Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Запасные белки семян подсолнечника

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Анисимова, Ирина Николаевна, Санкт-Петербург



-к ^

С* ¿4 « ,/ ? га»

«/У V/ / ^¿Г/ -

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА им.Н.И.ВАВИЛОВА

" $" ^ - • На правах РУКОПИСИ

. .Г ' ' " Л2 "Г^Г".1 1 УДК 575.12:547.962:633.854.78

А- У^'ОЛ/ГО Л^РР

/Г

мачал-

у ' .....

Анисимова Ирина Николаевна

ЗАПАСНЫЕ БЕЛКИ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА: ГЕТЕРОГЕННОСТЬ, ПОЛИМОРФИЗМ, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

Специальность 03.00.15 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

• 1 / ^¿/¡Ци-Ь

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................&

Глава 1. ЗАПАСНЫЕ БЕЛКИ СЕМЯН КАК ОБЪЕКТ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. Молекулярная гетерогенность и полиморфизм

белков семян двудольных растений.............................................А 6

1.2. Молекулярно-генетическая организация и биохимические особенности альбуминов семян двудольных растений............2.6.

1.3. Запасные белки семян подсолнечника.........................................Ш

1.4. Выводы........................................................................................АЗ.

Глава 2. МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Генетический анализ....................................................................

2.2. Общая характеристика материала.................. .............................40.

2.3. Методы идентификации и анализа признаков

2.3.1. Выделение белков...............................................................4.4

2.3.2. Электрофоретический анализ............................................#7.

2.3.3. Иммунохимический анализ....................................................

2.3.4. Обратнофазная высокоразрешающая жидкостная хроматография (НР-НРЬС)................................................

Глава 3. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕЛИАНТИНИНА

3.1.

3.2.

3.3.

3.4.

3.5.

Глава 4. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ПОЛИМОРФИЗМ 28 АЛЬБУМИНОВ

4.1. Состав и функциональные свойства 28 альбуминов

подсолнечника..............................................................................

4.2. Характеристика индивидуальных компонентов альбуминовой фракции.................................................................1.1 Я

4.3. Полиморфизм 28 альбуминов......................................................110

4.4. Полиморфизм богатых метионином компонентов альбуминовой фракции................................................................1Я5

4.5. Выводы........................................................................................127.

Молекулярная гетерогенность белков семян подсолнечника.......

Молекулярная гетерогенность гелиантинина..............................

Полиморфизм гелиантинина у однолетнего культурного

подсолнечника Н.аппит (Н.аппит виЬхр.аппит)........................

Межвидовая изменчивость гелиантинина

в роде НеИап1кт...........................................................................$5

Выводы........................................................................................

Глава 5.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ БЕЛКОВ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА

5.1. Анализ наследования гелиантинина у межлинейных

гибридов.......................................................................................{2.9

5.2. Гипотеза генетической организации гелиантинина.....................!.ЬЯ

5.3. Анализ совместного наследование локусов

гелиантинина и других признаков...............................................

5.4. Анализ наследования гелиантинина и 2S альбуминов при отдалённых скрещиваниях в роде Helianthus..............................Ш

5.5. Гипотеза генетического контроля 2S альбуминов.......................(Ф

5.6. О некоторых общих закономерностях организации и изменчивости мультигенных семейств, кодирущих

запасные белки семян..................................................................{7.2.

5.7. Выводы........................................................................................{7.&

Глава 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ СЕМЯН В ПРИКЛАДНОЙ БОТАНИКЕ, ГЕНЕТИКЕ И СЕЛЕКЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА

6.1. Белки семян в геномном анализе рода Helianthus........................i$.Q

6.2. IIS глобулин как серологический маркёр в изучении взаимосвязей в семействе Asteraceae...........................................

6.3. Использование гелиантинина в качестве генетического маркёра в селекционно-генетических исследованиях подсолнечника..............................................................................ШВ

6.4. Выводы.......................................................................................

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................2J.S

ЛИТЕРАТУРА...................................................................................................Ш

ПРИЛОЖЕНИЕ. СПИСОК ИЗУЧЕННЫХ ОБРАЗЦОВ..............................Ш

ВВЕДЕНИЕ

i

Подсолнечник {Helianthus annum L.) - одна из важнейших масличных культур. Благодаря хорошей адаптации к различным климатическим условиям, подсолнечник культивируется даже в тех районах, которые непригодны для выращивания других масличных растений. Ежегодно в разных странах мира производится около 22 млн.т семян подсолнечника (Anderson 1992). Семена подсолнечника служат источником пищевого растительного масла, отличающегося высоким содержанием биологически активных ненасыщенных жирных кислот - олеиновой и линолевой. Масло подсолнечника имеет широкий спектр промышленного применения при производстве масел для светильников, стеарина, мыла, косметики, фармацевтических препаратов, эмульгаторов, смазочных веществ, связующих компонентов красок, лаков и полировочных материалов, пластика и полимеров, синтетической резины, составов для выделки кож и обработки шерсти, а также в качестве кормовых добавок (Пустовойт 1975, Friedt et al. 1994). Растительные масла и эфиры жирных кислот могут служить перспективными добавками, либо заменителями для дизельного топлива (Lühs and Friedt 1994).

Другими ценными продуктами, получаемыми при переработке семян подсолнечника на масло, являются жмых и шрот. Подсолнечный шрот отличается высоким содержанием белка и занимает по этому показателю третье место после арахисового жмыха и соевого шрота (Sabir and Sosulski 1973; Пустовойт 1975). Ценность подсолнечного шрота заключается в том, что содержащийся в нём белок имеет в своём составе (и в довольно значительных количествах) все незаменимые аминокислоты (Дублянская и Супрунова 1969). Содержание белковой фракции в семенах подсолнечника колеблется в пределах 25-40%, а у некоторых сортов достигает 47% (Чмелёва и др. 1981). По суммарному содержанию масла и белка в семенах подсолнечник лишь немного уступает клещевине, превосходя другие масличные культуры: лён масличный, • горчицу, сою, арахис, кунжут (Пустовойт 1975). Белки семени подсолнечника хорошо сбалансированы по аминокислотному составу. Их биологическая

ценность по сумме незаменимых аминокислот составляет 53,6 - 63,5% в сравнении со стандартным белком ФАО (Чмёлева и др. 1981). Кроме того, белки подсолнечника выгодно отличаются от белков семян других масличных отсутствием аллергенных, антипитательных и токсических компонентов (Smith 1968). Поэтому они рассматриваются в качестве исключительно ценных источников пищевого и кормового белка (Gassman 1983; Sosulski 1984; Lusas 1985; Vaintraub and Lapteva 1996). Обогащенные белком изоляты и концентраты подсолнечника находят в последние десятилетия применение в различных областях пищевой промышленности Зайченко и др. 1984, Щербаков 1984, Артемьева 1985). Их основными компонентами являются белки глобулиновой природы. В семенах подсолнечника и других масличных растений была обнаружена богатая серосодержащими аминокислотами метионином и цистеином фракция низкомолекулярных водорастворимых белков - 2S альбуминов (Youle and Huang 1981). Установлено, что главный компонент альбуминовой фракции семян подсолнечника, белок SFA8, характеризуется исключительно высоким содержанием остатков метионина (16 мол%, Kortt and Caldwell 1990). Ген этого белка уже используется для генетической трансформации ряда растений с целью повышения содержания метионина в семенах и вегетативных органах (Kortt et al. 1991). Таким образом, белки семян подсолнечника могут служить как объектом селекции, так и источником ценных признаков для генетических модификаций других сельскохозяйственных культур.

Несмотря на то, что физико-химические и функциональные свойства белков и белковых изолятов семян подсолнечника исследовались весьма интенсивно (Тюрина и Клименко 1978, Артемьева 1985, Parrado et al. 1993, Veintkesh and Prokash 1993), сведения о составе и свойствах главных запасных белков семени подсолнечника немногочисленны й ограничиваются в основном его глобулиновой фракцией. Это объясняется прежде всего тем, что до недавнего времени альбумины рассматривались как метаболические и, следовательно, высокоизменчивые белки. Кроме того, альбумины имеют , небольшой молекулярный вес, с чем связаны определенные методические трудности при их выделении и анализе. Между тем альбумины составляют

весьма значительную в процентном отношении фракцию семени

подсолнечника. По сравнению с глобулинами, они содержат больше

)

незаменимых аминокислот (лизина, метионина) и играют вполне определенную, хотя и не изученную роль в накоплении масла (Бородулина и Супрунова 1978, Kabbaj and Berville 1997). Отсутствует в литературе и информация о генетическом полиморфизме запасных белков подсолнечника. В этой связи изучение состава и изменчивости белков семян рассматривается как одно из актуальных направлений исследований в области генетики физиологических и биохимических признаков подсолнечника на ближайшие годы (Materials FAO Meeting 1995).

Ещё одной причиной выбора белков в качестве объекта исследования явилась необходимость поиска эффективных маркёрных признаков для решения актуальных проблем прикладной ботаники, генетики и селекции подсолнечника. Среди них - выяснение филогенетических взаимоотношений в роде Helianthus. Дикорастущие виды рода Helianthus адаптированы к различным условиям обитания и обладают значительной изменчивостью большинства хозяйственных и агрономических признаков, ценным биохимическим составом семян, а также устойчивостью к болезням и вредителям (Seiler 1992). В то же время генетическая основа современных сортов в большинстве своём ограничена; в последние десятилетия это значительно осложнило возможности распространения культуры подсолнечника в мире (Анащенко 1979; Arnaud 1986). Так, например, многие возделываемые сорта оказались чувствительными к грибным заболеваниям, что обусловило необходимость передачи признаков устойчивости от дикорастущих видов в геном культурного подсолнечника. При производстве семян коммерческих гибридов подсолнечника используется один и тот же источник цитоплазматической мужской стерильности, полученный Леклерком, cms petiolaris (Leclerq 1969), в связи с чем большинство используемых в мире гибридов имеют идентичную цитоплазму и являются близкородственными. Межвидовая гибридизация может служить одним из способов расширения основ цитоплазматической мужской стерильности.

. (Whelan 1980,1981; Anashchenko 1981; Heiser 1982; Christov 1996). Однако сообщения об успешных межвидовых скрещиваниях культурного

подсолнечника с дикорастущими видами немногочисленны и объясняется это низкой совместимостью многих видов рода Helianthus, особенно многолетних и однолетних. Для выяснения причин репродуктивной изоляции и прогнозирования результатов скрещиваний при отдаленной гибридизации важное значение имеет оценка степени родства видов Helianthus. Рядом авторов предпринимались попытки использования в качестве хемотаксономических признаков веществ вторичного происхождения. В частности, у сложноцветных для этих целей использовались флавоноиды (Seeligmann 1996), алканы воска листьев (Maffei 1996), лактоны (Spring and Buschmann 1996), антоцианы и фитоалексины (Harborne 1996). Однако полиморфные системы запасных белков семян, успешно зарекомендовавшие себя в качестве молекулярно-генетических маркеров у различных видов растений (Конарев 1983), пока еще не нашли применения в семействе Asteraceae. Предпосылкой настоящего исследования послужила работа А.В.Анащенко и И.П.Гаврилюк (1979), в которой впервые были охарактеризованы иммунохимические свойства белков семян различных видов рода Helianthus и показана принципиальная возможность использования сравнительного анализа белков для выяснения родственных взаимосвязей между видами подсолнечника.

Другой актуальной проблемой, стимулировавшей поиск генетических маркеров среди запасных белков семян, явилась проблема межлинейной гибридизации в селекции подсолнечника на гетерозис. В связи с возрастанием числа инбредных линий, используемых в селекционных программах, перед селекционерами встала задача поиска точных и надежных критериев оценки генетической чистоты родительских линий и определения полноты гибридизации. В последние годы у ряда сельскохозяйственных культур для этих целей успешно использовались полиморфные системы запасных белков семян и изоферментов (Конарев и др. 1993). Однако работы по использованию белков семян в качестве маркёров для идентификации генотипов подсолнечника в литературе неизвестны.

Изучение запасных белков как признаков имеет важное значение и для частной генетики культуры. Следует отметить, что у подсолнечника, в отличие от многих других сельскохозяйственных растений, число идентифицированных

генов сравнительно невелико. Их можно условно объединить в пять групп. К первой группе относятся гены, контролирующие морфологические признаки (окраску цветков, ветвистость, высоту растений и другие). Их анализу были посвящены многочисленные работы (Luczkiewicz 1975, Fick 1976, Skaloud and Kovacik 1978, Демурин и Толмачёв 1986, Тихонов и др. 1992, Есаев 1978). Ко второй группе можно отнести многочисленные идентифицированные гены устойчивости к болезням (Miller and Fick 1997). Третью группу составляют гены, контролирующие биохимические признаки - состав токоферолов и жирнокислотный состав масла (Демурин 1988, Demurin 1993, Miller and Fick 1997), важнейшие изоферментные системы (Torres 1974, Kahler and Lay 1985, Лоскутов и др. 1988, Lay et al. 1988). К четвертой группе относятся генетические системы, обусловливающие мужскую стерильность (Miller and Fick 1997). В пятую группу можно объединить гены, контролирующие физиологические и анатомические признаки, связанные с адаптацией растений подсолнечника к засухе (Fambrini et al. 1995, Ruso and Fernandez-Martinez 1998). Совместное наследование ряда морфологических и биохимических признаков изучалось в работах (Боровкова и др. 1991; Demurin et al. 1993), однако из-за большого числа хромосом (п=17) лишь в нескольких случаях удалось выявить сцепление кодирующих локусов.

• i |

Значительный прогресс в создании генетических карт подсолнечника был достигнут при использовании молекулярных ДНК-маркеров. К настоящему времени сконструированы несколько RFLP карт культурного подсолнечника (Berry et al. 1995, Gentzbittel et al. 1995, Jan et al. 1998) и одна RFLP карта - для дикорастущего вида H:anomalus (Riesberg et al. 1993). Построена также объединенная RFLP/AFLP карта (Prüfe et al. 1998). Осуществлено картирование ряда генов, контролирующих ценнейшие биологические признаки, в частности, устойчивость к ложной мучнистой росе (Mouzeyar et al. 1995, Brahm and Friedt 1996, Vear et al. 1997, Brahm et al. 1998), локуса Rß, контролирующего признак восстановления фертильности (Prüfe et al. 1998), некоторых изоферментных систем, окраски рыльцев, а также фактора, определяющего жизнеспособность пыльцы в межвидовом скрещивании (Quilett et al. 1995). С созданием методов фингерпринтинга ДНК, RAPD- и RFLP-анализа была заложена основа для так

называемой "marker based selection", для идентификации QTL {quantitative trait loci), сцепленных с важными агрономическими признаками, для клонирования новых генов - кандидатов для трансформации. В частности, были идентифицированы молекулярные маркёры, связанные с интенсивностью транспирации (Beihassen et al. 1993), ветвлением (Iouras et al. 1998), масличностью семян и их лузжистостью (Leon et al. 1995). В связи с проблемой картирования генома изучение генетики запасных белков семян - важных биологических и хозяйственных1 признаков, без сомнения, представляет актуальную научную задачу.

Цель настоящей работы - раскрытие генетического потенциала запасных белков семян подсолнечника как признаков, выполняющих важные биологические функции, имеющих хозяйственную ценность и перспективных для использования в качестве генетических маркёров.

В ходе выполнения работы были решены следующие задачи:

• разработаны способы идентификации и анализа изучаемых признаков: выделение и очистка белков из отдельных семян и их частей, различные модификации электрофореза и иммунохимических методов;

• изучен состав полипептидов гелиантинина и 2S альбуминов;

• проведен скрининг основных представителей генофонда подсолнечника и проанализирован полиморфизм Запасных белков;

• проанализирован характер наследования состава запасных белков семян у гибридов от внутривидовых и межвидовых скрещиваний;

• исследованы пути использования запасных белков семян в качестве молекулярно-генетических маркёров для решения актуальных проблем прикладной ботаники, генетики и селекции подсолнечника.

Работа состоит из шести глав, введения, заключения, списка литературы и приложения. Во введении обоснован выбор запасных белков семян подсолнечника в качестве объекта исследования, обсуждается биологическое и хозяйственное значение этих признаков. Показано общее состояние изученности генетики признаков подсолнечника. Даётся общая характеристика работы и её основных частей, обосновывается актуальность задач исследования, формулируются выносимые Hai защиту положения. В первой главе

анализируются данные литературы о составе