Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бета-гликозидазы женьшеня (Panax ginseng, G.A.Meyer).

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бета-гликозидазы женьшеня (Panax ginseng, G.A.Meyer)."

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ, ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ И ТЕХНИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Ростовский ордена-Трудового Красного Знамени i

государственный университет Р V 5 Специализированный сове? К 063.52.09.

v .. На правах рукописи.

УДК 577.154.2.

Тувик Валентина Перфирьевна

р-Гликозадазы женьшеня (Panax ginseng, C.A.Meyer).

■ к». •

(03.00.04-0иологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Ростов на Дону Гээзгод.

Работа выполнена в Научно-исследовательском биологическом институте тгри Ростовском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете.

Научный руководитель- кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Р.М.Кесслер (г. Ростов на Дону). Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

института им. А.Н.Баха РАН В.А.Пасешниченко (г. Москва); кандидат биологических наук, старший научный сотрудник НПО "Дон" А.К.Сулейманов (г.Ростов на Дону). Ведущзя организация: Институт молекулярной биологии и генетики

АН Украины (г.Киев).

Защита диссертации состоится " rií ^ f!993r. на засе-

дании специализированного совета К 063.52.09.-в Ростовском государственном университете (г.Ростов на Дону, ул. Б.Садовая, 105).

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке РГУ.

Автореферат разослан " -3 " б&нГ■¿J/'./ 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Актуальность проблемы. [З-Гликозидазы представляют собой обширную и разнообразную грушу гидролитических ферментов, которые катализируют гидролиз гликозидных связей в различных углеводсо-держащих соединениях. Среда многочисленных функций, осуществляемых р-гликозидазами, следует отметить их важную роль в метаболизме вторичных соединений, разнообразив и богатство которых является отличительным свойством растительного мира. Исследования, касающихся участия (3-гликозидаз в указанных процессах, пока крайне недостаточно. В особенности, это относится к культивируемым тканям растений- продуцентам физиологически активных веществ.

Особое значение изучение активности и свойств [3-гликозидаз в различных органах, тканях, клеточных культурах приобретает в

том ^случае, .-если- в качестве объекта исследования используются

i

ценные лекарственные растения, такие, например, как женьшень.

В корнях и наземной части женьшеня содержатся стероидные глдаозиды- гинзенозиды, обладающие уникальными лекарственными ' свойствами. Стероидные гликозиды из корней женьшеня настоящего (Panax ginseng, C.A.Meyer) обладают ярко выраженной биологической активностью, в том числе адаптогенной, противоопухолевой, антимутагенной, антиоксидантной, противосклеротической и многими другими. Несомненно, что в последние годы при возрастащем дефиците природных препаратов и сырья, большое значение приобретает проблема поиска источников сырья методами биотехнологии и изучение метаболизма гинзенозидов.

Сравнительное изучение {3-гликозидаз в различных органах и культуре тканей женьшеня, динамики ферментативной активности и изоферментного спектра на различных этапах развития растений и роста культуры клеток будет способствовать выяснению механизмов

регуляции активности этих ферментов и их функциональной роли в процессе жизнедеятельности дифференцированных и дедифференциро-ванных клеток.

Изучение активности р-гликозидаз женьшеня может иметь не

только теоретическое, но и практическое значение, поскольку све-

1

дения об их распространении и динамике в различных органах и тканях могут оказаться полезными при выборе сроков сбора, условий хранения и переработки растительного сырья, времени пассирования культивируемых тканей. Активность р-гликозидаз в определенной степени может служить биохимическим индикатором метаболизма стероидных гликозидов.

Цель и задачи исследования.Настоящая работа посвящена изучению активности, свойств и особенностей действия р-глюкозидззы и р-галактозидазы корня, листьев и каллусной культуры женьшеня на синтетические и природные субстраты.

Целью работы было изучение р-гликозидаз женьшеня настоящего и установление их участия в трансформации стероидных гликозидов. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1.Выделение и очистка р-гликозидаз из различных тканей женьшеня.

2.Исследование уровня активности, изоферменгного спектра и молекулярных форм р-гликозидаз в различных дифференцированных и дедифференцированных тканях женьшеня настоящего.

3.Изучение некоторых физико-химических свойств р-гликозидаз.

4. Сравнительное изучение сезонных изменений изоферментного спектра в запасающих тканях женьшеня.

5. Изучение гидролззной и гликозилирующей способностей р-гликозидаз женьшеня в отношении эндогенных субстратов.

Научная новизна работы состоит в выявлении в различных тканях женьшеня комплекса р-гликозидаз, которые расщепляют зндоген-

ше стероидные гллкозида. Вперьые выделены и частично очищены р-глюкозидаза и р-галактозидаза из разлитых тканей женьшеня. Определены их физико-химические свойства (рН-оптимум, отношение к ингибиторам, молекумярше мaccu, кинетические константы и др.).

Изучена сезонная динамика ферментов и их изоферментный спектр в корне женьшеня. Обнаружены изменения в активности р-гликозидаз и содержании гинзенозидов в каллусной культуре женьшеня. Полуденные---сведения -расширяют представления о свойствах и роли р-гликозидаз и указывают на возмо:кность их участия в метаболизме сапонинов женьшеня.

Практическая значимость работы. Уровень активности ¡3-гликозидаз может быть использован как адекватный биохимический показатель стадии и уровня синтетической активности культивируемых тканей женьшеня. Препараты р-глюкозидазы можно использовать для модификации стероидных гликозидов в биотехнологических процессах. Экспериментальные данные полученные в работе могут быть использованы для разработки технологии хранения и переработки ценного растительного сырья. Апробация работы. Результаты работы докладывались на научно-практической конференции "Женьшень и люди" (г. Москва,1991), II Съезде общества физиологов растений (г.Минск, 1991), 4 Международной конференции "Биоантиоксидант" (г.Москва, 1992), 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (г.Алма-Ата, 1993).

Результаты исследований опубликованы в 6 печатных работах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, содержащего 185 наименований. Работа

изложена на 153 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 47 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве источника р-гликозидазных активностей были использованы различные органы и ткани женьшеня Panax ginseng, i

C.A.Meyer. Для исследования брали зрелые листья, корни и каллус-ную .культуру женьшеня, полученную из листьев месячных проростков.

Получение ферментного препарата. Навеску материала (кал-лусная ткань или органы растения) измельчали и экстрагировали в 4-кратном объеме 0,008 M раствора диэтилдитиокарбамата натрия, (Колоколова Н.С. с сотр., 1987). Полученный экстракт очищали от фенолов, пигментов, диэтилдитиокарбамата натрия и других низкомолекулярных соединений методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Полученный экстракт использовали для определения р-галактозидазной и р-глюкозидазной активностей.

Определение активности р-глюкозидазы и р-галактозидазы проводили с использованием соответствующих метилумбеллифероновых (4-метилумбеллиферил-р-Б-глюко- и галактопиранозид) субстратов.

Интенсивность флюоресценции отщепившегося 4-метилумбелли-ферона определяли на спектрофлгориметре "Hitachi 650-60" при X возб.= 375 нм и X эмис.=450 -нм. Общая ферментативная активность выражалась в мкМ/мин-мл экстракта, удельная активность- в мкМ/мин-мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951 ).

Поиск оптимальных значений рН проводился с использованием фосфат-цитратной буферной системы с диапазоном рН от 2,4 до 7,5 (2,4; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,5) при 37°С. В

качестве адсорбента при ионообменной хроматографии была выбрана карбоксиметал- целлюлоза (КМ-целлюлоза) ("Sigma"). Элюирование осуществляли растворами фосфат-цитратного буфера со ступенчато увеличивающейся ионной силой и рН. Были использованы следующие буферы: рН 5,2 (0,005 М; 0,01 М; 0,1 М; 0,2 М); рН 7,0 (0,2 М); рН 9,0 (0,4 М).

Гель-фильтрацию проводили на колонке с Акрилексом Р-150 фирмы "Reanal" (Венгрия). Элюентом служил 0,05 М раствор фосфат-цитратного буфера рН 5,5. Сбор фракций осуществляли с помощью коллектора Mlnirac 17.000 фирмы 1KB (Швеция). Объем фракций - 3,5 мл. Скорость элюции составляла в среднем 9 мл/час.В полученных пробах определяли ¡3-гликозидазные активности. Оптическую плотность белкового профиля определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм.

Для определения молекулярной массы ферментов колонка была откалибровэна стандартными кристаллическими белками. Изучение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации ингибиторов проводилось с использованием D-глюкозы, D-галактозы, глюконо-1,5-лактона, галактоно-1,4-лактона в диапазоне концентраций 5-20 мМ.

Максимальную скорость реакции Vm и константу Михаэлиса Н^ рассчитывали графически по методу двойных обратных величин ' согласно линейному уравнению Лайнуивера- Верка.

Определение активности р-гликозидаз при использовании в качестве субстратов суммарной гликозидной фракции (СГФ)и гинзено-зидов Re и Rgl проводилось следующим образом: нэЕеску субстрата (СГФ или Re, Rgl) IQ мг растворяли в 0,5 ад диметидсульфоксидэ, добавляли I мл фосфат-цитратного буфера (рН 4,5; 5мМ) и 2 мл препарата фермента. Инкубировали в течение 2 часов при 37°С.

Суммарная гликозидная фракдая и гинзенозиды Н j и Re любезно предоставлены Т.М.Полетаевой (ВШ1Р, г. Москва).

СГФ женьшеня, подвергшуюся обработке р-глюкозидазой I в течение 2 часов использовали для определения гликозилирующей функции фермента. Для этого в реакционную смесь был добавлен раствор глюкозы, так что ее концентрация в пробе была равна 45 мМ.

Тонкослойную хроматографию продуктов ферментативной реакции проводили на пластинках Silufol'UV 254 (Чехославакия) в системе I бензол-этилацетат (1:1), которые проявляли опрыскиванием смесью уксусный ангидрид-сернэя кислота-этиловый спирт(5:5:90) с последующим нагреванием в сушильном шкафу в течение 5 мин при ПО°С. В качестве свидетелей использовали панаксатриол, панакса-диол, p-ситостерин и олеаноловую кислоту, любезно предоставленных Т.И.Полетаевой (ВШЕР, г.Москва) и В.А.Пасешниченко (институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г.Москва).

ТСХ гликозидов женьшеня проводили на пластинках Silufol UV 254. (Чехославакия) в системе II хлороформ- метанол- вода (65:35: 10). Проявляли таким же образом как и в случае ТСХ в системе I.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) гинзено-зидов каллусной культуры женьшеня проводили на хроматографе MI1-lipore (USA). Колонка Dlasorb 130 С16Т(100x4mm), Эмкм. Предко-лонка Silasorb SPHC18(50x4mm), 7мкм. Хроматография в линейном градиенте: 50 мин: 85% А, 15% В-> 0£ А, 100% В. A-I5& ацетонит-рил (MeCN), В- 60% WeCN. Скорость элюирования 1,5 мл/мин. А.=203нм. Для идентификации пиков использовали гинзенозиды Rx (x=b1, bo, с, d., е, g^), любезно предоставленные проф. Shibata (MeIJi college of Pharmacy, Tokyo, Japan). Количественную оценку содержания гинзенозидов производили в сопоставлении с биомассой клеточной суспензионной культуры кеньшеня Смутнинского завода.

тестированной по гинзенозидам.

Для определения содержания 'гинзенозидов бутано'льные экстракты также разделяли в режиме изократического элюирования. Для гликозидов на основе 20-Б-протопанаксадиола (RM, пь2,пс,Н(1)использовали колонку Dlasorb SPH-C18 (100х4шш), 9мкм; элюент 30%-ный MeCN. Для гликозидов на основе 20-3-протопанаксатриола (Re, R^ ) использовали колонку Separen С 18 (1QQ*4mm), 7мкм, элюент 20%-ный MeCN.

Полученные результаты во всех сериях опытов обрабатывали статистически (Владимирский Б.М., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Определение уровней активностей и оптимумов рН в различных органах и тканях женьшеня.

Нами проведено изучение р-глюкозидазы и р-галактозидазы в запасающей (корень), фотосинтезирующей (листья) и культивируемой тканях женьшеня. Все изучаемые ткани обладают и р-глюкозидазной и р-галактозидазной активностями.В корне, например, наблюдается наивысший уровень обеих активностей, однако, р-галактозидазная активность выше р-глюкозидазной в три раза. В листьях и каллусе удельная р-глюкозидазная активность в 20-25 раз ниже, чем в корне. Что же касается удельной р-галактозидазной активности в этих тканях, то она на порядок выше р-глюкозидазной (Табл. I).

Оптимум рН для каталитического действия р-глюкозидазной активности из листьев совпадает с оптимумом рН для р-глюкозидазной активности из каллуса (рН 4,5). Оптимальное значение рН для р-глюкозидэзы корня равно 5,0. Оптимумы рН р-галактозидазной активности из листьев и каллусной ткани также совпадают (оптимум рН 4,0). р-Галактозидаза в корне имеет оптимум рН- 5,0.

Таблица I.

Активность р-гликозидаз в различных органах и тканях женьшеня.

Источник фермента Общая активность х 10 мкМ/мин х мл Белок мг/мл Удельная активность хЮ мкМ/мин х мг

р-глюко-зидазэ р-галакто-зидаза р-глюко-зидаза р-галакто-зидаза

корень листья каллус I,3-0,88 0,2-0,15 0,1-0,06 3,3^0,01 3,5±0,10 1,6±0,Ю 1,5-0,01 6,0-0,07 3,3±0,01 8,83-0,50 0,35-0,10 0,51-0,19 22,0-0,17 5,4-0,15 4,8-0,80

Изучение изоферментного спектра р-гликозидаз из различных органов и тканей женьшеня.

Используя метод гель-фильтрации на колонке с Акрилексом Р-150 в изученных тканях женьшеня выявили три изоформы р-глюкозидазы и четыре изоформы р-галактозидазы, которые обладают различными уровнями активностей'и молекулярными массами (Рис. I). Для удобства изоформы с различными молекулярными массами обозначены римскими цифрами I, II, III, IV (Табл. 2).

Таблица 2.

Молекулярные массы изоферменгов р-гликозидаз из различных органов и тканей женьшеня.

Источник фермента Молекуля] зная масса (Дальтон)

р-глюкозидаза р-галактозидаза

корень листья каллус I II III I II III 17

500000 500000 500000 150000 150000 65000 500000 500000 500000 300000 110000 35500 35500

Использование другого принципа разделения- по заряду белковых молекул- на КМ-целлюлозе позволило разделить экстракты трех изучаемых тканей на несколько изоформ (I и II р-глюкозидазы и I, II III З-гзлзктозндззы). Анализ комбинаций изофе^ментоз в этих

180016001200800400: о

750600450300 150-

корень

листья

15 б5 9?

Рис. I. Относительная активность (А) р-глюкозидазы (I) и р-галактозидазы (2) во фракциях при разделении частично очищенных экстрактов различных органов и тканей женьшеня методом гель-фильтации ь.а Акрилек-се Р-150.

Таблица 3.

Количество изоформ р-гликозидаз, выявленных методами ионообменной хроматографии (КМ-целлюлоза) и гель-фильтрации (Акрилекс

Источник р-глюкозидаза р-галактозидаза

фермента ионообменная хроматография гелъ-фильтрация ионообменная хроматография гель-фильтация

корень I II - I - - - - III I II - IV

листья Г II - I II - - II III I - - IV

каллус Г - - I II III I - III I - III -

экстрактах (Рис. 2. Табл. 3) позволяет сделать заключение о существовании в тканях женьшеня отличных друг от друга изофермен-

I

тов ß-глюкозидазы и ß-галактозидазы. Каждая из тканей при этом обладает строго выраженными особенностями изоферментного . спектра, отражающими их структурно-функциональные отличия.

pH 5,2

0,02М

А

180016001200800400.0 200-1ба 12080400

гоа 1ба 12080400

О,IM

0,2М

рН7,0

0,2М

рН9,0

0,4M

корень

листья

; t

I \

V2 \ \

* /

.А

каллус.

Л

I \ I I

«■"ч / »

I t

/' I

гс \

/

V* \ \

\

V

V

Рис. 2. Относительная активность (А) р-глюкозидазы . (I). и р-галакто_зидазц_ (2) во фракциях при разделении частично очищенных экстрактов различных органов и тканей женьшеня методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе. Примечание: корень, листья и каллус взяты в экспери-

10 20 з5 Й б5 J&$p. мент в июле.

П !

Изучение каталитических свойств р-гликозидаз. j

Ингибиторное действие было изучено но (фракциях I р-глюкозидазы и фракции I р-галактозидазы из корня (Табл.-4).

В ходе эксперимента выяснилось, что активность р-глюкозидазы практически полностью ингибирует глюконо-1,5-лактон (98,5%) и на 70% глюкоза (20 мМ). Эти соединения оказыва- i ют на активность р-галактозидазы крайне незначительное ингибиру- ! ющее действие.

Таблица 4.

Ингибирующее действие некоторых моносахаридов на активность

р-гликозидаз женьшеня.

Наименование ингибитора Концентрация ингибитора в мМ Проценты ингибирования

р-глюкозидазы р-галактозидазы

5 49,1 3,6

глюкоза 10 58,6 4,9

20 69,9 4.9

5 7,4 69.1 |

галактоза 10 14,0 77,3 1

20 18,6 78,7 . ,

5 98,4 8,4

глюконо-1,5- 10 98,5 13,5 i

лактон 20 98,6 17,3

галактоно-I,4-лактон 5 10 20 8,4 16,0 21,4 94,3 96,3 96,3

Аналогичная картина наблюдается и для другого фермента, ^ р-галактозидазы, активность которой также подавляется галактоко- ' 1,4-лактоном и галактозой, но на которую почти не влияют ингибиторы р-глюкозидазы. 1

Полученные результаты сходны с литературными данными о кон- и

формзшгонксЯ прешсчтателькости Ферментов к знзлогзм переходного • I,

; | •••

: :!

состояния, к промежуточным между субстратом и продуктом формаг Так, у р-гликозидаз лактоны связываются в активном центре в К раз прочнее, чем глюкоза. Реакция расщепления гликозидной связ! катализируемая гликозидазами, идет через промежуточное образовЕ ние карбониевого, или карбоксилат, иона(Н. ïï.Franck, 1992). Пс этому'аналоги переходного состояния являются лучшими ингибиторг î|M, чем аналоги субстрата. Возможно, что активный центр у фер ментов более комплементарен именно переходному состоянию субст ратов.

! Величины кинетических констант (К,, и Vmov) сопоставляемы

I M Шал

ферментов из двух органов различны (Табл. 5).^

i

! Таблица 5.

I

Характеристика скорости образования и распада комплекс, (З-рдакозидаз женьшеня с синтетическими метилумбеллифероноЕымз субстратами.

Фермент ^ (в мкМ) Vmax(B мкМ/мин X мг)хЮ У

р-глюкозидаза из

листьев 0,0465 1.3

р-галактозидаза

из листьев 0,158? 3,1

р-глюкозидаза из г.)

корня 0,212 "7,69

р-галактозздаза

из корня 0,384 62,5

Наиболее еысокой ферментативной активностью обладает фракция р-галактозидазы корня, что, по-видимому, определяется значительной величиной Угаах> У этого фермента скорость образования комплекса с субстратом также наибольшая (0,384 мкМ). Несколько меньшая Км наблюдается для р-глюкозидазы корня, и значительно меньше (в 8 раз) Утах.

Наиболее низкой ферментативной активностью характеризуется

I

р-глюкозидэза листьев, имеющая самое низкое сродство к субстрату. Таким образом, несмотря на сходство условий выделения при гель-фильтрации фракций I с р-глюкозидазной активностью, кинетические параметры ферментов из корня и листьев довольно сильно различаются. То же самое можно сказать и о константах, опреде-' ленных для р-галактозидазы из тех же органов. (

Изучение сезонных изменений активности

Р-гликозидаз в корне женьшеня. |

Полученные данные показывают (Табл.6), что в период, пред- I шествующий стадии покоя и в период покоя (ноябрь-январь) активность р-гликозидаз в корне резко уменьшается. Соответственно тог мозятся и процессы превращений их.субстратов.

| Таблица 6.

Динамика р-гликозидазных активностей в корне в течение года.

Время года, месяц Общая активность х 10 мкМ/мин х мл Белок мг/мл Удельная активность х!0 мкМ/мин х мг

р-глюко-зидаза р-галакто-зидаза р-глико-зидаза р-галакто-зидаза

ноябрь январь март май июль 0,47-0,02 0,05-0,10 0,66-0,07 0,93-0,14 1,3-0,88 4,42±1,50 0,04-0,50 2,58-0,05 4,10-0,01 3,30-0,01 7,95-0,1 3,05-0,4 4,60-0,1 6,37-0,1 I,5-0,01 0,59-0,02 0,17-0,23 1,43-1,29 1,47-2,30 8,83-0,50 5,56-0,19 0,13-0.02 5,59-0,07 6,43-0,10 22,0-0,17

На стадии цветения - наиболее важного для растения периода, когда идет формирование репродуктивных органов и активное накопление биомассы наземной части и корня, активность сравниваемых ферментов максимальна. I :

На начальной стадии экспериментов (осень) были взяты четырехлетние корни женьшеня. В конце опытов это были, по существу, пятилетние корки- всзрзст оптимальный по скорости накопления

: I

ТСГ2Й ЗЙ Ш 5fr~XJp.

Рис. 3. Динамика сезонных колебаний относительной активности (А) р-глюкозидазы (I) и р-галактозидазы (2) во фракциях при разделении частично очищенного экстракта корня женьшеня методом ионо^Зменной хроматографии на КМ-целлюлозе.

гинзенозидов. Шестилетние

и более старые корни от-

i

стают по темпам накопления сапонинов; их состав также претерпевает изменения в сторону уменьшения некоторых гинзенозидов (Полетаева Т.И., 1991). Максимальное количество cano-, нинов приходится на летние месяцы и лучшее время сбора урожая- конец лета 5-го года жизни (SolcLatl Р., Tanaka 0., 1984). Таким образом, максимум активности ферментов совпадает с максимумом накопления

этих вторичных соединений. Изучение изоферментного спектра р-гликозидаз в течение сезона также показало его заметную вариабельность. Особенно это касается изоформ р-глюкозидэзы (Рис\ 3), г1 количество которых может колебаться от одной (ноябрь) до J трех " (май). Растения обладают тонкой системой регуляции активности |

V

ферментов, уровень которой, вероятно, определяется ■ необходи- ' мостью их участия в трансформации (расщепление, синтез) природ- . ных субстратов. ¡.

Динамика р-гликозидаз в культивируемых тканях женьшеня.! : >11 Нак показано (Табл. 7), изменения в уровне р-гликозидазных 1' активностей в каллусной культуре в какой-то степени повторяют динамику ферментов в течение года. Низкая активность ферментов в лагнфазе (латейгной) и в фазе экспоненциального роста достигает максимума на завершающих стадиях развития. При этом активнЬсть (З-глюкозидазы в каллусе ниже, чем в корне в 16 раз', а (З-галактозидазы в 4 раза. По-видимому, синтез изучаемых ферментов в культуре сильно зарепрессирован в результате дедиффереНвд-ровки. i

Различный уровень активности ферментов, а также некоторая' разница в сроках возрастания их до максимума (р-глюкозидазэ- на

i

28-ые сутки, р-галактозидаза- на 35-ые сутки) может указывать не;

i i

только на различие в регуляции их активности, но и на некоторое: отличие в функциях.

Для большинства изученных гликозидаз в культивируемых клетках максимум их активности приходится на 12-14 сутки. Такие дан ные получены для ферментов следующих клеточных культур: '. . р-глюкозидэзы и р-галактозидазы подсолнечника (Кесслер P.M. с сотр., 1991), кислой шгеертазы сахарной свекла (Дубинина И.М. с , - ¡ ; сотр., 1978), целлюлазы и полигалактуронидэзы Rosa glauca; \

Таблица 7.

Динамика р-гликозидазных активностей в каллусной культуре женьшеня ь течение цикла пассирования (х 10 и).

р-глюкозвдазная р-галактозвдазна!

Сутки Количество активность активность

пассирования белка,мг/мл общая удельная общая удельная

_мкМ _мкМ _мкМ _мкМ

мин мл мин мг мин мл мин м

7-ые 0,33± 1,22± 3,96- 0,509- 1,64-

0,23 0,09 0,05 0,35 0,74

14-ые 0,33± 0,68- 3,43- 0,78- 3,94-

0,81 0,02 0,16 0,54 1,1

21 -ые 0,21- 0,56- 3,73- 0,35- 2,зб±

0,38 0,02 0,1 0,03 0,16

28-ые 0,43- 9,54- 24,9- 4,95- 12,9-

0,1 0,54 0,68 3,77 4,04

35-ые 0,19- 2,04± 15,1- 2,131 16,3*

0,78 0,06 0,38 0,67 5,98

(1оБе1еаи J.-?., С!тшЬаг С., 1980). Указанные ферменты играю значительную роль в растяжении клеточных стенок. Рос р-гликозидазных активностей на завершающих стадиях развития

I

культуры клеток женьшеня может указывать на возможность их учас тия в осуществлении не только этих, но и других функций. Не иск лючено, что эти функции связаны с формированием спектра гинзе нозвдов.

Изучение динамики гинзенозидов в культивируемой ткани женьшеня.

Использование метода ВЭЖХ в линейном градиенте и режим! зократического элюирования указывает на существенные сдвиги з метаболизме гинзенозидов в культуре в течение одного пассажа Уже на 10 сутки из обычного для женьшеня спектра сапонинов н<

Рис.4. Хроматограмма бута-нольной фракции экстракта биомассы каллусной культуры женьшеня (34 сутки). Колонка Берагоп 018 (100x4 ш), 9мкм.,-Элюент 20% МеСЫ, скорость ,1,2 мл/мин, \= 203 им. Неиденти- ' фицированный пик 10 (8,8мин).

остается ни одного в количествах, достаточных для определения этим чувствительным методом. На заключительных стадиях (34" сутки) на Фоне следовых содержаний гликозидов в других пиках вняь-ляются лишь фракции со временем удерживания 6,2 и 8,8 шт.. Первая из них - шторная. Однако, вторая по содержанию вещества (12,5 х Ю-2 мг/Ж) превышает сумму всех гинзенозидов группы НЬ и Ня; (СГФ), которые обнаруживаются на 41 сутки пассирования. Эта

фракция (8,8 мин) наиболее значительна и на 10 сутки, но в пять' *

I

раз меньше, чем на 34 сутки (Рис.4). Можно предположить, что эта фракция является основным предшественником гликозидов группы ЯЬ на основе 20-Б-протопанаксадиолз (ЯЫ , НЬ2, Не, ЕШ,' доминируя-них в каллусной культуре женьшеня (10 х 10 ° мг/%). Совпадение ее максимума с щетивностью ферментов в этот период (28-35 сутки) может указывать на возможность их участия, наряду с другими фер-чентзмя, в м^тзболизме гинзенозидов. |

Изучение действия р-гликозидаз женьшеня на гинзенозиды. | Для непосредственной проверки этого предположения были прс ¡ведены эксперименты по изучению воздействия р-гликозидаз женьше ня на эндогенные субстраты, а именно, суммарную гликозидную фра кцию (СГФ) и сумму гинзенозвдов , Не. На рис.5 представлен типичные хроматограммы метанольных экстрактов смеси Н ^, Ее СГФ до и после воздействия р-глюкозидазы I из корня, выделенно на Акрилексе Р-150 (Рис. I). В результате гидролитического дейс твия фермента все фракции, располагавшиеся в зоне, характерно: ря суммы гинзенозидов (ЯГ 0,15-0,45), исчезают. Продукты ферме; дативной реакции смеси И^ и Бе обнаруживаются в виде двух пяте] с НГ 0,83; 0,91, совпадающих по подвижности с олеаноловой кислотой и р-ситостершюм. При гидролизе СГФ р-глюкозидазой появляют-< .

ся пятна различной интенсивности в верхней части хроматограммы, ЙХ некоторых из них совпадают с ИГ панаксатриола, панаксадаола, олеаноловой кислоты и р-ситостерина.

Добавление избытка глюкозы ь реакционную смесь после двухчасового гидролиза ферментом СГФ приводило к полному восстановлению спектра гинзенозидов (Рис.5). Подвижность полученных фракций совпадала с НГ компонентов СГФ корня, однако это не позволяет сделать окончательных выводов о полной идентичности этих веществ. Тем не менее, не вызывает сомнений, что р-глюкозидаза женьшеня способна катализировать как реакции гидролиза, так и гликозилирования эндогенных сапонинов.

: Знзиматический гидролиз гинзенозидоЕ, очевидно, идет с образованием просзпогешшов и агликонов, но вряд ли доходит до стадии их превращения в панэксаднол и панаксатрнол. Циклизация брковой цепи с обращением конфигурации хиралыюго С-20 центра является необратимой и препятствует образованию гинзенозидов из

\

1.& 0,90,80,7-)

0,6 0,50,4 0,3 0,20,4

©

Ш

Я

с

<9 0 Э

<г*

0 0

О О

&

«27 <2?

с:'; С

с-1 (7А

О @ @

° Э © О

О

о о о

\

\ <зя> СО

<гг?

в»

ы в с?'

ттттттттт

Ю 11

Рис. 5. ТСХ метанольных экстрактов в системе II хлороформ- метанол- вода (65:35:10). : 1-СГФ, ИГ 0,15;0,20;0,25;0,29;0,33;0,42, 2-стэндартше раствори смеси гинзенозидов Рд.) и Rg.Hr 0,24;0,44, 3-панаксадиол, И£ -0,78,4-панаксатриол, РГ 0,67, 5-р-ситостерин, ИГ 0,91, ' 6-олеаноловая кислота, ИГ 0,83, 7-СГФ после воздействия (З-глюкозидазы Г.НГ 0,5;0,56;0,67;0,75;0,78; 8-СГФ после воздействия р-глюкозидазы 11,0,82;0,86;0,9Г, 9-СГФ поело воздействия экстракта корня женьшеня, ИГ 0,13;0,15;0,2;О,25;0,36, Ю-СГФ после воздействия экстракта каллусной ткани женьшеня,ИГ 0,13;0,15; 0,20;0,25;0,36, П-СГФ после воздействия р-глюкозидазы каллусной ткани женьшеня,

12-смесь Ид^ е после воздействия р-глюкозидэзн I,

13-смесь е после воздействия р-глюкозидазн II,

14-СГФ после воздействия р-глюкозидазы I

р-глюкозидазы гликозилирования.

15-СГФ после действия р-галактозидазы из корня женьшеня

последующего

панаксадиола и панаксатриола путем их гликозилирования. Увелич

!

|ш1э подвижности фракций и их количества в результате гидролит: '' ( !ческого действия р-глюкозидазы, по-видимому, можно объясни1 ¡частичной потерей гидроксильных групп за счет уменьшения чис.

углеводных остатков у всех без исключения гинзенозидов.

, ! I

Судя по данным, полученным в настоящей работе, оба типа рс

акций (гидролиз и гликозилирование), катализируем!

Тг'

( р-глюкозвдазой, протекают не хаотически, а с еысокой степеш

¡•; селективности.

'• Избирательное гликозилирование наблюдалось при добавлении

среду культивируемых клеток женьшеня фенольных и стероидных сое динешй (Ushiyairia М., Furuya Т., 1989; Kawaguchl К. et al. 1990). При этом остатки глюкозы в дисахаридах образоваЕшихс

t ■

гликозидов преимущественно были связаны ß-(I->2) и р-(1->6) свя i ,

; зями, типичными для сапонинов женьшеня. Имеются сведения о

■ участии в гликозилировании фитостеринов некоторых растительны ^ликозилтрансфераз, использующих в качестве донора гликозильны | остатков УДФ-глюкозу (Schütte H.-R., 1987).

Наряду с изучением р-глюкозидазы, мы исследовали действи р-галактозидазы на СГФ (Рис. 5). Спектр выявленных фракций вклю , ' чает в себя остатки гинзенозидов в виде слабо окрашенных пятен : ! ; продуктов их частичного гидролиза. В области расположения проса' . погешшов отсутствуют вещества с RI- 0,67 и 0,78, обнаруженные после действия р-глюкозидазы, но появляются зоны с Rf 0,62 и 0,1 Поскольку Фракция р-галактозидазы, взятая в эксперимент при разделении частично перекрывается Фракцией р-глюкозидазЕ | (Рис. I), соотношение этих активностей при действии на СГФ былс I 1:1. Возможно поэтому данная р-галактозвдазная фракция способш частично гидролизоьать р-глюкозида. В то же врем?

р-галактозидаза некоторых растений отщепляет ct-L-арабинозные фрагменты субстратов (Кесслер P.M., Колоколова Н.С., 1993). Для р-глюкозидаз также характерна способность катализировать реакцию гидролиза p-D-ксилозшх остатков (Кесслер P.M., Колоколова"Н.С., 1993). р'-Глюкозидаза Г из корня женьшеня также расщепляет р-ксилозиды. в соотношении с основной активностью 10:1.

Как мы видим, р-глюкозида'за и р-галактозидаза женьшеня потенциально1, способны произвести каталитическое расщепление почти всех углеводных остатков гинзенозвдов, содержащих p-D-глюкозу, p-D-ксилозу и a-L-арабинозу в пиранозной форме. Исключение составляют гинзенозиды Re и Rg, имеюдие в качестве концевого остатка при С-6 агликона рамнозу и гинзенозид Не с арабинозой в фура-нозной форме при С-20.

I

Коммерческий препарат р-глюкозидазы миндаля и частично очищенные фракции р-глюкозидазы и р-галактозидазы подсолнечника не действовали на гинзенозиды.

ВЫВОДЫ

1. В корнях, листьях и культуре тканей женьшеня впервые обнаружены и исследованы р-глюкозидазная и р-галактозидазная активности. Обе активности в корнях намного выше, чем в листьях и каллусной культуре.

2. Изучены физико-химические свойства ферментов. Определен оптимум рН, каталитические свойства ферментов. Максимальное число Фракций р-глюкозидазы, обнаруженных в тканях .женьшеня - три; их

молекулярные массы- 500; 150; 65 кДа. р-Галактозидазная активность выявляется в четырех фракциях; молекулярные массы изоформ-500; 300; ПО; 35,5 кДа.

3. Впервые изучена динамика сезонных изменений активности р-гликозидаз корня женьшеня. р-Глюкозидазная и р-галактозидазная

активности максимальны в середине лета (июль). Они выше, чем в период покоя корня (январь), соответственно, более, чем в 50 и 200 раз. Изоферментный спектр обеих активностей в течение года изменяется незначительно.

\

4. Исследована динамика ß-гликозидаз в каллусной культуре в

i

течение цикла пассирования. Максимум активности ферментов выявляется на заключительных циклах роста культивируемых тканей. \

5. Показано, что частично очищенная фракция ß-глюкозидазы из корня женьшеня катализирует реакции гидролиза и гликозилиро-вания эндогенных сапонинов.

По материалам диссертации.опубликованы следующие работы:

1.Ананян A.A., Милютина Н.П., Тувик В.П., Кесслер P.M. Антирадикальное и антиоксидантное действие женьшеня// Всесоюз. конф. -"Женьшень и люди"- Москва, 1991.- С.З. j

2.Тувик В.П., Кесслер P.M. ß-Гликозидазы женьшеня// II Всесоюз. съезд общества физиологов растений.- Минск, 1991.- 0.35.

3.Милютина Н.П., Ананян A.A., Тувик В.П., Кесслер P.M. Антирадикальная активность женьшеня// 4 Международ. конф. "Биоантиокси-дант".- Москва, 1992.- I.- С. 220.

4.Тувик В.П., Кесслер P.M., Полетаева Т.Н. Сравнительная характеристика ß-гликозидаз каллусной ткани, листьев и корня Panax ginseng// 2 Междунэрод. конф. "Биология^лШтйруёшхНклеток и биотехнология".- Алма-Ата,1993.- С.199.

5.Полетаева Т.И., Тувик В.П., Кесслер P.M. Динамика гинзенозидов и ß-гликозидаз в процессе культивирования каллусных тканей Panax ginseng// 2 Междунэрод. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология".- Алма-Ата,1993.- С.190.

G.Тувик В.П., Полетаева Т.И., Кесслер P.M. ß-Глюкозидаза из корня женьшеня (Panax ginseng, C.A.Meyer)// Докл. РАК (в печати).