Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Альбумины семян льна: биохимические и физико-химические свойства

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Альбумины семян льна: биохимические и физико-химические свойства"

На правах рукописи

005017299

Козловская Юлия Владимировна

Альбумины семян льна: биохимические и физико-химические свойства

03.01.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О [.¡АЗ 20 ¡2

Тверь - 2012

005017299

Работа выполнена на базе кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Лапина Галина Петровна

Официальные оппоненты: Паничева Лариса Петровна,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный университет», заместитель директора по научной работе Института математики, естественных наук и информационных технологий

Рабинович Галина Юрьевна, доктор биологических наук, профессор, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мелиорированных земель, зав. отделом биотехнологии

Ведущая организация Государственное научное учреждение

Всероссийский научно-исследовательский институт льна Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится «24» мая 2012 года в 14.00 на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр-т Чайковского, 70/1 б, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170000, г. Тверь, ул. Володарского, 44а.

Автореферат разослан «ДА» /¿^/¿¿•¿■Р 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Н.В. Костюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Растения - биосистемы, в которых важную роль в регулировании и нормализации течения биохимических процессов играют различные биомолекулы, среди которых большая часть имеет белковую природу. Белки растительного происхождения изучены в меньшей степени в сравнении с животными.

Лен, одна из важнейших сельскохозяйственных культур Тверского региона, изучен недостаточно с точки зрения отдельных классов биоорганических макромолекул. В частности мало исследованы основные биоорганические молекулы льна — альбумины — и их физико-химические и биохимические свойства. Есть информация, что семена льна (Linum usitatissimum L.) содержат от 18 % до 33 % белковых молекул (С.К. Гребинский, 1967; Б.П. Плешков, 1968, 1977; Г.П. Лапина, 1981). Важность исследования белковых макромолекул определяется тем, что именно эта группа определяет структурные характеристики биотканей, их специфические функции и биохимические особенности, характеризует связь структуры и свойств. В то же время известно (В .Л. Кретович, 1986; Г.П. Лапина, 1999), что альбуминовые белки играют немаловажную роль в процессах роста и развития растений льна (создают тургор ткани, определяют транспорт микроэлементов, являются депо для аминокислот), а, следовательно, способны влиять на качество льняного волокна. Стойкость и перспектива качества зависят от фракции альбуминовых белков. В связи с этим изучение на молекулярном уровне альбуминов льна позволит приблизиться к созданию условий и механизмов, обеспечивающих высокое качество льняных волокон (В.Г. Черников, А.Н. Панкрушина, А.Г. Григорьева, 2002).

Для выполнения этой задачи необходимо исследование структурно-функционального состояния белков не только в объеме, но и на границе раздела фаз. Именно на поверхности раздела локализованы и функционируют многие биомолекулы (Амбрамзон A.A., 1988; Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., 19912005), формирующие количество, длину элементарных волоконец и др.

Получение новой информации по исследованию поведения иммобилизованных белковых макромолекул - альбуминовых белков льна — представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Исследования на молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искусственных коллоидных систем имеет огромное значение для льна, а также разработки новых лекарственных форм и новых технологий для пищевой и косметической промышленности и др.

Кроме того, изучение функционирования группы альбуминовых белков и ферментов (пероксидазы, о-ДФО и др.) в объеме и на границе раздела фаз тесно связаны с изучением механизмов регуляции и обмена, а также процессов роста и развития растений (Е.А. Андреева, 1993).

Однако, в настоящее время в арсенале исследователей не разработаны в достаточной мере подходы и методы, позволяющие на молекулярном уровне изучать физико-химические свойства белков, адсорбированных на поверхности раздела, т.е. в иммобилизованном состоянии. Информация, встречающаяся в литературе (Ж. Геген, 1991; М.Г. Николаева, 1999), носит скорее качественный и эпизодический характер.

Таким образом, разработка современных методических подходов на стыке биохимии, коллоидной химии, физической химии и т.д. для получения новой информации о физико-химических и структурно-функциональных свойствах альбуминовых белков льна открывает широкие перспективы, как в плане фундаментальных исследований, так и для создания новых технологий для сельского хозяйства, пищевой промышленности, биотехнологии и медицины.

Особо следует отметить, что актуальность исследований поведения белковых молекул и в объеме водного раствора, и на границе раздела фаз определяется возможностью на этой основе разработать биохимические и физико-химические подходы по регулированию качественных, количественных и характеристик культурных сельскохозяйственных растений (на примере альбуминов льна).

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить биохимические и физико-химические свойства альбуминовых белков, выделенных из семян льна, и сформировать подходы в исследовании молекулярных (в объеме водного раствора) и иммобилизованных форм (в структуре адсорбционных слоев, сформированных на границе раздела вода-воздух) альбуминов льна.

В работе поставлены следующие задачи:

- изучить электрофоретическое поведение альбуминов,, выделенных из стеблей льна, на разных стадиях роста и развития с целью подтверждения значимости именно этой группы белковых макромолекул льна;

- выделить и очистить фракцию альбуминовых белков из семян льна. Процедура выделения включает стадии гомогенизации, экстракции, центрифугирования и высаливания.

I часть. Для исследования физико-химических характеристик альбуминов льна в объеме водной фазы:

получить и интерпретировать УФ-спектры фракции альбуминовых белков льна;

- количественно определить альбуминовые белки семян льна и рассчитать их содержание в семенах льна;

- определить и рассчитать молекулярную массу альбуминовой фракции

льна.

II часть. С целью исследования иммобилизованной формы альбуминов

льна:

- провести количественную оценку поверхностной активности водного экстракта фракции альбуминовых белков при рН 7 и варьировании ионной силы водной подложки в интервале 0 - 0,3 М, включающей построение изотерм адсорбции и их анализ по рассчитанному комплексу адсорбционных параметров: максимальной адсорбции (Гтах); площади, приходящейся на молекулу (8М0Л), и толщины адсорбционного слоя (5). На основе полученных данных построить и проанализировать молекулярные модели структуры адсорбционного слоя альбуминовых белков льна;

- определить размеры белковых ассоциатов с использованием метода электронной микроскопии.

Научная новизна результатов исследования. Теоретическая значимость работы

В настоящее время практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков адсорбированных (или иммобилизованных) на поверхностях раздела фаз. Данных по строению белков и белоксодержащих молекулярных ансамблей на поверхности раздела фаз в литературе практически не встречается.

В представленной работе впервые предложен принципиально новый подход, позволяющий исследовать структурные свойства адсорбированных (иммобилизованных) на поверхности раздела фаз индивидуальных белков -альбуминов льна.

Суть разработанного подхода состоит в изучении альбуминов льна, как в объеме, так и на поверхности раздела вода-воздух для получения наиболее полной количественной информации о свойствах альбуминов льна (молекулярной массы, концентрации, содержании в семенах льна, степени агрегации, адсорбции и т.д.).

С применением комплексного подхода получена детальная количественная информация о содержании альбуминовых белков в семенах льна-долгунца, их молекулярной массе, а также о структурных параметрах альбуминов, адсорбированных на границе раздела вода-воздух. Впервые предложены молекулярные модели структуры иммобилизованных альбуминов льна, механизмы их формирования. Показано, что применение такого подхода открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов формирования иммобилизованных белковых систем и их комплексов на поверхности раздела фаз, а также способов регуляции их характеристиками, что важно для решения прикладных задач, стоящих в льноводстве и связанных с получением льноволокна высокого качества.

Практическая значимость работы

Практическая значимость характеризуется возможностью регулировать качественные, количественные и технические характеристики культурных сельскохозяйственных растений (льна) посредством варьирования комплекса биохимических и физико-химических параметров отдельных групп биоорганических молекул на примере белков альбуминов, как в объеме, так и на границе раздела, т.е. в иммобилизованной форме.

Наряду с неоспоримой фундаментальной значимостью исследований объемных и поверхностных свойств и особенностей функционирования белков представляют особый интерес с точки зрения практического применения. Немаловажный аспект прикладного применения результатов такого рода исследований — разработка новых пищевых коллоидных систем и биологически активных добавок, а также белок- и фермент-содержащих синтетических моющих средств. В связи с широкими перспективами практического применения исследования молекулярных параметров альбуминовых белков на поверхности раздела и в объеме водной фазы привлекает все большее внимание исследователей.

В частности, многие пищевые продукты представляют собой коллоидные системы, в которых белки и их комплексы выполняют роль стабилизаторов.

Адсорбционные свойства белков в них определяют условия получения, текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов.

Показано, что эффективными методами контроля процесса образования текстуры и стабильности белок-содержащих иммобилизованных систем являются варьирование физико-химических свойств среды.

Найденные закономерности и предложенный подход могу служить физико-химической основой при разработке новых продуктов в пищевой и косметической промышленности, при разработке новых лекарственных форм, путей регуляции процессами роста и развития льноволокна с целью получения наиболее качественных его параметров.

Полученные результаты перспективны в плане рассмотрения круга практического использования белков и ферментов для аналитических целей и в тонком органическом синтезе.

Полученные данные по исследованию биохимических и физико-химических свойств альбуминов семян льна используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ: в курсе лекций, семинарских занятий, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов и аспирантов.

Научные результаты, выносимые на защиту

1. Выявлена и подтверждена существенная доля фракции альбуминовых белков льна во фракции водорастворимых белков по данным диск-электрофореза в ПААГе.

2. Уф-спектры альбуминов льна имеют максимум поглощения, приходящийся на длину волны X, равную 280 нм.

3. На основе результатов двух методов — УФ-спектроскопии и методом биуретовой реакции — рассчитано содержание альбуминов в семенах льна, составляющее (1,75+ 0,05) ' 10"3 г/г сырой массы семян льна.

4. Проведен расчет молекулярной массы альбуминов льна, равный 82000±5700, с применением метода электрофореза на агарозе и построением калибровочного графика4 по коммерческим препаратам белков: САЧ (сывороточному альбумину человека), ПОХ (пероксидазе хрена) и АДГ (алкогольдегидрогеназе печени лошади).

5. Иммобилизация альбуминов льна границе вода-воздух позволяет получить устойчивые формы адсорбционных слоев белка, структурные характеристики (максимальную адсорбцию Гш; площадь, приходящуюся на молекулу Бд, и толщину адсорбционного слоя 5) которых можно варьировать, меняя ионную силу водной подложки.

6. Предложены молекулярный механизм формирования структур адсорбционных слоев альбуминов льна и модели этих структур.

7. Методом электронной микроскопии получены электронномикроскопические имиджи структуры межфазных адсорбционных слоев альбуминов льна и определены размеры разрешенных элементов структуры. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности

03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».

Апробация и реализация результатов диссертации

Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронежская государственная технологическая академия, Воронеж, 2005); III, V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2004, 2006); XIV, XVII Региональных Каргинских чтениях. Областной научно-технической конференции молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2007, 2010); Научной сессии РАН «Применение поверхностно-активных веществ в сельском хозяйстве: производство и переработка сельхозпродукции» (Белгородский государственный университет, Белгород, 2009); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010); III Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, 2010); IV Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронежский государственный университет, Воронеж, 2011); Международном семинаре «Роль льна в улучшении среды обитания и активном долголетии человека» (ВНИИ льна, Торжок, 2012); научно-методического семинаре «О взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью» (ТвГУ, Тверь, 2012), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении курсовых и дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем.

Публикации. Результаты исследования отражены в 26 публикациях, 2 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 15 таблиц, 24 рисунков, 2 схем.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

> Семена льна (Linum usitatissimum L.) — коричневые, шаровидные, яйцевидные коробочки травянистого однолетнего растения - льна-долгунца сорта Торжокский-4, выведенного во ВНИИ льна (г. Торжок) методом индивидуального отбора из гибридов М-34хТомский -10.

> Стебли льна-долгунца сорта Торжокский-4, выведенного во ВНИИ льна (г. Торжок) методом индивидуального отбора из гибридов М-34хТомский -10, на семи фазах роста: проросток, «ёлочка», быстрый рост, бутонизация, цветение, зеленая спелость и ранняя желтая спелость.

> Водные экстракты общей фракции белков стеблей и семян льна на разных фазах роста.

> Сывороточный альбумин человека (САЧ) коммерческий препарат, лиофилизованный из человеческой сыворотки, фирмы «Reanal» (Венгрия).

> Пероксидаза хрена (ПОХ) - лиофилизованный коммерческий препарат фирмы «Reanal» (Венгрия).

> Алкогольдегидрогеназа печени лошади (АДГ) — очищенный гомогенный коммерческий препарат фирмы «Reanal» (Венгрия).

В работе использованы следующие методы:

1. Комплекс современных физико-химических методов выделения и очистки фракции альбуминовых белков (А.Н. Смолин, 1969), которые включены в схему выделения и очистки этих белков. Эта схема включает в себя стадии гомогенизации, экстракции (дистиллированной водой), фракционирования (насыщенным раствором сульфата аммония) и очистки (диализом). В результате выделен водный экстракт фракции альбуминовых белков семян льна, который использован для выполнения следующих этапов экспериментальной программы.

2. Спектрофотометрический метод с применением спектрофотометра «Hitachi EPS-3T» (Япония) для проведения определения качественного и количественного содержания альбуминовых белков в семенах льна.

3. Метод биуретовой реакции для оценки и расчета концентрации альбуминовых белков в семенах льна с использованием калибровочного графика, построенного по белку-стандарту - сывороточному альбумину человека (коммерческий препарат фирмы «Reanal», Венгрия).

4. Метод электрофореза на агарозе для определения гомогенности альбуминов семян льна и расчета их молекулярной массы с использованием прибора BioSystems BTS-100 ELECTROPHORESIS POWER SUPPLY (фирма-изготовитель BioSistems S.A. Barcelona, Spain).

5. Метод диск-электрофореза в ПААГе для изучения электрофоретического поведения альбуминов, выделенных из стеблей и семян льна, на приборе фирмы «Reanal» (Венгрия).

6. Метод максимального давления в пузырьке (метод П.А. Ребиндера) для определения и расчета комплекса поверхностных характеристик водных растворов альбуминов семян льна с использованием микроманометра ММН-

h

240. Поверхностное натяжение рассчитывали по формуле: ст=оэ—, где аэ -

h,

поверхностное натяжение эталонной жидкости, h - высота поднятия исследуемой жидкости, h3 — высота поднятия эталонной жидкости. Эта часть работы проведена на кафедре коллоидной химии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

7. Метод электронной микроскопии для получения элеюронномикроскопических имиджей альбуминовых белков, выделенных из семян льна, при 10000-кратном увеличении на растровом микроскопе JSM - 5300LV (JEOL) при увеличении 5000-10000 раз. Данный этап работы выполнен в лаборатории структуры полимеров Московского института синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬ ТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение электрофоретического поведения альбуминов, выделенных из стеблей и семян льна

Белки (фракция общих белков и альбуминовые белки) стебля 4-х сортов льна (Верхневолжский, Тверца, Л-1120 и Светоч) изучены на семи фазах роста: всходы, «ёлочка», быстрый рост, бутонизация, цветение, зеленая спелость и ранняя желтая спелость электрофоретическим методом в ПААГе. На полученных электрофореграммах выявлено число белковых фракций (табл.1). Для изученных сортов льна характерно появление максимального числа белковых фракций в экстракте суммарных белков в фазе быстрого роста.

Таблица 1. Число белковых фракций в экстракте суммарных белков, выделенных из стеблей льна-долгунца в разных фазах их роста

Число белковых фракций

Сорт Всходы «Ёлочка» Быстрый рост Бутонизация Цветение Зеленная спелость Ранняя желтая спелость

Верхневолжский - 15 22 14 13 11 12

Тверца 15 15 24 - 12 12 13

Л-1120 18 16 22 16 И 9 10

Максимальное число фракций альбуминовых белков также приходится в фазу быстрого роста (табл. 2). Можно предположить, что пик числа фракций в фазе быстрого роста для фракции суммарных белков обусловлен большим вкладом альбуминовых фракций на данной фазе роста.

Таблица 2. Число альбуминовых фракций в экстракте, выделенных из стеблей

льна-долгунца в разных фазах их роста

Число альбуминовых фракций

Сорт Всходы «Ёлочка» Быстрый рост Бутонизация Цветение Зеленная спелость Ранняя желтая спелость

Верхневолжский - 6 И 6 5 6 6

Тверца 7 6 12 - 5 6 7

Л-1120 8 8 11 6 3 6 3

Аналогичная тенденция преобладания числа белковых фракций альбуминов прослеживается и в семенах льна (табл. 3). Это позволяет сделать предположение о большем типовом разнообразии белков-альбуминов в

процессе роста и развития растений льна. Подтверждение этому можно встретить в (Billard J.-P., 1974).

Итак, данные табл. 1, 2, 3, а также данные литературы (Billard J.-P., 1974) позволяют сделать предположение о значительном вкладе альбуминов в процессы роста и развития растений льна.

Таблица 3. Число альбуминовых фракций и фракции суммарных белков в экстрактах, выделенных из семян льна-долгунца

Сорт Число ( >ракций

Альбумины Фракция общих белков

Верхневолжский 14 20

Тверда 16 18

Л-1120 12 20

Это обстоятельство и определило выбор вида белковых молекул льна в качестве объекта данного исследования - альбумины льна.

Выделение и очистка фракции альбуминовых белков Для исследования биохимических и физико-химических свойств белков-альбуминов семян льна непременным условием является получение белков из природного источника в индивидуальном гомогенном состоянии.

Выделение и очистку фракции альбуминовых белков из семян льна вели по схеме на рис. 1.

Биологический объект (семена льна) \

Гомогенизагцм

I

Экстракция

I

Фракционирование \

Очистка

I

Экстракт альбуминовых белков

Рис.1. Схема выделения и очистки белков альбуминов из семян льна (Смолин А.Н., 1969)

В процессе выделения и очистки белков альбуминов из измельченных семян льна нами сочетались следующие современные лабораторные приемы и подходы: гомогенизация, экстракция, фракционирование и очистка. По вышеприведенной схеме (рис.1) выделили альбуминовые белки семян льна.

Определение концентрации альбуминов в водных экстрактах спектрофотометрическим методом

Нахождение и расчет концентрации альбуминовых белков в выделенном из семян льна экстракте вели с использованием УФ-спектроскопии в интервале длин волн (X) 240 - 290 нм.

2,5

0,5

Рис. 2. УФ-спектры водных экстрактов

индивидуальных белков альбуминов семян льна при варьировании рН: 1 — 6,5; 2-5,5

2

0,0

230 240 250 260 270 280 290 300

Поскольку поглощение белков в области 250-300 нм обусловлено остатками тир, три и фен, изменения поглощения в этой области связаны с влиянием, которое оказывает на хромофоры изменение условий внешней среды, а именно рН, концентрация солей и т.д. (Мартин Р., 1966).

Видно (рис. 2) снижение значения О280 на 33 % (рис. 2, кривая 2) в сравнении с кривой 1 (рис. 2), что может быть связано с увеличение концентрации ионов водорода и, как следствие, снижением интенсивности водородных связей и электростатических взаимодействий, стабилизирующих нативную структуру альбуминов. Это указывает на их важную роль в комплексе сил, включающих водородные, гидрофобные, электростатические связи, поддерживающих нативность данной белковой макромолекулы и возможность регуляции их числа и интенсивности посредством изменения рН. Значение изоэлектрической точки альбумина составляет 4,8. Чем дальше от изоточки, тем существеннее и глубже процессы денатурации белковых макромолекул, тем больше различия в значениях О28о- Дм сохранения нативных свойств белковых молекул следует вести изучение их биохимических и физико-химических параметров вблизи изоточки, т.е. при рН 6,5, что и выполнено в данной работе.

По УФ-спектру водных экстрактов индивидуальных альбуминовых белков семян льна рассчитали значение концентрации альбуминов в семянах льна, которое составило (3,60 + 0,15) • 10"5 моль/л или (1,70 + 0,07) ■ 10"3 г/г сырой массы семян льна (п = 3; Р = 0,95), что коррелирует с данными (Эллиот В., 2002).

С использованием построенного калибровочного графика (рис. 3) определяли концентрацию исследуемого белка альбумина семян льна в водном экстракте, которая составила 0,005 г/мл.

Определение концентрации альбуминов в водных экстрактах методом биуретовой реакции

1.0 0.9 0.8 0,7

□

0.6 0.5 0,4 0.3 0J 0.1 0.0

0.005 0.010 0,015 0.020 0,025 0,030 0.035 0.040 С. Г/МЛ

Используя значение средней молекулярной массы альбуминовых белков, равное 78000, пересчитали значение концентрации в моль/л, что составило (9,30 ±0,19) ■ 10"5, п= 3, Р = 0,95.

В расчете на сырую массу семян льна содержание индивидуальных белков альбуминов равно (1,80 + 0,04) • 10"3 г/г сырой массы семян льна.

Итак, использование двух независимых физико-химических методов (УФ-спектроскопии и биуретовой реакции) позволило получить близкие по значению величины содержания индивидуальной группы альбуминовых белков, составившие в среднем (1,75+ 0,05) -10"3 г/г сырой массы семян льна.

Определение гомогенности альбуминов семян льна методом электрофореза на агарозе

Далее устанавливали гомогенность выделенной фракции альбуминов льна и их молекулярную массу с использованием метода электрофоретического разделения альбуминов льна на агарозе.

На электрофореграмме (рис. 4, а) четко прослеживается наличие одного крутого пика, который соответствует альбуминовой фракции, выходящей из хроматографической колонки первым (это соответствует длинам пробега от 15 до 19 o.e.). Самые крупные молекулы альбумина выходят последними. Пик доминирующий, узкий; наличие небольших пиковых возмущений на электрофореграмме (рис.4, а) можно считать фоновыми. Итак, альбумины семян льна - гомогенная фракция белков.

Для определения значения молекулярной массы альбуминов льна необходимо проведение электрофореза на агарозе в тех же условиях, что и при разделении альбуминовых белков с использованием маркерных белков с известной молекулярной массой.

Для выполнения этой задачи было проведено элекгрофоретическое разделение на агарозе следующих белков-маркеров: САЧ (Mr 45000), АДГ (Mr 122000) и ПОХ (Mr 20000) с известными молекулярными массами.

Рис. 3. Калибровочный график зависимости оптической плотности (О) от концентрации раствора САЧ

"-Л

Я I |

дЛчЛу V

Длина пробега, о.е.

¿1! гI

Ж!

Длина пробега, о.е.

Рис.4. Зависимости величины оптической плотности различных белков (а-альбумины льна; б-САЧ; в-ПОХ; г-АДГ) от величины длины их пробега

Определение молекулярной массы альбуминов семян льна

Калибровочный график построен с использованием белков-маркеров: АДГ, САЧ и ПОХ (рис. 5).

МП ООО

120

100

Альбумины льпа

Рис.5.

Калибровочный

график

зависимости

Длина пробега, о.е.

молекулярной массы белков (1 -АДГ; 2-САЧ; 3-ПОХ) от длины их пробега

На основе калибровочного графика зависимости молекулярной массы белков от длины пробега провели расчет молекулярной массы альбуминов семян льна, составившей (82000+5700).

Изучение поверхностной активности водного раствора альбуминовых белков

Вторая часть работы - исследование иммобилизованной формы альбуминов льна.

Первая задача - изучение поверхностной активности водного раствора альбуминовых белков.

С использованием метода максимального давления пузырька получили зависимости поверхностного натяжения от концентрации альбуминов семян льна (от 0,5-10"4 до 2,5-10 М) при варьировании ионной силы водной фазы (I) от 0 М до 0,3 М. Значение рН водной фазы составило 6,5 во всех изученных системах.

На основе полученных зависимостей (о - С) были построены изотермы адсорбции, приведенные на рис. 7.

Видно, что с увеличением ионной силы от 0 до 0,3 М изотермы адсорбции «веерообразно» смещаются вниз (рис. 6). Для концентраций белка, меняющихся от 0,4-10"4 М до 1,2-10"4 М, наблюдали равномерное возрастание адсорбции при всех изученных значениях ионной силы. Затем, в области концентраций альбуминов льна от 1.2-10"4 М до 2,4-10"4 М наблюдается выход на плато.

Г,-Ю",0моль/см2

Рис. 6. Изотермы адсорбции водных

растворов альбуминовых белков при изменении ионной силы (I, М) раствора: 1-0; 2-0,1; 3-0,2; 4-0,3; рН 6,5

На основе построенных изотерм адсорбции рассчитали комплекс адсорбционных параметров: Гшах, БдИ 6, представленных в табл. 4.

Таблица 4. Расчетные адсорбционные характеристики (Гш, Бд, 5) _альбуминов семян льна

1=0 1=0,1 1=0,2 1=0,3

Гтах.-ю"7 МОЛЬ/М2 7,07 ±0,50 6,18±0,40 5,85±0,40 5,45±0,40

SA, Ä2 230±16 270±19 280±20 300±21

S, Ä 580±41 507±35 480±34 445±31

2.50 2.45 2.40 2.35 2,30 2,25 2.20 2,15 2.10 2,05

2.5

C,-WM

Видно, что с возрастанием ионной силы от 0 до 0,3 М увеличивается и значение максимальной адсорбции, и величина площади, приходящейся на молекулу. Это, в свою очередь, ведет к снижению толщины адсорбционного слоя от 580 Ä до 445 Ä.

Предполагаемые модели структуры адсорбционных слоев альбуминов льна

Одним из возможных путей выяснения структуры иммобилизованного белка является изучение адсорбционного поведения альбуминов семян льна и расчет площади, приходящейся на молекулу (SA) и толщины (8) межфазного слоя. По данным (Кузин, 1969) молекула альбумина представляет собой эллипсоид вращения с размерами полуосей (Ä): а/2 : Ь/2 : с/2=80 : 25 : 24.

Площадь на молекулу SA должна зависеть от ориентации эллипсоида вращения. При ориентации больших осей молекулы перпендикулярно поверхности площадь на недеформированную молекулу должна составлять 1808,64 А" (рис. 7, II А). При другой ориентации (при параллельном расположении главной оси эллипсоидов по отношению к границе раздела) площадь составляет ~ 24115 Ä2 (рис. 7,1 А).

Возможна и другая ориентация молекул иммобилизованного белка-глобула белка располагается под некоторым углом к поверхности раздела (рис. 7, III В). Только при малых концентрациях белка в объеме водного раствора (С=0,4010" М) SA больше приведенных величин. Уменьшение SA до величин, меньших рассчитанных из молекулярных параметров, свидетельствует о полимолекулярной адсорбции.

Данные по адсорбции альбуминовых белков льна удовлетворительно соответствуют предложенным на рис. 7 моделям. Можно наблюдать постепенный переход по мере увеличения концентрации белка в объеме водной фазы от незаполненного монослоя (рис. 7А) к полислоям (рис. 7Б).

Рис. 7. Модели структуры иммобилизованного альбумина для разных степеней заполнения (©) поверхности белком: ®<1 (А), 0>1 (Б)

Сопоставление адсорбционных характеристик (Б,А2 и 0,А), полученных расчетным способом, и данных, полученных в данной работе по иммобилизованным белкам альбуминов льна (табл. 4), позволяет рассчитать долю тех или иных моделей адсорбционных слоев в реальных системах -иммобилизованных альбуминовых белков льна.

Это положение требует дополнительного подтверждения, что будет предпринято в следующем разделе по элекгронно-микроскопическому изучению структуры адсорбционных иммобилизованных альбуминов льна.

Таблица 5. Значение адсорбционных параметров (Ба-А" и 5,А), полученных расчетным методом и на основе собственных экспериментальных _данных по адсорбции альбуминов льна на поверхности вода-воздух

Варианты структуры 5 Молекулярная модель структуры п Доля структуры, %

I. Б 1809 160 ошхшо 8 ~ 17

II. Б 25120 50 109 ~3

III. Б 2250 120 89 -80

Электронномикроскопическое исследование структуры межфазного адсорбционного слоя альбуминов льна, сформированного на границе с воздухом

С целью подтверждения молекулярной модели структуры адсорбционного слоя альбуминовых белков проведено электронномикроскопическое исследование.

Получили микрофотографии альбуминовых белков (рис. 8), выделенных из семян льна, при 10000-кратном увеличении. На электронномикроскопических имиджах четко прослеживается образование крупных белковых ассоциатов, состоящих из более мелких, минорных молекул белка на фоне

Рис. 8. Микрофотографии альбуминов семян льна

Увеличение микроскопа - 10000, 1 щп на микрофотографии равен 1 см, поэтому размер исследуемой молекулы - 0,5 см, а минорных образований - от 0,5 до 0,7 мм.

Таким образом, поперечный размер белкового ассоциата составил ~5000 А, макромолекул -500-700 А. По данным (Волькенштейн М.В., 1975) поперечный размер альбуминовых молекул составляет ~ 60 А. Т.е. в составе белкового ассоциата ~ 83 молекулы белка. На возможность ассоциации белков указано в (Волькенштейн М.В., 1975). Таким образом, подтверждено преобладание в структуре иммобилизованных альбуминов льна варианта структуры Ш.Б (табл. 5).

выводы

1. Исследованы структурно-функциональные характеристики альбуминов льна в объеме водной фазы:

- максимальное число альбуминовых фракций на электрофореграммах выявлено в фазе быстрого роста стеблей льна и составляет 11-12, в семенах - 1216, что подтверждает значимость белков-альбуминов льна в процессах роста и развития растений льна;

- найден максимум поглощения водных растворов альбуминов льна при нм, наличие которого обусловлено 3-мя ароматическими аминокислотами

- тир, три, фен, - входящими в состав первичной структуры альбуминов льна;

- рассчитано содержание альбуминовых белков в семенах льна, составившее (1,75±0,05)Т0~3 г/г сырой массы семян льна;

- впервые определена молекулярная масса альбуминовых белков семян льна, равная 82000±5700.

2. Впервые исследованы структурно-функциональные характеристики альбуминов льна на границе раздела водный раствор белка - воздух (в иммобилизованном состоянии):

- установлено, что возрастание от 0 до 0,3 М ионной силы водного раствора pH 6,5 ухудшается адсорбируемость альбуминов льна:

• максимальная адсорбция Гтах (10"7, моль/мг) снижается от 7,07±0,05 до 5,45±0,04;

• площадь, приходящаяся на молекулу (SA, А2), возрастает от 230±16 до 300±21;

• толщина адсорбционного слоя (8, А) уменьшается от 580±41 до 445±31;

- построены молекулярные модели структуры адсорбционных слоев альбуминов при различных степенях заполнения поверхности;

- показана полимолекулярность адсорбционных слоев белков;

- определены размеры разрешенных элементов структуры адсорбционных слоев альбуминовых белков, которые составили 5000 А, и подтверждены молекулярные модели структуры адсорбционного слоя иммобилизованных альбуминов льна.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Козловская Ю.В. О специфике поверхностной активности альбумина из семян льна на границе раздела фаз «водный раствор белка - воздух» // Тезисы докладов III научной конференции аспирантов и студентов химического факультета Тверского государственного университета. - Тверь, 2004. - С.44.

2. Крюкова О.Ю., Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Альбумины растений льна в раннем развитии // Тезисы докладов Третьей междисциплинарной конференции «НБИТТ-21» - Петрозаводск, 2004. - С.40

3. Козловская Ю.В., Давыдова Л.В. Поверхностная активность альбуминов семян льна на границе раздела фаз различной природы // Тезисы докладов XII Региональных Каргинских чтений. - Тверь, 2005. - С. 43

4. Лапина Г.П., Козловская Ю.В., Давыдова Л.В. Специфика поверхностной активности альбумина из семян льна на границе раздела фаз различной природы // Сб. тез. XV молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и

экспериментальной химии», посвященной 85-летию УрГУ им. А.М.Горького. Екатеринбург, 2005.

5. Козловская Ю.В., Давыдова Л.В. Особенности экстракции и поверхностно-активные свойства альбуминов семян льна // Тезисы докладов IV научной конференции аспирантов и студентов химического факультета Тверского государственного университета. - Тверь, 2005. - С.45.

6. Лапши Г.П., Козловская Ю.В. Альбумины растений льна: выделение и очистка // Вестник Тверского государственного университета. - Тверь, 2005, №8. -С.121-124.

7. Лапина Г.П., Козловская Ю.В., Давыдова Л.В. Специфика экстракции альбуминов из растений льна // Каталог докладов III Междун. конференции «Экстракция органических соединений». Воронеж, 2005. - С. 363.

8. Лапина Г.П., Козловская Ю.В. Физико-химические свойства альбуминов семян льна // Материалы международной междисциплинарной научной конференции «Идеи синергетики в естественных науках». Тверь, 2006. - С. 185

9. Козловская Ю.В., Давыдова Л.В. Физико-химические характеристики альбуминов семян льна // Тезисы докладов V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета, посвященная 35-летию Тверского государственного университета. - Тверь, 2006.-С. 23.

10. Козловская Ю.В., Давыдова Л.В. Определение и обсуждение физико-химических характеристик альбуминовых белков семян льна // Тезисы докладов XVI Российской молодежной научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения профессора В.П. Кочергина. - Екатеринбург, 2006. - С. 243.

11. Лапина Г.П., Белова О.В., Козловская Ю.В., Малыщик М.П., Шарилина Н.С. Влияние pH, ионной силы раствора на поверхностные характеристики белков, ферментов и фенольных соединений // Сб. материалов VII Международной междисциплинарной научно - практической конференции «Современные проблемы науки и образования». Харьков. Харьков, национ. Ун-т им. В.Н.Каразина. 2006. с. 42.

12. Лапина Г.П., Козловская Ю.В. Исследование комплекса физико-химических характеристик альбуминов семян льна // Вестник ТвГУ, серия: Химия. - Тверь, 2006, №8[25]. - С. 160-165.

13. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Объемные и поверхностные свойства альбуминов семян льна // Тезисы XIV Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование».- Пущино, 2007. - С. 158

14. Козловская Ю.В. О структуре и свойствах адсорбционных слоев альбуминовых белков льна // Тезисы докладов IV Региональных Каргинских чтений. - Тверь, 2007. - С. 27

15. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Изучение адсорбционных характеристик альбуминов семян льна на границе раздела «водный раствор белка-воздух» // Материалы I Международной конференции «Состояние воды в биологических и модельных системах». - Тверь, 2007. - С. 64-67.

16. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Синергетический характер формирования адсорбционных слоев альбуминов семян льна на границе раздела фаз водный раствор белка-воздух // Материалы международной междисциплинарной научной конференции «Синергетика в естественных науках». - Тверь, 2008. - 200-203 с.

17. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Влияние ионной силы водного раствора на адсорбируемость альбуминов семян льна // Материалы научной сессии РАН «Применение ПАВ в сельском хозяйстве: производство и переработка сельхозпродукции». Белгород, 2009. - 52-54 с.

18. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Поведение альбуминовых белков семян льна на границе раздела вода-воздух // Материалы международной междисциплинарной научной конференции «Синергетика в естественных науках» с элементами научной школы для молодежи. - Тверь, 2010. - С. 231-232.

19. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Элекгрофоретическое изучение белков стеблей различных сортов льна-долгунца // Материалы международной междисциплинарной научной конференции «Синергетика в естественных науках» с элементами научной школы для молодежи. - Тверь, 2011. - С. 302-303.

20. Козловская Ю.В. Изучение поверхностно-активных свойств альбуминовых белков семян льна // Тезисы докладов XVII Региональных Каргинских чтений: областной научно-технической конференции молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» - Тверь, 2010. - С. 44

21. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Особенности структурообразования альбуминовых белков семян льна на границе раздела вода-воздух // Сборник тезисов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов «Симбиоз-Россия 2010». -Нижний Новгород, 2010. -С. 58.

22. Козловская Ю.В. Изучение физико-химических характеристик альбуминов семян льна как потенциальных субстратов растительных протеаз // Сборник научных трудов по материалам Всероссийской научной школы для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» - Тверь, 2010. - С. 18-20.

23. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Изучение электрофоретического спектра белков стеблей четырех сортов льна-долгунца // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов «Симбиоз-Россия 2011». - Воронеж, 2011. - С. 22-24.

24. Козловская Ю.В. Физико-химические свойства альбуминов семян льна // Материалы международного семинара «Роль льна в улучшении среды обитания и активном долголетии человека». - Торжок, 2012.

Рецензируемые научные журналы, включенные в перечень ВАК:

25. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. Выделение и физико-химические свойства альбуминов семян льна // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. - 2008 -Вып. 80, №20.С. 77-81.

26. Козловская Ю.В., Лапина Г.П. О поверхностной активности альбуминов льна при варьировании ионной силы водной среды // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология - 2009 - № 34. С. 88-91.

Технический редактор А.В. Жильцов Подписано в печать 19.04.2012. Формат 60x84 '/] Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ № 200. Тверской государственный университет Редакционно-издательское управление Адрес: 170100, г. Тверь, ул. Желябова, 33. Тел. РИУ: (4822) 35-60-63

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козловская, Юлия Владимировна, Тверь

61 12-3/1136

Тверской государственный университет

На п^авах^рукописи

Козловская Юлия Владимировна

Альбумины семян льна: биохимические и физико-химические свойства

03.01.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор

Лапина Галина Петровна

Тверь - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................... 6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................. 15

1.1. Аминокислотный состав альбуминовых белков................... 13

1.2. Структурная организация белков........................................ 17

1.3. Альбумины животного и растительного происхождения............26

1.4. Выделение белков растительного происхождения..................33

1.5. Методы количественного определения

индивидуальных белков.......................................................................... 38

1.6. Кислотно-основные свойства альбуминовых белков................ 41

1.7. Электрохимические свойства белков и их электрофоретическое поведение......................................................................... 44

1.8. Поверхностное натяжение и поверхностно-активные

вещества............................................................................ 47

1.9. Адсорбция и структурообразование адсорбционных слоев

белков............................................................................

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............. 55

2.1. Объекты исследования.................................................... 55

2.2. Выделение и очистка белков............................................ 57

2.2.1. Гомогенизация биоматериала (семян льна)......................... 57

2.2.2. Выделение и очистка белков альбуминов

из гомогената семян и стеблей льна.........................................57

2.3. Приготовление реактивов................................................ 59

2.3.1. Приготовление трис-глицинового буфера............................ 59

2.3.2. Приготовление 50% и 100% насыщения

нейтрального раствора сульфата аммония (МН4)2804 ..................... 59

2.3.3. Приготовление биуретового реактива................................ 59

2.4. Спектрофотометрический метод качественного

и количественного анализа водных растворов белков.......................... 59

2.5. Биуретовый метод определения концентрации белков........... 60

2.6. Методика электрофореза на целлогеле в

горизонтальных блоках.......................................................... 61

2.6.1. Подготовка к работе полосок целлогеля............................. 61

2.6.2. Подготовка к работе ЭФ камеры....................................... 61

2.6.3. Нанесение образцов........................................................ 61

2.6.4. Окрашивание белковых фракций....................................... 61

2.6.5. Просветление целлогеля................................................... 62

2.6.6. Сканирование проб......................................................... 62

2.7. Методика электрофореза на агарозе.................................... 62

2.8. Метод электрофореза в полиакриламидном геле.................... 63

2.9. Метод максимального давления пузырька............................ 67

2.10. Метод электронной микроскопии....................................... 68

2.11. Линейный регрессионный анализ....................................... 69

2.12. Статистическая обработка результатов исследования.............70

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖЕНИЕ.... 71

3.1. Изучение электрофоретического поведения альбуминов, выделенных из стеблей и семян льна.......................................... 71

3.2. Выделение и очистка белков альбуминов из семян

растений льна................................................................ 80

3.3. Определение концентрации белков альбуминов в

водных экстрактах методом УФ-спектроскопии........................... 82

3.4. Определение содержания белков альбуминов

в семенах льна методом биуретовой реакции............................... 83

3.4.1. Построение калибровочного графика................................. 83

3.4.2. Количественное определение содержания белков

альбуминов в семенах льна...................... ............................... 85

3.5. Определение гетерогенности альбуминов семян

льна методом электрофореза на агарозе................. ..................... 86

3.6. Определение молекулярной массы альбуминов

семян льна................................................................................................. 88

3.7. Изучение поверхностной активности раствора альбуминовых белков........................................................... 90

3.8. Предполагаемые модели структуры адсорбционных слоев альбуминов льна............................ ....................................... 100

3.9. Электронномикроскопическое исследование структуры межфазного адсорбционного слоя альбуминов

льна, сформированного на границе с воздухом.............................. 104

ВЫВОДЫ............................................................................ 106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................... 109

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АДГ - алкогольдегидрогеназа печени лошади ИЭТ - изоэлектрическая точка

ОЭП - относительная электрофоретическая подвижность

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПОХ - пероксидаза хрена

САЧ - сывороточный альбумин человека

Тир - тирозин

Три - триптофан

Фен - фенилаланин

ВВЕДЕНИЕ

Растения - биосистемы, в которых важную роль в регулировании и нормализации течения биохимических процессов играют различные биомолекулы, среди которых большая часть имеет белковую природу. Белки растительного происхождения изучены в меньшей степени в сравнении с животными.

Лен, одна из важнейших сельскохозяйственных культур Тверского региона, изучен недостаточно с точки зрения отдельных классов биоорганических макромолекул. В частности мало исследованы основные биоорганические молекулы льна - альбумины - и их физико-химические и биохимические свойства. Есть информация, что семена льна (1лпшп шкайззтшт Ь.) содержат от 18 % до 33 % белковых молекул [48, 70, 77, 86]. Важность исследования белковых макромолекул определяется тем, что именно эта группа определяет структурные характеристики биотканей, их специфические функции и биохимические особенности, характеризует связь структуры и свойств. В то же время известно [45, 48], что альбуминовые белки играют немаловажную роль в процессах роста и развития растений льна (создают тургор ткани, определяют транспорт микроэлементов, являются депо для аминокислот), а, следовательно, способны влиять на качество льняного волокна. Стойкость и перспектива качества зависит от фракции альбуминовых белков. В связи с этим изучение на молекулярном уровне альбуминов льна позволит приблизиться к созданию условий и механизмов, обеспечивающих высокое качество льняных волокон [32].

Для выполнения этой задачи необходимо исследование структурно-функционального состояния белков не только в объеме, но и на границе раздела фаз. Именно на поверхности раздела локализованы и функционируют

многие биомолекулы [1], формирующие количество, длину элементарных волоконец и др.

Получение новой информации по исследованию поведения иммобилизованных белковых макромолекул - альбуминовых белков льна -представляет очевидный интерес с фундаментальной точки зрения. Исследования на молекулярном уровне механизмов образования и стабилизации искусственных коллоидных систем имеет огромное значение для льна, а также разработки новых лекарственных форм и новых технологий для пищевой и косметической промышленности и др.

Кроме того, изучение функционирования группы альбуминовых белков и ферментов (пероксидазы, о-ДФО и др.) в объеме и на границе раздела фаз тесно связаны с изучением механизмов регуляции и обмена, а также процессов роста и развития растений [49].

Наряду с неоспоримой фундаментальной значимостью исследований объемных и поверхностных свойств и особенностей функционирования белков представляют особый интерес с точки зрения практического применения. Немаловажный аспект прикладного применения результатов такого рода исследований - разработка новых пищевых коллоидных систем и биологически активных добавок, а также белок- и фермент-содержащих синтетических моющих средств. В связи с широкими перспективами практического применения исследования молекулярных параметров альбуминовых белков на поверхности раздела и в объеме водной фазы привлекает все большее внимание исследователей.

Однако, в настоящее время в арсенале исследователей не разработаны в достаточной мере подходы и методы, позволяющие на молекулярном уровне изучать физико-химические свойства белков, адсорбированных на поверхности раздела, т.е. в иммобилизованном состоянии. Информация,

встречающаяся в литературе [23, 58, 59], носит скорее качественный и эпизодический характер.

Таким образом, разработка современных методических подходов на стыке биохимии, коллоидной химии, физической химии и т.д. для получения новой информации о физико-химических и структурно-функциональных свойствах альбуминовых белков льна открывает широкие перспективы, как в плане фундаментальных исследований, так и для создания новых технологий для сельского хозяйства, пищевой промышленности, биотехнологии и медицины.

Особо следует отметить, что актуальность исследований поведения белковых молекул и в объеме водного раствора, и на границе раздела фаз определяется возможностью регулировать качественные, количественные и технические характеристики культурных сельскохозяйственных растений (льна) посредством варьирования комплекса биохимических и физико-химических параметров отдельных групп биоорганических молекул на примере белков-альбуминов как в объеме, так и на границе раздела, т.е. в иммобилизованной форме.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить биохимические и физико-химические свойства альбуминовых белков, выделенных из семян льна, и сформировать подходы в исследовании молекулярных (в объеме водного раствора) и иммобилизованных форм (в структуре адсорбционных слоев, сформированных на границе раздела вода-воздух) альбуминов льна.

В работе были поставлены следующие задачи:

- изучить электрофоретическое поведение альбуминов, выделенных из стеблей льна, на разных стадиях роста и развития с целью подтверждения значимости именно этой группы белковых макромолекул льна;

- выделить и очистить фракцию альбуминовых белков из семян льна. Процедура выделения включает стадии гомогенизации, экстракции, центрифугирования и высаливания.

I часть. Для исследования физико-химических характеристик альбуминов льна в объеме водной фазы:

- получить и интерпретировать УФ-спектры фракции альбуминовых белков льна;

- количественно определить альбуминовые белки семян льна и рассчитать их содержание в семенах льна;

- определить и рассчитать молекулярную массу альбуминовой фракции

льна.

II часть. С целью исследования иммобилизованной формы альбуминов

льна:

- провести количественную оценку поверхностной активности водного экстракта фракции альбуминовых белков при рН 6,5 и варьировании ионной силы водной подложки в интервале 0 - 0,3 М, включающей построение изотерм адсорбции и их анализ по рассчитанному комплексу адсорбционных параметров: максимальной адсорбции (Гтах); площади, приходящейся на молекулу (8М0Л) и толщины адсорбционного слоя (5). На основе полученных данных построить и проанализировать молекулярные модели структуры адсорбционного слоя альбуминовых белков льна;

- определить размеры белковых ассоциатов с использованием метода электронной микроскопии.

Научная новизна результатов исследования. Теоретическая значимость работы. В настоящее время практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков адсорбированных (или иммобилизованных) на поверхностях раздела фаз. Данных по строению

белков и белоксодержащих молекулярных ансамблей на поверхности раздела фаз в литературе практически не встречается.

В представленной работе впервые предложен принципиально новый подход, позволяющий исследовать структурные свойства адсорбированных (иммобилизованных) на поверхности раздела фаз индивидуальных белков -альбуминов льна.

Суть разработанного подхода состоит в изучении альбуминов льна, как в объеме, так и на поверхности раздела вода-воздух для получения наиболее полной количественной информации о свойствах альбуминов льна (молекулярной массы, концентрации, содержании в семенах льна, степени агрегации, адсорбции и т.д.).

С применением комплексного подхода получена детальная количественная информация о содержании альбуминовых белков в семенах льна-долгунца, их молекулярной массе, а также о структурных параметрах альбуминов, адсорбированных на границе раздела вода-воздух. Впервые предложены молекулярные модели структуры иммобилизованных альбуминов льна, механизмы их формирования. Показано, что применение такого подхода открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов формирования иммобилизованных белковых систем и их комплексов на поверхности раздела фаз, а также способов регуляции их характеристиками, что важно для решения прикладных задач, стоящих в льноводстве и связанных с получением льноволокна высокого качества.

Практическая значимость работы. Практическая значимость характеризуется возможностью регулировать качественные, количественные и технические характеристики культурных сельскохозяйственных растений (льна) посредством варьирования комплекса биохимических и физико-химических параметров отдельных групп биоорганических молекул на

примере белков альбуминов, как в объеме, так и на границе раздела, т.е. в иммобилизованной форме.

Немаловажный аспект практического применения результатов такого рода исследований - разработка новых пищевых коллоидных систем и биологически активных добавок, а также белок- и фермент-содержащих синтетических моющих средств. Способность белков адсорбироваться на различных поверхностях раздела является молекулярной основой формирования и стабилизации белок-содержащих иммобилизованных систем.

В частности, многие пищевые продукты представляют собой коллоидные системы, в которых белки и их комплексы выполняют роль стабилизаторов. Адсорбционные свойства белков в них определяют условия получения, текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов.

Показано, что эффективными методами контроля процесса образования текстуры и стабильности белок-содержащих иммобилизованных систем являются варьирование физико-химических свойств среды.

Найденные закономерности и предложенный подход могу служить физико-химической основой при разработке новых продуктов в пищевой и косметической промышленности, при разработке новых лекарственных форм, путей регуляции процессами роста и развития льноволокна с целью получения наиболее качественных его параметров.

Полученные результаты перспективны в плане рассмотрения круга практического использования белков и ферментов для аналитических целей и в тонком органическом синтезе.

Полученные данные по исследованию биохимических и физико-химических свойств альбуминов семян льна используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ: в курсе лекций,

семинарских занятий, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов

и аспирантов.

Научные результаты, выносимые на защиту:

1. Выявлена и подтверждена существенная доля фракции альбуминовых белков льна во фракции водорастворимых белков по данным диск-электрофореза в ПААГе.

2. Уф-спектры альбуминов льна имеют максимум поглощения, приходящийся на длину волны X, равную 280 нм.

3. На основе результатов двух методов - УФ-спектроскопии и методом биуретовой реакции - рассчитано содержание альбуминов в семенах льна,

Л

составляющее (1,75+ 0,05) '10" г/г сырой массы семян льна.

4. Проведен расчет молекулярной массы альбуминов льна, равный 82000±5700, с применением метода электрофореза на агарозе и построением калибровочного графика по коммерческим препаратам белков: САЧ (сывороточному альбумину человека), ПОХ (пероксидазе хрена) и АДГ (алкогольдегидрогеназе печени лошади).

5. Иммобилизация альбуминов льна границе вода-воздух позволяет получить устойчивые формы адсорбционных слоев белка, структурные характеристики (максимальную адсорбцию Гт; площадь, приходящуюся на молекулу Бд, и толщину адсорбционного слоя 8) которых можно варьировать, меняя ионную силу водной подложки.

6. Предложены молекулярный механизм формирования структур адсорбционных слоев альбуминов льна и модели этих структур.

7. Методом электронной микроскопии получены электронномикроскопические имиджи структуры межфазных адсорбционных слоев альбуминов льна и определены размеры разрешенных элементов структуры.

Апробация и реализация результатов диссертации. Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронежская государственная технологическая академия, Воронеж, 2005); III, V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2004, 2006); XIV, XVII Региональных Каргинских чтениях. Областной научно-технической конференции молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государ