Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование иммуностимулирующей активности белковых компонентов из культуры ткани женьшеня

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование иммуностимулирующей активности белковых компонентов из культуры ткани женьшеня"

Оз

^ Министерство здравоохранения Российской федерации

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ГРАЧЕВА Юлия Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ ИЗ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

ЖЕНЬШЕНЯ

Специальность 03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соиска1ше ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Министерство здравоохранения Российской федерации

САНКТ — ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ГРАЧЕВА Юлия Александровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ ИЗ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

ЖЕНЬШЕНЯ

Специальность 03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена на кафедре биологической химии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Комов В. П. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лызлова С.Н. доктор медицинских наук, профессор Щербак И.Г.

Ведущая организация:

Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт гриппа

/А

Защита состоится мая 1998 г. в ' часов

на заседании диссертационного Совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской Государственной Химико - Фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат диссертации разослан С'МЪ^Ъ^Л-? 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Н.В. Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследований.

В связи с ростом иммунодефицитов и аутоиммунных заболеваний в настоящее время актуален поиск новых малотоксичных иммуномодуляторов. Расширение спектра таких препаратов возможно за счет БАВ растительного происхождения, которые в ряде случаев оказываются более эффективными, чем исходные многокомпонентные растительные экстракты. С целью сокращения сроков получения растительной биомассы весьма перспективно использование культуры ткани растений. Благодаря успехам в развитии клеточной инженерии стало возможным создание различных штаммов - суперпродуцентов БАВ, представляющих интерес в медицине. Большой интерес исследователей вызывают биологически активные компоненты такого представителя семейства Аралиевых (Araliaceae), как женьшень. В ряде работ установлено иммуностимулирующее действие гликозидов и полисахаридов из женьшеня (Masashi et al.,1993; Lee et al., 1997). Таким образом, корень женьшеня прочно зарекомендовал себя как источник ценных БАВ.

На протяжении последних лет в СПХФА проводятся исследования по разработке новых штаммов культуры ткани женьшеня. Путем перевода стандартного штамма ИФРЖ-5 на агаризоваиную питательную среду, содержащую германийорганическое соединение, был получен селективный штамм Панакс-13, с выраженным иммуностимулирующем действием. В экспериментах in vivo установлено, что настойка его биомассы способствовала усилению продукции интерферона и обладала противоопухолевой активностью (Слепян и др., 1986; Беспалов и др., 1993; Slepyan et al., 1994) . Было предположено, что наблюдаемый эффект обусловлен белковым компонентом биомассы женьшеня, поскольку в литературе имеются сообщения об иммуностимулирующей активности растительных белков и гликопротеинов .

Цель и задачи работы. Данное исследование проведено с целью изучения in vivo биологической активности белкового компонента из культуры ткани женьшеня в отношении неспецифического иммунного ответа и микросомальных монооксигеназ печени. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать схему выделения и очистки белкового компонента из биомассы культивируемых клеток женьшеня.

2. Угтановить компонентный и аминокислотный состав выделенных белковых фракций.

3. Изучить эффект действия белковых фракций из культуры ткани женьшеня на некоторые маркерные ферментные системы различных иммунокомпетентных клеток.

4. Определить способность белковых фракций восстанавливать угнетенный иммунодепрессантом иммунный ответ.

5. Оценить действие белков из культуры ткани женьшеня на изменение уровня монооксигеназ печени.

Научная новизна. Впервые получены белковые компоненты из культурь ткани женьшеня стандартного штамма ИФРЖ-5 и селективного штамма Панакс-13, выращенного на питательной среде с соединением германия. Обнаружень различия в биологической активности белковых фракций из селективного v стандартного штаммов, обусловленные особенностями их компонентноп состава. Установлено стимулирующее действие фракций из биомассы женьшен: штамма Панакс-13 на маркерные ферментные системы перитонеальны: макрофагов, нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов крови и клеток тимуса Выявлена иммунокорректирующая активность у белков и гликопротеинов и селективного штамма женьшеня в отношении фагоцитоза и некоторых маркеро

макрофагов на фоне экспериментатыюй иммуносупрессии. Изучено воздействие фракций Панакс-13 на уровень монооксигеназ детоксикациоиной системы печени.

Теоретическое и практическое значение. В результате выполнения работы оптимизированы методы выделения и очистки белкового компонента из биомассы женьшеня, что позволило получить белковые фракции с достаточно высоким выходом. Полученные результаты доказывают, что белки и гликопротеины обусловливают выраженное иммуностимулирующее действие комплексных препаратов биомассы Панакс-13. Учитывая этот факт, экспериментальные данные помогают определить подходы к объяснению механизмов действия in vivo настойки биомассы селективного штамма женьшеня, а также расширить представления о природе белково-пептидных иммуностимулирующих агентов. Результаты оценки влияния фракций из Панакс-13 на уровень микросомальных цитохромов гепатоцитов служат очередным подтверждением концепции реципрокных отношений между иммунной системой и Р-450 - зависимыми монооксигеназами печени, а также дают ценную информацию о спектре фармакологического эффекта выделенных белковых фракций.

Положения , представляемые на защиту.

1. Биомассы стандартного штамма женьшеня ИФРЖ-5 и селективного штамма Панакс-13 содержат белковые компоненты, отличающиеся по своему составу и биологической акгивности в отношении иммунной системы.

2. Белковые фракции из селективного штамма в экспериментах in vivo усиливают неспецифическую резистентность и проявляют стимулирующую активность в отношении маркерных ферментных систем перитонеальных макрофагов, нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов крови, клеток тимуса.

3. Высокомолекулярная и низкомолекулярная фракции оказывают различное влияние на уровень метаболизма ксенобиотиков , что может свидетельствовать о различных мояекулярно - клеточных механизмах их действия .

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международном Научном Конгрессе студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодежь и наука- третье тысячелетие" в Москве в 1996 г. , Всероссийской Научной Конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств " в Санкт-Петербурге в 1996 г., III и IV Российском Научном Конгрессе " Человек и лекарство " в.Москве в 1996 и 1997 гг.

Объем работы. Текст диссертации изложен на страницах и иллюстрирован 13 таблицами, 8 диаграммами и 4 рисунками. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования , экспериментальных данных и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 249 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали культуру ткани женьшеня штаммов Ралах ginseng ИФРЖ-5 ВСКККВР N 11, выращенную на стандартной агаризованной питательной среде Мурасиге в модификации Писецкой (1970) и селективного штамма Panax ginseng LX-13 ИФРЖ-5 ВСКККВР N 26 (Папакс-13). Штамм Панакс-13 был получен путем перевода штамма ИФРЖ-5 на среду, содержащую германийорганическое соединение. Культуру ткани женьшеня поддерживали периодической пересадкой на свежую питательную среду. Продолжительность одного пассажа составляла 30 - 35 суток. Белковые фракции получали методами гель-хроматографии и ионо-обменной хроматографии. Компонентный состав фракций определяли с помощью электрофореза в ПААГ по методу Девиса (Davis, 1964). Окрашивание гелей на гликопротеины проводили по разработанной нами методике, состоящей в последовательной обработке гелей 1 % раствором NaI04 в течение 30 мин., 2 % раствором Na2S03 20 мин. и фуксинсернистой кислотой 15 мин.

В работе использовали мышей - самцов линии СВА весом 18 - 20 г. Белковые фракции вводили мышам внутрибрюшшшо в дозе 1 мг / кг однократно. В параллельных опытах по оценке действия белковых фракций на иммунный ответ и на уровень монооксигеназ печени исследуемые белковые компоненты вводили животным трехкратно в дозе 1 мг / кг с интервалом между инъекциями 24 часа. Тимоген, тималин, конканавалин А вводили мышам внугрибрюшинно в дозах 0.02 мг/кг, 0.2 мг/кг и 1 мг/кг соответственно. Для создания иммуносупрессии мышам вводили внутрибрюшинно Акгиномицин D в дозе LD 50 за сутки до стимуляции животных белковыми фракциями из культуры ткани женьшеня. Нейтрофилы и моноциты получали фракционированием крови мышей в градиенте плотностей верографина и фиколла. Интенсивность продукции 0{ оценивали по скорости восстановления нитросинего тетразолия (Nishikimi et. al, 1972) в лизатах клеток. Определение содержания цитохромов проводили по методу Омура и Сато (Omura, Sato, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Установлено, что штаммы ИФРЖ-5 и Панакс-13 характеризуются одинаковыми белковыми профилями с двумя пиками в областях порядка 160 кДа (высокомолекулярная фракция) и 10 кДа (низкомолекулярная фракция). На электрофореграмме высокомолекулярной фракции из Панакс-13 было обнаружено семь белковых зон, низкомолекулярной - пять (Рие.1). Высокомолекулярная фракция из штамма ИФРЖ-5 содержала пять компонентов, а низкомолекулярная -только два. Расширение компонентного спектра фракций, выделенных из селективного штамма Панакс-13, видимо, связано с индукцией ряда генов германийорганическим соединением, присутствующим в питательной среде. Возможность такой экспрессии генома косвенно подтверждается тем фактом, что культивирование клеток женьшеня на среде с германийорганическим

соединением сопровождается обязательным накоплением его в биомассе в количестве 0.1-0.2 % (Слепян и др., 1986).

190 кДа

170 кДа 168 кДа

151 кДа 151 кДа

144 кДа

125 кДа 124 кДа

60 кДа 59 кДа

43 кДа 43 кДа

17.4 кДа

11.5 кДа

4.9 кДа 5.0 кДа

3.8 кДа 3.9 кДа

- 2.6 кДа

1 2 1 2

Штамм Панакс - 13 Штамм ИФРЖ- 5

Рис. 1. Компонентный состав белковых фракций из биомассы женьшеня штаммов ИФРЖ-5 и Панакс-13.

Примечание: 1-высокомолекулярная фракция, 2 - низкомолекулярная фракция.

С помощью специфической окраски электрофореграмм было установлено, что компоненты с молекулярными массами 190кДа, 170кДа, 3.8кДа и 4.9кДа являются гликопротеинами.

В последние годы при изучении иммуностимулирующей активности БЛВ часто применяют биохимические методы анализа маркерных ферментных систем иммунокомпетентных клеток. Большое распространение при отборе иммуностимуляторов получил тест определения активности 5' - нуклеотидазы (Кирилличева и др.,1993). Показано, что снижение активности этого мембранного фермента свидетельствует об активации иммунокомпетентных клеток (D'Alesandro, 1985; Мастернак и др., 1994). Полагают, что это связано с созданием условий для наименьшего образования и проникновения внутрь клетки аденозина - известного супрессора многих функций иммуноцитов ( Feng et al., 1994). Активность 5'-нуклеотидазы определяли через 24 часа после внутрибрюшинной инъекции мышам белковых фракций, выделенных из биомассы женьшеня штамма Панакс-13 от разных пассажей и штамма ИФРЖ-5. Для сравнения изучали действие на 5'-нуклеотидазу известных белково-пептидных иммуностимуляторов: тимогена, тималина, и конканавалина А. Как показали результаты (Таб.1), белковые фракции, выделенные из биомассы штамма ИФРЖ-5 оказывали незначительное действие на активность маркерного фермента макрофагов 5'-нуклеотидазу. В ходе исследований удалось проследить изменение биологической активности белковых фракций в процессе вновь осуществляемого перевода штамма ИФРЖ-5 на среду с германийорганическим соединением с целью получения селективного штамма Панакс-13. В течение нескольких пассажей (продолжительность одного пассажа 30 - 35 суток ) эффект высоко- и низкомолекулярной фракции на 5' - нуклеотидазу возрастал от пассажа к пассажу. Постепешюе усилении эффекта фракций из Панакс-13 на 5'-нуклеотидазу макрофагов свидетельствует о приобретении ими иммуностимулирующей активности вследствие появления новых белковых компонентов, которые вносят иммуностимулирующие свойства в биологическую активность фракций. При изучении действия белковых фракций из селективного

штамма к VI - VII пассажам наблюдали стабилизацию эффекта. К этому сроку процесс накопления германийорганического соединения в биомассе достигает стационарной фазы (Слепянидр., 1986).

Таблица 1.

Изменение активности 5'-нуклеотидазы под воздействием белковых фракций.

Штамм, пассаж Фракция Активность 5'-нуклеотидазы, Е/мг

Норма 10,7 + 0,37

ИФРЖ-5 высокомолекулярная 9,3 + 0,53

низком олекулярная 9,6 + 0,50

Панакс -13, III высокомолекулярная 10,2 + 0,42

Панакс - 13, IV высокомолекулярная 7,3 + 0,58

низкомолекулярная 6,8 + 1,9

Панакс -13. V высокомолекулярная 2,2 + 0,25

низкомолекулярная 3,7 + 0,17

Панакс -13, У1+УП высокомолекулярная 4,7 + 0,34

низкомолскулярная 3,2 + 0,22

Результаты эксперимента показали, что фракции из биомассы Панакс-13

оказывали на 5'-нуклеотидазы действие сопоставимое с эффектом тимогена,

тималина и конканавалина А.

Известно, что фагоцитоз является наиболее важной функцией макрофагов,

нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов крови. Изучение изменения

интенсивности фагоцитоза позволяет получить информацию воздействии

10

иммуностимулятора на уровень неспецифической защиты организма (Алехин,1994). Влияние белковых фракций из биомассы Панакс-13 на фагоцитоз анализировали по скорости абсорбции внутривенно введенной туши через 24 часа после стимуляции животных. В случае высокомолекулярной фракции скорость фагоцитоза туши составила 182 % от контроля, в случае низкомолекулярной -195 %.

Переваривающая способность фагоцитирующих клеток во многом обусловлена уровнем активности их гидролитических ферментов (Маянский, 1989). В данном аспекте вызывало интерес изменение активности протеолитических ферментов эластазы, катепсина D и неспецифической эстеразы - кислой фосфатазы (Ivanova et al., 1988) на различных сроках после стимуляции мышей белковыми фракциями из биомассы Панакс-13. Известно, что эластаза играет ведущую роль в деградации нативных белков на ранних этапах активации фагоцитов (Travis et al., 1980; Virca et al., 1984). Поэтому изменение эластазной активности под воздействием фракций из Панакс-13 изучали на более ранних сроках.

Установлено, что эффект низкомолекулярной фракции на активность эластазы различных видов фагоцитов превосходил таковой высокомолекулярной фракции преимущественно через сутки после иммунизации мышей (Таб. 2, 3, 4). Предположительно увеличение активности эластазы фагоцитов может происходить за счет усиления синтеза мРНК. С другой стороны, увеличение активности Са2+- зависимой формы эластазы, идентифицированной в макрофагах (Travis et al., 1980) может быть следствием усиления потока кальция в клетку, которое наблюдается при активации фагоцитов.

Таблица 2

Влияние белковых фракций на активность гидролитических ферментов

макрофагов.

Фермент Фракция Активность ферментов, Е / мг

2 часа 24 часа 5 суток 7 суток

Эластаза Норма 17.21 + 1.53

Высокомолекул. 25.26±5.95 24.60±3.68 - 19.50±2.74

Низкомолекул. 15.56i4.99 42.20i2.23 - 43.45±0.34

Катепсин Б Норма 2.13 ±.0.01

Высокомолекул. - 2.57±0.13 2.90±0.49 3.08^0.43

Низкомолекул. - 2.08 ±0.23 3.26±0.37 3.62±0.09

Кислая фосфа-таза Норма 8.60 ± 0.49

Высокомолекул. - 7.13± 0.43 7.29± 0.91 7.78±0.52

Низкомолекул. - 8.60±0.30 8.47±0.85 8.28± 1.05

Таблица 3

Воздействие белковых фракций на эластазную активность нейтрофилов.

Фракция Активность эластазы , Е / мг мин.

1 час 2 часа 24 часа

Норма 7.5

Высокомолекулярная 14.3 14.7 10.2

Низкомолекулярная 14,3 10,6 19,0

Таблица 4

Влияние белковых компонентов на активность эластазы моноцитов.

Фракция Активность эластазы, Е / мг мин.

1 час 2 часа 24 часа

Норма 6.1

Высокомолекулярная 8.9 6.5 11.3

Низкомолекулярная 8.1 9.5 12.0

В отношении катепсина D эффективнее оказалась низкомолекулярная фракция. Максимальное возрастание активности катепсина D наблюдали к 7 суткам после стимуляции мышей. Этот факт согласуется с данными литературы, поскольку установлено, что при стимуляции макрофагов активность катепсина D достигала максимальных значений через несколько суток (Васильев и др., 1990).

Активация фагоцитов как правило сопровождается усилением генерации цитотоксичных кислородных метаболитов. (Pabst, 1980; Ягнзггинская, 1985). Так как процесс выработки свободных радикалов начинается сразу после контакта фагоцита со стимулятором (Маянский, 1989), то уровень генерации О^ макрофагами, моноцитами и нейтрофилами оценивали на ранних этапах после стимуляции животных фракциями из биомассы Панакс-13 (Рис.2,3,4). На модели этих клеток показано усиление окислительного взрыва, в тесте с нитросиним тетразолием. Низкомолекулярная фракция оказалась несколько активнее в отношении продукции Ог во всех видах изучаемых фагоцитирующих клеток. Согласно данным литературы, выработку Од в фагоцитах осуществляют мембранные НАД(Ф)Н - оксидазы, которые активируются либо протешпсиназой С (Adams 1986; Kamdiz et al., 1995), либо кальмодулином (Shimomiya et al., 1995) при усилении потока кальция в клетку. По-видимому, действие белковых фракций

запускает механизм каскадного фосфорилирования белков, приводящий к активации протеинкиназы С или кальмодулина.

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

I

ДА

□ 1 фракция □2 фракция ЕЗ Норма

¿я

_1_

1 час 2 часа 24 часа Норма срок после стимуляции

Рис. 2. Изменение интенсивности генерации О'г макрофагами. Примечание : 1-высокомолекулярная фракция, 2-низкомолекулярная фракция.

200 180 160 140 120 % 100 80 60 40 20 0

1 час 2 часа 24 часа срок после стимуляции

□ 1 фракция

□ 2 фракция В Норма

Норма

Рис.3. Влияние белковых фракций на продукцию (V нейтрофилами. Примечание: 1-высокомолекулярная фракция, 2-низкомолекулярная фракция

срок после стимуляции

Рис. 4. Воздействие белковых фракций на генерацию ОгГ моноцитами.

Примечание: 1-высокомолекулярная фракция, 2-низкомолекулярная фракция.

Известно, что гиперфункция активных форм кислорода может вызывать повреждение клеточных мембран и связанное с этим подавление функций фагоцитов (Алехин 1994). Учитывая, что на всех сроках исследования активность супероксиддисмутазы в изучаемых фагоцитах была следовой, можно полагать, что уровень генерации 0£ не выходил за рамки физиологической нормы. Изучение изменения активности каталазы перитонеальных макрофагов показало, что при стимуляции обеими фракциями активность фермента резко увеличивалась, достигая максимальных значений через 2 часа после инъекции. Так как каталаза является индуцибельным ферментом, то причиной возрастания ее активности может быть только увеличение внутриклеточного содержания Н2О2. Известно, что макрофаги в процессе активации способны продуцировать Н2О2 независимо от (Манько и др., 1985). Поскольку в дайной работе не Оценивали эту функцию макрофагов, можно предположить, что интенсивность генераций перекиси водорода превышала уровень продукции О^.

При изучении влияния белковых фракций на пероксидазную активность нейтрофилов в их эффекте были обнаружены существенные различия. Согласно полученным данным (Таб.5) низкомолекулярная фракция способствовала возрастанию активности внутриклеточной пероксидазы на всех сроках после инъекции. В случае высокомолекулярной фракции в первые два часа регистрировали снижение пероксидазной активности.

Таблица 5

Изменение активности пероксидазы нейтрофилов.

Фракция Активность пероксидазы, Е / мин. Мг

1 час 2 часа 24 часа

Норма 0,53

Высокомолекулярная 0,32 0,20 1,22

Низкомолекулярная 1,49 1,62 1,06

Сложностью в трактовке результатов является затруднение идентификации определяемых видов перокеидаз. Хотя различные виды пероксидаз характеризуются субстратной специфичностью, однако, общепринятые методы определения их активности не позволяют должным образом выявить их вклад в регистрируемый уровень пероксидазной активности (Шафран, 1981). Известно, что нейтрофилы характеризуются высоким содержанием миелопероксидазы и относительно небольшим - глутатионпероксидазы (Шафран, 1981; Кулинский и др., 1993; Морозов и др., 1997). Поэтому, исходя из данных литературы, вероятнее всего, что применяемый в данной работе метод с использованием в качестве субстрата о-фенилендиамина позволил определить активность этих видов пероксидаз с преимущественным вкладом миелопероксидазы. Предполагается, что снижение активности внутриклеточной пероксидазы

16

нейтрофилов мышей, стимулированных высокомолекулярной фракцией, связано с усилением его секреции на ранних сроках исследования. Действие пизкомолекулярной фракции, напротив, приводит к накоплению пероксидазы внутри клетки в течение всего времени после стимуляции животных.

Данные по оценке эффекта белковых фракций на гидролитические ферменты клеток тимуса не выявили существенных различий в их действии. Максимальное увеличение активности эластазы и кислой фосфатазы в клетках тимуса белковые фракции вызывали преимущественно на 7 сутки исследования (Таб.6). Активность катепсина Б, напротив, была наибольшей через 24 часа после стимуляции животных с тенденцией к нормализации на более поздних сроках. Этот факт согласуется с данными литературы (Васильев и др., 1990).

Таблица 6

Влияние белковых фракций на ферментные системы клеток тимуса.

Фермент Фракция Активность ферментов, Е / мг

2 часа 24 часа 5 суток 7 суток

Эластаза Норма 22.00

Высокомолекулярная 21.4 - 25.9 28.4

Низкомолекулярная 20.9 - 25.7 22.9

Катепсин Б Норма 1.62

Высокомолекулярная - 2.44 1.71 1.58

Низкомолекулярная - 2.36 1.89 1.86

Кислая фосфатаза Норма 3.40

Высокомолекулярная - 3.88 2.49 5.70

Низкомолекулярная - 5.90 3.82 6.95

В следующей серии экспериментов анализировали способность белковых фракций из селективного штамма женьшеня восстанавливать угнетенный иммунный ответ. Изменения интенсивности иммунного ответа мышей анализировали по уровню генерации 0{, активности эластазы перитонеальных макрофагов и скорости абсорбции внутривенно введенной туши (Таб. 7, Рис.5, 6). Актиномицин Д через сутки после введения мышам вызывал снижение фагоцитоза туши на 25% , генерации Ог" макрофагами - на 15% , активности эластазы на - 40% по сравнению с интактными животными. Установлено, что следствием действия актиномицина Д in vivo является уменьшение количества лейкоцитов в крови экспериментальных животных (Терентьева, 1971). Очевидно, что снижение значений скорости фагоцитоза обусловлено этим патологическим процессом. Одна из причин ингибирующего действия антибиотика на генерацию 02~, видимо, связана с блокировкой транскрипции ДНК и прекращением синтеза соответствующих ферментов, катализирующих выработку активных радикалов (НАД(Ф)Н-оксидазы, ксантиноксидазы и т.д.). Аналогичные предположения могут быть выдвинуты и в отношении эластазы.

Таблица 7

Изменение эластазной активности макрофагов на фоне иммуносупрессии.

Препарат Активность эластазы, Е / мг мин.

2 часа 24 часа

Норма 17.21 ± 1.53

Актиномицин Д 10.21 ± 0.62 8.84 i 0.53

Ак-н Д+Высокомолекулярная фракция 13.68 ± 1.00 19.66 i 0.80

Ак-н Д+Низкомолекулярная фракция 41.57 ± 5.24 35.00 ± 3.52

ií

2 часа

ВАс О

□ Ас 0+1 фракция

□ Ас СН-2 фракция

□ Норма

24 часа Норма срок после стимуляции

Рис.5. Влияние белковых фракций на скорость клиренса туши. Примечание: АсБ - Актиномицин Д, 1 - высокомолекулярная фракция, 2 -н и з ком о л е кул яр н ая фракция.

%

300 -

250 -

200 -

150 -

100 - -

50 0 "Е§ ■А

X

Ас О

□Ас 0+1 фракция □ Ас 0+2 фракция ВНорма

2 часа 24 часа Норма

срок после стимуляции

Рис. 6. Изменение интенсивности продукции Од в макрофагах. Примечание : Ас Б - Актиномицин Д, 1 - высокомолекулярная фракция, 2 - низкомолекулярная фракция

Введение животным белковых фракций не только приводило к полной реабилитации анализируемых параметров, но и в большинстве случаев способствовало их росту выше нормальных значений, особенно через 24 часа после стимуляции. Депрессивное воздействие актиномицина Д на животных, не стимулированных белками из женьшеня, на этом этапе усиливалось. Согласно полученным данным, высокомолекулярная фракция проявляла более сильное иммунокорректируюшее воздействие в отношении фагоцитоза. Действие низкомолекулярной фракции отличается большей эффективностью на восстановление функций макрофагов. Можно предположить, что высоко- и низкомолекулярная фракции характеризуются либо различными механизмами, либо различными точками приложения иммунокорректирующего действия.

Иммуностимулирующую активность препаратов белково - пептидной' природы исследователи связывают с их аминокислотным составом (Демин и др.. 1994). Таким образом, для оценки возможных молекулярно - клеточных механизмов действия выделенных белковых фракций был изучен состаг мажорных аминокислот. В результате оказалось, что высокомолекулярна! фракция содержала наибольшее количество аспарагиновой кислоты -1.29 mkM/mi белка, лизина - 1.16 мкМ/мг белка и аргинина - 0.96 мкМ/мг белка. В состав! низкомолекулярной фракции обнаружено доминирование глутамшювой кислоты 0.70 мкМ/мг белка и аспарагиновой кислоты - 0.62 мкМ/мг белка. Тенденции преобладания глутаминовой кислоты и лизина в общем белке биомассь характерна и для других штаммов женьшеня (Александрова и др., 1979) .

Из литературы известно, что многие белково-пептидные иммуно стимуляторы характеризуются высокой гидрофильностыо ( Мартынов и др., 1986 Демин и др., 1994; Кайдашев, 1996). Полагают, что связывание белковы иммуностимуляторов с рецепторами клеток осуществляется за сче взаимодействия их полярных групп (Демин и др., 1994; Беседнова и др., 1996

Факт преобладания аминокислот с заряженными группами позволил предположить, что реализация иммуностимулирующего действия изучаемых фракций осуществляется по рецепторному механизму. Однако, полученные экспериментальные данные показали, что в большинстве случаев эффект низкомолекулярной фракции был сильнее выражен на более поздних сроках исследования. По-видимому, причина неодинакового действия высоко- и низкомолекулярной фракций заключается в природе составляющих их компонентов. Вероятно, механизмы иммуностимуляции пептидными и высокомолекулярными белковыми веществами на определенных этапах реализации иммунного ответа различны.

В последние годы большой интерес исследователей вызывает проблема функциональных отношений между иммунной системой и цитохром Р-450 -зависимых монооксигеназ печени. Отмечено, что существенным недостатком ряда работ по этой тематике является отсутствие параллельной оценки метаболической активности гепатоцитов и функциональных параметров иммунитета при введении животным однотипных доз препаратов (Картозия и др., 1986; Сибиряк и др., 1992 ). Учитывая этот факт, в данной работе изучено воздействие белковых фракций штамма Панакс-13 на общий уровень фагоцитоза, некоторые маркерные системы перитонёальных макрофагов и на изменение содержания цитохромов Р - 450 и Ь - 5 микросом печени. Согласно полученным результатам трехкратное введение мышам высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций из биомассы штамма Панакс - 13 вызывало более выраженный иммунный ответ по исследуемым показателям, чем однократное. Предполагается, что это происходит не за счет кумуляции компонентов белковых фракций в организме, а скорее вследствие накапливания внутриклеточных веществ, участвующих в реализации стимулирующего сигнала.

При введении мышам исследуемых фракций в аналогичных дозах отмечено, что обе они способствовали снижению уровня микросомальных цитохромов Р-450 и Ь-5 (Таб. 8). Полученные результаты хорошо согласуются с концепцией реципрокных отношений между иммунной и монооксигеназной системой печени, предложенной Ковалевым (Ковалев и др., 1988).

Таблица 8

Изменение уровня цитохромов Р - 450 и Ь - 5 под влиянием белковых фракций .

Фракция Содержание в микросомах

Цитохром Р-450, нМ Цитохром Ь-5, нМ

Норма 0.81 0.98

Высокомолекулярная 0.49 0.44

Низком олекулярная 0.75 0.95

Полагают, что действие стимуляторов иммунитета на микросомальные ферменты опосредовано через активацию макрофагов (Сибиряк и др., 1990, 1992) и выработку интерферона (11еШоп й а1.,1976; Ковалев и др., 1988). Как показали результаты настоящей работы, фракции из биомассы Панакс-13 проявляли стимулирующую активность в отношении изученных функциональных систем макрофагов. Однако, введение низкомолекулярной фракции мышам способствовало лишь незначительному снижению уровня цитохромов Р-450 и Ь-5 в отличие от высокомолекулярной фракции. Этот факт свидетельствует с различных молекулярно - клеточных механизмах действия двух белковых фракций. Учитывая данные литературы, можно предположить, что высоко- к низкомолекулярная фракции в различной степени способствуют секрецш интерферона. Результаты изучения воздействия белковых фракций из культурь:

2

мни женьшеня на монооксигеназные ферменты печени дают важную шформацию о спектре фармакологических эффектов исследуемых фракций, а также служат еще одним доказательством иммуностимулирующей активности «следуемых белковых фракций из биомассы женьшеня штамма Панакс-13.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые обнаружено, что получение селективного штамма женьшеня Панакс-13 путем перевода стандартного штамма ИФРЖ-5 на среду с германием сопровождается появлением новых белковых компонентов с молекулярными массами 190кДа, 144кДа, 17.4кДа, 11.5кДа и 2.6 кДа.

2. Установлено, что белковые фракции из биомассы штамма Панакс-13 проявляют выраженный стимулирующий эффект в отношении макрофагов, сопоставимый с действием тимогена, тималина, конканавалина А.

3. Изучено иммуностимулирующее действие белков из Панакс-13 на маркерные системы перитонеальных макрофагов, нейтрофилов, моноцитов и клеток тимуса. На модели макрофагов, нейтрофилов и моноцитов обнаружена преобладающая иммуностимулирующая активность низкомолекулярной фракции на более поздних сроках исследования.

4. Белковые фракции из биомассы женьшеня штамма Панакс-13 обладают способностью восстанавливать угнетенную актиномицином Д иммунную реактивность мышей по изученным показателям. Причем наиболее эффективной в отношении ферментных систем макрофагов оказалась низкомолекулярная фракция.

5. При изучении влияния белковых фракций из биомассы Панакс-13 на уровень цитохромов печени выявлено, что высокомолекулярная фракция способствует снижению содержания цитохромов Р-450 и Ь-5 в 2 раза, в то время как эффект низкомолекулярцой фракции был незначительным.

Полученные результаты указывают на их различную интерферониндуцирующую активность.

Результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Грачева Ю.А., Стрелкова М.А., Комов В.П. Иммуностимулирующее действие белковых препаратов из культивируемых клеток женьшеня. //В кн.: Тезисы докладов Всерос. Научной Конференции "Актуальные проблемы создания лекарственных средств". С-Петербург. 1996. С. 12-13.

2. Грачева Ю.А., Стрелкова М.А., Комов В.П. Выделение и оценка иммуномодулирующей активности белковых фракций из культуры ткани женьшеня. // В кн.: Труды Междунар. Научного конгресса студентов, аспирантов и молодых ученых "Молодежь и наука - третье тысячелетие". Москва. 1997. Т П. С.131-132.

3. Комов В.П., Стрелкова М.А., Гойло Е.Э., Грачева Ю.А. Иммуномодуляторы из культивируемых клеток женьшеня.// В кн.: Тезисы докладов III Рос. Нац. Конгресса " Человек и лекарство". Москва. 1996. С. 50.

4. Комов В.П., Стрелкова М.А., Грачева Ю.А. Оценка иммуностимулирующей активности белковых препаратов из культивируемых клеток женьшеня. // В кн.: Тезисы докладов IV Рос. Нац. Конгресса "Человек и лекарство". Москва. 1997. С.267.

5. Комов В.П., Стрелкова М.А., Грачева Ю.А. Иммуностимулирующие вещества белковой природы из культуры ткани женьшеня. // В кн.: Тезисы докладов VII Междунар. Конференции "Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда." Москва. 1997. С.492.