Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов очистки белков адсорбционной хроматографией на ионообменниках на примере пероксидазы хрена и лизостафина

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов очистки белков адсорбционной хроматографией на ионообменниках на примере пероксидазы хрена и лизостафина"

На правах рукописи

Смотров Олег Игоревич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА ИОНООБМЕННИКАХ НА ПРИМЕРЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА И ЛИЗОСТАФИНА

03.02.03 - микробиология 03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР Ш

Оболенск- 2012

005020543

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научные руководители:

чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич;

д-р биол. наук Суровцев Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

Козлов Леонид Васильевич, д-р биол. наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ, руководитель группы.

Игнатов Сергей Георгиевич, д-р биол. наук, Федеральное бюджетное учреждение пауки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», заведующий лабораторией.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН», г. Пущино

Защита состоится «26» апреля 2012 г. в 13 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении иауки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослаш*?^» марта 2012 г. Учёный секретарь диссертационного а>вета

кандидат биологических наук^ _ Фурсова Надеяода Константиновна

Обшая характеристика работы Актуальность проблемы:

До середины 1950-х гг. практически единственным широко применяемым методом очистки белков оставалось дробное осаждение сульфатом аммония. Однако к концу 1950-х гг. количество исследований, посвященных разработке новых методов очистки протеинов, значительно возросло. Были опубликованы данные по очистке белков на целлюлозных ионо-обмешшках - КМ- и ДЭАЗ-цсллюлозах, введены новые постели - сефадексы и сефарозы. К началу 1990-х годов был разработан целый ряд тонких методов очистки белков (аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, металлохелатная и хроматография на триази-новых красителях, гель-фильтрация и др.). Эти методы очистки были основаны на различиях белковых характеристик: разности молекулярных масс, растворимости, температурной и рН-устойчивости, зарядов при различных значениях рН, адсорбции на гидроксилапатите, сродству к субстратам, ингибиторам, триазиновым красителям и др. Однако существенным ограничением многих из этих методов является невозможность их использования в условиях большого количества балластных примесей - клеток продуцента, их фрагментов, протеаз, содержащихся в культуральной жидкости. Это приводит к необходимости введения дополнительных этапов очистки. Еще одним ограничением для широкого применения ряда хрома-тографических методов является их высокая специфичность. В частности, использование аффинной хроматографии обеспечивает высокую чистоту фермента, ингибитор которого иммобилизован на носителе. Но, с другой стороны, поскольку химическое строение ингибиторов различно, то для отдельно взятого фермента нужно разрабатывать свою отдельную методику иммобилизации ингибиторов.

Универсальным принципом связывания белка является его адсорбция на сорбенте, основанная на силах Ван-дер-Ваальса. Однако, среди сил слабого взаимодействия, действующих в водном растворе, адсорбция является наиболее слабой. Поэтому разработать сорбент, использующий данный принцип, весьма сложно, и к моменту начала работы был разработан только один метод, использующий адсорбционное связывание - хроматография на гидроксилапатите. Однако применение гидрокеилапатита ограничено тем, что этот сорбент требует сложного процесса подготовки и не подлежит регенерации. Кроме того, его использование возможно только на последней стадии очистки после удаления большинства балластных соединений.

Поэтому целью нашего исследования была разработка метода очистки белков, лишенного перечисленных выше ограничений, в достаточной степени универсатыюго, масштаби-

руемого и позволяющего получить белки высокой степени чистоты уже на первых стадиях применения.

Основной задачей нашего исследования была иллюстрация работоспособности и универсальности метода на модельных белках, имеющих важное промышленное значение, но в настоящее время получаемых трудоемкими способами. В качестве одного их таких ферментов была выбрана пероксидаза хрена. Этот белок широко используется в биохимических и иммунологических исследованиях и представляет интерес как препарат дня лечения лепры и карциномы. Однако выход его ограничивается 0,5-1 г из 100 кг корневищ хрена, и цена достигает нескольких тысяч долларов за 1 г.

Другим модельным ферментом был выбран лизостафин. Определяющим критерием выбора стала его способность к лизису клеточной стенки стафилококков. Он был выделен из культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus (Schindler, Schuchardt, 1964) и, как было показано, лизировал клетки стафилококковых штаммов, в том числе анти-биотикорезистентных. Лизис бактериальной клетки обусловлен тем, что лизостафин является глициназой и гидролизует пентаглициновые мостики, которые входят в состав клеточной стенки любого (в том числе - резистентного к антибиотикам) стафилококка. На этом основании данный фермент был отнесен к факторам межмикробного антагонизма, обеспечивающим подавление роста других видов стафилококков.

В настоящее время борьба с инфекциями, вызываемыми штаммами антибиотикорези-стентных бактерий является актуальной проблемой медицины. Бактерии рода Staphylococcus занимают в этом ряду одно из главных мест. Так, в США ежегодно фиксируется -500 000 случаев заболеваний, вызываемых стафилококками, из которых около 100 000 случаев были вызваны антибиотикорезистентными штаммами. Таким образом, на сегодняшний день представляется важной задача поиска новых лекарственных средств, альтернативных антибиотикам, а также необходимость разработки новых эффективных подходов к лечению стафилококковых инфекций. В этом свете возможность применения лизостафина в клинической и ветеринарной практике выглядит перспективной, тем более что показания для лечения некоторых инфекций, вызываемых стафилококками, уже встречались в лотературе. (Braraley, Foster, 1990).

Описанные методы выделения лизостафина не пригодны для наработки препаративных и промышленных количеств препарата, поскольку существующие методы включают, как правило, очистку в три-четыре этапа; выращивание штамма-продуцента осуществляется на дорогих или малодоступных питательных средах (Iversen, Grov, 1973); в целом процесс оказывается экономически высокозатратным.

Таким образом, в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих фермент лизостафин, и работа в данном направлении является актуальной и перспективной для медицины, ветеринарии и биотехнологии. Поэтому заключительным этапом нашей работы явилось изучение очищенного с помощью разработанного нами метода лизостафина, позволяющее получить важную информацию о его физико-химических и биологических свойствах.

Цель исследования - Разработать адсорбционные хроматографические методы очистки белков па ионообменниках, использовать их для препаративной очистки лизостафина и нероксидазы хрена, изучить некоторые физико-химические и биологические свойства очищенного лизостафина.

Задачи исследования:

1. Разработать методы препаративной адсорбционной хроматографии белков на целлюлозных (КМ-ДЭАЭ-целлюлозах) и кремниевых (силохром С-80) ионообменниках.

2. Использовать эти методы для получения препаративных количеств лизостафина и пероксидазы хрена.

3. Подобрать оптимальные условия культивирования штамма 51. ¡¡гтйат Ыоуаг НарИуМуНсш - продуцента лизостафина.

4. Разработать кинстико-термодинамический метод определения ионогенных групп, входящих в каталитический центр макромолекулы лизостафина.

5. Показать возможность использования полученного препарата лизостафина для лечения стафилококковых инфекций у домашних я сельскохозяйственных животных.

Научная новизна:

1. Впервые разработан метод адсорбционной хроматографии белков на ионообменниках, применение которого позволяет существенно сократить количество этапов очистки.

2. Впервые предложен кинетико-термодинамический метод для определения ионогенных групп активного центра ферментов, катализирующих гидролиз поверхностных структур клеточной стенки бактерий (лизостафин, лизоцим).

Практическая значимость и внедрение результатов:

1. Разработан новый способ получения лизостафина на основе адсорбционного метода очистки, защищенный патентом на изобретение РФ: №2342431.

2. Предложенный метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках может использоваться для очистки препаративных количеств других белков.

3. Предложены эффективные схемы применения лизостафина для лечения стафилококковых инфекций домашних животных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках позволяет получать препаративные количества высокоочшценных препаратов лизостафина и пероксидазы хрена.

2. Разработка условий культивирования штамма-продуцента лизостафина S. simulons позволяет обеспечить высокий выход целевого продукта.

3. Метод кинетико-термодинамического анализа позволяет определять ионогенные группы активного центра ферментов без использования рентгеноструктурного анализа.

4. Препарат лизостафина, полученный из культуральной жидкости S. simulons методом адсорбционной хроматографии на силохроме, эффективен против стафилококковых инфекций у животных.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на двух научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Оболенск, 2009 г. и 2010 г.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 6 научных публикациях, включая 3 статьи в реферируемых научных журналах и 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 30 работ отечественных и 95 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 6 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы штаммы Staphylococcus simulans biovar staphylolylicus №1030, Staphylococcus aureus FDA 209P №4441 и Micrococcus lysodeicticus №4405, полученные из ГКПМ ГНЦ ПМБ.

Микробиологические методы. Для культивирования S. aureus использовали агар, приготовленный на основе панкреатического гидролизата рыбокостной муки. Для культивирования S. simulans №1030 использовали жидкие и плотные питательные среды на основе панкреатического гидролизата рыбокостной муки, пептона, панкреатического гидролизата казеина, панкреатического гидролизата мяса, панкреатического гидролизата крови (Оболенск, Россия). Культивирование на жидких питательных средах проводили в качалочных колбах при скорости 200 об/мин при температуре 37 °С в течение 16 ч. Штамм S. simulans для получения биомассы культивировали на жидкой питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбокостной муки при температуре 34 °С в биореакторе «Magnaferm Fermentor» (New Brunswick Scientific, США). Для проведения кинетико-термодинамических исследований штамм М. lysodeicticus культивировали на плотной питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбокостной муки и высушивали в сублимационной камере «Genesis» (Virtis, США). Определение гемолитической активности проводили на чашках-Петри с 5 %-ным кровяным агаром.

Биохимические методы. В качестве сорбентов использовали силохром С-80 с размером пор 520 А (Ставропольский завод люминофоров и красителей, Россия); ДЭАЭ-целлюлозу и КМ-целлюлозу (Fluka, США). В работах по получению белков использовали хроматографическую систему Monitor UVis-920 (GE healthcare, США). Определение концентрации белка проводили методом Bradford (1976) или Lowry (1951). Измерение активности пероксидазы проводили по описанному методу (Worthington, 1978). Определение активности лизостафина проводили методом Шиндлера-Шухардта (Schindler, Schuhardt, 1964). Кинетические эксперименты проводили с использованием суспензии бактериальных клеток при исследуемых температурах в термостатируемой кювете спектрофотометра Ultraspec 2000 (Amersham-Biosciences, Швеция).

Биологические методы. Опыты по использованию лизостафина для лечения животных проводили в ЗАО «Сельские зори» Воронежской области и в ветеринарных клиниках ООО «Лесси» и ООО «Сэнди» г. Москвы. В качестве объектов лечения использовали собак (группа из 20 животных) со стафилококковым отитом и коров (группа из 17 животных) со стафилококковым маститом.

Результаты исследований

Первоначальным этапом наших исследований была разработка простого, экономичного и в достаточной степени универсального метода, пригодного для масштабирования.

В водном растворе действуют различные силы слабого взаимодействия, на основе которых можно проводить связывание белка с сорбентом: ионное, гидрофобное и адсорбционное. Хотя в воде ионное взаимодействие весьма слабо (в 80 раз меньше, чем в вакууме), но оно обратно пропорционально квадрату расстояния между зарядами, тогда как силы Ван-дер-Ваальса, от которых и зависит главным образом величина адсорбции, обратно пропорциональны расстоянию в шестой степени, то есть силы Ван-дер-Ваальса в водном растворе значительно слабее электростатических сил. Адсорбционное связывание также значительно слабее гидрофобного. Но адсорбция - самопроизвольное увеличение концентрации белка на сорбенте - общее явление и поэтому ее мы попытались использовать для очистки белков, надеясь, что число таких белков может быть велико. Для этого необходимо создать условия, чтобы адсорбция являлась определяющей для связывания белка с сорбентом.

Что касается сорбента, то, во-первых, он должен быть таким, чтобы эффективная очистка могла быть проведена уже на первой или на одной из первых стадий, например, из куль-туральной жидкости. Во-вторых, процесс можно бы было масштабировать, для чего сорбент должен обладать, прежде всего, хорошими проточными характеристиками. В-третьих, адсорбированный целевой белок можно было бы легко удалять с колонки в условиях, когда балластные белки либо удалялись раньше, либо оставались на колонке, либо двигались по ней, но со скоростью отличной от скорости движения целевого белка Кроме того, сорбент должен обладать химической устойчивостью, и его можно было бы использовать многократно. Поэтому в качестве сорбентов были выбраны очень слабый (в нейтральных условиях) ка-тионит силохром и слабые ионообменники КМ- и ДЭАЭ-целлюлозы.

Использование для адсорбционной хроматографии силохрома основано на следующем. Изоэлектрическая точка кремнеземных сорбентов лежит в пределах рН 2,5 - 3,0, а значение рК~9,0. При рН=7, как следует из уравнения Хендерсона-Хассельбаха

где НА - сопряженная кислота, А" - сопряженное основание; например ^ЮН^^Ю' +Н*), это очень слабые катионообменники, и для сорбции белков ионные связи не могут быть определяющими в нейтральной области. Многие кислые белки (с р1<7) связываются на кремнеземных сорбентах при нейтральных значениях рН и не десорбируются из колонки при значениях рН>р1 вплоть до рН=8,0. Из этого же уравнения следует, что при повышении рН концентрация зарядов на поверхности силохрома растет, то есть сила его, как ионообменни-

ка, увеличивается и белки, имеющие низкое значение изоточки будут удаляться с поверхности этого ионообменника. 1 {аиболее удерживаемыми будут белки с самым высоким значением изоточки, которые выйдут в последнюю очередь и, таким образом, будут очищены от балластных белков.

11а рис. 1 показана хроматограмма очистки лизостафнна (р!-9,5) на силохроме. Пик «Б» показывает элюцию балластных белков, имеющих величину рК<9 при действии глицинового буфера с рН-9,0. Пик «В» - выход лизостафина при действии глицинового буфера рП 10,0.

Рисунок 1 - Хроматограмма очистки лизостафина на силохроме

Как видно из результатов, представленных в табл. 1, выход целевого продукта составляет 71 % со специфической активностью по расщеплению стафилококка 1535 ед/мг белка. Чистота белка определялась методом электрофореза (рис. 2).

97 кДа ■ V1'.

В

А-посадка материала Б-элюция балластных белков (рН-9,0) В-элюция лизостафина (рН-10,0)

ее

45«!

ЭО*

Рисунок 2 - 808-РАСЕ электрофореграмма лизостафина

Таблица 1 - Результаты очистки лизостафина*.

Стадия очистки Объем, л Активность, ед/мл Концентрация белка, мг/мп Удельная активность, ед/мг Выход, /о

Культур алъная жидкость 10 5,5 0,08 64,4 100

Элюат 0,5 75 од 1535 71

* Приведены данные одного го пяти репрезентативных экспериментов.

КМ- и ДЭАЭ-целлюлозы - более сильные ионообменники, чем силохром, и при нейтральных значениях рН белки могут удерживаться на них благодаря ионному взаимодействию. Для того чтобы была возможна очистка белка адсорбционной хроматографией, необходимо, чтобы на нужный белок не действовали электростатические силы. Это может быть в случае, если адсорбент-ионообменник уравновешивается буфером с рН, соответствующим р1 нужного бежа. Тогда, в зависимости от заряда, часть балластных белков останется на колонке, часть будет быстро двигаться вниз, за счет одинакового заряда сорбента и белка, а целевой белок будет адсорбироваться на каждой частице носителя и десорбироваться, если компоненты буфера будут конкурировать с ним за адсорбент. Лишь балластные белки, имеющие значения р1, близкие к р1 данного белка (в пределах нескольких десятых единиц рН), могут двигаться по принципу адсорбции-десорбции и снижать тем самым степень очистки. Таким образом, необходимым условием успешного использования этого метода адсорбционной хроматографии является отсутствие подобных балластных белков, присутствие их в минорных количествах или удаление на предыдущих или последующих стадиях, а также хорошая растворимость белка в области р1 (некоторые белки, например люцифераза, практически нерастворимы в этой области).

Элюирукяций буфер должен обеспечить десорбцию адсорбируемого белка, а также движение части балластных белков (остальные удерживаются вследствие ионного обмена), причем скорость движения этого белка вниз по колонке должна быть меньше скорости балластных белков. Такие условия выполняются при использовании буфера, кислая часть которого либо состоит из одноосновной алифатической или сульфоновой кислот (ЫСООН, МОзН), либо заряжена по типу Радикалы (незаряженные части) компонентов буфера

обеспечивают конкуренцию с адсорбируемым на целлюлозе белком и его десорбцию, а ионы буфера, находящиеся на поверхности макромолекулы, заряд которой противоположен заряду ионообменника, связывают контрионы (соответственно СГ или Ыа*), обеспечивая тем самым ионный обмен балластных белков.

Дня доказательства возможности эффективного использования этого метода была очищена пероксидаза хрена, широко применяемая в биохимии и биотехнологии. Пероксидаза -

фермент, имеющий р1 7,2 (вернее несколько изоферментов с близкими значениями р1) и молекулярную массу 40 кДа. Ранее фермент был очищен (высокоочшценной считается перок-сидаза с Ю£~3,1) методами, среди которых один ш основных - ионообменная хроматография. Она, однако, не может обеспечить требуемую чистоту, и потому этот процесс является многостадийным. Так, описано получение пероксидазы из низкоочшценного препарата (Яг~0,2) ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах и гель-фильтрацией на сефадексе 0-100. Из 1 г препарата получено 50 мг высокоочшценной пероксидазы (Березин и др., 1975).

Результаты очистки пероксидазы адсорбционной хроматографией на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозах из такого же начального материала даны в табл. 2. Выход пероксидазы при адсорбционном методе повышается в два раза, возможно вести работу с большим количеством белка без использования дополнительных стадий. Время очистки составляет примерно 2 ч, тогда как при ионообменной хроматографии - несколько суток. Кроме того, пероксидаза была очищена тем же методом из сока хрена после предварительного осаждения белка сульфатом аммония. Из 100 кг корневищ было получено 3,5 г очищенного фермента (Яг 3,35), тогда как в ранее опубликованной работе (Рини патент Венгрии №172872, 1990) из того же количества сырья получали 0,6 г фермента с 2,7.

Таблица 2 - Очистка пероксидазы адсорбционной хроматографией

Стадия очистки Степень очистки от балластных белков, % Количество белка, г Удельная активность, ед/мг Выход, %

Исходный препарат 13,3 148 100 ■

Адсорбционная хроматография на ДЭАЭЦ 86 1,85 979 92

Адсорбционная хроматография на КМЦ 88 1,58 1050 84

"Приведены данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

Таким образом получили высокоочшценный фермент со средним значением RZ 3,35 и специфической активностью 1000-1100 ед/мг (субстрат 4-аминоантипирин). Этот фермент соответствует типу 12 (наиболее очищенному препарату) пероксидазы производства фирмы Sigma (рис. 3).

Пероксидаза

ЗОкДа

Рисунок 3 - SDS-PAGE электрофореграмма пероксидазы хрена

Одной из основных задач было определение оптимальных условий культивирования штамма-продуцента лизостафина S. simulons biovar staphylolyticus №1030, которые бы обеспечивали повышенный выход целевого продукта. Поэтому на первом этапе исследований было проведено сравнение ростовых свойств питательных сред, используемых для выращивания S. simulons. В качестве основ питательных сред для промышленного выделения мы использовали следующие ферментативные гидролизаты:

- панкреатический гидролизат рыбокостной муки - ПГРМ;

- панкреатический гидролизат казеина - ПГК;

- панкреатический гидролизат мяса - ПГМ;

- панкреатический гидролизат крови - ПГКр;

- пептон.

На основе этих гидролизатов готовили питательные среды с содержанием аминного азота 0,15%. Культивирование проводили в качалочных колбах при скорости 200 об/мин при температуре 37 °С в течение 16 часов. Результаты испытаний различных гидролизатов в трех независимых экспериментах при культивировании S. simulons представлены в табл. 3.

Таблица 3 - Испытание различных гидролизатов при культивировании S. simulons на колбах

Питатель- № Максимальная Литическая Средняя

ная среда опыта оптическая активность, литическая

плотность, 540 нм ед/мл активность, ед/мл

ПГРМ 1 6,9 5,0

2 6,8 7,7 7,6 + 1,5

3 7,7 9,2

ПГКр 1 1,9 0,3

2 2,2 0,4 0,37±0,1

3 2,4 0,4

ПГМ 1 3,6 5,8

2 5,7 7,9 7,3 ±1,1

3 5,4 8,2

ПГК 1 4,8 8,4

2 5,0 8,7 8,2+1,4

3 4,0 7,5

Пептон 1 1,0 3,1

2 1,0 2,8 3,0 ±0,5

3 1,6 3,2

В результате экспериментов было показано, что наилучшими ростовыми свойствами обладают среды, приготовленные на основе панкреатического гидролизата казеина, рыбного и мясного гидролизатов. Образование лизостафина происходило при росте стафилококка на всех испытанных средах, но активность целевого продукта существенно отличалась. Из трех вышеназванных сред среда на основе ПГРМ является наиболее дешевой и доступной, поэтому ее использование экономически оправдано.

Следующим этапом исследований было определение оптимальных условий культивирования штамма-продуцента S. simulons №1030, при которых наблюдается максимальная ли-тическая активность культуральной жидкости (время культивирования, рН питательной среды и концентрация питательных веществ). Культивирование проводили на жидкой среде, на основе ПГРМ в качалочных колбах при скорости 200 об/мин при температуре 37 °С в течение 16 ч. Для оценки влияния кислотности питательной среды на рост штамма-продуцента и синтез лизостафина, культивирование проводили при различных значениях рН. Результаты исследований представлены на рис. 4, 5.

«реш.ч

Рисунок 4 - Динамика роста Л". вти1апв в процессе культивирования при различных рН

время, ч

Рисунок 5 - Динамика ферментативной активности лизостафина (ед/мл) в процессе культивирования X. ътиЫт при различных рН

Было показано, что наилучшая секреция лизостафина наблюдалась при значениях рН культуральной жидкости 7,5 и времени культивирования 12 ч. При сравнении динамики роста S. simulons с изменением литической активности культуральной жидкости видно, что оптическая плотность культуры в процессе роста коррелировала с активностью лизостафина. Показатель литической активности супернатанта достигал максимума в фазе замедления роста бактериальной культуры.

Другим важным фактором, определяющим процесс роста культуры, является концентрация питательных веществ в культуральной среде, интегральным параметром которого может служить содержание аминного азота. Чтобы выявить влияние этого параметра, было проведено культивирование S. simulons в среде на основе ПГРМ, содержащей различное количество аминного азота. Оценку результатов определяли по двум показателям: литической активности и удельной литической активности, рассчитываемой как литическая активность в расчете на 0,1 % аминного азота. Результаты экспериментов представлены на рис. 6.

0.1 0,15 0,2 0,25 0.3 0.35 0,4 Концентрация аминного аюп. % максимальное значение литичесгай активности > дглъная лкжчсская ак-жвность

Рисунок 6 - Зависимость стафилолитнчеекой активности культуры 5. лшш/с/и.< 1030 от концентрации аминного азота в питательной среде. Приведены данные одного из пяти репрезентативных экспериментов.

Логическая активность культуральной жидкости зависела от содержания аминного азота в питательной среде - увеличение концентрации аминного азота приводило к повышению литической активности. Однако эта зависимость не была линейной: двукратное повышение аминного азота не приводило к двукратному повышению литической активности. Таким образом, из графика видно, что максимальная удельная литическая активность наблюдалась при концентрации аминного азота 0,03 %. Это наиболее «экономичная» точка, где расход питательных веществ на получение единицы литической активности лизостафина в процессе культивирования минимален. Однако следует иметь в виду, что использование низких «экономичных» концентраций аминного азота существенно увеличивает объем культуральной жидкости, поэтому реально целесообразная концентрация питательных веществ в среде определяется возможностями применяемого оборудования.

В качестве источника углерода и энергии в опытах на колбах использовали глюкозу. Однако на биореакторе было показано, что однократное введение глюкозы часто приводит к хорошему росту культуры, но к низкой активности фермента. Лучшие результаты были достигнуты при дробном введении глюкозы, причём общее количество её было ниже, чем при однократном введении. Эти результаты объясняются тем, что при добавлении небольшого количества глюкозы она используется как источник углерода и энергии, а при дальнейшем добавлении действует как ингибитор синтеза лизостафина. Поэтому в дальнейшем в качестве источника углерода и энергии использовали глицерин, в концентрации такой же, как и при однократном введении глюкозы без каких-либо последствий для уровня активности при выращивании как на колбах, так и в биореакторе.

Известно, что культивирование бактерий в биореакторе осложняется таким процессом как пенообразование. Одним из распространенных методов уменьшения ценообразования

при культивировании микроорганизмов является добавление в культуральную среду пенога-сителей. Наиболее часто в качестве пеногасителей используются гидрофобные вещества -растительные масла - образующие в водной среде отдельную фазу, на границе которой действуют значительные силы межфазового натяжения, вызывающие необратимую денатурацию белка. По этой причине добавление масла может приводить к резкому снижению выхода целевого продукта. Поэтому одной из задач успешного масштабирования процесса культивирования является поиск «нетравмирующего» фермент пеногасителя. В качестве альтернативы масляным пеногасителям мы использовали технический пеногаситель «Пента 465», относящийся к классу кремнийорганических соединений. Результаты сравнения свойств кукурузного масла и пеногасителя «Пента 465» представлены в табл. 4.

Таблица 4 - Влияние добавок пеногасителей на ферментативную активность лизо-стафина при культивировании »У. яти1аю

Пеногаситель Без добавки пеногасителя Кукурузное масло Пента 465

0,1% 1,5% 0,01% 0,15%

средняя ферм, активность, ед/мл 6,5+1,5 2+0,5 1,5+0,4 6+1 5,5±1,5

% от исходной активности 100 31 23 92 85

Как видно из таблицы, применение кукурузного масла приводит к трех- четырехкратному снижению литической активности культуральной жидкости в результате значительной денатурации лизосгафина. В то же время после применения «Пента 465» выход целевого продукта составлял не менее 85 % от исходного, то есть денатурация лизостафина была не более 15%. Таким образом, эксперименты показали высокую эффективность пеногасителя «Пента 465» при отсутствии значительного инактивирующего воздействия на лизостафин.

Таким образом, были определены оптимальные условия культивирования штамма £ и'тиЬтз 1030 в биореакторе. Было показано, что при культивировании культуры в питательной среде на основе ПГРМ, содержащей 0,03 % аминного азота в течение 12 ч происходит максимальное накопление лизостафина в супернатанте, а применение пеногасителя «Пента 465» обеспечивает высокую эффективность пеногашения и незначительную денатурацию целевого фермента.

Следующей задачей данной работы было изучение физико-химических свойств фермента лизостафина. Ранее было установлено, что это Ъг?*- содержащая глицилглициновая пептидаза, обладающая также эластазпой активностью. Интересно, что фермент катализирует также реакцию транспептидации глициновых пептидов с образованием имино-, а не ацил-ферментов, как в подавляющем большинстве случаев.

(Gly)3+E 25 (Gly)2+E-NH-Gly;

RCONH-(G!y),+E-NH Gly S RCONH (G!y)3 + E.

Однако для установления механизма ферментативной реакции необходимо знать, какие группы входят в состав каталитического центра. До начала нашей работы эти группы были неизвестны. Для их определения при использовании клеточно иммобилизованного субстрата нами предложен кинетико-термодинамический метод. Суть его заключается в том, что определяются значения рК групп каталитического центра при двух различных температурах, а также величина ДН„он, получаемая из уравнения Вант-Гоффа:

г,тыркат{г2

шио» -----—

Тг~Т\

Хотя на значение ДНИ0„ и рК групп влияют соседние аминокислотные остатки, тем не менее, отличия от этих величин, даваемых для свободных аминокислот, таковы, что, учитывая и другие данные по белку (первичную структуру, данные по химической модификации различных остатков и др.), можно точно определить принад7ежность того или иного остатка к каталитическому центру. Но для ферментов, осуществляющих лизис клеток, существует дополнительная трудность, связанная с тем, что все кинетические и равновесные константы относятся к растворимому субстрату, тогда как в опыте мы определяем только лизис клеток. Поэтому было показано, что определяемые из лизиса константы пропорциональны константам для истинного (пентаглициновых мостиков) значения. Кроме того оказалось, что величина ДНИ011 указывает на одни остатки, а величины рК - на другие. Для определения истинных остатков мы обратились к другому ферменту, лизирующему клетки - лизоциму, который катализирует гидролиз чередующегося сополимера NAG-NAM (N-ацетилглюкозамин - N-ацетилмурамовая кислота). По данным ре.птеноструктурного анализа, в активный центр этого фермента входят остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот со значениями рК 4,0 и 6,0 в случае низкомолекулярных субстратов и незаряженного полимерного субстрата - хитина Однако в случае лизиса клеток Ы. lysodeicticus эти значения оказались равными 5,0 и 9,2. Такое повышение значений рК (особенно в случае рКь) до нашей работы было неясным.

Нам удалось показать, что такое несоответствие между значениями рК для клеточного и остальных субстратов объясняется сильным отрицательным зарядом клеток, возникающим из-за наличия N-ацетилмурамовой кислоты. Концентрация ионов водорода у поверхности клетки в результате оказывается выше, чем в растворе, значение рН которого фиксирует рН-метр и создается неравновесная концентрация ионов водорода между клеткой и объемным раствором. В результате кривая рН-зависимости в случае М. lysodeicticus сдвигается в щелочную область и фиксируется не истинное, а кажущееся значение рК (рис. 7).

Рисунок 7 - Зависимость логарифма константы скорости второго порядка лизиса стафилококков под действием лизостафина от рН

Однако величина ДрК, определяемая из двух значений температуры, оказалась такой, что для лизоцима можно однозначно определить наличие в актином центре двух кислых аминокислотных остатков, относящихся либо к аспарагиновой, либо к глутаминовой кислоте. Дополнительные данные по свойствам фермента могут их однозначно дифференцировать.

Поэтому для клеточных субстратов (в случае сильного заряда клетки) определение групп, входящих в состав активного центра, следует делать по величине ДН„0„. А в случае низкомолекулярных или полимерных незаряженных субстратов по величине ДН„он и рК.

В дальнейшем определение ионогенных групп активного центра фермента с использованием уравнения Вант-Гоффа было проведено для лизостафина. Идентифицированными группами оказались карбоксильная и имидазол гистидина. Кроме того, используя данные по Яп2<-содержащим ферментам удалось показать, что карбоксильная группа принадлежит остатку глутаминовой кислоты, а используя данные по эластазной активности показали, что этот остаток находится в пятом положении. Опубликованные рентгеноструктурные данные полностью подтвердили эти результаты.

Заключительным этапом наших исследований была оценка биологических свойств лизостафина как потенциального терапевтического агента при лечении стафилококкозов.

Ранее было показано, что добавление 10 мкг лизостафина к 1 мл инфицированного золотистым стафилококком молока через 30 мин снижает количество жизнеспособных клеток на 5-6 порядков. Ясно выраженным был также стафилолитический эффект in vivo. Однократное введение в молочную железу лактирующих мышей 10 мкг лизостафина сразу после ин-трамаммарного инфицирования клетками S. aureus в дозе 108 КОЕ/мышь позволило снизить

бактериальную обсеменеиность пораженных тканей на 2-3 порядка (Bramley, Foster, 1990). В данной работе количество фермеша было выражено не в единицах специфической активности, а в весовых единицах малоочищенного фермента, поэтому трудно установить эффективность его действия. Тем не менее, полученные данные указывают на то, что лизостафин обладает стафилолитическими свойствами.

В настоящей работе мы использовали очищенный лизостафин для лечения стафилокок-козов у домашних (собаки) и сельскохозяйственных (коровы) животных. Группе из 20 собак с диагнозом стафилококковый отит трижды в течение трех дней вводили очищенный лизостафин в дозе 3-5 ед/кг веса животного. Период наблюдения составил семь дней. Явное улучшение у всех животных наблюдалось уже на второй день после первого введения препарата: регистрировалось уменьшение гнойного выделения из ушной раковины, уменьшение болезненности, значительное снижение покраснения ушной раковины. Окончательное выздоровление этих животных наблюдали на 3-4 день после начала применения лизостафина. У пяти животных, владельцы которых ранее проводили лечение антибиотиками и мазями, положительный эффект проявлялся позже, и выздоровление наступало на 7-8 день лечения. Таким образом, все животные были излечены. Побочное действие лизостафина или повышенная чувствительность к нему ни в одном случае не были выявлены. Следует отметить, что отсутствие побочных эффектов позволяет применять лизостафин для животных всех возрастных групп и в любом физическом состоянии.

Опытной группе коров (17 животных), страдающим стафилококковым маститом, препарат вводили трехкратно с периодичностью день-день-через день. Период наблюдения составил 14 дней. Через неделю после последнего введения происходило уменьшение отека вымени и исчезновение гнойных выделений. Полное выздоровление наблюдалось через две недели после окончания курса лечения. Бактериологический контроль молока проводился трехкратно: перед началом лечения, на следующий день после последнего введения препарата и через две недели уже у клинически здоровых животных. У всех животных после лечения кленки S. aureus в молоке отсутствовали. Побочные явления не отмечались. Следует отметить, что у одной коровы в молоке были обнаружены стрептококки и диагноз был изменен на стрептококковый мастит. Это еще раз указывает на узкую специфичность лизостафина, который расщепляет только клетки стафилококков.

Таким образом, в результате наших исследований были разработаны адсорбционные методы очистки лизостафина и других промыщленно важных белков, с помощью этих методов получен очищенный препарат лизостафина, изучены некоторые его физико-химические свойства и оценен терапевтический эффект применения лизостафина при лечении стафилококковых инфекций домашних животных.

Выводы.

1. Разработан адсорбционный метод выделения белков на силохроме, с помощью которого получен высокоактивный (1535 ед/'мг) препарат лизостафина. Метод может быть использован для масштабирования процесса очистки.

2. Разработан адсорбционный метод выделения белков на КМЦ и ДЭАЭЦ, позволяющий получать высокоочшценную пероксидазу хрена с 3,35-3,40. Метод применим для масштабного получения фермента.

3. Оптимизированы условия культивирования штамма-продуцента 5. $ти1ат Ьюуаг наркуЫуИсия. Подобрана экономически выгодная среда на основе ПГРМ. Определено значение рН, концентрации аминного азота и времени культивирования, позволяющие получать лизостафин с активностью до 6 ед'мл. Предложено при культивировании использовать глицерин в качестве источника углерода и силиконовый пеногаситель Пента-465, не оказывающий денатурирующего действия на целевой белок.

4. Разработан кинетико-термодинамический метод определения ионогенпых групп каталитического центра ферментов, который позволяет идентифицировать их без использования рентгеноструктурного анализа. Этим методом получены данные о каталитически активных группах активного центра, входящих в состав макромолекул лизостафина и лизоцима.

5. Показана возможность использования полученного разработанными методами высо-коочищенного нативного препарата лизостафина для лечения стафилококковых заболеваний у домашних и сельскохозяйственных животных (отита у собак и мастита у коров).

Список опубликованных по теме диссертации работ

а) в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Ионогенные группы в активном центре лизостафина. Сравнение кинетико-термодннамических и рентгеноструктурных данных / В.И. Суровцев, В.М. Борзенков, Т.В. Федоров, О.И. Смотров//Биохимия - 2007 - Т. 72.-Вып. 9.-С. 1214-1219.

2. Применение лизостафина для лечения животных при стафилококкозах / О.И. Смотров, В.И. Суровцев, В.М. Борзенков, Ю.И. Хапошин// Ветеринария. -2010. -№11. - С. 2427.

3. Причина аномальной кислотности ионогенных групп активного центра лизоцима при лизисе клеточной стенки Micrococcus lysodeicticus / О.И. Смотров, В.М. Борзенков, В.И. Суровцев // Биоорганическая химия. - 2011. - №5. - С. 631-636.

б) в патентах

I. Способ получения лизостафина / В.И. Суровцев, В.М. Борзенков, Т.В. Федоров, О.И. Смотров // Патент РФ №2342431. - Бюл. 2008. - № 36.

в) в материалах конференций

1. Адсорбционная хроматография белков на ионообменниках / О.И. Смотров // научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире»: Тезисы докладов. - Оболенск, 2009. - С. 187

2. Модификация метода ионообменной очистки лизостафина на силохроме / О.И. Смотров // научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности»: Тезисы докладов. - Оболенск, 2010. - С.334

Список сокращений и условных обозначений

ГКПМ - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов

ГНЦ ПМБ - Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехно-

rl

ДЭАЭЦ - диэтиламиноэтилцеллюлоза

КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

КОЕ - колониеобразующая единица

ПГРМ - панкреатический гидролизат рыбокостной муки

ПГ'Кр - панкреатический гидролизат крови

ПГМ - панкреатический гидролизат мяса

ПГК - панкреатический гидролизат казеина

in vivo - эксперимент на животных

NAG-NAM - N-ацетилглюкозамин - N-ацетилмурамовая кислота

pi - значение изоэлектрической точки

рК - значение рН, при котором заряжено 50% групп

RZ - от Reinheitszahl, критерий очистки А403/А275

ДНИ0„ - значение энтальпии ионизации

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность моим научным руководителям чл.-корр, РАМН, доктору мед. наук, профессору Дятлову Ивану Алексеевичу и доктору биол. наук Суровцеву Владимиру Ивановичу, за неизменно высокий вклад и огромную помощь в формировании концепции научной работы.

Приношу благодарность всем членам диссертационного совета, а также моим научным рецензентам канд. хим. наук Жиглецовой С.К. и канд. мед. наук Евсегнееву С.И. за тщательную проработку моей диссертационной работы и ценные замечания, которые будут учтены и исправлены при проведении дальнейших исследований.

Считаю своей приятной обязанностью выразить искреннюю благодарность Борзенкову В.М., Хатюшину Ю.И., Бахтеевой И.В., а также всем моим соавторам и сотрудникам ГНЦ ПМБ, принимавшим непосредственное участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказании помощи в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю благодарность моим неофициальным рецензентам настоящей работы, за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.

Подписано в печать:

26.03.2012

Заказ № 6884 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смотров, Олег Игоревич, Оболенск

61 12-3/873

ФБУН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

СМОТРОВ Олег Игоревич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА ИОНООБМЕННИКАХ НА ПРИМЕРЕ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА И ЛИЗОСТАФИНА

03.02.03- микробиология 03.01.04- биохимия

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич. Доктор биологических наук Суровцев Владимир Иванович.

0боленск-2012

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.........................................................................................5

Введение....................................................................................................................7

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР......................................................................13

1Л. Физико-химические основы очистки белков...........................................13

1ЛЛ. Осаждение белков солями и органическими растворителями.........14

1.1.2. Хроматографическое разделение белков..............................................21

1.1.2.1. Ионный обмен..................................................................................22

1.1.2.2. Аффинное взаимодействие..............................................................24

1.1.2.3. Ковалентная аффинная хроматография..........................................27

1.1.2.4. Гидрофобная хроматография..........................................................28

1.1.2.5. Металлохелатная хроматография...................................................30

1.1.2.6. Хроматография на триазиновых красителях..................................31

1.1.2.7. Адсорбционное взаимодействие.....................................................34

1.1.2.8. Гель-фильтрация..............................................................................35

1.1.2.9. Жидкофазное распределение белков..............................................37

1.1.2.10. Ультрафильтрация и диализ..........................................................38

1.2. Лизостафин. Получение, свойства, применение......................................41

1.2.1. Открытие лизостафина и других глицилглициновых протеаз.........41

1.2.2. Биосинтез и генетический контроль лизостафина............................43

1.2.3. Лизостафинрезистентность..................................................................44

1.2.4. Методы выделения и очистки лизостафина.......................................46

1.2.5. Методы определения активности лизостафина.................................48

1.2.6. Физико-химические свойства лизостафина.......................................52

1.2.7. Обоснование применения лизостафина в медицине и ветеринарии.....................................................................................................54

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................................58

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................58

2.1. Штаммы микроорганизмов..........................................................................58

2.2. Экспериментальные животные....................................................................58

2.3. Среды и условия культивирования.............................................................58

2.4. Биохимические методы................................................................................59

2.4.1. Использование метода адсорбционной хроматографии на силохроме для получения лизостафина..........................................................60

2.4.2. Использование метода адсорбционной хроматографии на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозе для получения пероксидазы хрена...................................60

2.5. Определение ферментативной активности и чистоты...............................62

полученных белков.............................................................................................62

2.6. Определение ионогенных групп каталитического центра лизостафина и лизоцима методом кинетико-термодинамического анализа.............................64

Глава 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................68

3.1. Разработка метода адсорбционной хроматографии на ионообменниках. 68

3.1.1. Очистка пероксидазы хрена на КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах..................71

3.1.2. Очистка лизостафина адсорбционной хроматографией на силохроме.........................................................................................................73

3.1.3. Обсуждение............................................................................................75

3.2. Оптимизация условий культивирования Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus.......................................................................................................77

3.2.1. Выбор основы питательной среды........................................................77

3.2.2. Влияние рН среды и времени культивирования на рост S. simulans и секрецию лизостафина.....................................................................................79

3.2.3. Оптимизация концентрации питательных веществ при культивировании S. simulans...........................................................................82

3.2.4 Особенности культивирования я'/им/ага в биореакторе...................85

3.2.5. Обсуждение............................................................................................88

3.3. Разработка кинетико-термодинамического метода определения ионогенных групп каталитического центра ферментов (на примере лизоцима и лизостафина)....................................................................................90

3.3.1. Обсуждение..........................................................................................102

3.4. Использование лизостафина для лечения стафилококковых поражений

у экспериментальных животных......................................................................104

3.4.1. Обсуждение..........................................................................................107

Заключение...........................................................................................................108

Выводы..................................................................................................................Ш

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................113

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

АНион - значение энтальпии ионизации

АМФ - аденозинмонофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

в/б - внутрибрюшинно

в/в - внутривенно

в/м - внутримышечно

ГКПМ - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов

ГНЦ ПМБ - Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДЭАЭЦ - диэтиламиноэтилцеллюлоза КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза КОЕ - колониеобразующая единица

кДж - килоджоуль

МПА - мясо-пептонный агар

НАД+ - никотинадениндинуклеотид

ПГРМ - панкреатический гидролизат рыбокостной муки

ПГКр - панкреатический гидролизат крови ПГМ - панкреатический гидролизат мяса ПГК - панкреатический гидролизат казеина ПЭГ - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота

ТНБС - тринитробензолсульфоксид ФМСФ - фенилметансульфонил фторид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия FemAB - оперон метициллинрезистентности in vitro - эксперимент «в пробирке», без использования животных in vivo - эксперимент на животных lif— ген, контролирующий лизостафинрезистентность Iss - ген, контролирующий синтез препролизостафина N-AGA-N-NAM - чередующийся сополимер N-ацетилглюкозамин - N-ацетилмурамовая кислота

PAGE - полиакриламидный гель

рАСК1-рАСК5 - плазмиды S. simulans biovar staphyloliticus pi - значение изоэлектрической точки рК - значение рН, при котором заряжено 50% групп RZ - от Reinheitszahl, критерий очистки А403/А275

SDS-Na - додецилсульфат натрия TEA - триэтаноламин

Введение

Актуальность проблемы:

До середины 1950-х гг. практически единственным широко применяемым методом очистки белков оставалось дробное осаждение сульфатом аммония. Однако к концу 1950-х гг. количество исследований, посвященных разработке новых методов очистки протеинов, значительно возросло. Были опубликованы данные по очистке белков на целлюлозных ионообменниках -КМ- и ДЭАЭ-целлюлозах, введены новые носители - сефадексы и сефарозы. К началу 1990-х годов был разработан целый ряд тонких методов очистки белков (аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, металлохе-латная и хроматография на триазиновых красителях, гель-фильтрация и др.). Эти методы очистки были основаны на различиях белковых характеристик: разности молекулярных масс, растворимости, температурной и рН-устойчивости, зарядов при различных значениях рН, адсорбции на гидрокси-лапатите, сродству к субстратам, ингибиторам, триазиновым красителям и др. Однако существенным ограничением многих из этих методов является невозможность их использования в условиях большого количества балластных примесей - клеток продуцента, их фрагментов, протеаз, содержащихся в культуральной жидкости. Это приводит к необходимости введения дополнительных этапов очистки. Еще одним ограничением для широкого применения ряда хроматографических методов является их высокая специфичность. В частности, использование аффинной хроматографии обеспечивает высокую чистоту фермента, ингибитор которого иммобилизован на носителе. Но, с другой стороны, поскольку химическое строение ингибиторов различно, то для отдельно взятого фермента нужно разрабатывать свою отдельную методику иммобилизации ингибиторов.

Универсальным принципом связывания белка является его адсорбция на сорбенте, основанная на силах Ван-дер-Ваальса. Однако, среди сил слабого взаимодействия, действующих в водном растворе, адсорбция является наиболее слабой. Поэтому разработать сорбент, использующий данный принцип, весьма сложно, и к моменту начала работы был разработан только один метод, использующий адсорбционное связывание - хроматография на гидро-ксилапатите. Однако применение гидроксилапатита ограничено тем, что этот сорбент требует сложного процесса подготовки и не подлежит регенерации. Кроме того, его использование возможно только на последней стадии очистки после удаления большинства балластных соединений.

Поэтому целью нашего исследования была разработка метода очистки белков, лишенного перечисленных выше ограничений, в достаточной степени универсального, масштабируемого и позволяющего получить белки высокой степени чистоты уже на первых стадиях применения.

Основной задачей нашего исследования была иллюстрация работоспособности и универсальности метода на модельных белках, имеющих важное промышленное значение, но в настоящее время получаемых трудоемкими способами. В качестве одного их таких ферментов была выбрана пероксидаза хрена. Этот белок широко используется в биохимических и иммунологических исследованиях и представляет интерес как препарат для лечения лепры и карциномы. Однако выход его ограничивается 0,5-1 г из 100 кг корневищ хрена, и цена достигает нескольких тысяч долларов за 1 г.

Другим модельным ферментом был выбран лизостафин. Определяющим критерием выбора стала его способность к лизису клеточной стенки стафилококков. Он был выделен из культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus [86] и, как было показано, лизировал клетки стафилококковых штаммов, в том числе антибиотикорезистентных. Лизис

бактериальной клетки обусловлен тем, что лизостафин является глициназой и гидролизует пентаглициновые мостики, которые входят в состав клеточной стенки любого (в том числе - резистентного к антибиотикам) стафилококка. На этом основании данный фермент был отнесен к факторам межмикробного антагонизма, обеспечивающим подавление роста других видов стафилококков.

В настоящее время борьба с инфекциями, вызываемыми штаммами ан-тибиотикорезистентных бактерий является актуальной проблемой медицины. Бактерии рода Staphylococcus занимают в этом ряду одно из главных мест. Так, в США ежегодно фиксируется -500 ООО случаев заболеваний, вызываемых стафилококками, из которых около 100 ООО случаев были вызваны анти-биотикорезистентными штаммами. Таким образом, на сегодняшний день представляется важной задача поиска новых лекарственных средств, альтернативных антибиотикам, а также необходимость разработки новых эффективных подходов к лечению стафилококковых инфекций. В этом свете возможность применения лизостафина в клинической и ветеринарной практике выглядит перспективной, тем более что показания для лечения некоторых инфекций, вызываемых стафилококками, уже встречались в литературе. [39]

Описанные методы выделения лизостафина не пригодны для наработки препаративных и промышленных количеств препарата, поскольку существующие методы включают, как правило, очистку в три-четыре этапа; выращивание штамма-продуцента осуществляется на дорогих или малодоступных питательных средах [62]; в целом процесс оказывается экономически высокозатратным.

Таким образом, в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих фермент лизостафин, и работа в данном направлении является актуальной и перспективной для медицины, ветерина-

рии и биотехнологии. Поэтому заключительным этапом нашей работы явилось изучение очищенного с помощью разработанного нами метода лизоста-фина, позволяющее получить важную информацию о его физико-химических и биологических свойствах.

Цель исследования - Разработать адсорбционные хроматографические методы очистки белков на ионообменниках, использовать их для препаративной очистки лизостафина и пероксидазы хрена, изучить некоторые физико-химические и биологические свойства очищенного лизостафина.

Задачи исследования:

1. Разработать методы препаративной адсорбционной хроматографии белков на целлюлозных (КМ- ДЭАЭ-целлюлозах) и кремниевых (силохром С-80) ионообменниках.

2. Использовать эти методы для получения препаративных количеств лизостафина и пероксидазы хрена.

3. Подобрать оптимальные условия культивирования штамма & Ыоуаг $1арку1о1уИсш - продуцента лизостафина.

4. Разработать кинетико-термодинамический метод определения ионо-генных групп, входящих в каталитический центр макромолекулы лизостафина.

5. Показать возможность использования полученного препарата лизостафина для лечения стафилококковых инфекций у домашних и сельскохозяйственных животных.

Научная новизна:

1. Впервые разработан метод адсорбционной хроматографии белков на ионообменниках, применение которого позволяет существенно сократить количество этапов очистки.

2. Впервые предложен кинетико-термодинамический метод для определения ионогенных групп активного центра ферментов, катализирующих гидролиз поверхностных структур клеточной стенки бактерий (лизостафин, ли-зоцим).

Практическая значимость и внедрение результатов:

1. Разработан новый способ получения лизостафина на основе адсорбционного метода очистки, защищенный патентом на изобретение РФ: №2342431.

2. Предложенный метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках может использоваться для очистки препаративных количеств других белков.

3. Предложены эффективные схемы применения лизостафина для лечения стафилококковых инфекций домашних животных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод адсорбционной хроматографии на ионообменниках позволяет получать препаративные количества высокоочищенных препаратов лизостафина и пероксидазы хрена.

2. Разработка условий культивирования штамма-продуцента лизостафи-на 5*. 8тги1ап$ позволяет обеспечить высокий выход целевого продукта.

3. Метод кинетико-термодинамического анализа позволяет определять ионогенные группы активного центра ферментов без использования рентге-ноструктурного анализа.

4. Препарат лизостафина, полученный из культуральной жидкости Я. яшиЬт методом адсорбционной хроматографии на силохроме, эффективен против стафилококковых инфекций у животных.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН ГНЦ ПМБ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на двух Научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 2009 г. и 2010 г.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 6 научных публикациях, включая 3 статьи в реферируемых научных журналах и 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 40 работ отечественных и 95 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 6 таблицами.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Физико-химические основы очистки белков

До 50-60-х г. прошлого столетия количество методов очистки было крайне ограниченным. Основным и почти единственным было осаждение белков солями аммония, щелочных и щелочноземельных металлов, открытое еще в XIX в. Однако именно благодаря этому методу был совершен ряд важнейших открытий. Так, в 1927 году Самнер, получив высокоочищенную уреазу показал, что этот фермент является обычным белком. В тридцатые годы Нортроп и др. осуществили получение и изучение свойств очищенных (примерно до состояния одной полосы в электрофорезе при окрашивании кумасси) ферментов желудочно-кишечного тракта - пепсина, химотрипсина, трипсина и их зимогенов. Современный этап работ по очистке белков можно, вероятно, датировать серединой 50-х годов, когда Петерсон и Собер применили для очистки белков ионообменную хроматографию на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозе [18].

В настоящее время известны принципы, разделяющие целевой и балластные белки по молекулярной массе, заряду, растворимости, температурной и рН-устойчивости, сродству к ингибитору или субстрату (для ферментов), к антителу, к цианурхлориду и его производным, адсорбционным свойствам и др. Таким образом, возможнос�