Сравнительная оценка стабильности и свойств пероксидазы в различных штаммах культуры ткани женьшеня

Троицкая, Лариса Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная оценка стабильности и свойств пероксидазы в различных штаммах культуры ткани женьшеня
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная оценка стабильности и свойств пероксидазы в различных штаммах культуры ткани женьшеня"

п О V«

1 О ИЮЛ 1995

министерство здравоохранения и медицинской,промышленности российской федерации

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ТРОИЦКАЯ

Лариса Александровна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ И СВОЙСТВ ПЕРОКСИДАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ШТАММАХ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ ЖЕНЬШЕНЯ

Специальность 03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена на кафедре биологической химии Санкт Петербургского химико-фармацевтического института.

Научный руководитель -доктор биолигических наук, профессор Коыов В.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.Н.Лызлова доктор медицинских наук, профессор И.Г.Щербак

Ведущая организация: Ботанический институт им.Комарова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 1995г. в ^ час. на

заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат диссертации разослан " ^^ 1895г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Последние годы характеризуются возросшим интересом к методам культивирования растительных клеток и тканей. Это связано с перспективностью использования клеточных культур в качестве продуцентов различных биологически активных веществ, широко используемых в медицине, промышленности, сельском хозяйстве. Метод культивирования растительных клеток открывает новые возможности в биохимических, цитологических и генетических исследованиях, позволяя достаточно адекватно оценить процессы обмена веществ в растениях. Изолированные клетки растений находят также все более широкое применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов (Слепян и соавт.,1968; Урманце-ва,1992; ВЛепко et а1.,1993). Исследование молекулярных механизмов метаболизма (презде всего белкового) в дедифференцированных клетках создает предпосылки для более эффективного развития биотехнологии культивируемых клеток.

Объектом данного исследования была пероксидаза, являющаяся одним из основных ферментов метаболизма кислорода и принимающая участие в ферментативном окислении различных субстратов (фенолов, ароматических аминов, индоламинов, ИУК, НАД(Ф)Н и др.). Присутствие этого полифункционального фермента в растительных и животных тканях, а также в составе грибов и бактерий дает основание считать его жизненно важным соединением высших и низших организмов (Андреева,1988). Одной из основных функций пероксидазы является защита растения при действии на него различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Однако до сих пор анализ синтеза и стабильности этого фермента в условиях стресса не был предметом специального исследования. Поскольку в настоящее время рассматривается возможность использования пероксидазы в качестве маркера физиологического состояния растений, сопоставление биосинтетических способностей клеток родственных штаммов по отношению к этому ферменту было бы весьма актуальным. Отсутствие подобных данных в литературе позволяет рассматривать предпринятое нами сравнительное исследование пероксидазы каллусных культур ткани женьшеня в норме и при действии низко- и высокотемпературного шока как перспективное и своевременное.

Задачи.исследования. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусных культур Р.ginseng, Р.ginseng LX-5, Р.ginseng LX-13, P.quinquefolius.

2. Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани Р. ginseng LX-5, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.

3. Оценить скорости синтеза, распада и время "полужизни" пероксидазы в клетках ткани Р.ginseng, Р.ginseng LX-5, P.quinquefolius.

4. Исследовать влияние температурного шока на содержание и физико-химические свойства пероксидазы. ее молекулярную гетерогенность и обмен в клетках культур ткани женьшеня.

Научная новизна. В настоящей работе была впервые изучена и сопоставлена динамика изменения активности, физико-химические свойства, молекулярная гетерогенность и обмен пероксидазы в клетках штаммов двух родственных видов рода Рапах, выращиваемых на стандартной и селективных средах. Установлено, что культивирование Р.ginseng на средах, обогащенных органическими соединениями германия, приводит к значительным изменениям всех вышеназванных параметров и их сходству с P.quinquefolius: уровень активности пероксидазы увеличивается в 4,5 раза, происходит усложнение ее изоферментного спектра, скорость синтеза фермента возрастает в 5,2 и 4,5 раза соответственно.

Был разработан способ выделения и очистки до гомогенного состояния пероксидазы из культуры ткани Р.ginseng LX-5, изучены некоторые физико-химические свойства фермента.

В работе оценено влияние температурного шока на состояние пероксидазы и общего белка в каллусах женьшеня. Установлено, что как при низко-, так и высокотемпературном стрессе активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активности отдельных изоформ. Обнаружено, что действие низких температур приводит к значительному снижению скорости спонтанной деградации фермента, а высокие температуры вызывают существенное увеличение скорости его синтеза. Показано более сильное повреждающее действие низкотемпературного шока.

Теоретическая и практическая значимость. Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидагы в клеточных культурах ткани женьшеня позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культурах растительных клеток. Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительной клетки и подтверждают данные о том, что пероксидаза. наряду с белками теплового шока, защищает клетку от повреждения токсичными продуктами обмена и обеспечивает ее функционирование в изменившихся условиях. Работа по выделению и очистке фермента показала, что культура ткани женьшеня может рассматриваться как один из альтернативных источников пероксидазы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на ¡50 страницах, содержит 20 таблиц и U2 рисунка . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, который включает в себя 228 наименований, из них ->80 на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И },ЕТ0ДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на культуре ткани женьшеня обыкновенного и пятилистного: штаммы Р. ginseng С.А.Меу. (11ФРЙ-1 ВСКККВР N1), P.quinquefolius L. (ИФРЖ-10 ВСКККВР N16), полученные из корней нативных растений, и селективные штаммы Р.ginseng LX-5 (ИФКК-5 ВСКККВР N11), Р.ginseng LX-13 (ИФРЖ-5 ВСКККВР N26). Штаммы Р.ginseng и P.quinquefolius выращивали на стандартной агаризованной среде Мурасиге и Скуга, модифицированной Писецкой (1970), селективные среды LX-5. LX-13 были обогащены органическими соединениями германия: 1-гидроксигерматраном и 2-карбоксиэтилгермсесквиок-саном соответственно. Культуру выращивали в темноте при температуре 26°С и относительной влажности 707.. Продолжительность одного пассажа составляла 30-35 суток, после чего разрыхленную ткань весом около 5 г пересаживали на 50 мл свежей питательной среды. В работе использовали ткань женьшеня из 3-4 пассажей.

Для выделения цитозольной фракции навеску ткани женьшеня со-

ответствующего возраста гомогенизировали в ступке на холоду с 0,2 М нитратно-фосфатным буфером (рН=7,4) в присутствии 0,1% тритона Х-100 ("Serva". ФРГ) при соотношении ткань-буфер 1:10. Полученный гомогенат оставляли при 4°С в течение 30 мин.. и затем центрифугировали при 105000g 45 мин. Осадок отбрасывали, а для анализа использовали супернатамт, в котором определяли активность перок-сидазы (Bovaird et al.,1982) и содержание белка по методу Лоури (Lowry et al.,1951). Выделение и очистку пероксидазы проводили, используя методы фракционного высаливания фермента сульфатом аммония из супернатанта (105000g), гельфильтрации на Сефздексе G-150, ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе С-25 и ДЕ-АЕ-целлюлозе А-50. Гомогенность полученной пероксидазы оценивали при цомощи ступенчатого диск-электрофореза в ПААГ (3Z.10Z) по методу Дэвиса (Davis,1Q64). Специфическое окрашивание геля на активность пероксидазы осуществляли по методу Лиу (Liu,1973) с некоторыми модификациями (Грушин и соавт., 1985; Гаянова и со-авт..1990).

Молекулярную массу выделенной и очищенной пероксидазы определяли методом электрофореза по Лэммли (Laeiranly.1970) в ЗХ, 10% ПААГ с добавлением 0,1% ДС-Na. Антисыворотку к пероксидазе из культуры клеток P.ginseng LX-5 получали иммунизируя кролика гомогенным препаратом фермента. Специфичность антител оценивали методом иммунодиффузии в 1% агаре Дифко по Охтерлони (Ouchterlo-пу.1949) и диск-электрофорезом преципитатов в денатурирующих условиях (Laemmly,1970).

Для изучения обмена пероксидазы и тотального белка в культурах ткани женьшеня использовали радиоизотопный и ишунохимический методы анализа. Радиозотоп (14С-лейцин) вводили в ткань в асептических условиях стерильной иглой из расчета 150 ыкКи на 10 г каллуса. Затем через 2 часа вносили десятикратное количество неме-ченного лейцина для предотвращения реутилизации изотопа. При изучении влияния температурного стресса на обмен пероксидазы и тотального белка радиоизотоп добавляли в культуру непосредственно после шока и через сутки после низко- и высокотемпературного воздействия. Обмен пероксидазы и общего белка оценивали на 1-7 сутки после введения 1^-лейцина. Радиоактивность проб измеряли на сцинтилляционном счетчике (Mark-3,ОНА). Концентрацию пероксидазы в культурах ткани женьшеня определяли двумя независимыми метода-

ми. В первом случае содержание фермента рассчитывали, исходя из общей активности пероксидазы и активности 1 мг гомогенного препарата. полученного в результате выделения и очистки фермента. Во втором - концентрацию антигена определяли методом простой радиальной иммунодиффузии в агаре по Манчини (1965). Константы скорости синтеза и распада пероксидазы и общего бедка определяли по методу Шимке (Schimke et al.,1975), время "полужизни" - по методу Ариаса (Arias et al.,1969).

Для изучение влияния экстремальных температур на активность пероксидазы культуру ткани женьшеня в возрасте 10-40 суток подвергали низко- (7°С, 24 часа) и высокотемпературной (45°С, 3 часа) обработке. В первой серии опытов ткань исследовали непосредственно после действия шока. Во второй серии опытов ее выдерживали суиси при 26°С в темноте.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне вероятности Рс0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование динамики изменения уровня активности и молекулярной гетерогенности пероксидазы. Активность пероксидазы, содержание белка и массу ткани измеряли в течение 40 дней роста кал-лусных культур с интервалом в 5 суток. Как видно из рисунков 1-4, уровень белка в Р.ginseng по сравнению с остальными штаммами был выше в среднем на 30-35%. Максимальное содержание белка в культурах Р.ginseng и P.quinquefolius достигалось к 10 суткам роста, Р.ginseng LX-5 - к 5 суткам, Р.ginseng LX-13 - к 15 суткам. Если в Р.ginseng и P.quinquefolius концентрация белка после 10 с. существенно не изменялась, то в культурах, выращиваемых на средах с добавлением препаратов германия, она характеризовалась наличием еще одного максимума: на 30 (Р.ginseng LX-13) и 40 сутки роста (Р.ginseng LX-5).

Пероксидазная активность описывалась кривой с максимумом на 10 (Р.ginseng), 35 (P.ginseg LX-13). 40 (P.quinquefolius), двумя максимумами на 15, 30 (Р.ginseng LX-5) сутки роста. Высокая активность фермента на начальных этапах культивирования штаммов женьшеня может быть связана с увеличением потребления кислорода

i -1'

\ 41

\ 5 ■i3

% i'

У А,

S~ /0 fS ¿0 íS -30 35 40

ОУ07/И/

Рис. 1 Активность пероксидазы (1), содержание белка (2) и масса ткани (3) Р.ginseng в течение роста.

г£

го

Sí Г

ГО

rs го 25 30 ЛГ 40

Рис. 2 Активность пероксидазы (1), содержание белка (2) и масса ткани (3) P.quinquefolius в течение роста.

i™

га

го

зо

а/таи

Рис. 3 Активность пероксидазы (1), содержание белка (2) и масса ткани (3) Р.ginseng LX-5 в течение роста.

го

Рис. 4 Активность пероксидазы (1), содержание белка (2) и масса ткани (3) Р.ginseng LX-13 в течение роста.

делящимися клетками и активацией ферментов антиоксидантной системы. Увеличение же активности пероксидазы к концу цикла выращивания регистрировалось при работе со многими клеточными культурами (Кунаева,1992; Урманцева,1992; Kossatz et al.,1976). Оно совпадает с окончанием интенсивного прироста биомассы и объясняется протеканием процессов старения ткани, когда в ней накапливаются токсичные перекисные соединения, являющиеся истинными субстратами пероксидазы. Для пероксидазы, как и для другого фермента антиоксидантной системы - каталазы , изменение уровня активности может быть связано и с колебанием митотической активности клеток кал-лусных культур, сопровождаемой изменением в потреблении ими кислорода (Комов" if Соавт., 1989).

Сопоставление активности одного из основных ферментов метаболизма кисловода - пероксидазы - в штаммах Р.ginseng и P.quinquefolius показало, что в клетках женьшеня американского она в 4,5 раза выше. Это, видимо, связано с большей степенью дифференциации ткани P.quinquefolius и интенсификацией энергетического обмена в клетках. На основании этих данных можно предположить, что для P.quinquefolius характерно более высокое потребление кислорода, чем для Р.ginseng. Полученные результаты, демонстрирующие различия между Р.ginseng и P.quinquefolius на молекулярном уровне представляют интерес, поскольку женьшень и панакс пятилистный в настоящее время рассматривают как наиболее древние, эволюционно близкие (анатомо-морфологическое строение листа и корневой системы, химический состав) ввды рода Panах, проявляющие много общих черт и при культивировании их ln vitro (одинаковый состав оптимальных питательных сред, скорость роста, гистологические особенности тканей) (Высоцкая,1978).

До настоящего времени не оценивали влияние соединений германия на метаболизм белков и, в частности, пероксидазы в растительной клетке. Исследование культур ткани женьшеня показало, что выращивание Р. ginseng на селективных средах LX-5 и LX-13 не только уменьшает содержание общего белка в клетках, но и увеличивает приблизительно в 4.5 раза активность пероксидазы. делая эти штаммы очень близкими по вышеназванным характеристикам к штамму P.quinquefolius. Известно, что низкие концентрации окиси германия стимулировали поглощение кислорода тканями животных (.Тар,Миронов. 1982). Не исключено, что введение органических соединений

Рис. 5 Молекулярная гетерогенность пероксидазы в различных штаммах женьшеня, где 1 - Р.ginseng, 2 - Р.ginseng LX-5, 3 - Р.ginseng LX-13, 4 - P.quinquefolius.

германия приводило к перестройке метаболических процессов, связанных с потреблением энергии. Это, в свою очередь, могло усиливать потребление кислорода клетками ткани и, как следствие, активировать антиоксидантную систему. Появление в кадлусных культурах P.quinquefolius, Р.ginseng LX-5 и LX-13 максимумов активности пероксидазы на заключительных этапах культивирования также согласуется с нашей гипотезой о перестройке в них процессов метаболизма, связанных с потреблением кислорода.

Методом ступенчатого диск-электрофореза по Дэвису было обнаружено: 11 (Р.ginseng), 12 (Р.ginseng LX-5), 15 (Р.ginseng LX-13), IV (P.quinquefolius) множественных молекулярных форм пе-рассидазы. Данные представлены на рисунке 5. Не исключено, что некоторые выявленные множественные молекулярные формы пероксидазы являются псевдоизоформаыи, появление которых вызвано взаимодействием истинных изоформ фермента с различными активаторами, ингибиторами (в частности, фенольной природы) и клеточными органелла-

ми. Для изучаемых объектов установлено наличие трех групп изоформ пероксвдазы: медленно-, средне- и быстромигрирующих по отношению к аноду, что сопоставимо с данными литературы (Сарсенбаев,Полим-бетова,1086; De Jong,1973). В клетках всех штаммов преобладали медленномигрирующие изофорш. Сдвиг изоферментного спектра пероксвдазы в сторону более щелочных множественных молекулярных форм связывают с почти полным отсутствием в культивируемых клетках растений процессов лигнификации, в которых непосредственно участвуют кислые изоформы. (Газарян и соавт.,1992). В ходе культивирования не наблюдали изменений в числе изоформ, менялась лишь.их относительная активность, причем г наибольшей степени - в группе медленномигрирувдих изоформ пероксвдазы, относительная активность которых колебалась в пределах 50-77% (Р.ginseng), 60-927. (Р.ginseng LX-5, LX-13), 73-887. (P.quinquefolius). Максимумам перокси-дазной активности на кривых динамики активности фермента в клетках различных культур ткани женьшеня соответствовало снижение доли медленно- и повышенна содержания быстромигрирующих молекулярных форм пероксвдазы. Усложнение изопероксидазного спектра в каллусах Р.ginseng, выращенных на селективных средах можно рассматривать как ответ клеток женьшеня на введение в культуральную среду органических соединений германия, влияющих на клеточный геном, а близость его к изоферментному спектру в P.quinquefolius - на возможное сходство процессов метаболизма в клетках этих штаммов.

Выделение и очистка пероксвдазы из культуры ткани Р.ginseng LX-5. Был разработан и оптимизирован способ выделен,, и очистки пероксвдазы, основанный на фракционном высаливании фермента сульфатом аммония, гель-фильтрации на Сефадексе G-150, ионообменной хроматографии на КМ- и ДЕАЕ-целлюлозе. При использ^ании данного метода выход ферментативного белка составил 28% при степени очистки в 66 раз. Выделенная пероксидазная фракция была представлена двумя медленномигрирующими изоформами с относительной активностью 78% и 22%. То, что выделенная пероксидаза не сорбировалась ни на KM-, ни на ДЕАЕ-целлюлозе и принадлежала к группе медленно-мигрирующих к аноду изоформ пероксвдазы может служить косвенным подтверждением ее слабокислой природы. Данные представлены в таблице 1.

Используя разработанный метод выделения и очистки пероксида-

Выделение и очистка пероксидагы иа культуры ткани Р. ginseng: LX-5.

1 1 | Стадия- | Белок, i 1Суммарная Удельная i Очистка.| i Выход, |

| выделения | МГ |актив- актив- раз | У- 1

1 1 |ность, ность,

1 1 |Ед.ферм./ ЕД-Ферм.^

1 1 1 1 ¡мин. i МГ В 1МНН

1 1 | Вытяжка | 1 1 561,30 1 |25 522.5 i 45.5 - • 1 100,0 |

1 1 |Высал(ЮЦ)25041 1 1

1(0,5 - 0,8 н) | 1 1 57,35 |20 162.3 i 351,6 7.73 | 79,00 |

1 1 |Сефадекс (3-150| I 1 36,16 1 |19 334,0 i 534,7 11.75 | 75,75 |

1 1 | ВЫСОЛ (ШЦ) 2^41 1 1

1(0.8 н) 1 1

|Диализ | 1 1 26.28 ¡12 738,0 i 484,7 10,65*| 49,91 |

1 1 I КМ-целлюлоза | 1 1 16,99 1 |11 421,8 i 672,3 14.78 | 44,75 |

1 1 1ВЫСОЛ (N114)23041 1 1

1(0,8 н) | 1

|Диализ | 1 1 15.76 | 7 847,2 1 497,9 10,94*1 30,75 |

1 1 |ДЕАЕ-целхшоза| ' < 2,36 1 | 7 081,3 i 3 000,6 65.95 | i 27,75 | i

Примечание: * - при высаливании фермента сульфатом аммония и последующем диализе пробы наблюдали некоторую инактивацио фермента.

зы из 10 г сырой ткани Р.ginseng LX-5 можно получить около 90 мет гомогенного фермента. В настоящее время пероксидаза широко применяется в иммуноферментном анализе, является одним из основных ферментов диагностических наборов, может использоваться в качестве катализатора таких процессов как димеризация индольных алкалоидов и образование смол (Газарян,1992). Однако основным источником ее получения по-прежнему являются корни хрена,- из 50 кг этого сырья получают 200 мг фермента (Van Huystee,1987). Высокая цена пероксидазы на мировом рынке требует поиска новых альтернативных источников для промышленного получения фермента, в качестве которых в последние годы предлагаются культуры растительных клеток с высоким содержанием пероксидазы. Так, в предложенной суспензионной культуре клеток люцерны выход фермента, близкого по физико-химическим свойствам к пероксидазе из корней хрена, составляет 250-300 мкг на 1 г сухой биомассы (Газарян и соавт. .1992), что сопоставимо с нашими данными (230 мкг на 1 г сухой ткани).

Исследование физико-химических свойств пероксидазы. При определении молекулярной массы фермента диск-электрофорезом по Лэммли в качестве маркеров использовали следующие белки с известной массой: цитохром с, гемоглобин бычий, хшоглобин, СОД, химот-рипсиноген А, дезоксирибонуклеазу, пероксидазу хрена, альдолазу, яичный альбумин. Выделенная фракция, обладающая пероксидазной активностью, была представлена двумя изоформами с молекулярной массой 29 и 31 кДа. Поскольку на долю углеводов в молекуле фермента может приходиться до 20%, в качестве одного из объяснений более высокой молекулярной массы некоторых других пероксидаз, выделенных из различных культур растительных клеток, предлагают большую степень их гликозилирования (Chibbar et al.,1984; Gaspar et al., 1982; Xu et al.,1991).

Обнаружено, что температурный оптимум выделенного фермента находится при 40-50°С, что совпадало с данными литературы для пероксидаз из других источников (Кунаева,1992; Урманцева,1992; Soda Isao,1991). Определение зависимости активности фермента от рН проводили в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере в интервале 3,8-6,8. Установлено, что оптимум рН пероксидазы женьшеня находится при 4,2.

Изучение обмена пероксидазы и общего бедка в различных штаммах женьшеня. С целью проверки нашей гипотезы о различиях в биосинтетических способностях клеток штаммов женьшеня в работе оценивали скорости синтеза и регулируемого распада общего белка и пероксидазы в каллусах Р.ginseng, P.quinquefolius и Р.ginseng LX-5. В работе использовали радиоизотопный метод с применением 14С-лейцина. На основании экспериментальных данных были рассчитаны константы скорости биосинтеза и спонтанной деградации пероксидазы и тотального белка! а также время их функционирования и концентрации в исследуемых штаммах женьшеня (таблицы 2,3).

Установлено, что снижение содержания общего белка в клетках P.quinquefolius по сравнению с Р.ginseng происходило за счет увеличения скорости его спонтанной деградации (на 46%) и подавления его синтеза (на 25%). В Р.ginseng LX-5 синтез общего белка оставалась на том же уровне, что и в Р.ginseng, а скорость его распада возрастала на 80%.

Особенностью обмена пероксидазы в штаммах P.quinquefolius и Р.ginseng LX-5 по сравнению с Р.ginseng являлось ускорение синтеза фермента в 4,5 и 5,2 раза соответственно при небольшом (на 11%) увеличении скорости его распада. Вследствие этих изменений содержание пероксидазы в культурах ткани Р.ginseng LX-5 и P.quinquefolius было приблизительно в 4 раза выше, чем в Р.ginseng. Данные результаты подтверждают выдвинутое ранее предположение об изменениях в потреблении клетками кислорода и, как следствие, в концентрации пероксидазы, как в штамме близкородственного вида женьшеня, так и в штаммах, культивируемых на средах с добавлением препаратов германия. Обнаружено, что скорость накопления синтезированной de novo пероксидазы составляет 0,35% (Р.ginseng), 1,86% (Р.ginseng LX-5) и 2,16% (P.quinquefolius) от скорости биосинтеза общего белка в соответствующих культурах клеток. Эти величины соответствуют данным литературы (Stephan et al.,1981; Van Hyustee et al.,1982), согласно которым синтез пероксидазы в суспензионной культуре ткани арахиса составлял 2% от синтеза общего белка. Показано, что распад фермента, выводимого из пула функционирования, составлял 0,163 (Р.ginseng), 0,190 (Р.ginseng LX-5) и 0,193 сут. 1 (P.quinquefolius). Таким образом, сравнительная оценка параметров обмена пероксидазы в каллусных тканях Р.ginseng, выращенных на стандартной и селективной LX-5 средах, с ферментом из

Обмен пероксидазы в культурах ткани женьшеня.

1 1 | Р. ginseng | i i 0,163 4.25 1 ИД5 i i i 1.87 |

1 1 |P.quinquefolius| 0,103 3.50 1 1 I 43.53 | i i 8,40 |

1 ■ 1 |Р.ginseng LX-5 | 0,100 3.65 1 1 . | 51,СЮ | i , ____i 9,69 | •

Таблица 3

Обмен общего белка в культурах ткани женьшеня.

1 i |Р.ginseng | i i 0,114 6,08 1 1 | 4500 | i i 513 |

1 1 |Р. quinquefoliusl i i 0,166 4.18 1 1 | 2340 | i i 388 |

1 I |Р.ginseng LX-5 | i i 0,205 3,38 1 1 | 2530 | i i 520 | i

Примечание: Ка - константа скорости деградации Кг - константа скорости синтеза 11/2 - время функционирования Е - концентрация белка

P.quinquefollus подтвердило обнаруженное ранее сходство перокси-дазы из Р. ginseng LX-5 и P. quinquefol lus. Установленное наш время "полужизни" пероксидазы в клетках культур ткани женьшеня было втрое меньше времени функционирования фермента в суспензионной культуре арахиса. Одним из объяснений этого может быть меньшая степень гликозилирования пероксидазы женьшеня, результатом чего является ускорение деградации фермента (Maranon,Van Huys-tee,1994).

Влияние теплового шока на активность, изоферментный спектр и обмен пероксидазы в процессе культивирования штаммов женьшеня. Изученное в данной работе влияние низких и высоких температур на состояние пероксидазы в культурах ткани женьшеня является распространенным видом стресса, часто применяемым для решения различных исследовательских задач. Как низко-, так и высокотемпературный шок воздействует на программу белкового метаболизма клетки и индуцирует синтез "стрессовых" белков, способствующих адаптации растения к новым условиям. Влияние температурного стресса на обмен пероксидазы и тотального белка оценивалось в каллусной культуре ткани Р.ginseng LX-5 (таблицы 4,5). С целью определения обратимости изменений,. происходящих в клетке при действии экстремальных температур, проводилось две серии опытов, в которых кругооборот пероксидазы и тотального белка оценивался непосредственно после стресса и после 24-часового адаптационного периода при 26°С.

Было установлено, что как при низко-, так и высокотемпературном шоке в клетках Р.ginseng LX-5 содержание общего белка и пероксидазы возрастало. Причем, изменения в концентрации пероксидазы были более значительными (37,3% и 47,1% соответственно), чем для белка (17,4% и 4,0% соответственно). Это может служить косвенным подтверждением высокой изменчивости пероксидазы в ответ на воздействие экстремальных температур. Увеличение концентрации как общего белка, так и пероксидазы в условиях низкотемпературного стресса происходило на фоне снижения скорости их синтеза (на 70,4% и на 13,3% соответственно) и увеличения стабильности (на 75% и 36,8% соответственно). Наши данные сопоставимы с результатами, полученными Карасевым и соавторами (1994). В ходе изучения обмена водорастворимых белков озимой пшеницы при действии низких

Обмен пероксидазы в культуре ткани женьшеня Р. ginseng LX-5 при низко- и высокотемпературном шоке.

|7°С, 24 часа 1 I 0,120 1 5,78 I 1 1 70,0 | I I 8,40 |

j26°C, 24 часа 1 I 0,191 1 3,63 1 1 1 72,0 | I i 13,75 |

|45°С, 3 часа 1 | 0,215 1 3,22 1 1 1 75,0 | i i 16,13 |

|26°С, 24 часа i 1 | 0,195 i 3,55 1 1 1 61,0 | i i 11,90 | i

Таблица 5

Обмен общего белка в культуре ткани женьшеня Р.ginseng LX-5 при низко- и высокотемпературном шоке.

1 |7°С, 24 часа i 1 | 0,052 i 13,33 1 I | 2970 | 1 i 154 |

1 |25°С, 24 часа i 1 | 0,220 I 3,15 I 1 | 2960 | I i 651 |

1 |45°С, 3 часа i 1 I 0,199 i 3,48 1 1 | 2630 | i i 523 |

1 |26°С, 24 часа i 1 | 0,191 i 3,63 i 1 1 I 2630 | i i 502 | i

температур они также обнаружили эффект накопления белковых молекул в результате нарушения соотношения скоростей их синтеза и деградации в условиях интенсивного торможения ростовых процессов. Падение скорости синтеза при низких температурах может быть связано с подавлением процессов транскрипции и трансляции, а уменьшение скорости регулируемого распада - со снижением активности специфических протеиназ пероксидазы.

При действии высоких температур, когда в обмене общего белка значительных изменений не было обнаружено, увеличение концентрации пероксидазы в клетках было вызвано резким ускорением синтеза фермента (на 66,5%) при некотором снижении его стабильности (13%). Возможно, что усиление синтеза пероксидазы было обусловлено необходимостью быстрой утилизации токсичных перекисных соединений, накопление которых было вызвано увеличением энергетических потребностей клеток и изменением потребления ими кислорода. В свою очередь, это могло вызвать и более интенсивное старение фермента. Также ускорение деградации пероксидазы могло происходить в результате восстановления межпептидных S-S связей, что было отмечено при различных стрессовых воздействиях для других белков (Со-oke et al.,1979) и изменением при стрессе проницаемости мембран, в частности, тонопласта (Сооке et al.,1980).

24-часовая адаптация после температурного шока практически не влияла на концентрацию тотального белка в культивируемых клетках. В то же время, содержание пероксидазы через сутки после высокотемпературного шока приближалось к контрольному уровню, а после низкотемпературного еще несколько повысилось, что, возможно, отражает метаболические потребности клетки в изменившихся условиях. Полученные результаты указывают на более сильное повреждающее действие низких температур: если через 24 часа после действия высоких температур константы скорости синтеза и деградации пероксидазы приближались к норме, то после низкотемпературного стресса на фоне нормализации скорости спонтанного распада ферментативного белка скорость его синтеза возрастала на 41,9%, что приводило к повышению содержания пероксидазы в клетках Р.ginseng LX-5.

Увеличению содержания ферментативного белка при действии экстремальных температур соответствовало возрастание активности пероксидазы (рисунки 6-9). Сравнительная оценка влияния темпера-

e/s/ntcts

Рис. 6 Динамика активности пероксидазы при температурном шоке (7° - 1, 45° - 2) и через сутки после стресса (3,4) в Р.ginseng.

го

i so

Рис. 7 Динамика активности пероксидазы при температурном шоке (7° - 1, 45° - 2) и через сутки после стресса (3,4) в Р.дШпдиеГоПиг.

Л7

агтхи

Рис. 8 Динамика активности пероксидазы при температурном шоке (7° - 1, 45° - 2) и через сутки после стресса (3,4) в Р.ginseng LX-5.

*о

еутхи

Рис. 9 Динамика активности пероксидазы при температурном

шоке (7 - 1,

45° -

2) и через сутки после стресса

(3,4) в Р.ginseng LX-13.

турного стресса на уровень пероксвдазной активности в различных каллусных культурах женьшеня показала тенденцию, установленную в стандартных условиях культивирования: близость "ответа" при действии экстремальных температур в Р.quinquefolios и штаммах Р.ginseng. выращенных на средах с добавлением препаратов германия: в них наблюдалось достоверное увеличение активности пероксидазы (в Р.ginseng LX-5 оно достигало 99% при действии низких температур и 91% при высоких, в P.ginseng LX-13 - 93% и 35%, в P.quinquefolius - 63% и 70% соответственно), в то время как в штамме Г.ginseng активность фермента изменялась незначительно, снижаясь лишь на начальных этапах культивирования на 40% при низко- и на 55% при высокотемпературном стрессе. При изучении влияния температурного стресса на пероксидазную активность в культурах ткани женьшеня были подтверждены данные о более сильном повреждающем действии низкотемпературного шока, которому в большинстве случаев соответствовал более высокий уровень активности фермента. Возможно, что одной из причин этого была длительность низкотемпературного воздействия.

Действие экстремальных температур вызывало также изменение относительной активности отдельных молекулярных форм пероксидазы, что согласуется с данными других авторов (Савич,1989; McCown et al.,1970). Низкотемпературный стресс оказывал более сильное влияние на изоферментный спектр пероксидазы, чем высокотемпературный. Наиболее значительные изменения установлены для медленно- и быст-ромигрирующих изоформ, отклонения в активности которых колебались в пределах 30, 23% (P.ginseng). 40. 28% (P.ginseng LX-5), 25, 8% (P.ginseng LX-13), 22, 12% (P.quinquefolius) соответственно. При действии температурного стресса прослеживалась тенденция к увеличению доли медленноыигрирующих и снижению содержания быстромигри-руюших по отношению к аноду множественных молекулярных форм пероксидазы. Данная тенденция была менее выражена на сроках, соответствующих максимальной активности фермента. Более глубокими эти изменения были, как правило, через 24 часа после шока.

Общепризнано, что изменения в изоферментном спектре пероксидазы способствуют нормальному протеканию метаболических процессов в стрессовых условиях (Савич,1989; Титов,1975). Имеется небольшое число работ описательного характера по этой тематике, в которых не оценивали уровень активности отдельных изоформ пероксидазы при

стрессе. Сопоставление с данными литературы также осложнялось использованием исследователями различных субстратов для выявления зон с пероксидазной активностью, что могло служить источником ошибок, поскольку отдельные изоформы характеризуются различной субстратной специфичностью (Андреева, 1988; Газарян.1992; Сарсен-баев и соавт.,1986; Gaspar et al., 1982)'.

Таким образом, сопоставление штаммов женьшеня показало значительные отличия в их биосинтетической способности как по отношению к общему бедку, так и к пероксидазе, что может указывать- на определенные метаболические различия, связанные с обменом кислорода в клетках каллусных культур. Изучение влияния низко- и высокотемпературного стресса на уровень активности, молекулярную гетерогенность и обмен пероксидазы подтвердило данные о повышенной чувствительности этого фермента к действию стресс-факторов и его вкладе в обеспечение функционирования клетки в изменившихся условиях.

ВЫВОДЫ

1. В штаммах Р.ginseng и Р.quinquefolius установлено наличие одного максимума активности пероксидазы на 10-е и 40-е сутки культивирования соответственно. Сравнение штаммов показало возрастание активности фермента в Р.quinquefolius в 4,5 раза, сопровождаемое увеличением числа изоформ пероксидазы.

2. Установлено, что культивирование Р.ginseng на средах, обогащенных органическими препаратами германия, приводит к появлению максимума активности фермента на поздних сроках культивирования, повышению активности пероксидазы в 4,5 раза и усложнению ее изоферментного спектра, что приближает эти штаммы по вышеназванным характеристика),! к Р.quinquefolius.

3. Разработан метод выделения и очистки пероксидазы из культуры ткани Р.ginseng, выращенной на селективной среде LX-5. Выход ферментативного белка составлял 287. при степени его очистки в 66 раз. Идентифицированы две изоформы пероксидазы с молекулярными массами 29 и 31 кДа, оптимум рН фермента 4,2.

4. Впервые исследованы синтез и стабильность пероксидазы и общего белка в культурах ткани Р.ginseng, Р.ginseng LX-5, Р.quinquefolius. Показано значительное увеличение скорости синтеза фер-

мента как в клетках Р.quinquefoli us, так и в селективном штамме.

5. Изучено влияние температурного шока на активность, молекулярную гетерогенность и обмен пероксидазы в культивируемых клетках женьшеня и панакса пятилистного. Установлено увеличение концентрации фермента, сопровождаемое существенным снижением скорости его деградации при действии низких температур и значительным ускорением синтеза под влиянием высоких.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. KomovV.P., Kirillova N.V., Troitskaya L.A. "The properties of peroxidase from callus culture of Panax", thesis, the 6th International Ginseng Symposium, Seoul, Korea, 1993.

2. Комов В.П., Троицкая Л.А., Кириллова H.В., Слепян Л.И. "Влияние экстремальных воздействий на состояние пероксидазы дазы в различных штаммах культуры ткани женьшеня", тезисы, 2й Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, Россия, 1993, с.147,378.

3. Троицкая Л.А., Кириллова Н.В., Комов В.П."Изучение пероксидазы в различных штаммах каллусной культуры женьшеня", тезисы, Зй съезд Всероссийского общества физиологов растений, С-Петербург, Россия, 1Q93, с.219.

4. Троицкая Л.А., Кириллова Н.В., Комов В.П. "Выделение и очистка пероксидазы из каллусной культуры ткани женьшеня", тезисы, Всероссийская научная конференция "Химия и технология лекарственных веществ", С-Петербург, Россия, 1994, с.31.

Информация о работе

Троицкая, Лариса Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 1995
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы