразной ценной реакции проводили методом кинячения проб, методом хлороформно-фенол ы юй депротсннизацни, метолом неферментативного лизиса с последующей сорбцией на силикаїеле с использованием наборов реактивов для выделения ДНК из исследуемых образцов «ДНК-сорб Л» и «ДНК-сорб Б» (Центральный IІІ1М эпидемиологии МЗ РФ).

Для выявления //. pylori использовался метод полнмеразиой цепной реакции. Обнаружение //, pylori в клинических образцах проводили с помощью лраймеров к гену ІбЗрРНК (тест-система «Лм п л нСенс-Н.ру lori-520», Центральны» НИИ энндем йолопі и NO РФ, Й тест-система «Helicobacter, СП «Ниармеднк»), и прзймерами к гену UreC (тсст-снстема «Хелнкопол И», НПФ «Литех»). Для выявления гена вакуопизируюїце'го цитотоксина — VacA использовалась тест-система «Хеликопол VA>> (НПФ «Литех»); маркер «острова паїогеїшостії» - ген СацА детектировали с использованием тест-

системы «Днаге^-Helicobacter» (фирма «Jlantc»).......

Учет результатов нолимеразной цепной реакции проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле.

Для оценки вариабельности генов IßSpPHK и гена CogA Н. pylori разработан метол, базирующийся на анализе гстсродуплексоп.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась с применением программы «STATISTICA» (критерий хи-квадрат) и статистических функций программы Excel по стандартным формулам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Падбор огтти мяльного материально-технического обеспечения для детекции Н. pylori методом полимеразиой ценной реакции. Адаптация метола к проведенню практических исследований ирн дна гностике да и нон инфекции.

- В рамках этой задачи было необходимо максимально упростить, удешевить процедуру исследования, сократить время ее проведения, избежать ложных результатов при выявлении //. pylori.

1. Нами подобрано оптимальное приборное обеспечение, и частности, приборы для синтеза ДНК - амюшфикаторы «Терпи кМС2» и система для визуализации результатов «Biotest».

2. Проведено сравнение различных способов выделения ДНК из клинического материала: метода кипячения проб, метода хлороформно-фенольнон депротеинизации, метода неферм ентати в но го лизиса исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом.

Сорбентнын вариант подготовки образцов оказался наиболее удобным для практического применения. Эффективность выделения ДНК из пробы при этой форме пробоподгоговки составляет 80-90%. Его применение позволило отказаться от работы с токсичными веществами и сократить время первой стадии ПЦР в 2,5 раза по сравнению с фенольным способом выделения ДНК.

3. Освоены и адаптированы для практических исследований три экспериментальные отечественные тест-системы для выявления Н. pylori методом полимеразной цепной реакции: «Helicobacter», «Хеликонол И», «Амп лиСенс-Н.ру 1 ori-520», выявляющие консервативные последовательности генома Н. pylori, подобраны оптимальные температур но-временные режимы для проведения амплификации. В дальнейшей работе использовалась тест-система «АмшжСенс» как наиболее эффективная, чувствительная и удобная.

4. Внедрена антнконтами нацнонная защита ПЦР-исследовання для исключения ложно положительных результатов, основанная на использовании урацнл-гшIкозилазы и модифицированного уридинтрифосфата. Перед проведением электрофореза в пробу, изначально содержащую дезоксиуридинтрнфосфат вместо дезоксити м ннтрифосфата, добавляют урацил-гликозилазу, которая гликозилируя остатки урацила, делает ам или кон термочувствительным. Первое нагревание до 95 °С приводит к деградации подобного ампликона.

Выявление Н. pylori в различных' биологических субстратах; биоптатах слизпстоЛ оболочки желудка н двенадцатиперстной кишки, желудочном соке, фекалиях.

Традиционно для выявления И. pylori рекомендуется исследовать бионтаты

слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки. Однако забор этою материала — инвазнвная процедура, травмирующая пациента и требующая дорогостоящего оборудования. Кроме тою, при проведении фиброгасгроскопиин с целью последующего исследования на присутствие //. pylori рекомендуется производить забор биоцтатоа не менее, чем и 5 участках, что на практике зачастую не представляется возможным. На наш взгляд, весьма перспективным материалом для ПЦР-нсследования на И. pylori является желудочный сок.

Проведена оценка возможности использования желудочного сока как возможного материала для ПЦР-детекции Н. pylori. Для оценки эффективности выявления микроорганизма в этом субстрате были обследованы 128 пациентов с гастродуоденальной патологией. У иих анализировались образцы биогггатов слизистой желудка и пробы желудочного сока, забранные одновременно.

Были получены следующие результаты: Н. pylori выявлялся в 93 пробах бноптатов (72, 6%), и в 92 пробах желудочного сока (71,9%). В 109 случаях наблюдалось совпадение результатов ПЦР по выявлению Н. pylori в обоих субстратах. Варианты, когда в одном ю субстратов Н. pylori выявлялся, а в другом — нет (14,8% случаев), можно объяснить неудачным забором материала при фиброгастроскоп и и (биопгат взят из неколон изнрованного возбудителем участка) и ингабированием Taq-полнмеразы компонентами проб.

Из полученных результатов следует, что И. pylori выявлялся в желудочном соке практически с той же эффективностью, что и в биолтататах — 90,2% и 91,2% от числа всех положительных проб соответственно. Результаты выявления Н, pylori в образцах биоптатов и желудочного сока, полученных от одного пациента имеюг высокую степень корреляции (86%). Кроме того, следует отметить, что при работе с желудочным соком не наблюдается нсспецифического синтеза ДНК, что объясняется незначительным количеством эукариотичсской ДНК в данном субстрате.

Полученные результаты позволяют рекомендовать исследование желудочного сока как менее инвазишюго и более интегративного материала при обследопэнии пациентов на наличие И. pylori.

Наиболее доступным ма!ериалом для выявления //. pylori являются фекалии, их забор не требует дополнительного оборудования и инвазивной процедуры. В ходе работы было обследовано 40 пациентов с гэспродуоденал ьной патологией. В этой группе обследованных параллельно исследовались пробы фекалий и Сиогггаты. //. pylori выявлен в пробах биоптата у 33 пациентов н только в 12 пробах фекалий. Таким образом, эффективность выявления Н. pylori в копроматернале составляет всего 35,3% от числа всех положительных проб. Низкая выявляемость возбудителя в копроматериале объясняется невысокой концентрацией возбудителя в данном материале и ингибировапием ПЦР компонентами пробы. Отсутствие простых и доступных методов концентрации ff. pylori в фекалиях и удаления ингибиторов не позволяют рекомендовать копроматернал как информативный субстрат для детекцин.

Сопоставление результатов выявления Я. pylori, полученных традиционными методами и методом полимеразной цепном реакции.

В связи с тем, что использованные в работе тест-системы для детекции Н. pylori методом полимеразной ценной реакции являются экспериментальными, и не имеется достаточной информации об их применении и практической диагностике, нами проведено сопоставление результатов, полученных методом ПЦР с результатами традиционных методов выявления Н. pylori,

В лечебно-профилактических учреждениях г. Н. Новгорода наиболее часто для выявления Н. pylori используется цитологический метод - световая микроскопия окрашенных- по Грамму отпечатков бногггатов. Нами методом полимеразной цепной реакции исследовано на наличие хелнкббактера 107 проб бногггатов, которые параллельно анализировались ми крое копированием. Совпадение результатов этих двух методов наблюдалось в 53,3% случаев. Достаточно часто (45,8% случаев) встречались варианты, когда методом ПЦР выявлен И. pylori, а световая микроскопия давала отрицательный результат. Наличие данных вариантов вполне логично, так как метод ПЦР позволяет обнаружить И. pylori в пробах, где содержание- его невелико, и он., не определяется микроскопией. Кроме того, кокковые формы Н. pylori, выявляемые

в ПЦР, не илентифицируются как бактерии этого вида метолом световой микроскопии. Единственный случай, когда ДНК Я. pylori не была обнаружена методом ПЦР, а результат микроскопии был положителен, может быть объяснен тем, что помимо Я. pylori, на слизистой оболочке желудка встречаются другие представители сем. Campylobacter, дрожжи, имеющие форму клетки сходную с Я. pylori и могут быть идентифицированы при микроскопии как данный вид.

Проведенные исследования показали, что метод ПЦР в 2,5 раза эффективнее выявляет Я. pylori, чем метод световой микроскопии.

Совместно с сотрудниками санатория им. ВЦСПС проведено обследование 38 пациентов с гастродуодекальной патологией. Помимо ПЦР-дстекции И. pylori в желудочном соке, на базе Нижегородского областного диагностического центра проводилось микроскопическое исследование пристеночной слизи желудка методом brush-биопени. Эффективность выявления И. pylori методом ПЦР была выше и составила 83,3% от числа всех положительных проб, при использовании brush-биопсии этог показатель составил 70,8%. В. 71% случаев результаты, полученные этими методами совпадали. Несовпадение результатов (в 7 случаях ПЦР выявляла Я. pylori, brush-биопсия давала отрицательный результат; в .4 случаях ПЦР была отрицательна, а brush-биопсия - H.pylori-положительна) могут быть объяснены теми же причинами, что и несовпадение результатов ПЦР и световой микроскопии отпечатков биоптатов.

Сравнительный анализ результатов ПЦР-детекции и микроскоп и рования гистологических срезов проведен нами при параллельном обследовании 30 детей - пациентов Нижегородского НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ. Я. pylori был выявлен методом ПЦР в 33,3% исследованных 1Троб желудочного сока, в то время как в гистологических препаратах возбудитель был идентифицирован в 93,3% случаях. Столь высокий процент и н ф и иирован ности детей, полученный гистологическим методом, не соответствует данным литературы (Волков А.И., 1999; Корсунскнй А.Л., 1999; Щербаков ПЛ., 1999). Методом ПЦР было проведено исследование л а рафинизиро ванных срезов

бпоптатов слизистой желудка (3 предметных стекла) or детей с хеликобастерной инфекцией, подтвержденной гистологически. Эти пробы оказались отрицательными как после обычной процедуры выделения ДНК, что может быть обусловлено иншбированием П1Ц* парафином, так и после депарафинизацик гистологических препаратов. Применение на данном этапе исследования внутреннего контроля показало отсутствие ингибирования ПЦР.' Вероятно, гистологический метод давал ложиопо ложнтельн ые результаты.

Полученные при проведении сравнительных исследований данные свидетельствуют о субъективизме методов диагностики Я. pylori, основанных на идентификации возбудителя в образце по его морфологическим особенностям. Для успешного проведения диагностики инфекции Я. pylori методами, базирующимися на микроскопии, требуется высокая квалификация и опыт от исполнителя. Но и при этом высока вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Нами доказана диагностическая ценность метода ПЦР при выявлении Я. pylori и целесообразность его использования по сравнению с другими методами диагностики возбудителя хеликобактерной инфекции, доступными специализированным медицинским учреждениям г. Н. Новгорода: цитологическими (световая микроскопия, brush-биопсия) и гистологическими.

Вьишление Н. pylori у больных с гастродуоденалыюй патологией.

Одним из актуальных вопросов хеликобактерной инфекции* является вопрос о детской инфицнроваиности. Нами проведено обследование детей с различными типами гастродуоденальной патологией - пациентов Нижегородского НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ. Материалом для исследования на Я. pylori был выбран желудочный сок. Обследовано 285 детей в возрасте ог 8 до 17 лет. Я pylori был выявлен методом ПЦР у 168 обследованных (58,9%). Результаты согласуются сданными отечественных исследователей (Волков А.И., 1999; Корсунский A.A., 1999), которые свидетельствуют о достаточно высокой инфицированности детского населения в России (на уровне 60%). Частота выявления Н. pylori у детей разных возрастов представлена на рис. I.

; шм i еъ «

8л 9 я 10л Мл

12л 13л 14л 15л 16л 17я

üoipacT

Рис. 1. Частота выявления IL pylori у детей с гастродуоденальной патологией в разных возрастных группах. ("HP*" - выявлен //. pylori).

Высокая частота выявления возбудителя хслккобактерной инфекции у детей 8 лет (57,1%), позволяет говорить о ранней инфицированности населения нашей страны. Подобная ситуация характерна для стран с развивающейся экономикой, низким социально-экономическим уровнем, что наряду с несоблюдением санитарно-гигиенических правил приводит к ранним клиническим проявлениям хеликобактерной инфекции (Щербаков ПЛ., 1999).

Была показана следующая частота выявления И, pylori у детей при различных типах гасгродуодеизльных заболеваний: хронический гастродуоденнт — 60,3%; хронический эрозивный гастродуоденит — 45,7%; язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки - 71,6%; язва двенадцатиперстной кишки на фоне хронического гастродуоденита-51Д%.

В рамках проводимых исследований по выявлению инфекции //. pylori методом ПЦР у больных с гастродуоденальной патологией было обследовано 439 человек в возрасте от 18 до 79 лет. Н. pylori обнаружен у 364 человек (82,9%). Частота выявления Н. pylori при различных типах гастродуоденальной патологии среди взрослого населения представлена на рис. 2.

Показана высокая частота выявления Н. pylori при всех типах гастродуоденальной патологии. Особенно следует отметить практически 100% обнаружение //, pylori у больных с резекцией желудка (20 человек) и ушиванием перфоративной язвы (-16 человек), что свидетельствует о необходимости проведения своевременной антихелнкобактериой терапии.

сдба

* $ £

'¿с

■an* iik ynioi yn*m |

I I

Рис. 2. Частота, выявления H. pylori методом ПЦР при различных типах гастродуоденальной патологией среди взрослого населения.

Условные обозначении: "НР+" - выявлен Н pylori; "HP-" - не выявлен И pylori ГБА • гастрит без атрофии; ГДЕА - гастродуоденит 0<п атрофии; ГСЛ — гастрит с атрофией; ГДСА -гастродуоденит с атрофией; ЭГ — эрозивный гастрит; ЭГД - зрочивный гастродуоденот; ЯЖ-- язва желудка; ЭБ — эрозивный бульбит; РДЛ - рубцоаая деформация луковицы ДПК; ЯДПК - шва двенадцатиперстной кишки; ГКЖ- гастрит кулми желудка; УПЯДК-состояние после ушивания язвы двенадцатиперстной кишки; УПЯЖ - состояние поле уши ванн* язвы желудка.

Полученные данные о распространенности II. pylori у больных с различными типами гастродуоденальной патологии согласуются с имеющимися литературными данными (Аруин.Л.И., Григорьев ПЛ., Исаков В .Л., Якооекко Э.П., 1993; Сафонова Н.В., Жебрун А.Б., 1995; Каргальцева Н.М., 1997), что свидетельствует о специфичности использованной тест-системы.

Разработка варианта ПЦР-диагностики И pylori, позволяющего оценивать эффективность проведенной антнхелмкобактерпоЙ терапии.

Большинство методов диагностики инфекции II. pylori имеют о1раничение, связанное с невозможностью раннего контроля эффективности проведенной терапии. Для большинства методов такой контроль возможен через 4 недели после окончания лечения, для серологических методик - через 6 месяцев.

В связи с этим, адаптация метода ПЦР для объективной опенки эффективности антихеликобактерной терапии является актуальной задачей. Нами предложен полу кол ичественн ы й вариант ПЦР, позволяющий оценивать изменения степени обсемененности желудка Н. pylori до и после лечения.

Ранее проведенные исследования показали, что наиболее усредненным

интегративным субстратом для детекции //, pylori методом Г11Ц* является топшковоя порция желудочного сока. Испытание метода проведено при обследовании 46 человек, находящихся на реабилитации после ушивания перфоративной язвы желудка млн двенадцатиперстной кишки в санатории им. ВЦСПС.

Нами был апробирован вариант полимеразной цепной реакции, проводимый с разведениями ДНК, выделенной из проб желудочного сока. Н. pylori был выявлен до лечения в желудочном соке у 40 человек (78,3% больных). После лечения они были повторно обследованы. Забор желудочного сока проводился через 1-2 недели после окончания терапии. У 18 человек (45%) Н. pylori не выявлялся, у остальных 22 пациентов (55%) Н, pylori был обнаружен и после лечения. Пробы от этих пациентов (взятые до и после лечения) разводили в 10, 100, 1000 и в каждом из разведений проводили ГТЦР-детекцию Н. pylori, а затем сравнивали полученные эяектрофореграммы. При этом, в 13 случаях (32,5%) не наблюдалось изменений концентрации возбудителя в пробах, забранных до н после лечения, что свидетельствовало о необходимости продолжения лечения с использованием других схем. (Рис. 3,4).

У 9 пациентов ДНК И. pylori выявлялась во всех разведениях до лечения, а после терапии - только в исходной пробе желудочного сока наблюдалось слабое свечение специфического фрагмента. Детекция незнач!гтельных количеств специфического фрагмента может быть объяснена амплификацией остатков ДНК погибшего возбудителя. Данный результат рассматривался нами как свидетельство эффективности проведенной терапии, что в последствии было подтверждено при изучении отдаленных результатов терапии.

В тех случаях, когда у инфицированных больных после лечения //. pylori не выявлялся, либо выявлялся слабый сигнал, при проведении контрольной эздфагогастродуоденоскотш наблюдались эндоскопические и клинические улучшения: рубцевание язв, эпителизация эрозий, уменьшение активности гастродуодсннта. Прослежены отдаленные результаты лечения. В течение полутора лет больные данной группы отмечали хорошее самочувствие, не обращались за медицинской помощью.

Линия старта => -t-^-

I О"' 10'1 I О*1 W* I О1 І О"' к+ к-

до лечения после лечения

Линия старта:

исх 10' 10'г 1(Г' исх 10'1 10*! 10"1 К+ К-проба проба

до лечения после лечения

РисЗ,4. Электрофореграммы разведений ДНК Нpylori из проб желудочного сока.

У 3 больных без эффекта эрадикации Н. pylori, отказавшихся от повторного лечения, имелся рецидив язвенной болезни через 17-18 месяцев.

При анализе эффективности различных схем антихеликобактерной терапии было показано, что большинство неудач (86%) при проведении лечения связано со схемой, в которую входил метронвдаэол. Это подтверждает данные о том, что в России распространенность штаммов ff. pylori, резистентных к метронидазолу уже превысила 40% (Кудрявцева Л.В. и др., 1999; Демарева И.В., 2001).

Проведенные исследования показали, что наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и невысокой инваэивностыо (за счет исследования желудочного сока, а не биоптата) метод ПЦР является информативным при оценке эффективности противохеликобактерной терапии уже через 1-2 недели после окончания курса. Использование пояуколичественного варианта ПЦР имеет прогностическое значение при оценке эффективности проведенной аитихеликобахтерной терапии.

Исследование возможности не польз» nimmt метода молимеразной цепной реакции для выявления факторов патогекности Н. pylori.

Способность //. pylori обусловливать развитие целого ряда гастродуоденальных заболеваний связана с наличием у него комплекса факторов патоген поста. Наиболее значимыми факторами патогенности //. pylori являются: уреаза, вакуолизирующий питотоксин, белки, кодируемые островком патогенности (McGee DJ., Mobley H.L.T., 1999). Одной из задач пашей работы являлась апробация отечественных ПЦР-тест-систем, позволяющих выявлять гены факторов патогенности Я, pylori: вакуолизирующего цитотоксина VacA н гена токсигенности CagA.

Материалом для исследования служили биоптаты слизистой оболочки желудка, желудочный сок, взятый от пациентов с различными формами гастродуодсналыюй патологии. П ходе работы все пробы были предварительно исследованы на наличие Н. pylori с помощью ГЩР-тест-системы "АмплиCeHc-Helicobacter pylori-520", детектирующей фрагмент гена löSpPHK. 127 положительных проб были исследованы на наличие гена CagA* маркера острова патогенности. Ген CagA был обнаружен в 97 случаях (76,4% HP-положительных проб). В 30 пробах ген CagA не выявлен (23,6%). Пробы, имевшие слабый сигнал на электрофорефамме при исследовании на ген löSpPHK, как правило, давали отрицательный результат при использовании тест-системы на ген CagA. При использовании тест-системы на данный фактор патогенности было замечено значительное ослабление сигнала на электрофореграмме. Это связано с меньшей чувствительностью тест-системы на ген CagA по сравнению с системой, выявляющей ген 16SpPHK, поэтому в 8 случаях определить наличие или отсутствие гена CagA не удавалось из-за невысокой концентрации возбудителя. Ген CagA устойчиво выявлялся в образцах, дающих HP-положительный сигнал при использовании системы "Ам плиСенс-Н/>уЛ}м'-520" в разведениях пробы в 100, 1000 раз. В целом апробированная тест-система зарекомендовала себя удобной в работе, не давала песпецнфического синтеза и ложноположительных результатов.

При сопоставлении результатов ПЦР-детекции гена CagA с диагнозом заболевания пациентов получены данные, свидетельствующие о том, что токсигенные штаммы Я pylori, имеющие генотип «CagA+» чаще колонизируют слизистую оболочку желудка (64,3%) и ассоциированы преимущественно с заболеваниями желудка (76,4%). Большинство CagA-отрннательных вариантов И. pylori (82%) выделено от больных с поражением двенадцатиперстной кишки.

В ходе работы нами было исследовано SO Я. ду/оге-положительных проб на наличие гена VacA. Ген VacA может быть представлен несколькими аялельными вариантами двух вариабельных участков гена (s и ш). Предполагается, что генотипы штаммов Я. pylori slml и slm2 имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксииа, штаммы Н. pylori с генотипом s2m2 проявляют незначительную токсическую активность. При использовании тест-системы образование специфических фрагментов сопровождалось неспецифическим синтезом. Кроме того, многие пробы взаимодействовали не со всеми праймерами. Из 50 исследуемых проб ген VacA был выявлен в 66% исследованных образцов, полностью установлен генотип в 54,5% от числа всех VacA-положительных проб. Генотип slml был выявлен в 5 образцах; slm2 - в 9; s2m2 - в 1. В 3 случаях наблюдалось присутствие обоих аллелей участка m (генотип stml/m2). В 15 пробах синтезировался фрагмент только одного из двух вариабельных участков. Сложность и нестабильность работы тест-системы «Хеликопол VA», возникающие затруднения с интерпретацией результатов не позволяют рекомендовать ее для проведения практических исследований.

Гетеродуплексиый анализ фрагментов гена CagA И. pylori.

Для оценки вариабельности нуклеотиднои последовательности фрагмента гена CagA был использован метод гетеродуплексного анализа. Метод основан на электрофоретическом разделении денатурированных, а затем ренатурированных комплементарных цепей, имеющих единичные несовпадения нуклеотндных последовательностей. За счет* несовпадений в двойной спирали ДНК образуются петли и шпильки, что приводит к уменьшению подвижности ДНК в порах лолиакриламидного геля. Такой

частично гомологичный, фрагмент (ютеродуллекс) движется в 1еле медленнее полностью гомологичного фрагмента - шмодуплекса. •,

Первоначально нами были проанализированы все возможные комбинации для 10 НЦР-изолятов фрагментов гена CagA. В случае неполной гомологии исследуемых фрагментов при гибридизации между цепями разных изолятов образовывался гетеродуплекс (верхняя полоса а треках б и 7 электрофоре граммы. Рис. 5). В треках с гетеродуплексами присутстпуют и фрагменты гомодуплекса, образовавшиеся в результате регибрилизации между собой.цепей.фрагментов генов каждого из изолятов (нижние фрагменты в треках б и 7, Рис. 5).

1 2 3 4 5 6 7. 8 9 10 11, 12 K-b Рис. 5. Элсктрофореграмма гомодунлексов н нетероду индексов фрагментов re«aCagA //. pylori.

Высоко гомологичные фрагменты давали только одну полосу, соответствующую гомодуплексу (треки 1-5, 8-12. Рис.5.). Проведенные исследования показали, что фрагмент гена CagA одной из 10 проб (иэолят 3) имел отличия в последовательности нуклеотидов от остальных и давал гетерюдуплексы в комбинациях со всеми пробами. У 8 изолятов фрагменты гена CagA имели высокую степень гомолога и, так как в комбинациях между собой гетеро дуплексов не образовывали. Кроме того, одна проба содержала два различающихся между собой фрагмента гена CagA, поскольку при ее денатурации и ренатурации формировался гетеродуплекс. Возможно, в данном случзе пациент был инфицирован двумя штаммами Н. pylori. Проведенные исследования показали перспективность использования гена CagA как одного щ возможных маркеров при изучении шгаммового разнообразия Н. pylori.

Предложенный комплекс молскулярно-генетических методов выявления И. pylori адаптирован для практических клинических исследований. Высокая чувствительность, специфичность и неинвазивиость (при исследовании

желудочного сока) позволяет использовать его при обследовании больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии как для . первичной диагностики инфекции, так и для оценки эффективности антихеликобактерной терапии. Использование ПЦР-тест-систем на факторы патогенное™ и гетеродуплексного анализа вариабельных фрагментов гена CagA позволяет получить штаммовую характеристику ПЦР-изолктов.

Практическое внедрение.

По результатам работы подготовлено пособие для врачей «Полимеразная цепная реакция для выявления нилорического хеликобактера» (Мазепа В.Н., Бокарев A.A., Шнпулни Г.А., Щелокова Е.И., Перфилова К.М„ Дерен и некая Е.Л., Орлова К.А., Махова М.А.), утвержденное председателем Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ, академиком РАМН Покровским В.И. 28.11.2000 г., протокол №5.

Результаты, полученные с использованием предложенного комплекса методов используются в работе клиники Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной МЗ РФ, Нижегородского НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ, Нижегородской государственной медицинской академии, Областной клинической больницы и ряда других медицинских учреждений, специализирующихся на гастродуоденальной патологии.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован для практического применения комплекс молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить детекцию и дифференцировку Н. pylori за счет подбора реактивов, температурно-временных условий, материально-технического обеспечения.

2. Доказана целесообразность исследования методом полимеразной цепной реакции проб желудочного сока как информативного субстрата, не требующего инвазивной процедуры забора по сравнению с образцами биогттатов слизистой оболочки желудка.

3. Показана диагностическая ценность метода полимеразной цепной реакции при выявлении Н. pylori и его преимущества по сравнению с традиционными микробиологическими методами. Эффективность метода полимеразной цепной реакции в 2,5 раза выше, чем метода световой микроскопии.

4. Установлена высокая степень инфицирован кости Я. pylori детского (58,9%) и взрослого (82,9%) населения с различными типами гастродуоденалыюй патологии при обследовании обширного контингента больных (724 человека).

5. Показана возможность использования полуколичественного варианта полнмеразной цепной реакции для оценки эффективности проведенной антихеликобактерной терапии.

6. Установлена высокая распространенность токенгенных штаммов среди популяции Я. pylori (76,4%). Предложен метод диффереицировки изолятов Я. pylori, основанный на гетеродуплексном анализе фрагментов гена CagA.

Список работ, опубликованных по теме;

1. Белоусов С.С., Мазепа В.Н., Махова М.А., Ахмад A.M., Солодухо В.И. Определение CagA-штаммов Helicobacter pylori в желудочном соке у больных с гастродуоденальной патологией. Материалы IV Российского научного форума с международным участием «Санкт-Петербург - Гастро-2002», - Гастробюллетепь,-2002. - №2-3. - С. 44.

2. Катышева А.В., Белоусов С.С., Махова М.А., Мазепа В.Н. Значение эрадикации Helicobacter pylori при ранней реабилитации больных после ушивания перфорашвных гастродуоденальных язв. Материалы III международного симпозиума Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori». Росс. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроюгологии.- 2001. -Т. XI, №2. - С. 44-46.

3. Катышева А.В., Белоусов С.С., Махова МЛ., Мазепа В.Н. Ранняя реабилитация больных после ушивания перфоративных гастродуоденальных язв.

9-"602

Материалы Ш Российского научного форума «Гастро-2001». Гастробюллетень.-2001. - №2-3.—С. 44-46.

4. Мазепа В.Н., Бо карев А. А., Ш и пулам Г. А., Щелокова Е.И., Перфилова К.М., Деречинская E.JI., Орлова К.А., Махова М.А. Полимеразная цепная реакция для выявления пилорнческого хеликобактера. Пособие для врачей. - Н.Новгород, 2000. - 8с.

5. Мазепа В.Н., Брусннгнна Н.Ф., Черневская О.М., Орлова К.А., Скобло JIJE., Махова М.А. Опыт работы центра индикации, идентификации н таксономии Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохи ной. В сборнике «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии». — М., 2000. - С. 64.

6. Мазепа В.Н., Махова М.А. Гетеродуплексный анализ фрагментов гена CagA Helicobacter pylori, полученных из клинического материала методом ПЦР. Тезисы III съезда биохимического общества. - СПб., 2002. - С. 298.

7. Махова М.А. Совершенствование метода полнмеразной цепной реакции для выявления Н. pylori у больных с гастродуоденальной патологией. В сборнике тезисов докладов V Нижегородской сессии молодых ученых. - Н. Новгород, 2000. - С. 206.

8. Махова МЛ. Использование полнмеразной цепкой реакции для оценки эффективности проти вогели кобактерной терапии у больных с язвенной болезнью. В сборнике тезисов докладов VI Нижегородской сессии молодых ученых.-Н, Новгород, 2001.-С. 171.

9. Махова М.А., Мазепа В.Н., Орлова К.А. Апробация отечественных ППр-тест-систем для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний». — М;, — 2002, - С. 218-2^9.

Подписано в печать 23.04.03. Формат 60x84 '/16, Бумага офсетная.

Печать офсетная. У ч.-изд. л. 1,0. Тираж 80 экз. Заказ 317.

Нижегородский государственный технический университет.

Типография НГТУ. 603600, Нижний Новгород, ул. Минина, 24,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Махова, Мария Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1.1. Особенности хеликобактерной инфекции.

1.1.1 .Микробиологическая характеристика Helicobacter pylori.

1.1.2. Факторы патогенности Helicobacter pylori.

1.1.2.1. Уреаза.

1.1.2.2. Продукт гена IceA.

1.1.2.3. Вакуолизирующий цитотоксин.

1.1.2.4. Остров патогенности Helicobacter pylori.

1.1.2.5. Другие факторы патогенности.

1.2. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori.

1.3. Лабораторная диагностика хеликобактериоза.

1.3.1. Бактериологический метод.

1.3.2. Морфологическая группа методов.

1.3.3. Быстрый уреазный тест.

1.3.4. Уреазные дыхательные тесты.

1.3.5. Серологический метод.

1.3.6. Молекулярно-генетические методы.

1.3.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методики подготовки клинических проб к проведению ПЦР.

2.1.1. Подготовка клинических проб к проведению ПЦР методом кипячения.

2.1.3. Подготовка клинических проб к проведению ПЦР методом, предложенным Марковой Г.А. и соавт. (1994) - полный вариант.

2.1.4. Способы выделения ДНК из клинического материала, основанные на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом.

2.1.4.1. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб А».

2.1.4.2. Выделение ДНК с помощью набора «ДНК-сорб Б».

2.1.5. Методика выделения ДНК из парафинизированных срезов.

2.2. Проведение ПЦР-амплификации фрагмента генома Helicobacter pylori.

2.2.1. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Helicobacter».

2.2.2. Проведение ПЦР-амплификации гена 16SpPHK Helicobacter pylori с использованием тест-системы «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520».

2.2.3. Проведение ПЦР-амплификации гена UreC Helicobacter pylori с использованием тест-системы «Хеликопол II».

2.2.4. Проведение ПЦР-амплификации гена CagA Helicobacter pylori с помощью тест-системы «ДиаГен-Helicobacter».

2.2.5. Проведение ПЦР-амплификации гена VacA Helicobacter pylori с использованием набора «Хеликопол VA».

2.3. Пост-ПЦР обработка продуктов амплификации с помощью ураци л-ДНК-гл икозил азы.

2.4. Метод гетеродуплексного анализа фрагмента гена CagA Helicobacter pylori.

2.5. Методы регистрации результатов.

2.5.1. Электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле.

2.5.1.1. Приготовление агарозного геля.

2.5.1.2. Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.5.1.3. Учет результатов.

2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5.2.1. Приготовление 10% полиакриламидного геля.

2.5.2.2. Проведение электрофореза в 10% полиакриламидном геле

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Адаптация метода ПЦР для целей практической клинической диагностики хеликобактерной инфекции.

3.1.1. Подбор оптимального приборного обеспечения амплификации.

3.1.2. Выбор метода обработки клинического материала.

3.1.3. Апробация экспериментальных отечественных тест-систем для ПЦР-детекции Helicobacter pylori.

3.1.4. Антиконтаминационная защита проведения

ПЦР-детекции Helicobacter pylori.

3.1.5. Введение внутреннего контроля ПЦР.

3.2. Выявление Helicobacter pylori в различных типах биологического материала: биоптате слизистой оболочки желудка, желудочном соке, фекалиях.

3.3. Сопоставление результатов диагностики, полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами.

3.4. Выявление Helicobacter pylori у больных разных возрастных групп с различными формами гастродуоденальной патологии.

3.5. Разработка варианта ПЦР-детекции Helicobacter pylori, позволяющего оценивать эффективность проведенной антихеликобактерной терапии.

3.6. Исследование возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности Helicobacter pylori.

3.7. Исследование гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA Helicobacter pylori методом гетеродуплексного анализа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции"

Актуальность проблемы.

Открытие этиологической и патогенетической роли бактерий рода Helicobacter при гастродуоденальных заболеваниях явилось одним из важнейших достижений современной микробиологии и гастроэнтерологии. В настоящее время не вызывает сомнения, что Helicobacter pylori является этиологическим фактором 70-80% гастритов (Аруин.Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П., 1993). Этот микроорганизм обнаруживается более чем у 95% больных, страдающих язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ДПК), у 70-80% больных с язвенной болезнью желудка и в 60 - 70% случаев при раке желудка (Каргальцева Н.М., 1997; Pretolani S., Bonvicini F., Gasbarrini G., 1998). В развитых странах рак желудка стоит на четвертом месте среди причин смерти от злокачественных новообразований, а в развивающихся он прочно занимает первое место. Международное агентство по изучению рака Всемирной Организации Здравоохранения признало инфекцию Н. pylori канцерогенной для человека (Татаринов П.А., Грацианская А.Н., 1998; Аруин Л.И., 2001). Риск развития пептической язвы выше в 30 раз, а рака желудка — в 3-6 раз выше у хеликобактер-положительных индивидуумов по сравнению с лицами, не инфицированными этим возбудителем (Ивашкин В.Т., 1997).

В Российской Федерации по данным официальной статистики, ежегодно регистрируется более 1 млн. случаев заболеваний хроническими гастритами и язвенной болезнью, более 100 тыс. больных подвергается резекции желудка. Исключительно велика частота хеликобактериоза у детей — более 100 на 100 тыс. детского населения или более 10% всех заболеваний пищеварительного тракта (Сафонова Н.В., Жебрун А.Б., 1995).

В связи с осознанием роли Н. pylori в этиологии гастродуоденальных заболеваний, появились многочисленные работы по изучению Н. pylori, разработаны схемы для эрадикации Н. pylori, диагностические технологии. В настоящее время разработан целый ряд методов, позволяющих выявлять Н. pylori или последствия его персистирования в организме:

- бактериологический — основной метод лабораторной диагностики, включающий в себя выделение, идентификацию, культивирование возбудителя и определение его биологических свойств;

- биохимические методики - заключаются в обнаружении в исследуемой пробе (биоптате слизистой оболочки желудка) фермента уреазы, продуцируемого Н. pylori или в определении уровня аммиака в воздушной среде ротовой полости пациента (аэротест);

- морфологические методики - микроскопия окрашенных мазков-отпечатков биоптатов слизистой оболочки желудка (цитологический метод) или микроскопия парафинизированных срезов, окрашенных стандартными красителями (гистологический метод) или с использованием люминесцирующей сыворотки (гистоиммунохимический метод); серологические методики - наиболее часто используется иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на выявлении специфических антител, в основном класса Ig G к Н. pylori;

Современный подход к изучению инфекции Н. pylori состоит в использовании молекулярно-генетических методов исследования. Данные методы представляют собой различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР). Достоинства ПЦР обусловлены практической простотой и скоростью, чувствительностью и специфичностью данного метода. В связи с этим крайне актуально освоение и активное внедрение в работу практических медицинских учреждений методов диагностики, основанных на выявлении уникальных фрагментов генома возбудителя. Указанные методы выявления инфицированности Н. pylori являются перспективными, высокая чувствительность, специфичность и относительная простота метода позволяет его использовать в скрининге больных. Применение метода ПЦР для диагностики хеликобактерной инфекции позволит значительно повысить эффективность антихеликобактерной терапии и сократить затраты на лечение.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: усовершенствование комплекса молекулярно-биологических методов детекции, внутривидового типирования Н. pylori, основанных на принципе полимеразной цепной реакции, разработка полуколичественного варианта полимеразной цепной реакции для оценки эффективности антихеликобактерной терапии.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальное материально-техническое обеспечение для детекции Н. pylori методом полимеразной цепной реакции. Адаптировать метод к практическому применению при диагностике хеликобактериоза.

2. Изучить особенности выявления Н. pylori методом полимеразной цепной реакции в различных биологических материалах: биоптатах слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочном соке, фекалиях.

3. Провести сравнительный анализ результатов детекции Н. pylori, полученных методом полимеразной цепной реакции и традиционными микробиологическими методами диагностики хеликобактерной инфекции.

4. Исследовать распространение Н. pylori у больных с гастродуоденальной патологией в разных возрастных группах.

5. Разработать полуколичественный вариант полимеразной цепной реакции для детекции Н. pylori, позволяющий проводить оценку эффективности антихеликобактерной терапии.

6. Изучить возможность применения метода полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогенности Н. pylori и разработать метод для типирования его изолятов.

Научная новизна работы:

На обширном контингенте больных с различными типами гастродуоденальной патологии установлена высокая степень инфицированности Н. pylori. Применение современных молекулярнобиологических методов диагностики позволило получить новую, объективную научную информацию о циркуляции Н. pylori.

Разработан метод, основанный на гетеродуплексном анализе фрагмента гена CagA, позволяющий дифференцировать изоляты Н. pylori.

Практическое значение работы:

Предложенный комплекс молекулярно-генетических методов выявления Н. pylori является перспективным для внедрения в практическую медицину. Высокая чувствительность, специфичность, относительная простота и невысокая стоимость метода позволяет широко использовать его как при первичной диагностике хеликобактерной инфекции, так и для оценки эффективности лечения. Использование полимеразной цепной реакции для выявления факторов патогенности Н. pylori и гетеродуплексного анализа дает возможность получить штаммовую характеристику ПЦР-изолятов возбудителя. Полученные данные могут быть использованы в системе эпиднадзора за хеликобактерной инфекцией. Применение предложенного комплекса методов позволит значительно улучшить диагностику инфекции Н. pylori, повысить ее эффективность, проводить своевременную терапию и сократить затраты на лечение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Алгоритм обследования пациентов с гастродуоденальной патологией, основанный на методе полимеразной цепной реакции, разработанный в данной работе, позволяет выявлять Н. pylori с минимальной инвазивностью и оценивать эффективность антихеликобактерной терапии.

2. Метод полимеразной цепной реакции дает возможность получить более объективные данные о распространении Н. pylori у больных с различными типами гастродуоденальной патологии по сравнению с наиболее распространенными в практике морфологическими методами выявления хеликобактера.

3. Использование молекулярно-генетических методов (полимеразной цепной реакции, гетеродуплексного анализа) позволяет получать информацию о присутствии генов факторов патогенности Н. pylori, о различиях в нуклеотидных последовательностях этих генов, осуществлять эпидемиологический мониторинг за хеликобактериозом.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Н. pylori» (2001); III Российском научном форуме «Гастро-2001» (Санкт-Петербург, 2001); IV Российском научном форуме с международным участием «Гастро-2002» (Санкт-Петербург, 2002); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002); V, VI Нижегородских сессиях молодых ученых. (Н. Новгород, 2000, 2001); заседании Ученого совета и межлабораторных научных конференциях Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Махова, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

2. Доказана целесообразность исследования методом полимеразной цепной реакции проб желудочного сока как информативного субстрата, не требующего инвазивной процедуры забора по сравнению с образцами биоптатов слизистой оболочки желудка.

4. Установлена высокая степень инфицированности Н. pylori детского (58,9%) и взрослого (82,9%) населения с различными типами гастродуоденальной патологии при обследовании обширного контингента больных (724 человека).

5. Показана возможность использования полуколичественного варианта полимеразной цепной реакции для оценки эффективности проведенной антихеликобактерной терапии.

6. Установлена высокая распространенность токсигенных штаммов среди популяции Н. pylori (76,4%). Предложен метод дифференцировки изолятов Н. pylori, основанный на гетеродуплексном анализе фрагментов гена CagA.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время, в связи с признанием роли Н. pylori в этиологии гастродуоденальных заболеваний, разработка технологий диагностики хеликобактериоза является актуальной задачей здравоохранения. К настоящему моменту предложен целый ряд методов, позволяющий выявлять Н. pylori'. бактериологические, морфологические, биохимические, серологические. Наряду с достоинствами, каждая из перечисленных методик имеет также свои ограничения.

Перспективным направлением в изучении Н. pylori является разработка и внедрение в научные исследования и практическую медицину методов молекулярно-генетического комплекса и, в частности, ПЦР. Метод ПЦР уже нашел свое применение в диагностике целого ряда инфекционных агентов как бактериальной (хламидии, микоплазмы, представители сем. Enterobacteriacea и многие другие), так и вирусной природы (вирусные гепатиты А, В, С, D, G; вирусы сем. Herpeviridae; адено-, рото-, ретровирусы и др.). Достоинства ПЦР обусловлены практической простотой и скоростью, высокой чувствительностью и специфичностью.

В связи с этим важной задачей является освоение ПЦР и активное использование в работе практических медицинских учреждений данных, полученных с помощью методов, основанных на выявлении уникальных фрагментов генома возбудителя.

Исходя из цели данной работы, первая задача нашего исследования носила методический характер и заключалась в освоении и совершенствовании метода ПЦР для выявления возбудителя хеликобактерной инфекции и подборе оптимального варианта диагностикума на Н. pylori, используя отечественные реактивы и экспериментальные ПЦР тест-системы.

В рамках этой задачи были решены проблемы, позволяющие избежать недостоверных результатов при ПЦР-диагностике инфекционных агентов.

Нами подобрано оптимальное приборное обеспечение, в частности, приборы для синтеза ДНК - амплификаторы и система для визуализации результатов.

Среди широкого модельного ряда программируемых термостатов (амплификаторов), отечественный прибор «ТерцикМС2» показал наиболее оптимальные рабочие характеристики, что, наряду с его невысокой относительно импортных аналогов стоимостью, позволили рекомендовать его для научных и практических исследований.

Использование системы для визуализации изображения «Biotest» позволило свести к минимуму количество манипуляций с гелем, содержащим ампликоны, и упростило (по сравнению с фотографированием на пленки) процедуру фиксации результата, за счет сохранения видеоизображения геля с продуктами ПЦР в электронном виде в памяти персонального компьютера.

В ходе работы было проведено сравнение различных способов выделения ДНК из клинического материала: кипячения, фенольно-хлороформной депротеинизации, неферментативного лизиса. Наиболее технологичным был признан вариант, основанный на неферментативном лизисе исследуемого материала с последующим связыванием выделенной ДНК с сорбентом, который и был выбран нами для последующих экспериментов. Этот вариант выделения ДНК позволил увеличить эффективность выделения ДНК из пробы, отказаться от работы с токсичными веществами (фенол, хлороформ), сократить время первой стадии метода ПЦР - выделения ДНК.

Была проведена апробация и адаптация экспериментальных отечественных тест-систем, основанных на принципе ПЦР, для выявления Н. pylori, подобраны оптимальные температурно-временные режимы для проведения амплификации, концентрация компонентов реакционной смеси. Все это позволило добиться надежного синтеза специфических фрагментов и снижения, а в большинстве случаев и полного отсутствия амплификации неспецифических фрагментов.

При сравнительном исследовании отечественных ПЦР тест-систем для выявления Н. pylori, система «АмплиСенс-Helicobacter pylori-520» производства Центрального НИИ эпидемиологии была признана наиболее чувствительной и удобной в работе. Она была рекомендована нами для проведения практических исследований (Мазепа В.Н. и соавт, 2000).

Для исключения ложноположительных результатов как одной из причин ошибок при ПЦР-диагностике нами была внедрена антиконтаминационная защита проведения ПЦР-исследования, основанная на использовании урацил-ДНК-гликозилазы и модифицированного уридинтрифосфата.

Во избежание ложноотрицательных результатов - для контроля за прохождением ПЦР, на стадии пробоподготовки в образцы вносили конкурентный внутренний контроль (был использован универсальный внутренний контрольный образец для урогенитальных инфекций производства Центрального НИИ эпидемиологии).

Традиционно для диагностики инфекции Н. pylori субстратом исследования является биоптат слизистой оболочки желудка, однако высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать менее обсемененные субстраты, такие как желудочный сок и фекалии.

Нами проведена оценка возможности использования желудочного сока, а также фекалий как возможного материала для ПЦР-детекции Н. pylori. Полученные результаты позволили рекомендовать исследование желудочного сока как менее инвазивного и более интегративного материала при обследовании пациентов. Кроме того, следует отметить, что при работе с желудочным соком не наблюдается неспецифического синтеза ДНК, что объясняется незначительным количеством эукариотической ДНК в данном материале.

Хотя наиболее доступным материалом для выявления Н. pylori являются фекалии, в ходе работы нами было установлено, что эффективность выявления Н. pylori в копроматериале составляет всего 35,3% от числа всех Н. ту/оп-положительных проб. Столь низкая выявляемость возбудителя в пробах копроматериала объясняется ингибированием ПЦР компонентами непереваренной пищи. К сожалению, доступных недорогих методов, позволяющих избавиться от ингибиторов, не имеется.

В настоящее время международным «золотым стандартом» лабораторной диагностики Н. pylori является комплексное обследование, включающее три метода: бактериологический, уреазный и гистологический. Для большинства отечественных практических лечебных учреждений такой диагностический комплекс дорог и не доступен.

Поскольку использованные в работе ПЦР тест-системы для детекции Н. pylori являются экспериментальными и не имеется достаточной информации об их применении в практической диагностике нами проведено сопоставление результатов полученных методом ПЦР с результатами традиционных микробиологических методов выявления Н. pylori, доступных медицинской практике.

Проведенные исследования показали, что метод ПЦР в 2,5 раза эффективнее выявляет Н. pylori, чем метод световой микроскопии.

При сравнении результатов, полученных методом ПЦР и микроскопией пристеночной слизи (brush-биопсия) установлено, что выявляемость Н. pylori методом ПЦР выше и составила 83,3% от числа всех Н. /ту/огг-положительных проб, при исследовании пристеночной слизи желудка этот показатель составил 70,8%.

Сравнительный анализ результатов, полученных при параллельном исследовании проб методом ПЦР и гистологическим методом, показал, что гистологический метод давал ложноположительные результаты и приводил к гипердиагностике.

В целом следует отметить субъективизм, характерный для методов, основанных на идентификации возбудителя в образце по морфологическим признакам.

В ходе работы нами доказана диагностическая ценность метода ПЦР при выявлении Н. pylori и его преимущества по сравнению с другими методами диагностики возбудителя хеликобактерной инфекции, доступными специализированным медицинским учреждениям г. Нижнего Новгорода: цитологическим (световая микроскопия, brush-биопсия), гистологическим.

Полученные в ходе работы методические разработки: реактивы, материально-техническое обеспечение, рекомендуемый субстрат для исследования, а также результаты, полученные при сравнении выявления Н. pylori различными методами - позволили рекомендовать метод ПЦР для практического использования.

Такие положительные стороны этого метода как высокая чувствительность и специфичность, наряду со снижением вероятности возникновения ложных результатов позволяют получить истинную картину инфицированности Н. pylori.

Одним из вопросов, касающихся инфекции Н. pylori, является вопрос о детской инфицированности. Нами проведено обследование 285 детей в возрасте от 8 до 17 лет с различными типами гастродуоденальной патологии. Материалом для исследования на Н. pylori у детей был выбран желудочный сок. Н. pylori был выявлен методом ПЦР 58,9% случаев.

В рамках проводимых исследований по выявлению инфекции Н. pylori методом ПЦР было обследовано 439 взрослых больных с разными типами гастродуоденальной патологии. Н. pylori был выявлен в 82,9%.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени инфицированности населения г. Нижнего Новгорода, которая во многом обеспечивается за счет раннего инфицирования детей. Перечисленные данные указывают на необходимость проведения эрадикационной терапии во избежание более тяжелых последствий персистирования Н. pylori в организме, таких как прободение, кровотечение желудка, развитие злокачественных новообразований.

В связи с этим актуальна разработка методических приемов, позволяющих проводить оценку степени инфицированности и эффективности проведенной терапии. К сожалению, большинство методов диагностики инфекции Н. pylori имеют ограничение, связанное с невозможностью раннего контроля излеченности. Для большинства методов контроль излеченности возможен по истечении 4 недель после окончания терапии, а при применении серологических методик - через 6 месяцев.

Актуальной задачей лабораторной диагностики хеликобактериоза является адаптация метода ПЦР для объективной оценки эффективности антихеликобактерной терапии. Высокая чувствительность и специфичность метода ПЦР позволяет избегать ложноотрицательной диагностики, выявлять кокковые формы. Кроме того, предложенный нами полуколичественный вариант ПЦР позволяет оценивать изменения степени обсемененности до и после лечения.

Нами был апробирован полуколичественный вариант ПЦР, проводимый с разведениями ДНК (в 10, 100, 1000 раз), выделенной из пробы желудочного сока. Производился забор тощаковой порции желудочного сока как наиболее усредненного интегративного субстрата для детекции Н. pylori. Проводили сравнительный анализ электрофореграмм продуктов ПЦР полученных из разведений желудочного сока, забранного от пациентов до лечения и через 1-2 недели после завершения терапии. При этом в ряде случаев (32,5%) не наблюдалось изменений концентрации возбудителя в пробах, забранных до лечения и после, что говорит о необходимости продолжения лечения с использованием других схем.

В 22,5 % случаев ДНК Н. pylori выявлялась во всех разведениях у больных до лечения, а после терапии - только в исходной пробе желудочного сока (наблюдалось слабое свечение специфического фрагмента). Детекция незначительных количеств специфического фрагмента может быть объяснена амплификацией остатков ДНК погибшего возбудителя. Данный результат, а также отрицательный результат после лечения у исходно инфицированных больных рассматривался нами как свидетельство эффективности проведенной терапии, что подтверждено эндоскопическими и клиническими улучшениями и отдаленными результатами. В течение 1-1,5 лет больные данной группы отмечали хорошее самочувствие, не обращались за медицинской помощью. В то время как некоторые больных без эффекта эрадикации Н. pylori имели рецидив язвенной болезни.

При анализе эффективности различных схем антихеликобактерной терапии было показано, что в большинство случаев с отсутствием эрадикации (86%) после проведенного лечения связано со схемами, в которые входил метронидазол.

Результаты показывают, что наряду с высокой чувствительностью и специфичностью и невысокой инвазивностью (за счет исследования желудочного сока, а не биоптата) метод ПЦР может быть рекомендован для оценки эффективности проведенной противохеликобактерной терапии уже через 1-2 недели после окончания курса. Использование полуколичественного варианта ПЦР имеет прогностическое значение при оценке предполагаемого эффекта от проведенной антихеликобактерной терапии.

Способность Н. pylori обусловливать развитие целого ряда гастродуоденальных заболеваний связана с наличием у него комплекса факторов патогенности. Одной из задач нашей работы являлась апробация отечественных ПЦР тест-систем, позволяющих выявлять гены одних из наиболее значимых факторов патогенности Н. pylori: гена токсигенности CagA- маркера острова патогенности и вакуолизирующего цитотоксина VacA.

В ходе работы была показана высокая степень инфицированности токсигенными штаммами Н. pylori (76,4%). При сопоставлении результатов ПЦР с диагнозом заболевания обследованных установлено, что большая часть гастродуоденальных заболеваний желудка ассоциирована с токсигенными штаммами Н. pylori (63,4%), в то время как при патологии ДПК чаще выявлялись CagA-отрицательные штаммы (82% от всех CagA-положительных изолятов).

В целом, апробированная ПЦР тест-система для выявления гена CagA «Диаген-Helicobacter» производства фирмы «Лагис» (г. Москва) зарекомендовала себя удобной в работе, не давала неспецифического синтеза и ложноположительных результатов.

В ходе работы по выявлению гена вакуолизирующего цитотоксина VacA - с использованием ПЦР тест-системы «Хеликопол VA», НПФ «Литех», мы столкнулись с рядом трудностей. Первая заключалась в том, что ген VacA может быть представлен несколькими аллельными вариантами двух вариабельных участков гена (s и т). В связи с этим для установления генотипа проводится 3 ПЦР-реакции. Во-вторых, в связи с не совсем удачным дизайном праймеров наблюдалось образование неспецифических фрагментов за счет амплификации с участков ДНК человека. Кроме того, в ряде случаев наблюдался синтез только с одного из определяемых аллельных вариантов (либо с s, либо с ш).

В результате ген VacA был выявлен в 63,8% исследованных образцов, полностью установлен генотип в 43,5% от числа всех VacA-положительных проб. Но сложность и нестабильность работы тест-системы «Хеликопол VA», возникающие затруднения с интерпретацией результатов не позволяют рекомендовать ее для проведения практических исследований.

Геном Н. pylori отличается высокой гетерогенностью. Данный факт может быть основой для разработки методов дифференциации этого микроорганизма Нами для оценки вариабельности нуклеотидной последовательности фрагмента гена CagA был использован метод гетеродуплексного анализа. Метод основан на электрофоретическом разделении денатурированных, а затем ренатурированных комплементарных и частично комплементарных цепей, имеющих единичные нарушения структуры двойной спирали за счет ошибочно связанных нуклеотидов и брешей. Это приводит к уменьшению подвижности ДНК в порах полиакриламидного геля и такой частично гомологичный фрагмент носит название гетеродуплекс. Контролем подвижности является полностью гомологичный фрагмент - гомодуплекс.

Проведенные исследования показали, что фрагменты гена CagA, полученные после амплификации с использованием ПЦР тест-системы «ДиаГен-Helicobacter» отличались между собой нуклеотидной последовательностью.

Перечисленные факты указывают на перспективность гена CagA как одного из возможных маркеров при изучении штаммового разнообразия Н. pylori.

Предложенный комплекс молекулярно-генетических методов выявления Н. pylori адаптирован для практических клинических исследований. Относительная простота, высокие чувствительность и специфичность и низкая инвазивность (при исследовании желудочного сока) позволяет использовать его при обследовании больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии как для первичной диагностики инфекции, так и для оценки эффективности специфической эрадикации Н. pylori. Использование ПЦР тест-систем на факторы патогенности и гетеродуплексного анализа вариабельных фрагментов гена CagA позволяет получить информацию о штаммовых особенностях ПЦР-изолятов.

Оптимальный алгоритм обследования больных с гастродуоденальной патологией на инфицированность Н. pylori методом ПЦР включает следующие этапы:

1. Проведение анализа на присутствие Н. pylori в пробах желудочного сока при поступлении больного в стационар (препарат нуклеиновых кислот, выделенных из желудочного сока сохраняется при минус 20°С до завершения лечения);

2. В случае назначения антихеликобактерной терапии, после ее завершения проведение повторного анализа желудочного сока на наличие Н. pylori-,

3. При положительном результате в контрольном необходимо проведение полуколичественного исследования образцов желудочного сока, забранных до и после проведения терапии;

4. В случае отсутствия эффекта эрадикации (концентрация Н. pylori в желудочном соке после лечения не изменилась или уменьшилась незначительно до 10-100 раз) целесообразно повторение терапии с использованием измененной схемы. После завершения второго этапа лечения также проводится контрольный анализ на присутствие Н. pylori.

После получения положительного результата на первой стадии целесообразно проведение полуколичественного исследования на Н. pylori и выявление гена CagA. Результаты титрования и определения токсигенности следует учитывать при назначении антихеликобактерной терапии. Как правило, высокие титры возбудителя (1/100, 1/1000) и наличие гена CagA являются показанием к проведению лечения. При обнаружении хеликобактера только в неразведенном желудочном соке и в его разведении 1/10, а также при отсутствии гена токсигенности CagA и серьезных клинических проявлений вопрос о проведении эрадикации Н. pylori однозначного решения не имеет. С одной стороны, такое состояние может рассматриваться как носительство, при котором нет необходимости в проведении терапии, а с другой стороны - как начальная, бессимптомная стадия развития хеликобактерной инфекции, и в этой ситуации своевременное профилактическое лечение позволит избежать формирования тяжелой гастродуоденальной патологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Махова, Мария Александровна, Москва

1. Анчукова Э.Л. Возможности цитологической диагностики Helicobacter pylori по материалу гастробиопсий. // Клин. лаб. диагностика. 1992. -№ 11-12. - С. 66-68.

2. Аруин Л.И. Helicobacter pylori в этиологии патогенезе язвенной болезни. // Материалы 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. -Н. Новгород, 1998. С. 6-10.

3. Аруин.Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам, 1993.-С. 151-161.

4. Баранская Е.К. История открытия Helicobacter pylori. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 243-255.

5. Бухарин О.В., Кириллов В.А. О некоторых механизмах персистенции Helicobacter pylori. // Журн. микробиол. 2002. - №2. - с.89- 94.

6. Волков А.И. Хронические гастродуодениты и язвенная болезнь у детей. // Рус. Мед. Жур. 1999. - Т. 7. - № 4. - С. 4-20.

7. Говорун в.М., Гущин А.Е., Исаков В.А., Кудрявцева Л.В., Семин С.Г., Щербаков П.Л. Молекулярная диагностика и генотипирование Helicobacter pylori в биопсиях слизистой оболочки желудка. III

8. Международный симпозиум «Диагносика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori». // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2000. - № 2. - С. 12-15.

9. Ю.Грефф М. Ятрогенный путь передачи инфекции Helicobacter pylori и стерилизация эндоскопического оборудования. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Д. М.: Триада-Х, 1999. - С. 21-28.

10. П.Григорьев Т.Я., Яковенко Э.П. Диагностика и лечение органов пищеварения. М.: Медицина, 1996. - С. 19-25.

11. Домарадский И.В. Молекулярно-биологические особенности изменчивости Helicobacter pylori. // Журн. микробиол. 2002. - № 3. - С. 79-84.

12. Дубинина И.Г., Щербо С.Н. Макаров В.Б. Метод ПЦР в лабораторной практике. // Клин. лаб. диагностика.- 1997. №7.- - С. 5 - 9.16.3игангирова Н.А. ПЦР в диагностике хеликобактериозов. // Жур. микробиол. 1991. - № 11. - С. 20 - 24.

13. Ивашкин В,Т. Helicobacter pylori и язвенная болезнь.// Клиническая фармакология и терапия. 1997. - Т. 6. - № 1. - С. 34-37.

14. Ивашкин В.Т., Никитина Е.И., Степанов Е.В., Миляев в.А., Зырянов13

15. П.В. Основы лазерного С-уреазного дыхательного теста и практика клинического применения. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. -М.: Триада-Х, 1999. С. 122-130.

16. Каргальцева Н.М. Хеликобактериоз. Методическое пособие. Санкт-Петербургская академия постдипломного образования. СПб., 1997. -12 с.

17. Катышева А.В., Белоусов С.С., Махова М.А., Мазепа В.Н. Ранняя реабилитация больных после ушивания перфоративных гастродуоденальных язв. // Материалы III Российского научного форума «Гастро-2001». Гастробюллетень.- 2001. - №2-3. - С. 44-46.

18. Кишкун А. А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori. // Клин. лаб. диагностика. 2002. - № 8. - С.41-46.

19. Кононов А.В. и др. Экспрессия тканевых антигенов и лимфопролиферативный ответ при хеликобактер-ассоциированныхзаболеваниях желудка. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1997. - Т. VII. - №5. Прил. - С. 30-31.

20. Кононов А.В. Местный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori. И Материалы 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Н. Новгород, 1998. - С. 14-19.

21. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Хинтинская М.С., Катаева JI.A., Спирина Г.В., Кириллов М.Ю., Шобухова Т.С., Волкова Р.А., Постникова Т.М., Современные методы диагностики Helicobacter pylori у детей. // Пособие для врачей. М., 2000. - 19 с.

22. Корсунский А.А. Инфекция Helicobacter pylori в педиатрической практике. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 224-242.

23. Кудрявцева Л.В. Опыт изучения антибиотикорезистентных российских штаммов Helicobacter pylori. // Материалы 7-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Н. Новгород, 1998. - С. 11-14.

24. Лапина Т.Л. Основные принципы диагностики Helicobacter pylori. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л.-М., 1999.-С. 107-116.

25. Логинов А.С., Аруин Л.И., Ильченко А.А. Язвенная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогенетической терапии. М., 1993. -С. 9-25.

26. Мазепа В.Н., Бокарев А.А., Шипулин Г.А., Щелокова Е.И., Перфилова К.М., Деречинская Е.Л., Орлова К.А., Махова М.А. Полимеразная цепная реакция для выявления пилорического хеликобактера. Пособие для врачей. Н. Новгород, 2000. - 8с.

27. Мазепа В.Н., Махова М.А. Гетеродуплексный анализ фрагментов гена CagA Helicobacter pylori, полученных из клинического материала методом ПЦР. Тезисы III съезда биохимического общества. СПб., 2002. - С. 298.

28. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженериию Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - С. 175-179.

29. Маркова Г.А., Бошнаков Р.Х., Петров П.К., Кацаров К.В., Гинцбург A.JL Применение ПЦР для идентификации Helicobacter pylori в клиническом материале. // Молек. генетика, микробиол и вирусол. 1994. - № 1. - С. 10-15.

30. Махова М.А. Использование полимеразной цепной реакции для оценки эффективности противогеликобактерной терапии у больных с язвенной болезнью. // Сб. тезисов докладов VI Нижегородской сессии молодых ученых. Н. Новгород, 2001. - С. 171.

31. Махова М.А. Совершенствование метода полимеразной цепной реакции для выявления Helicobacter pylori у больных с гастродуоденальной патологией. // Сб. тезисов докладов V Нижегородской сессии молодых ученых. Н. Новгород, 2000. - С. 206.

32. Мельникова В.А., Арзуманян Н.О. Helicobacter pylori при желудочно-кишечных заболеваниях и у здоровых лиц. // Журн. микробиол. 2000. -№6.-С. 108-112.

33. Морозов И.А. Морфологическая диагностика хронического гастрита и инфекции Helicobacter pylori в желудке. // Материалы 7-й сессии

34. Российской группы по изучению Helicobacter pylori. Н. Новгород, 1998.-С. 19-21.

35. Морозов И.А. Проблемы морфологической диагностики Helicobacter pylori. // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 117121.

36. Морозов И.А. Цитологическая диагностика инфекции Helicobacter pylori в желудке. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2000. -№2.-С. 7-10.

37. Нурмухаметова Е. Быстрый анализ крови на Helicobacter pylori. // Рус. Мед. журн. 1997. -Т.5. - № 18.-22-23.

38. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита. М.: Мир, 1997. - С. 46, 65.

39. Пасечников В. Д. Полимеразная цепная реакция в диагностике Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний. // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori. Сб. научных статей. М., 1998. - С. 8-10.

40. Пасечников В.Д., Чуков С.З. Значение геномной гетерогенности штаммов Helicobacter pylori в развитии ассоцированной патологии гастродуоденальной зоны. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2000. - № 3. - С. 7-11.

41. Пахарес-Гарсия Х.М. Уреазный дыхательный тест с мочевиной 11меченной С. Испанский опыт. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. -М.: Триада-Х, 1999.-С. 122-130.

42. Покровский В.В., Шипулин Г.А., Безруков В.М., Бектимиров Т.А., Блоха В.В., Куличенко А.Н. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях использующих метод ПЦР. М., 1995. -10 с.

43. Рекомендации по лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых при язвенной болезни желудка и ДПК. // Росс, журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998. - Т. 8. - № 1. - С. 82-83.

44. Рожавин М.А., Сологуб В.В., Микитюк И.Б. Диагностическое значение различных методов выявления Helicobacter pylori у больных с гастродуоденальной патологией. // Клин. мед. -1989. № 8. - С. 38-43.

45. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. // Анализ генома. Методы. Под. ред Дейвиса К. М.: Мир, 1990. - С. 176190.

46. Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактероз. СПб., 1995. - 40 с.

47. Серебрянская М.В. Прогностическая значимость выявления Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью. // Клин. Мед. 1994. - № 6. - С. 4042.

48. Спесивцев В.Н. Диагностические возможности иммунологического метода выявления Helicobacter pylori. // Клин. мед. 1992. - № 11-12. - С. 55-57.

49. Татаринов П.А., Грацианская А.Н. Helicobacter pylori: роль в арзвитии патологии желудочно-кишечного тракта, методы диагностики, подходы к лечению. // Педиатрия. 1998. - №2. - С. 92-97.

50. Чайка Н.А., Блейзер М. Дж., Буцлер Ж.-П., Бейер Т.В., Масловская Г.Я., Рыбальченко О.В., Сафонова Н.В., Стрелкова М.Р., Хазенсон Л.Б., Гуссенс Г., Ванг В. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1988. С. 115135.

51. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов. // Сб.: Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. Херрингтона С., Макги Дж. М.: Мир,1999.-С. 404-406.

52. Щербаков П.Л. Эпидемиология инфекции Helicobacter pylori. // Сб. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999. - С. 14-20.

53. Allaker R. P., Young K. A., Hardie J. M., Domizio P., Meadows N. J. Prevalence of helicobacter pylori at oral and gastrointestinal sites in children: evidence for possible oral-to-oral transmission. // J. Med. Microbiol.- 2002.-Vol. 51. №4.- P.312-317.

54. Andreson H., Loivukene K., Sillakivi Т., Maaroos H. I., Ustav M., Peetsalu A., Mikelsaar M. Association of cagA and vacA genotypes of Helicobacter pylori with gastric diseases in Estonia. // J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol.40. -№1.- P.298-300.

55. Ashton-Key M., Diss Т. C., Isaacson P. G. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy and resection specimens. // J. Clin. Pathol.- 1996.- Vol. 49. -№2.-P. 107-111.

56. Aspinall G., Moran A. Unique structural and biological features oh Helicobacter pylori lipopolisacharides. //Prog. Clin. Biol. 1998. - Vol. 397. -P. 37-49.

57. Atherton J.C. Non-endoscopic test in the diagnosis of Helicobacter pylori. // Aliment. Parmacol. Ther. 1997. - Vol. 11.- Suppl. 1. - P. 11-20.

58. Atherton J.C., Peek R.M. Jr., Tham K.T. Clinical and pathological importance of heterogenecity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori. // Gastroenterology. 1997. - Vol. 112. - P. 92-99.

59. Bauerfeind P., Garner R., Dunn B.E., Mobley H.L.T. Syntesis and activity of Helicobacter pylori urease and catalase at low pH. // Gut. 1997. - Vol. 40. -P. 25-30.

60. Blaser M. Helicobacter pylori: Cost of commensalisms. // 6-th United Europian Gastroenterology Week. 1997. - Abstract-on-disk.

61. Carmona Т., Minoz E., Del Mar Abad M. usefulness of antral brushing samples stained with Diff-Quik in the cytologic diagnosis of Helicobacter pylori. A coparative methodologic study. // Acta Cytol. 1995. - Vol. 39. -P. 669-672.

62. Catrenich C.E., Makin K.M. Characterization of the morthologic conversion of Helicobacter pylori from bacillary to coccoid forms. // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 26. - Suppl. 181. - P. 58-64.

63. Cellini L., Allocati N., Angelucci D., Iezzi N., Di-Camply E., Marzio L. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice. // Micribiol. Immunol. 1995. - Vol. 38. - P. 833-850.

64. Chan W.Y., Hui P.K., Leung K.M., Chow J., Kwok F., Ng C.-S. Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach. // Am. J. Clin . Pathol. -1994.-Vol. 102.-P. 503-507.

65. Chisholm S. A., Teare E. L., Patel В., Owen R. J. Determination of Helicobacter pylori vacA allelic types by single-step multiplex PCR. // Lett. Appl. Microbiol.- 2002.- Vol. 35. №1.- P.42-46.

66. Ciesielska U., Jagoda E., Marciniak Z. Value of PCR technique in detection of Helicobacter pylori in paraffin-embedded material. // Folia Histochem.Cytobiol.- 2002.- Vol.40, №2.- P.129-130.

67. Clayton C., Kleanthous K., Tabaqchali S. Detection and identification of Helicobacter pylori by the polymerase chain reaction. // J.Clin.Pathol.- 1991.-Vol. 44. №6.- P.515-516.

68. Cohen H., Laine L. Endoscopic methods for the diagnosis of Helicobacter pylori. // Aliment. Parmacol. Ther. 1997. - Vol. 11,- Suppl. 1. - P. 3-9.

69. Covacci A., Rappuoli R. Tirozine-phosphorylated bacterial proteins: Trojan horses for the host cell. // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 191. - P. 587-592.

70. Cover T.L., Blaser M.J. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori. // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 10570-10575.

71. Cover T.L., Dooley C.P., Blaser M.J. Characterization of and human serologic response to protein in Helicobacter pylori broth culture supernatants with vacuolizing cytotoxin activity. // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 603-610.

72. Crabtree J., Kersulyte D., Li S.D. Modulation of Helicobacter pylori-induced interleukin-8 sinthesis in gastric epilethelial cell mediated by cag PAI encoded VirD4 homologue. // J. Clin. Pathol. 1999. - Vol. 52. - P. 653657.

73. Dunn B.E., Vakil N.B., Schneider B.G., Miller M.M., Zitler J.B., Peutz Т., Phadnis S.H. Localization of Helicobacter pylori urease and heat shock protein in human gastric biopsies. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 65. - P. 1181-1188.

74. Eaton K.A. Animals models of Helicobacter gastritis. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 123-154.

75. Eaton K.A., Brooks C.L., Morgan D.R., Krakowska S. Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 2470-2475.

76. Eaton K.A., Catrenich C.E., Makin K.M., Krakowska S. Virulence of coccoid and bacillary forms of Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. // J. Infect. Dis.- 1995.-Vol. 171.-P. 459-462.

77. Farrell D. J. New developments in PCR-based diagnosis. Report of a session at the 11th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. // Expert. Rev.Mol. Diagn.- 2001,- Vol. 1 №1.- P.9-10.

78. Figura N. Helicobacter pylori exotoxins and gastroduodenal diseases associated with cytotoxic strain infection. // Aliment. Parmacol. Ther. 1996. -Vol. 10. - Suppl. 1.-79-96.

79. Fontham E.M., Ruiz В., Perez A. et al. Determinants of Helicobacter pylori infection and chronic gastritis. // Am. J. Gastroenterol. 1995. - Vol. 90. -№7.-P. 1094-1101.

80. Harris P. R., Mobley H. L., Perez-Perez G. I., Blaser M. J., Smith P. D. Helicobacter pylori urease is a potent stimulus of mononuclear phagocyte activation and inflammatory cytokine production. // Gastroenterology.-1996.- Vol. 111. -№2.-P.419-425.

81. Hulter K., Han S.W., Enroth H., Klein P.D., Opekun A.R., Gilman R.H., Evans D.G., Engstrand L., Graham D.Y., Elzaatari F. Helicobacter pylori in drinking water in Peru. // Gastroenterology. 1996. - Vol. 110. - P. 1031-1035.

82. Jeisong H., Megraud F. Evidence of the viability of non culturable coccoidal form of Helicobacter felis. // Gut. 1995. - Vol. 37. - Supll. 1. -P. 376.

83. Kabir S. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture, PCR and enzyme immunoassay. // J. Med. Microbiol.- 2001.- Vol. 50. №12.- P.1021-1029.

84. Kalantar J., Eslik G.D., Taller N.J. Chronic gastritis and nonulcer dyspepsia. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 31-46.

85. Keates S., Keates A.C., Varny M. Differential activation of mitogen-activated protein kinases in AGS gastric epithelial cells by cag+ and cag-Helicobacter pylori. // J. Immunol. 1999. - Vol. 163. - P. 5552-5559.

86. Kelly S.M., Pitcher M.C.L., Farmery S.M., Gibson G.R. Isolation of Helicobacter pylori from feces of patients with dyspepsia in the United Kingdom. // Gastroenterology. 1994. - Vol. 107. - P. 1671-1674.

87. Kolk H., Maaroos H. Do dyspeptic patients under the age of 45 need to be investigated. // 6-th United Europian Gastroenterology Week. 1997. -Abstract-on-disk.

88. Kusters J.G., Gerrits M.M., Van Strijp J.A., Vandenbroucke-Grauls C.M. Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell death. // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 36723679.

89. Li C., Musich P. R., На Т., Ferguson D. A. Jr., Patel N. R., Chi D. S., Thomas E. High prevalence of Helicobacter pylori in saliva demonstrated by a novel PCR assay. // J. Clin. Pathol.- 1995.- Vol. 48. №7.- P.662-666.

90. Lin Т. Т., Yeh С. Т., Wu С. S., Liaw Y. F. Detection and partial sequence analysis of Helicobacter pylori DNA in the bile samples. // Dig. Dis. Sci.- 1995,- Vol. 40. №10.- P.2214-2219.

91. Ling T.K.W., Cheng A.F.B., Sung J.J.Y. An increase in Helicobacter pylori strains resistant to metronidazole: a five-year study. // Helicobacter. -1996.-Vol. l.-P. 57-61.

92. Lingwood C.A., Wasfy G., Han H., Huesca M. Receptor affinity purification of a lipid-binding adhesin from Helicobacter pylori. // Infect. Immunol. 1993. - Vol. 61. - P. 2474-2478.

93. Maeda S., Yoshida H., Ogura K., Kanai F., Shiratori Y., Omata M. Helicobacter pylori specific nested PCR assay for the detection of 23 S rRNA mutation associated with clarithromycin resistance. // Gut.- 1998.- Vol. 43. -№3.-P.317-321.

94. Malaty H.M. Graham D.Y. Importance of childhood socioeconomic status on the current prevalence of Helicobacter pylori infection. // Gut.-1994.-Vol. 35.-P. 742-745.

95. Malaty H.M., Engstrand L., Pedersen N.L., Graham D.Y. Helicobacter pylori infection genetic and environmental influences. // Ann. Intern. Med. -1994. Vol. 120. - P. 982-986.

96. Mapstone N. P., Lynch D. A., Lewis F. A., Axon А. Т., Tompkins D. S., Dixon M. F., Quirke P. PCR identification of Helicobacter pylori in faeces from gastritis patients. //Lancet.- 1993b.- Vol. 341. №8842.- P.447.

97. Marais A., Monteiro L., Megraud F. Microbiology of Helicobacter pylori. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 103122.

98. Marshall В.J., Barret L.J., Prakash C., McCallum R.W., Guetrant R.L. Urea protects Helicobacter pylori from the bactericidal effect of acid. // Gastroenterology. 1990. - Vol. 99. - P. 687-702.

99. McGee D.J., Mobley H.T.L. Mechanisms of Helicobacter pylori infection: bacterial factor. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999.-P. 156-180.

100. Megraud F. How should Helicobacter pylori infection be diagnosed? // Gastroenterology. 1997. - Vol. 113. - Suppl. - P. 93-98.

101. Megraud F., Hirschl A.M. Diagnosis. // In: Helicobacter pylori: An Atlas.-1998.-P. 10-15.

102. Mitchell H.M. The epidemiology of Helicobacter pylori. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 11-30.

103. Mobley H. The role of Helicobacter pylori urease in the pathogenesis jf gastritis and peptic ulceration. // Aliment. Parmacol. Ther. 1996. - Vol. 10. -Suppl. l.-P. 57-64.

104. Monteiro L., Gras N., Vidal R., Cabrita J., Megraud F. Detection of Helicobacter pylori DNA in human feces by PCR: DNA stability and removal of inhibitors. // J. Microbiol. Methods.- 2001.- Vol. 45. №2.- P.89-94.

105. Moran A.P. Patogenic properties of Helicobacter pylori. // Scand. J. Gastroenterol. 1996. - Vol. 31. - Suppl. 215. - P. 22-31.

106. Moran A.P. The role of lipopolysaccharide in Helicobacter pylori pathogenesis. // Aliment. Parmacol. Ther. 1996. - Vol. 10. - Suppl. 1. - P. 39-50.

107. Moran A.P. Valkonen K., Wadstroom T. Identification of the lectin-like laminin-binding protein of Helicobacter pylori. // Gut. 1995. - Vol. 37. - Supll. l.-P. 1.

108. Morgan D.D., Clayton C., Kleanthous H. Molecular fingerprinting of Helicobacter pylori: an evaluation of methods. // In: Basic clinical aspects of Helicobacter pylori infection. Ed. by Gasbarini G., Pretolani S. Berlin: Springer, 1994. - P. 206-212.

109. Nguyen V.Q., Caprioli R.M., Cover T.L. Carboxy-terminal proteolitic processing of Helicobacter pylori vacuolating toxin. // Infect. Immun. 2001. -Vol. 69.-P. 543-546.

110. Nielsen P., Anderson L.P. Activation of human phagocytic oxidative metabolism by Helicobacter pylori. // Gastroenterology. 1992. - Vol. 103. -P. 1747- 1753.

111. Ning Leel, Kiu-kwong Chuo et al. The seroprevalence of Helicobacter pylori in expectant mothers and their newborns. // Helicobacter pylori: beginning the second decade. Houston, 1994. - Abstract-on-disk.

112. Nishiya D., Shimoyama Т., Fukuda S., Yoshimura Т., Tanaka M., Munakata A. Evaluation of the clinical relevance of the iceAl gene in patients with Helicobacter pylori infection in Japan. // Scand.J.Gastroenterol.-2000.- Vol. 35. №1.- P.36-39.

113. Nogueira C., Figueiredo C., Carneiro F. Helicobacter pylori genotypes may determine gastic histopathology. // Am. J. Pathol. 2001. - Vol. 158. -P. 647-654.

114. Odenbreit S., Puis J., Sedlmaier B. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cell by type IV secretion. // Science. 2000. -Vol. 287.-P. 1497-1500.

115. Osaki Т., Taguchi H., Yamaguchi H., Kamiya S. Detection of Helicobacter pylori in fecal samples of gnotobiotic mice infected with H. pylori by an immunomagnetic-bead separation technique. // J. Clin. Microbiol.- 1998.- Vol. 36. №1.- P.321-323.

116. Pai R., Sasaki E., Tarnawski A.S. Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin (VacA) alters cytoskeleton-associated proteins and interferes with re-epitheliazation of wounded gastric epithelial monolayers. // Cell Biol. Int. -2000.-Vol. 24.-P. 291-301.

117. Pelicic V., Reyrat J.M., Sartori L. Helicobacter pylori VacA cytotoxin associated with the bacteria increases epithelial permeability independently of its vacuolating activity. // Microbiology. -1999. Vol. 145. - P. 2043-2050.

118. Pretolani S., Bonvicini F., Gasbarrini G. Epidemiology. // In: Helicobacter pylori: An Atlas. 1998. - P. 4-9.

119. Quina M. Historical perspective. // In: Helicobacter pylori: An Atlas-1998.-P. 1-3.

120. Roosendaal R., Kuipers E. J., van den Brule A. J., Pena A. S., Meuwissen S. G., Walboomers J. M., de Graaff J. Detection of Helicobacter pylori DNA by PCR in gastrointestinal equipment. // Lancet.- 1993.- Vol. 341.-№8849.- P.900.

121. Ruzsovics A., Molnar В., Unger Z., Tulassay Z., Pronai L. Determination of Helicobacter pylori cagA, vacA genotypes with real-time PCR melting curve analysis. // J. Physiol. Paris.- 2001.- Vol. 95. №1-6.-P.369-377.

122. Segal E., Cha J., lo J. Altered states: involvement of phosphorilated CagA in the induction of host cellular growth changes by Helicobacter pylori. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 14559-14564.

123. Shimada Т., Ohtsuka Y., Endoh M., Yoshiura K., Yoneda M., Hiraishi H., Terano A. Diagnosis of H. pylori infection by PCR. // Nippon Rinsho.-2001.- Vol. 59. №2,- P.280-285.

124. Stein M., Rappuoli R., Covacci A. Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter pylori CagA antigen after cag-driven host cell translocation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 1263-1268.

125. Szab I., Brutsche S., Tombola F. Formation of anion -selective chanal in the cell plasma membrane by the cytotoxin VacA Helicobacter pylori is required for its biological activity. // Embo. J. 1999. - Vol. 18. - P. 55175527.

126. Tomas J.E., Gibson G.R., Darboe M.K., Dale A., Weaver L.T. Isolation of Helicobacter pylori from human faeces. // Lancet. 1992. - Vol. 340.-P. 1194-1195.

127. Tytgat G.N.J. Endoscopic transmission of Helicobacter pylori. // Aliment. Pharmacol. Ther. 1995. - Vol. 9. - Suppl. 2. - P. 105-110.

128. Veldhuyzen van Zanten S.J.O., Lee A. The role of Helicobacter pylori infection in duodenal and gastric ulcer. // In: Gastroduodenal diseases and Helicobacter pylori. Ed. by Westblom T.U., Czinn S.J., Nedrud J.G. Berlin: Springer, 1999. - P. 47-56.

129. Wadstroom Т., Hirmo S., Boren T. Biochemical aspects of Helicobacter pylori colonization of the human gastric mucosa. // Aliment. Pharmacol. Ther. 1996.- Vol. 10. - Suppl. 1. - P. 17-28.

130. Warren J., Marshall B. Unindentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. // Lancet.- 1983.- Vol. 1. P 12731275.

131. Westblom T. U., Phadnis S., Yang P., Czinn S. J. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by means of a polymerase chain reaction assay for gastric juice aspirates. // Clin. Infect. Dis.- 1993.- Vol. 16. №3.- P.367-371.

132. Yamaoka Y., Kodama Т., Kita M., Imanishi J., Kashima K., Graham D. Y. Relationship of vacA genotypes of Helicobacter pylori to cagA status, cytotoxin production, and clinical outcome. // Helicobacter.- 1998.- Vol. 3. -№4.- P.241-253.

Информация о работе

Махова, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-биологические методы в диагностике хеликобактерной инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы