Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var.repens при разных условиях выращивания
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var.repens при разных условиях выращивания"
На правах рукописи
Демидова Елена Викторовна
Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Рапах japonicus var. repens при разных условиях выращивания
03 00 12 - физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2007
003173163
Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г Москва
Научный руководитель-
доктор биологических наук, профессор
Носов Александр Михайлович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор,
Лобакова Елена Сергеевна
доктор биологических наук, профессор
Шаии Сергей Семенович
Ведущая организация: ОАО «Биохиммаш» (Институт прикладной биохимии и машиностроения)
Защита состоится 13 ноября 2007 г в 11 часов на заседании диссертацио «того совета К 002 210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35
Факс (495)977 8018, электронная почта m-azarkovich@ippras ru, ifr@ippras ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН
Автореферат разослав « » 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
МИ Азаркович
Актуальность работы Культура клеток высших растений служит удобным объектом для изучения ряда физиологических и биохимических проблем, может быть моделью для изучения закономерностей роста и развития растительной клетки В условиях m vi tro растительные клетки, выйдя из-под контроля организма, формируют уникальную биологическую систему - популяцию соматических клеток Это позволяет производить на их основе фундаментальные исследования, детально изучать механизмы роста и развития популяции, первичного и вторичного метаболизма растительной клетки Наиботее перспективным представляется исследование вторичного метаболизма в клетках высших растений in vitro, что может быть использовано в качестве нетрадиционного подхода к решению одной из фундаментальных проблем физиологии растений - функциональной значимости вторичных метаболитов в жизнедеятельности клетки и целого организма
Помимо использования в фундаментальных исстсдованиях, культура клеток высших растений является универсальным инструментом для решения многих практических задач В частности, растительные клетки т vitro могут служить источником ценных веществ растительною происхождения
Растения рода женьшень (Panax) синтезируют тетрациклические тртсрпено-вые гликозиды даммаранового ряда - гинзенозиды (панаксозиды), имеющие высокую биологическую активность На сегодняшний день открыто более пятидесяти гинзено-зидов, наибольшее внимание исследователей привлекают в первую очередь гликозиды, полученные из женьшеня настоящего - Panax ginseng Однако существуют друше представите™ рода Panax, использование которых в качестве продуцентов полезных веществ весьма перспективно К таким растениям можно отнести женьшень ползучий Р japomcus var repens, который многие авторы рассматривают как подвид Panax ja-ponicus - эндемичный вид, произрастающий на Дальнем Востоке нашей страны Состав гинзенозидов данного вида женьшеня необычен, в нем преобладают гликозиды с олсаноловой кислотой в качестве агликона (чикусетсу-гинзенозиды) \
I
Цель исследования заключалась в изучении закономерностей процесса роста суспензионной культуры клеток Panax japonicus var repetís и особенностей биосинтеза клетками in vitro тритерпеновых гликозидов при различных способах и режимах выращивания культуры
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи исследования
1 Изучить качественный и количественный состав тритерпеновых гтикозидов в суспензионной культуре клеток Panaxjaponicus var repens,
2 Изучить влияние различных факторов культивирования (начальная плотность культуры, фитогормональный состав среды, содержание углеводов в среде, добавление элиситора метилжасмоната) на ростовые характеристики культуры и синтез тритерпеновых гликозидов,
3 Изучить влияние различных способов культивирования (в колбах, в биореакторах различной конструкции) на рост культуры и биосинтез гинзенозидов,
4 Изучить влияние различных режимов культивирования (периодический, полупроточный и проточный) на ростовые и биосинтетические показатели культуры
Научная новизна
Впервые проведено комплексное исследование ростовых и биосинтетичсских характеристик суспензионной культуры клеток женьшеня ползучего Panax japonicus var repens Изучено влияние различных факторов культивирования (начальная плотность культуры, состав и количество в среде фитогормонов, сахарозы, метилжасмоната) на рост культуры и накопление в клетках гинзенозидов Впервые осуществлено полупроточное и проточное выращивание культуры клеток Panax japonicus var repens в биореакторах и показаны высокие ростовые и биосинтетические характеристики культуры при выращивании в этих режимах
Практическое значение работы
В результате проведенных исследований получены данные о возможности выращивания данного штамма в биореакторах, объем которых может быть в дальнейшем доведен до полупромышленных и промышленных величин Изучена возможность выращивания культуры в режимах, оттачных от периодического - полупроточ-
ном и проточном Предложены пути повышения биосинтеза тритерпеновых гликози-дов в биомассе с помощью изменений состава фитогормонов в питательных средах и добавления элиситора метитжасмоната
Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 работы
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста Содержит 8 таблиц, 27 рисунков и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка литературы Список цитируемой литературы включает 210 наименований, из них 136 иностранных
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали суспензионную культуру клеток женьшеня японского Panax japomcus var repens, полученную из каллуса корня интактного растения двухлетнего возраста (Приморский край Дальнего Востока) Каллус был получен в Институте пищевой химии и технологии в 1996-97 гг Л В Желтоножской и A JI Чайко и зарегистрирован в Российской коллекции культивируемых клеток высших растений (РККК BP) под № 62 Суспензионная культура была получена из каллусной культуры в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН
Исходную суспензию поддерживали на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, с добавлением 1 мг/л кинетина, 2 мг/л а - НУК, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,1 мг/л пиридоксина, 0,1 мг/л тишина, 500 мг/л гидролизата казеина, 90 мг/т ме-зоинозита
Культуру поддерживали методом пересевов в литровых колбах на качалке при скорости вращения 90 об/мин, в темноте при температуре 26°С Цикл субкутьтиви-рования - 21 сутки Аппаратурное выращивание проводили в барботажном биореакторе общим объемом 10 л и рабочим объемом 7 л ири 26 ±0 5°С Начальная плотность суспензии составляла в зависимости от целей эксперимента 1,0 либо 2,0 г/л по сухой биомассе Расход воздуха на барботаж устанавливали в пределах 0,2-0,6 wm
При осуществлении проточного режима культивирования биореактор быт оснащен перистальтическим насосом с системой измерения объема подаваемой жидко-
сти и сосудами с питательной средой
Концентрацию сырой и сухой биомассы, число клеток и митотический индекс определяли по общепринятым методикам (Бутенко, 1964) Жизнеспособность клеток определяли как процент не прокрашенных 0,02% синькой Эванса клеточных агрегатов Просчитывали не менее 200 агрегатов в трех повторностях
Агрегированность суспензии вычисляли путем подсчета количества клеток в 200 агрегатах, в трех повторностях При этом придерживались следующей градации просчитываемых агрегатов клеток агрегаты состоящие из 1-10 клеток, 11 - 30 клеток, 31-50 клеток, более 51 клеток
На основании полученных данных рассчитывали производные параметры роста культуры
Удельную скорость роста ц = (1пХ п+1 -Время удвоения Т= 1п 2 / ц, (сут), Индекс роста 1=Хтах/Х0, Экономический коэффициент- У = (Мшах"
М0) / ДБ,
Где ХшаХ1 Х0 X „ - максимальное, начальное и текущее значение параметра (сухой и сырой вес, число клеток в 1 мл), ЛЯ - разница значений концентрации сахарозы в начале и конце роста, Мтах, Мо- максимальное и начальное накопление сухой биомассы клеток Для надежного определения удельной скорости роста также проводили расчет ц графическим методом
Содержание гинзенозидов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) Образцы биомассы отбирали для анализа параллельно с образцами суспензии для измерения ростовых параметров Из 100 - 150 мг сухой биомассы проводили исчерпывающую экстракцию метанолом, экстракт упаривали досуха под вакуумом при температуре 45-50°С
Разделение гинзенозидов проводили на стальной колонке (4 х 250 мм), заполненной ЬюЬговогЬ ЯР-18 (5 мкм), на приборе фирмы "ЬКВ" (Швеция) в изократиче-ском режиме при скорости потока 0 5 мл/мин Использовали две системы растворителей ацетонитрил вода в объемном соотношении 35 65 для разделения гинзенозидов
Rf, Rbl, Rc, Rb2, Rd и ацетонитрил вода в объемном соотношении 22 78 для разделения гинзенозидов Rgl и Re Количественное определение гинзенозидов проводили методом абсолютной калибровки относительно индивидуальных гинзенозидов фирмы "Sigma" (США) при 203 им Пересчет содержания гинзенозидов проводили на абсолютно сухой вес Влажность образцов определяли по методике ГФ-Х1
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние начальной плотности на ростовые и бносинтетические характеристики суспензионной культуры Panaxjapomcus \ar.repeits
Дчя успешного выращивания культур клеток в биореакторе, как правило, необходимо проведение работ по оптимизации начальной плотности культуры Для проведения экспериментов были использованы два варианта начальной плотности культуры- 1г/л (с этой начальной плотностью культуру клеток женьшеня ползучего выращивают в колбах) и 2 г/л по сухой массе клеток Полученные данные представлены на рис 1
СуТКИ культавмрования Сутки культивирования
Рис 1 Кривые роста суспензионной культуры клеток Рапах japomcus var repens при выращивании в биореакторе с разной начальной плотностью Сухая масса, ■ - Сырая масса, ▲ - Число клеток в 1 мл
В варианте с начальной плотностью 1г/л лаг-фаза по всем используемым критериям составила 3 суток В варианте с начальной плотностью 2г/л таг-фаза по сухому и сырому весу сократилась до 1 суток, по числу клеток она практически отсутствовала При высокой начальной плотности культуры (2 г/л) максимальное накопление сухой
биомассы составило 10,2 г/л, при низкой начальной плотности - 6,8 г/л Продуктивность по биомассе при высокой начальной плотности оказалась 0,49 г/л за сутки, при низкой - 0,32 г/л за сутки В то же время, удельная скорость роста культуры при начальной плотности 1г/л составляла 0,20 - 0,22 сут(по разным критериям), что выше, чем при начальной плотпости 2 г/л - 0,16-0,18 сут"1 соответственно (таб 1) Можно предполагать, что увеличение начальной плотности культуры, приводящая к изменению длительности различных фаз роста (вплоть до исчезновения лаг-фазы), может вызвать и изменения в синтезе гинзенозвдов В результате проведенного анализа было установлено, что в обоих вариантах присутствовали семь основных гинзенозидов как Шэ-группы (агикон протопанаксадиол) - ИЫ, Яс, ЯЬ2, КД так и й^-группы (агли-кон протопанаксатриол) - 1^1,11е, Ш" Результаты количественного анализа гинзенозвдов в цикле выращивания представлены на рисунке 2
Таблица 1
Параметры роста суспензионной культуры Р]аротсш Уаг герет при выращивании с разной начальной плотностью
Начальная плотность культуры М шах, г/л Т, сут ц> сУт 1 Р, г/л сут У
1 г/л 6 82 3 01 0 23 0 32 0 23
2г, л 10 2 3 64 0 19 0 49 0 34
Из представленных данных следует, что общее содержание этих соединений в клетках, выращиваемых с начальной плотностью 2 г/л, оказалось выше, чем в варианте с плотностью 1 г/л Максимальное содержание (3,96% в сухой биомассе клеток) отмечено на 14 сутки выращивания в варианте с высокой начальной плотностью культуры и на 12 сутки (3,15%) - с низкой Известно, что биологическая активность женьшеня существенно зависит от соотношения гинзенозидов Ш> и групп В корне женьшеня настоящего это соотношение находится в районе единицы В биомассе культуры клеток женьшеня ползучего в обоих вариантах культивирования наблюдали преобладание гинзенозидов 1^-группы, но соотношение ЯЬ/К^-групп гинзенозидов было
разным. В варианте с высокой начальной плотностью соотношение на 14 сутки было 1/8, в варианте с низкой начальной плотностью - 1/3,5.
По совокупности показателей роста и данных химического анализа можно заключить, что для выращивания культуры клеток женьшеня ползучего в биореакторе предпочтительной является начальная плотность культуры 2 г/л.
О 7 14 21
Сутки культивирования
□ ргы п рс 0 РЬ2 а Рй В ^ И Рд1 0 Ре
О 6 14 21
Сутки культивирования
Рис.2 Содержание тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток женьшеня ползучего при выращивании в биореакторе с разной начальной плотностью.
Влияние разной концентрации сахарозы на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток Р. }аротси$ таг. герепз
В коллекции культуру клеток женьшеня ползучего выращивают при содержании сахарозы в среде 2,5% (25 г/л). В литературе имеются данные об успешном применении высоких концентраций сахарозы для увеличения синтеза гинзенозидов и улучшения роста культуры. Были приняты два варианта концентрации сахарозы в питательной среде - 4% и 5%. Увеличение содержания сахарозы в среде привели к заметным изменениям в длительности фаз ростовой кривой. В частности, в варианте с 5% сахарозы в среде произошло увеличение лаг-фазы до 6 суток, в варианте с 4% сахарозы этот показатель составил 2 суток. Максимальное накопление биомассы пришлось на 22 сутки и составило 8,1 г/л в варианте с 4% сахарозы и 7,6 г/л в варианте с 5 % сахарозы в среде. Исходя из полученных результатов, были рассчитаны основные
параметры роста культуры, представленные в таблице 2 Удельная скорость роста в варианте с 4% сахарозы составила 0,16 сут1, в варианте с 5% сахарозы - 0,14 сут'1, продуктивность была выше в варианте с 4% сахарозы
1,8 -1,6 " 5% сахарозы " 2,5 ■
1,4 - 2 -
1,2 " о с0,8 -0,6 - / f о 15 - 5 1-
0,4 -0,2 - f 05 ■
0 н 0 2 4 Е Iм I .....1 III,, 8 10 12 14 16 18 20 22 0 ■
сутки
О 2 4 6 8 10 12 14 1S 18 20 22
сутки
Рис 3 Кривые роста суспензионной культуры клеток Panaxjaponicus var repens при выращивании в биореакторе с разным содержанием сахарозы в среде Сухая масса, я - Сырая масса, к - Число клеток в 1 мл
Таблица 2
Параметры роста суспензионной культуры Рjaponicus var repens при выращивании на средах с разным содержанием сахарозы
Концентрация сахарозы в среде Р, г/л сут ц, сут-1 Т, сут Y I
4% 0,32 0,16 4,3 0,20 7,2
5% 0,28 . 0,14 5,0 0,12 5,4
Изменение начальной концентрации сахарозы привело к изменениям в содержании основных гинзенозидов Полученные результаты представлены на рис 4 Можно отметить, что увеличение концентрации сахарозы привело к резкому падению синтеза тритерпеновых гликозидов, снижение их содержания в биомассе в ряде случаев произошло почти на порядок (0,54 % в варианте с 4% сахарозы и 0,27% в варианте с 5% сахарозы в конце второго субкультивирования) по сравнению с начальными показателями Изменения произошли и в соотношении Ю> и И^-групп гинзенозидов оно составило 1/9,7 в варианте с 4% сахарозы и 1/4,7 в варианте с 5% сахарозы Снижение общего содержания гликозидов, которое наблюдали на среде с 5% сахаро-
зы, произошло в основном за счет снижения содержания гликозидов Г^-группы, содержание гликозидов ЙЪ-группы было примерно одинаковым в обеих вариантах.
□ Rb1 ю RC В Rb2 a Rd a Rf И Rg1 Ш Re
Рис.4 Содержание тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens при выращивании в биореакторе с разным содержанием сахарозы в среде.
По совокупности данных химического анализа и ростовых кривых можно сделать вывод, что увеличение концентрации сахарозы в среде отрицательно сказывается на ростовых и биосинтетических характеристиках культуры клеток P.japonicus var. repens
Исследование влияния метилжасмоната на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток P.japomcus var. repens.
Метилжасмонат является мощным регулятором синтеза вторичных метаболитов, но может подавлять рост культуры, особенно при его добавлении в начале культивирования. В ранее проведенных экспериментах было выяснено, что максимум накопления тритерпеновых гликозидов в культуре клеток женьшеня ползучего наблюдается в конце фазы замедления роста - начала стационарной фазы и приходится на 14 - 21 сутки выращивания. Поэтому метилжасмонат добавляли в среду на 14 сутки
выращивания, т е после прохождения культурой периода интенсивного роста В результате анализа литературы, для проведения экспериментов были выбраны три концентрации метилжасмоната, отличающиеся на порядок 1мкМ, ЮмкМ и ЮОмкМ, в качестве контроля была принята среда без добавления метилжасмоната Кривые роста по сухому весу представлены на рис 5
Рис 5 Кривые роста суспензионной культуры клеток Рапах ]аротсж уаг герет при добавлении разных доз метилжасмоната
контроль ЮмкМ
-1мсМ "ЮОмкМ
Т 10 12 14 17 21 Сутки
Максимальное накопление сухой биомассы в контрольном варианте составило 8,1 г/л, в варианте с добавлением метилжасмоната в дозе ЮОмкМ - 6,95 г/л Внесение метилжасмоната на 14 сутки культивирования, особенно в дозе ЮОмкМ, привело к резкому снижению жизнеспособности культуры и интенсивной гибели клеток, чем можно объяснить разницу в сухом весе на 21 сутки по сравнению с контрольным вариантом Содержание гинзенозидов в биомассе Р]аротст измеряли на 0, 7, 14, 17 и 21 сутки культивирования, первые три анализа были общими для всех вариантов Полученные результаты представлены на рис 6
Сутки
П Rb1 ERC В Rb2 В Rd a Rf н Rg1 ® Re Рис.6. Содержание тритерпновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens при добавлении разных доз метилжасмоната
На 21 сутки субкультивирования содержание гинзенозидов в варианте 1 мкМ составило 2,22%, в варианте с 100 мкМ - 1,62, что выше контрольного значения на 180% и 128% соответственно. Содержание гинзенозидов в варианте 10 мкМ составило 0,83%, что значительно ниже, чем в контроле. Содержание гинзенозида Re в варианте с добавлением метилжасмоната в дозе 1мкМ увеличилось на 200%, а содержание гинзенозида Rgi - на 155% по сравнению с контролем. В варианте с ЮОмкМ метилжасмоната увеличение содержания гинзенозида Re на 21 сутки выращивания составило 156% по сравнению с контролем, содержание гинзенозида Rgi снизилось на 44%.
Из полученных данных можно сделать вывод, обработка метилжасмонатом приводит к увеличению содержания гинзенозидов, при этом наибольший эффект наблюдается через 6-7 дней после его внесения; к максимальному увеличению содержания гинзенозидов приводит доза 1мкМ. Увеличение содержания гинзенозидов за счет обработки метилжасмонатом, как правило, происходит за счет увеличения содержания гинзенозидов Re и Rgi
Исследование влияния фитогормонов на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток P.japomcus var. repens
Из литературы известно, что изменение фитогормонального состава среды может привести к изменению, как ростовых характеристик культуры, так и содержания гинзенозидов в биомассе Кроме того, повышение общего уровня ауксинов в питательной среде может снижать степень агрегировагагости культуры, что важно при переходе к аппаратурному выращиванию суспензии Поэтому следующим этапом работы было исследование влияния состава и количества ауксинов на рост культуры и содержание гинзенозидов Для экспериментов были использованы два варианта питательной средыс следующим фитогормональным составом
среда 62 - а-НУК - 2 мг/л, кинетин -1 мг/л, среда Т02 - а-НУК - 2мг/л, 2,4-Д - 2мг/л
Первый этап исследования проводили в колбах на качалке, полученные данные о росте культуры представлены на рис 7
2 т--2 т-
Рис 7 Кривые роста суспензионной культуры клеток Panaxjapomcus var repens при разном фитогормоналыюм составе питательных сред в колбах на качалке •- Сухая масса, ■ - Сырая масса, ▲ - Число клеток в 1 мл
□ э
1D 12 1» 17 21
Сутки
О 3 7 10 12 14 17 21 Сутки
Длительность фаз роста при выращивании культуры на используемых двух средах не имеет существенных отличий продолжительность лаг-фазы составляла до 2
- 4 суток, фазы экспоненциального роста - 8 -10 суток. Максимальное накопление биомассы приходилось на 20 - 21 сутки и составляло 7.2 г/л. Жизнеспособность клеток в суспензии находилась на уровне 78 - 85%, максимум продуктивности, совпадающий с началом замедления роста, наступал на 12-14 сутки культивирования. В то же время, изменение состава гормонов существенно изменяло степень агрегирован-йости культуры. В культуре, выращиваемой на среде 62 количество агрегатов, содержащих более 50 клеток, оказалось 91%, тогда как при выращивании клеток на контрольной среде Т02 доля таких шрегатов составляла лишь 20%.
Анализ содержания гинзенозидов проводили на 21 сутки выращивания, т.е. при наступлении стационарной фазы. Полученные результаты представлены на рисунке 8. При выращивании на среде Т02 к концу третьего субкультивирования наблюдали увеличение содержания гинзенозида Яе с 3,8 мг/г до 6,1 мг/г и уменьшение содержания гинзенозида с 1,2мг/г до 0,2мг/г. Содержание гинзенозидов Яс, КЬ2, Яс1 в варианте с высоким уровнем ауксинов снизилось по-сравнению с контролем в 2 раза.
□ ИЫ и Рс а ЯЬ2 в ра в и" Яд1 ш р.е
Рис. 8. Накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Рапах ]аротсиз уаг. герет при разном фитогбрмоналыюм составе питательных сред в колбах на качалке.
В биомассе клеток, выращиваемых на среде Т02, соотношение гинзенозидов ЯЬ и К^ групп в конце первого субкультивирования составило 1/1,7, в конце третьего 1/2,6
Нужно отметить, что соотношение гинзенозидов ЛЬ и групп в клетках, выращиваемых на разных средах, к концу третьего цикла выращивания, стало практически одинаковым (1/2,5)
Выращивание суспензионной культуры Р. )аротси5 уаг. герею на средах с разным содержанием фнтогормонов в биореакторе.
После проведения ряда последовательных экспериментов в колбах на качалке на среде Т02 была получена мелкодисперсная суспензионная культура клеток жень шеня ползучего Это послужило основанием для проведения экспериментов по выращиванию культуры Р ]аротс№ уаг герет в барботажном биореакторе с использованием двух вариантов питательных сред 62 и Т02 Эксперименты проводили в биореакторе с рабочим объемом 7 литров, в качестве инокулюма использовали суспензию, которую поддерживали в колбах на качалке на среде 62, инокуляцию проводили сразу в два биореактора Кривые роста представлены на рисунке 9
Сутки культов иров ания Сутки культивирования
Рис 9 Кривые роста суспензионной культуры клеток Panax japomcus уаг гepeni при выращивании в биореакторе с разным фитогормональным составом питательных сред
•- Сухая масса, ■ - Сырая масса, А - Число клеток в 1 мл
Изменения гормонального состава среды существенных отличий в ростовых параметрах культуры не повлекли - кривые роста обоих вариантов имеют типичную в-образную форму Лаг-фаза ростовой кривой, вне зависимости от используемой среды, составляла около двух суток, экспоненциальная фаза длилась до десятых суток
Чтобы проверить тенденцию к изменению соотношения гинзенозидов на разных средах, аналогичный эксперимент был повторен спустя полгода, однако культуру для инокутяции ферментера весь промежуток времени (9 циклов кучьтивирования) выращивали в биореакторе на среде 062 Посте этого инокуляция была проведена сразу в два ферментера - с контрольной средой 62 и средой Т02 На среде Т02 наблюдали существенные изменения ростовых характеристик лаг-фаза продолжалась примерно трое суток, длительность экспоненциальной фазы роста составта восемь суток Стационарная фаза составила 2 суток против 4 суток в варианте со средой 62 Данная фаза роста отсутствовала во время первого эксперимента При анализе порученных результатов, были рассчитаны основные параметры роста, которые предетав-тены в сводной табтице 3
Таблица 3 Параметры роста суспензионной культуры Р]аротсш уаг герет при выращивании на средах с разным содержанием ауксинов
Среда, цикл Ц» г/л Т, сут Ц, сут"1 Р, г/л сут У
62 (23 01 2002) 102 2 89 0 19 0 49 0 34
62 (26 09 2002) 9 66 4 05 0 17 0 50 031
Т02 (23 01 2002) 9 87 3 01 0 18 0 47 0 36
Т02 (26 09 2002) 9 02 3 83 0 18 0 46 0 30
Из данных химического анализа, представленных на рис 10, следует, что изменение композиции и повышение уровня ауксинов существенно втияет на состав гинзенозидов К концу первого субкультивирования суспензии на среде Т02 наблюдали резкое снижение их общего количества При этом особенно сильно снижалось содержание гинзенозидов Я£-группы, в то время как на среде 62 данные гинзенозиды являются преобтадающими Соотношение гинзенозидов групп в суспензии, вы-
ращиваемой на среде 62, было 1/2 , на среде Т02 - 6/1. При анализе содержания отдельных гинзенозидов можно также отметить существенные отличия их содержания при выращивании культуры на разных средах. Так, на 14 сутки культивирования содержание в клетках гинзенозида Rgj в 6,7 раз выше на среде Т02 по сравнению с клетками, выращенными на контрольной среде (среда 62). К концу первого цикла субкультивирования содержание гинзенозида Re уменьшилось на среде Т02 в 5,7раз,
» 6
s <ï
о 0 о
X
Ч> л g 4
s
g 1
Т02 В
u.L LI к
О В 14 21
Сутки культивирования
О 8 14 21
Сутки культивирования
30
.-25 ■
S 20 ■
0
1
£15
а 5 -
ni °
Т02 D
и
Сутки культаеирования 0 Сутакультивирования 22
Рис. 10 Содержание тритерпсновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Р. japonicus var.repens при выращивании в биореакторе на средах 62 и Т02.
А, В - эксперимент от 23.01.02; С, D-эксперимент от 26.09.02
тогда как на среде 62 содержание данного соединения практически не изменялось При сопоставлении результатов двух аналогичных экспериментов (января и сентября 2002 гг), можно отметить близкие закономерности в качественном и количественном содержании гинзенозидов Однако наблюдали и ряд отличий Соотношение ЯЬ/'Яе-группна среде 62 1/15, на среде Т02 - 1/6,5 Содержание гинзенозида Яе на 14 сутки субкультивирования в культуре на среде 62 составило 37 мг/г
Выращивание суспензионной культуры клеток Р¡аромсиь \аг. герею на средах с разным содержанием ауксинов в режиме полупротока
После ряда экспериментов, направленных на изучение влияния повышенного уровня ауксинов на ростовые и биосинтетические характеристики женьшеня ползучего, был проведен эксперимент по полупроточному выращиванию этой культуры в биореакторе Суспензию выращивали в течение шести последовательных циклах культивирования на двух средах - на контрольной (62) и с измененным составом ауксинов (Т02) В конце каждого субкультивирования осуществляли операцию «сига суспензии - долив питательной среды», которая приходилась примерно на 19 - 21 сутки цикла выращивания Степень разбавления рассчитывали таким образом, чтобы начальная плотность культуры составлята около 2 0 г/л по сухой биомассе Кривые роста культуры и общее содержание гинзенозидов в биомассе представлены на рис 11 Как следует из представленных результатов, максимальное накопление биомассы в течение всего периода культивирования составило 9-11 г/л, начало роста характеризовалось отсутствием лаг-периода - культура после долива свежей питательной среды сразу переходила к экспоненциальной фазе роста Как и в ранее проведенных экспериментах, особенных различий между кривыми роста культуры на разных средах не наблюдалось
При анализе содержания гинзенозидов в культуре, выращиваемой на среде Т02, наблюдалось резкое снижение их общего содержания с 2,9 % в конце первого субкультивирования до 0,2 % в конце шестого В течение эксперимента происходите постепенное снижение содержания гинзенозидов ¡^-группы, в конце шестого пассажа
их содержание снизилось на порядок. Содержание гинзенозидов Rb-группы также значительно снизилось, вплоть до исчезновения отдельных гинзенозидов, что не является типичной картиной для исследуемой культуры клеток P.japonicus var. repens.
Подводя итоги эксперименту с использованием повышенного содержания ауксинов в питательной среде можно сказать, что среда Т02 не снижает ростовых характеристик культуры, а в ряде случаев и улучшает их. Однако присутствие в среде 2.4Д и повышение общего содержания ауксинов отрицательно сказывается на уровне накопления гинзенозидов, что не позволяет рекомендовать использование данной среды для выращивания культуры клеток женьшеня ползучего.
о
О 20 40 ео SO 100 120 Сутки кул ьтмвиров ания
О 140
- ВО *
н
о о
"75 1
о
- 70 i
зс
-в51
- ео
Содержание гинзенозидов Сухой еео.г/л Жизнеспособность.^
ТСК2
Сутки культ и вир ока ни я
Рис Л1 Кривые роста и накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Я. japonicus var. repens при выращивании на средах с разным составом фитогормонов (среды 62 и Т02) в режиме полупротока.
Выращивание суспензионной культуры клеток Pjaponicus var repens в режиме проточного культивирования (хемостат)
Эксперимент проводили в 10 л биореакторе барботажного типа, слив суспензии осуществляли по уровню, долив свежей питательной среды - с помощью перистальтического насоса Анализировали основные ростовые параметры культуры, на основе полученных данных были построены кривые роста и рассчитаны основные показатели роста и продуктивности культуры Полученные данные представлены на рисунке 12 Рост в начальном периоде характеризовался отсутствием лаг-фазы, практически сразу культура перешла к экспоненциальной фазе роста Максимальное накопление сухой биомассы на 14 сутки выращивания составило 7,8г/л В этот момент был включен проток (d=0 11 сут"1), что составило примерно 75% от удельной скорости роста культуры в эшт момент (ц = 0,15 сут"1) После включения протока плотность суспензии начала снижаться, и составила к 24 суткам 5,8г/л К 31-м суткам культивирования культура достипа равновесного состояния («stady sate») Содержание сухой биомассы клеток в суспензии стабилизировалось на уровне 6 г/л На 62 сутки культивирования скорость протока была увеличена до 0,16 сут"1, что составило 107% от первоначальной скорости роста кучьтуры Произошло интенсивное снижение концентрации клеток в суспензии, и на 66 сутки культивирования концентрация сухой биомассы в суспензии составила 4,9г/л К 69 суткам было вновь достигнуто равновесное состояние и сухой вес суспензии стабилизировался на уровне 5,0 г/л На 76 сутки культивирования скорость протока снова была увеличена до 0,22 сут'1, что составило 145% от первоначальной скорости роста культуры, что привело к полному вымыванию клеток из суспензии в течение 10 суток Синтез гинзенозидов на протяжении всего периода выращивания оставался на довольно высоком уровне, первые 14 суток кутьтивирова-ния 1,5 - 2,0 % к сухой массе клеток После включение протока общее содержание гинзенозидов увеличилось и составило 2,5 - 3,0%, причем на 31 сутки бычо зафиксировано самое высокое содержание этих соединений (более 5,0 %) Соотношение гинзенозидов Rb- и Rg- групп представлено на рис 13 Содержание гинзенозидов Rb-группы оставалось примерно одинаковым на протяжении всего выращивания, содер-
жание гинзенозидов Н^-группы в ряде случаев различались в пять раз (8,4 мг/г на 14 сутки и 41,8 мг/г на 31 сутки).
Сутки культивирования содержание гинзенозидов, %
—*— Сукой вес, г/л —ш— Жизнеспособность, % Рис. 12. Кривые роста суспензионной культуры клеток Р.]аротсш уаг. гере/м при выращивании на среде 62 в режиме протока.
- 75°
ю о о о
X
т
5
со
О 3 5 7 10 12 14 17 21 24 27 31 Э4 38 41 46 48 52 ЭЗ 62 № ВВ 73 7В 80 87
вр^ь-фуппа иид-группа Сутки
Рисунок 13. Соотношение гинзенозидов И> и Rg групп при выращивании суспензионной культуры клеток Р.^аротсш уаг. герет на среде 62 в режиме протока.
Содержание отдельных гинзенозидов претерпевало сильные изменения Основные колебания синтеза приходились на долю гинзенозида Ле - максимальное содержание которого составило 32,6 мг/г (более 3% в сухой биомассе клеток) на 31 сутки культивирования и 5,1 мг/г на 14 сутки
По результатам, описанным в настоящей работе можно сказать, что суспензионные культуры женьшеня могут требовать различные условия для роста и биосинтеза гликозидов Изменение условий или методов выращивания может стимулировать рост, но подавлять синтез гинзенозидов, либо приводить к обратному эффекту Основная задача исследований в этой области - наити оптимальное сочетание условий, при которых рост культуры и синтез гинзенозидов находился бы на высоком уровне
Выводы
1 Культуру клеток женьшеня японского можно выращивать в биореакторах в различных режимах с сохранением высоких ростовых и биосинтетических характеристик При этом клетки содержат семь основных гинзенозидов с общим содержанием не менее 1% Для выращивания культуры в биореакторах рекомендуется увеличение начальной плотности клеток до 2 г/л по сухой биомассе
2 Увеличение содержания сахарозы в среде до 4 - 5% приводит к ухудшению роста культуры и снижению содержания гинзенозидов Снижение гинзенозидов происходит в основном за счет соединений -группы
3 На содержание гинзенозидов в культивируемых клетках женьшеня ползучего значительное влияние оказывает состав и количество ауксинов в среде При этом добавление в питательную среду 2,4-Д (помимо НУК), приводит к уменьшению степени агрегированности суспензии и снижению уровня содержания гинзенозидов
4 Содержание гинзенозидов в культивируемых клетках женьшеня ползучего можно повысить добавлением элиситоров Использование метитжасмоната в дозе 1 мкМ привело к двукратному увеличению содержания этих соединений (до 2 2% к сухой биомассе), преимущественно за счет гинзенозидов Яе и 11§1
5 При полупроточном выращивании культуры клеток женьшеня ползучего в течение шести субкультивирований зафиксированы стабильные и достаточно высокие ростовые характеристики На стандартной среде синтез гинзенозидов оставался стабильным в течение всех циклов выращивания (общее содержание около 3%), тогда как на среде с измененным содержанием ауксинов (присутствием 2,4-Д) содержание гинзенозидов снизилось почти на порядок
6 Осуществлено проточное выращивание культуры клеток женьшеня ползучего в режиме хемостата в течение 70 суток со скоростью протока 0,11 - 0,16 сут"' Показан стабильный рост культуры, синтез гликозидов находился на высоком уровне (общее содержание гинзенозидов в клетках достигало 5% в сухой биомассе)
Публикации по материалам работы
1 Решетняк О В , Князьков И Е , Смоленская И Н , Демидова Е В , Носов А М (2003) Изменение состава и соотношения гинзенозидов в биомассе каллусной и суспензионной культуры клеток Panax japomcus (var repens) зависимости от условий сушки Биотехнология, 2, стр 21-28
2 Демидова Е В , Решетняк О В , Носов А М (2003) Тритерпеновые гинзе-нозиды в суспензионной культуре Panax japomcus (var repens) при разных условиях выращивания Тезисы YIII международной конференции биологии растительных клеток ш vitro и биотехно тогии, Саратов, стр 77
3 Демидова Е В , Решетняк О В , Орешников А В , Носов А М (2006) Ростовые и биосинтетические характеристики культивируемых клеток женьшеня ползучего Panax japomcus var repens при глубинном выращивании в биореакторах // Физиология растений, Т 53, №1, стр 148-154
4 Демидова Е В , Решетняк О В , Носов А М (2006) Влияние состава питательных сред на ростовые характеристики и содержание тритерпеновых гликозидов суспензионной культуры клеток женьшеня японского (Panax japomcus var repens) // Биотехнология, № 2, стр 37-43
1,5 печ л
Зак 773
Тир 100 экз
Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демидова, Елена Викторовна
Введение.
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Систематика, распространение и история изучения видов женьшеня.
1.2. Химический состав физиологически активных соединений женьшеня и их фармакологическое действие.
1.2.1. Тритерпеновые гликозиды растений рода
Panax.
1.2.2. Тритерпеновые гликозиды Panax japonicus
1.2.3. Другие биологически активные соединения женьшеня.
1.2.4. Физиологическая активность биологически активных соединений женьшеня
1.2.5. Физиологическая активность биологически активных соединений P.japonicus
1.2.6. Методы анализа тритерпеновых гликозидов женьшеня
1.3. Женьшень in vitro
1.3.1. Культура клеток и тканей растений рода
Panax
1.3.2. Получение культур клеток и тканей женьшеня
1.3.3. Другие способы культивирования женьшеня in vitro
1.3.4. Физиологическая характеристика культур клеток женьшеня
1.3.5. Оптимизация питательных сред
1.3.6. Использование элиситоров в культуре клеток и тканей женьшеня
1.3.7. Глубинное выращивание суспензионных культур клеток рода Panax
1.3.8. Режимы выращивания суспензионных культур клеток рода Panax
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Объект исследования
2.2 Анализ роста культуры клеток
2.3 Методы определения производных параметров роста
2.4 Химический анализ содержание гинзенозидов в биомассе культуры клеток женьшеня
Результаты и обсуждение
Глава 3. Влияние начальной плотности на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток P. japonicus vox.repens
3.1 Ростовые характеристики суспензионной культуры клеток P. japonicus var. repens при выращивании с разной начальной плотностью.
3.2. Накопление тритерпеновых гликозидов в клетках женьшеня ползучего in vitro, выращиваемых при разной начальной плотности суспензии
Глава 4. Влияние углеводного состава среды на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток P. japonicus vox.repens
4.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры клеток Р.japonicus var. repens при выращивании на средах с разным содержанием сахарозы
4.2 Накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток P.japonicus при выращивании в средах с разным содержанием сахарозы.
Глава 5. Изучение влияния метилжасмоната на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры клеток P. japonicus var.repens при выращивании клеток в колбах на качалке.
5.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры
P.japonicus var. repens при добавлении разных доз метилжасмоната.
5.2 Накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток P.japonicus var. repens в колбах на качалке при внесении разных доз метилжасмоната
Глава 6. Исследование влияния фитогормонов на ростовые и биосинтетические характеристики суспензионной культуры P.japonicus var. repens.
6.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры
P.japonicus var. repens при выращивании на средах с разным содержанием ауксинов в колбах на качалке.
6.2. Накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток P.japonicus var. repens на средах с разным содержанием ауксинов при выращивании в колбах на качалке.
6.3. Ростовые характеристики культуры клеток
P.japonicus var. repens при выращивании на средах с разным содержанием ауксинов в биореакторе.
6.4. Накопление тритерпеновых гликозидов при выращивании культуры клеток P.japonicus var. repens на средах с различным содержанием ауксинов в биореакторе.
6.5. Ростовые характеристики суспензионной культуры клеток P.japonicus var. repens на средах с разным содержанием ауксинов в режиме полупротока.
6.6. Накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре P.japonicus var. repens при выращивании на средах с разным содержанием ауксинов в режиме полупротока.
Глава 7. Выращивание суспензионной культуры клеток
P.japonicus var.repens в режиме проточного культивирования (хемостата)
7.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры клеток P.japonicus var.repens при выращивании в режиме протока (хемостата).
7.2. Накопление тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток P.japonicus var. repens при выращивании в режиме протока (хемостата)
Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var.repens при разных условиях выращивания"
Актуальность темы. Культура клеток высших растений может служить удобным объектом для изучения ряда физиологических и биохимических проблем, быть моделью для изучения закономерностей роста и развития растительной клетки. В условиях in vitro растительные клетки, выйдя из под контроля организма, формируют уникальную биологическую систему -популяцию соматических клеток. Это позволяет производить на их основе уникальные исследования, детально изучать механизмы роста и развития популяции, первичного и вторичного метаболизма растительной клетки. Наиболее перспективным представляется исследование вторичного метаболизма в клетках высших растений in vitro. Это может быть использовано в качестве нетрадиционного подхода к решению одной из фундаментальных проблем физиологии растений - функциональной значимости вторичных метаболитов в жизнедеятельности клетки и целого организма.
Помимо использования в фундаментальных исследованиях, культура клеток высших растений является универсальным инструментом, с помощью которого можно решать многие практические задачи. В частности, растительные клетки in vitro могут служить источником ценных веществ растительного происхождения
В настоящее время в мире наблюдается тенденция к широкому использованию лекарственных средств, полученных на основе растительного сырья. Особый интерес уделяется препаратам, направленным на усиление защитных свойств организма и повышение иммунитета, обладающими адаптогенными свойствами. Из всего растительного разнообразия растения рода Panax (женьшень) являются, пожалуй, самыми знаменитыми лекарственными растениями, обладающими подобными свойствами. Женьшень на протяжении веков пользовался легендарной славой панацеи, т.е. всеисцеляющего средства, и в результате разноплановых исследований многие ожидания, связанные с его лекарственными свойствами, подтвердились. Однако, усиление интереса к препаратам, созданным на основе женьшеня, привело к печальным последствиям экологического плана - невосполнимому уничтожению этих реликтовых растений. Например, в Дальневосточном крае нашей страны практически полностью уничтожены дикорастущие формы женьшеня настоящего, причем учитывая биологию его развития, потери действительно невосполнимы.
Растения рода женьшень содержат разнообразные биологически-активные соединения, обуславливающие их лекарственные свойства. Однако уникальными и наиболее интересными из них являются тетрациклические тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда - гинзенозиды (панаксизиды). Эти ценные вторичные метаболиты, имеющие высокую биологическую активность. На сегодняшний день открыто более пятидесяти гинзенозидов, ведутся работы по выявлению механизма их действия на человеческий организм. Наибольшее внимание исследователей привлекает в первую очередь гликозиды, полученные из женьшеня настоящего - P.ginseng, т.к. он является традиционным лекарственным растением восточных народов. Однако существуют другие представители рода Panax, использование которых в качестве продуцентов полезных веществ весьма перспективно. К таким растениям можно отнести женьшень ползучий P. japonicus var repens, который многие авторы рассматривают как подвид Panax japonicus -эндемичный вид, произрастающий на Дальнем Востоке нашей страны. Состав гинзенозидов данного вида женьшеня необычен, в нем преобладают гликозиды с олеаноловой кислотой в качестве агликона (чикусетсу-гинзенозиды).
Суспензионная культура клеток данного вида предоставляет возможность исследовать не только закономерности роста, но и особенности биосинтеза тритерпеновых гликозидов при различных способах и методах культивирования. Она может служить моделью для изучения изменения содержания гинзенозидов в зависимости от состава питательных сред, добавления элиситоров, использования биореакторов разных объемов, использования различных режимов культивирования и т.д. Получение тритерпеновых гликозидов с помощью культуры клеток P. japonicus var repens имеет большую практическую и теоретическую ценность.
Цель работы заключалась в изучении закономерностей процесса роста суспензионной культуры клеток Panax japonicus var. repens и особенностей биосинтеза клетками in vitro тритерпеновых гликозидов при различных способах и режимах выращивания культуры.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи исследования:
1. Изучить качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var .repens;
2. Изучить влияние различных факторов культивирования (начальная плотность культуры, фитогормональный состав среды, содержание углеводов в среде, добавление элиситора метилжасмоната) на ростовые характеристики культуры и синтез тритерпеновых гликозидов;
3. Изучить влияние различных способов культивирования (в колбах, в биореакторах различной конструкции и объема) на рост культуры и биосинтез гинзенозидов;
4. Изучить влияние различных режимов культивирования (периодический, полупроточный и проточный) на ростовые и биосинтетические показатели культуры.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное исследование ростовых и биосинтетических характеристик суспензионной культуры клеток женьшеня ползучего Panax japonicus var. repens. Изучено влияние различных факторов культивирования (начальная плотность культуры, состав и количество в среде фитогормонов, сахарозы, метилжасмоната) на рост культуры и накопление в клетках гинзенозидов. Впервые осуществлено полупроточное и проточное выращивание культуры клеток Panax japonicus var. repens в биореакторах и показаны высокие ростовые и биосинтетические ^ характеристики культуры при выращивании в этих режимах.
Практическое значение работы.
В результате проведенных исследований полученные данные о возможности выращивания данного штамма в биореакторах, объем которых может быть в дальнейшем доведен до полупромышленных и промышленных величин. Изучена возможность выращивания культуры в режимах, отличных от периодического - полупроточном и проточном. Предложены пути повышения биосинтеза тритерпеновых гликозидов в биомассе с помощью v изменений фитогормонального состава питательных сред и добавления элиситора метилжасмоната.
На защиту выносится
- Ростовые характеристики культуры при разных способах выращивания культуры;
-Результаты анализа содержания тритерпеновых гликозидов при разных способах выращивания культуры.
Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН в лаборатории физиологии культивируемых клеток.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Демидова, Елена Викторовна
Заключение
По результатам, описанным в настоящей работе можно сказать, что суспензионные культуры женьшеня могут требовать различные условия для роста и биосинтеза гликозидов. Изменение условий или методов выращивания может либо стимулировать рост, но подавлять синтез гинзенозидов, либо наоборот. Основная задача исследований в этой области - найти оптимальное сочетание условий, при которых рост культуры и синтез гинзенозидов находился бы на высоком уровне.
Определение размера иннокулюма для выращивания культуры клеток в биореакторах - первичная задача, которая стоит перед исследователем при переходе к использованию аппаратурного метода выращивания. Необходимость увеличения размера иннокулюма освещается в некоторых работах, посвященных этому вопросу (Thanh et al, 2004). В нашей работе увеличение размера иннокулюма вдвое по-сравнению с контролем привело к увеличению общего содержание гинзенозидов на 22%.
Увеличение концентрации сахарозы в среде обычно приводит к улучшению ростовых характеристик культур клеток женьшеня (Zhang et al, 1996, Sivakumar et al, 2005), но снижают синтез гинзенозидов. В нашей работе увеличение концентрации сахарозы до 4 % и 5% привело и к снижению роста и к снижению биосинтеза гинзенозидов.
При культивировании суспензии в среде Т02 с повышенным содержанием ауксинов, по ростовым параметрам культура не уступала контрольной среде 62, а биосинтез гинзенозидов отличался в значительной степени. Zhong (Zhong et al, 1996) с коллегами исследовали влияние кинетина, 2,4-Д и ИУК на рост и биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. ginseng. Максимального накопления гинзенозидов в биомассе (10,9% по сухому весу) им удалось добиться при применении 2,5 мг/л ИУК и 0,1 мг/л кинетина, без добавления 2,4-Д. Можно предположить, что 2,4-Д отрицательно влияет на биосинтетические характеристики культуры, каким-то образом блокируя синтез гликозидов.
Применение метилжасмоната как элиситора широко распространено в культуре клеток растений. Большинство исследователей считают его ответной реакцией на патогенную атаку. Существуют работы, связанные с использованием МЖ в качестве элиситора для синтеза веществ, имеющих защитные функции в растении, например алкалоидов (Facchini, 2001). Большинство исследователей считают гликозиды женьшеня - гинзенозиды -имеющими запасающие свойства, никак не связанные с защитной функцией. Однако всплеск синтеза гинзенозидов при применении метилжасмоната описаны во многих работах не только с культурой клеток растений, но и с каллусами, бородатыми и адвентивными корнями (Kim et al, 2005; Wang et al, 2002; Lu et al, 2001). В нашей работе максимальное накопление гинзенозидов в культуре удалось получить при применении метилжасмоната в концентрации 1 мкМ, большинство авторов указывают гораздо большую - до ЮОмкМ. Это еще раз доказывает необходимость дальнейшего исследования вопроса применения элиситоров в культуре клеток женьшеня.
При использовании биореакторов для выращивания культур клеток рода Panax часто используются режимы, отличные от периодического, способствующие увеличению продуктивности процесса по ростовым и биосинтетическим параметрам (Ushiyama, 1991; Giri, Narasu, 2000; Kim et al 1995; Kim, Wyslouzil, 2002; Sivakumar et al, 2005). При выращивании суспензионной культуры клеток P. japonicus var. repens в проточном режиме нам удалось добиться максимального содержания гинзенозидов 5 % , а в среднем около 3% к сухому весу клеток.
1. Увеличение начальной плотности культуры при выращивании в биореакторе приводит к изменению ростовых характеристик, но практически не изменяет содержания гликозидов;
2. При увеличении содержания сахарозы в среде содержание тритерпеновых гликозидов снижается, причем при 5% сахарозы в среде больше, чем при 4%. Снижение содержания гинзенозидов происходит в основном за счет Rg -группы, содержание гинзенозидов Rb -группы остается примерно одинаковым;
3. При добавлении метилжасмоната в дозе 1 мкМ происходит увеличение содержания гинзенозидов на 180% по сравнению с контролем, v ростовые характеристики культуры не снижались;
4. За счет увеличения содержания ауксинов в питательной среде получена мелкодисперсная суспензия, однако при этом снижается содержание гинзенозидов;
5. При полупроточном выращивании культуры на двух средах в течение шести субкультивирований зафиксированы стабильные и достаточно высокие ростовые характеристики культуры. Однако, на среде с высоким уровнем ауксинов содержание гинзенозидов снижалось почти на порядок. На контрольной среде (62) синтез оставался стабильным в течение всех циклов выращивания (около 3%);
6. Проточное культивирование в течение 70 сут. со скоростью протока 0,11 - 0,16 сут-1.показало стабильный рост культуры, синтез гликозидов находился на высоком уровне (около 3%).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демидова, Елена Викторовна, Москва
1. Баландин Д.А. Химический состав женьшеня.(1955)Материалы к изучению женьшеня и лимонника. ДВО АН СССР, В.2, -С.77-96
2. Бородова М.С., Дубинская В.А., Дороничева Н.Б., Минеева М.Ф., Колхир В.К. (2004) Оценка биологической активности растительных средств ферментными биотест системами. Фармация, 1, стр. 42-44.
3. Бочарова О.А., Куренная О.Н.,Серебрякова Р.В., Бодрова Н.Б.(1993) Новый способ биологического тестирования препаратов адаптогенов. Биотехнология, 8, С. 28 - 34.
4. Брехман И.Щ1957) Женьшень. JL: Медгиз., 181 С.
5. Брехман И.И., Дардымов И.В., Добряков Ю.И. (1966) К фармакологии индивидуальных гликозидов из корней женьшеня {Panax ginseng). Фармакология и токсикология, 2, С. 167-170.
6. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Бабкина Э.Н., Уварова Н.И., Маханьков В.В.(1991) Содержание даммарановых гликозидов в различных каллусных линиях Panax ginseng С.А. Meyer. Растит, pec., .27, В.З, - С. 94 - 100.
7. Булгаков В.П., Лауве Л.С., Чернодед Г.К., Ходаковская МИ.В., Журавлев Ю.Н. (2000) Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированного растительным онкогеном rol С. Генетика, 36, стр. 209-216.
8. Бутенко Р.Г., Грушвицкий И.В., Слепян Л.И. (1968) Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре ткани женьшеня и других представителей рода Панакс. Ботанический журнал, 53(7), с. 906912.
9. Бутенко Р.Г., Мясоедов Н.А., Шамина З.Б., Слепян Л.И. (1984) Штамм ИФР Ж2 - продуцент биологически активных веществ женьшеня и способ получения биологически активных веществ. А.
10. С. 1058281 СССР Б.И., 1984, - N. 37, - С. 214.
11. Бутенко Р.Г.( 1964) Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука., 162 С.
12. Бутенко Р.Г.( 1986) Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения. Культура клеток растений и биотехнология, под редакцией Р.Г.Бутенко. М.:Наука, с. 3 - 20.
13. Бутенко Р.Г.(1990) Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике. Основы сельскохозяйственной биотехнологии, под ред.Муромцев Г.С и др.,М.: Агропромиздат, с. 154- 235.
14. Бутенко Р.Г., (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.,: ФКБ-ПРЕСС, -159 с.
15. Бутенко Р.Г., СлепянЛ.И., Хретонова Т.И., Михайлова Н.В., Высоцкая Р.И. (1979) Фитохимический анализ штамма культуры ткани корня женьшеня и стандартизация его препаратов. Растительные ресурсы, 15, В.З, - С. 356 - 360.
16. ВФС 42-1890-89 Настойка" Биоженьшень "
17. ВФС 42-1891-89 Биомасса женьшеня сухая.
18. Высоцкая Р.И., Слепян Л.И. (1980) Культура ткани женьшеня. Сообщение 1. Химический состав биомассы культуры ткани женьшеня. Растительные ресурсы, 16, В.1, - С. 123 - 129.
19. Глебко Л.И., Улькина Ж.И., Воробьев О.Ю., Кондратьева Г.К. (1991) Количественное определение суммы гинзенозидов в корнях Panax ginseng С.А. Meyer. Метод спектрофотометрии. Растительные ресурсы, 27, В.4, - С. 120 - 123.
20. Громова Л.И., Громова Н.А., Минина С.А., Слепян Л.И. (1990) Экспресс-метод определения количественного содержания панаксозидов в корнях Panax ginseng С.А. Meyer. Растительные ресурсы, 26, В.З, - С. 428 - 430.
21. Грушвицкий И.В. (1961) Женьшень. Вопросы биологии.// Владивосток.:СО АН СССР, 344 С.
22. Губарь С.И., Гулько Т.П., Кунах В.А. (1997) Рост и накопление гликозидов в каллусной культуре тканей женьшеня при длительном воздействии экзогенных фитогормонов.Физиология растений, 44, N. 1, - С. 97-103.
23. Давыдов Д.Д.(1890) Фармакологическое и химическое изучение корня женьшеня. Фармацевтический журнал, 1, С.97; 8, - С. 114; 9, - С. 129.
24. Дар дымов И.В.(1979) Женьшень и элеутерокок (к механизму биологического действия). М.: Наука , 189 С.
25. Еляков Г.Б., Стригина Л.И., Хорлин А.Я., Кочетков Н.К. (1962) Гликозиды из корня женьшеня (Panax ginseng С.А. Meyer). Изв. АН СССР. Отд. хим. наук., 2, С. 2054.
26. Еляков Г.Б., Стригина Л.И., Кочетков Н.К.(1965) Гликозиды из корней женьшеня. VI. Строение углеводной цепи панаксозида А. Химия природн. соединений, 3, С. 149 - 152.
27. Еляков Г.Б., Уварова Н.И., Прокопенко Г.И., Маханьков В.В.,Слабко М.Г., Фаустов B.C., Константинова Н.А., Новиков Е.В.,Подгорбунская Н.В. (1989) Химическое исследование суспензионной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 5, -N.4,- С. 420 426
28. Журавлев Ю.Н.(1996) Araliacaea: Женьшень и другие.
29. Владивосток: Дальнаука, 279 с.
30. Запотылка Р.Т. (1951) Результаты сравнительного химического исследования различных представителей корня женьшеня и его препаратов. Материалы к изучению стимул, и тониз. средств корня женьшеня и лимонника., В.1, С.51 - 58.
31. Кандараков О.Ф., Воробьев А.С., Носов A.M. (1994) Биосинтетические характеристики популяции клеток Dioscorea deltoidea при проточном культивировании. Физиология растений, 41 (6), с. 913-917
32. Кефели В.И. Рост растений и природные регуляторы. (1978) Физиол. растений, 25, вып. 5, 975 989.
33. Клюшин А.Г. Характеристика роста суспензионной культуры клеток Polyscias filicifolia bailey при различных способах культивирования, Дисс. канд. биол. наук, М.: 2000
34. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве JI.C., Журавлев Ю.Н. Реунова Г.Д. (2001) Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня Panax ginseng.Биотехнология, 1, с. 19-26
35. Константинова Н.А.,Зайцева Г.В.,Фаустов В.С.,Маханьков В.В., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. (1989) Исследование ростовых и биосинтетических способностей длительно пассируемой суспензионной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 5, -N.5,517- 575.
36. Константинова Н.А., Маханьков В.В., Уварова Н.И., Самошина
37. Н.Ф., Сова В.В., Михайлова О.М. (1995) Исследование динамики биосинтеза гинзенозидов в цикле роста каллусной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 9-10, 35-39.
38. Кунах В.А. (1999) Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro. Физиология растений, 46(6), с.919-929.
39. Кунах В.А., Можелевская Л.П., Адонин В.И., Губарь С.И. (2003) Продуктивность и генетическая структура клеточных популяций женьшеня Panax ginseng С. А. Меу. в культуре in vitro. Биотехнология, 3, с. 25-35.
40. Малиновский Г.В.,Маханьков В.В.,Денисенко В.А., Уварова Н.И. (1991) Изучение химического состава товарных корней Рапса ginseng. Химия природных соединений, 2, 294 295.
41. Маханьков В.В., Самошина Н.Ф., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. (1993) Анализ нейтральных гинзенозидов диких и плантационных корней Panax ginseng, произрастающих в Приморье. Химия природных соединений, 2, 237 242.
42. Молодюк О.И., Александрова И.В., Долинина А.Н., Гуков И.А. (1983) Влияние стрессовых факторов на суспензионную культуруженьшеня. Культура клеток растений., Кишинев.:Штиинца, 75 с.
43. Мясоедов Н.А., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. (1985) Оптимизация питательной среды и выделение новых штаммов для культур ткани женьшеня. Физиология растений, 32,4, 800-806.
44. Липский А.Х. (1993) Физиология роста культур клеток растений в биореакторах (периодические режимы). Дисс. канд. биол. наук. -Москва, 162 с.
45. Носов A.M. (1991) Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений, под редакцией Бутенко Р.Г. М.:Наука, 520.
46. Носов A.M. (1992) Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной, как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов. Дисс. докт. биол наук.- М.: НИП-КИ прикладной биохимии, 243 с.
47. Носов A.M. (1994) Функции вторичных метаболитов растений in vitro и in vivo .Физиологиярастений, 41,6, 873 878.
48. Носов A.M. (1999) Культура вычших растений уникальная система, модель, инструмент. Физиология растений, 46, 6, 837-844.
49. Орешников А.В.( 1996) Физиология популяции культуры клеток Dioscorea deltoidea в условиях закрытого протока. Дисс. канд. биол. наук. М.: ИФР РАН, 115 с.
50. Пасешниченко В.А. (2001) Растения продуценты биологически -активных веществ. Биология, М.: Наука.
51. Перт С.Дж. (1978) Основы культивирования микроорганизмов. М.:Мир, 332 с.
52. Писецкая Н.Ф. (1970) К вопросу о подборе питательной среды для культуры ткани женьшеня. Растительные ресурсы, 6(4), с. 517520.
53. Решетняк О.В. (1998) Сравнительное исследование паноксазидов в культуре клеток и корне женьшеня. Дисс. канд. наук.-М.,1998.
54. Решетняк О.В., Князьков И.Е., Демидова Е.В., Носов A.M. (2003) Изменение состава и соотношения гинзенозидов в биомассе каллусной и суспензионной культуры клеток Panax japonicus (var.repens) зависимости от условий сушки. Биотехнология, 2, стр. 21-28.
55. Решетняк О.В., Смоленская И.Н., Смирнова Ю.Н., Чайко А.Л., Носов А.В. Носов A.M. (2005) Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens 2. Качественный и количественный составт гинзенозидов в клетках in vitro. Биотехнология, 6, 20-26.
56. Российский Д.М. (1952) Очерк развития медицины в Китае. Фелъдшерство и Акушерство, 1. 34 38.
57. Смоленская И.Н. Решетняк О.В., Зоринянц С.Э., Чайко А.Л., Носов A.M., Князьков И.Е (2001) Рост суспензионной культуры клеток женьшеня Panax japonicus (var. repens) и биосинтез панаксозидов в культуре. // Цитология, 43, с 891
58. Смоленская И.Н., Заринянц С.Э., Смирнова Ю.Н., Носов А.В., Чайко А.Л., Носов А.М.(2005) Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens 1. Параметры роста и цитогенетические характеристики. Биотехнология, 5, 21-28.
59. Строгов С.Е., Зайцева Г.В., Белоусова И.М., Шамков Н.В., Симонова Г.М. (1990) Опыт крупномасштабного культивирования клеток женьшеня в суспензии. 1. Масштабирование опытнопромышленной установки. Биотехнология, 4, 43 -45.
60. Тарчевский И.А. (2000) Элиситор-индуцируемые сигнальные системы клеток растений. Физиология растений, 47(2). С. 321-332.
61. Трилис Я.Г., Давыдов В.В. (1995) Новые сведения о механизмах адаптогенного действия препаратов культуры тканей Panax ginseng С.А. Меу. и Polyscias filicifolia bailey (Araliaceae). Растительные ресурсы, 3, 19 35.
62. Уварова Н.И., Горшкова Р.П., Стригина Л.И., Еляков Г.Б., Кочетков Н.К. (1965) Выделение новых гликозидов из женьшеня. Химия природных соединений, 2, 82 86.
63. Уварова Н.И., Маханьков В.В., Прокопенко Г.И., Слабко М.Г., Малиновская Г.В. (1988) Химическое исследование биомассы культуры клеток женьшеня. 11. б-О-ацилпроизводные-D-глюкозида-ситостерина. Химия природных соединений, 3,463-464.
64. Уварова Н.И. Маханьков В.В., Самошина Н.Ф.(2000) Химическая характеристика и биологическая активность тритерпеновых гликозидов приморской популяции Panax ginseng С.А. Meyer. Химико-фармацевтический журнал,34(3), стр. 19-25.
65. Филиппова И.Н., Зоринянц С.Э., Володина С.О., Смоленская И.Н. (2003) Культуры клеток экдистероидсодержащих растений Ajuga reptans и Serratula coronata. Физиология растений, 50, с. 501-508.
66. Ходаковская М.В., Булгаков В.П., Маханьков В.В. (1995) Влияние фитогормонов на накопление биомассы и содержание гинзенозидов в каллусных культурах Panax ginseng С.А. Meyer. Биотехнология, 9-10, 40-45.
67. Ходаковская М.В., Булгаков В.П., Журавлев Н.Н. (1997) Влияние некоторых метаболитов изопреноидного пути на накопление биомассы и содержиние гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня. Биотехнология, 1 стр. 42-47.
68. Чайко А.Л.,Решетняк О.В.,Куличенко И.Е. (1999) Культура клеток женьшеня японского Panax japonicus (var. repens): получение каллусной и суспензионной культуры, оптимизация роста и анализ панаксозидов Биотехнология, 6, 51-55.
69. Чой К-Т, Ан И-О, Парк Д-Ч. (1994) Образование гинзенозидов в культуре тканей женьшеня {Panax ginseng С.А. Meyer). Физиология растений, 41,6, 891-895.
70. Цой К.Т., Ахн И.О., Пак Д.С.(1994) Продуцирование гинзенозидов культурой клеток женьшеня (Panax Ginseng C.A.Meyer). Физиология растений, 41(6), 784 788.
71. Шиков А.Н., Антан И.С., Слепян Л.И., Минина С.А. (1995) Влияние низкотемпературного стресса на штаммы Panax ginseng C.A.Meyer. Растительные ресурсы, 31 (2), стр.1 9.
72. Энгельгардт X. (1980) Жидкостная Хроматография при высоких давлениях, М.:. Мир , 245 С.
73. Asaka I., Ii I.,Hirotani M., Asada Y., Furuya T.(1993) Production of ginsenoside saponins by culturing ginseng (Panax ginseng) embryogenic tissues in bioreactors. Biotechnology letters, 15(12) pp.1259-1264.
74. Asaka I.,Ii I,Hirotani M,Asada Y., Yoshikawa T.,Furuya T.(1994) Mass-production of ginseng (Panax ginseng) embryoids on media containing high concentrations of sugar. Planta medica, 60 (2), pp. 146-148.
75. Attele A.S., Wu J.A., Juan C.-S.(1999) Ginseng pharmacology multiple constituents and multiple actions. Biochemical pharmacology, 58, pp. 1685-1693.
76. Bonfill M., Cusido R.M., Palazon J., Pinol M., Morales C. (2002) Influence of auxins on organogenesis and ginsenosides production in Panax ginseng calluses. Plantcell, Tissue and organ culture, 68, pp.7378
77. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Chernoded G.K.,Zhuravlev Y.N. (1998) The impact of plant rolC oncogene on ginseniside production by ginseng hairy root cultures. Phytochemistry, 49 (7), pp.1929-1934.
78. Chan, T.W.D., But, P.P.H., Cheng, S. W, Kwok, I.M.Y, Lau, F. W. & Xu, H. X. (2000) Differentiation and authentication of Panax ginseng, Panx quinquefolius, and ginseng products by using HPLC/MS. Analytical Chemistry. 72, pp.1281-1287.
79. Cheng Y., Shen L.H., Zhang J.-T. (2005) Anti-amnestic and -aging effects of ginsenosides Rgi and Rbi and its mechasm of action. Acta Pharmocology, 26(2), pp. 143-149.
80. Choi Y.E. (2006) Ginseng (Panax ginseng). Methods Mol.Biology, 344, pp. 361-371.
81. Due N.M., Kasai R.,Ohtani K., Ito A., Nham N.T.,Yamasaki K.,Tanaka 0.(1994) Saponins from Vietnamese ginseng, Panax-vietnamensis Ha Et Grushv collected in central Vietnam . l.Chem.Pharm. Bull., 42(1), pp. 115-122.
82. Facchini P.J. (2001) Alkaloid biosynthesis in plant: biochemistry, cell biology, molecular regulation and metabolic engineering applications. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 52, pp.29-66
83. Fujimoto Y., Satoh M. (1987) Acetylenes from the callus of Panax ginseng. Phytochemistry, 26 (10), pp 2850-2852.
84. Fujimoto Y.,Wang H.C., Satoh M., Takeuchi N.(1994) Polyacetylenes from Panax quinquefolium. Phytochemistry, 35(5), pp.1255-1257.
85. FujiokaN., KohdaH., YamasakiK., Kasai R., Tanaka 0.,Shoyama Y., Nishioka I. (1989) Dammarane and oleanane saponins from callus tissue of Panax japonicus. Phytochemistry, 28 (7), pp. 1855 1858.
86. Furuya Т., Kojima H., Syono K., Ishii Т., Votani K., Nishio M. (1973) Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chem. Pharm. Bull., 21 (1), pp. 98-101.
87. Furuya Т., Yoshikawa Т., Ohihara J., Oda H. (1984) Studies of the culture conditions for Panax ginseng cell in Jar fermentors. J. of natural products, 47(1), pp.70-75.
88. Furuya Т., Yoshikawa Т., Ushiyana К., OdaH.(1986) Formation of planlets from callus cultures of ginseng (Panax ginseng). Experientia, 42 (2), pp. 193-194.
89. Gafner S. (2004) Evaluation of the efficiency of threedifferent solvent systems to extract triterpene saponins from roots of P.quinquefoliuns using high-performance liquid chromatography. Journal agriculture food chemistry, 52, pp. 1546-1550.
90. Gantet P., Memelink J. (2002) Transcription factors: tools to engineer the production of pharmacologically active plant metabolites. Trendpharmacology science, 23, pp.563-569.
91. A.Giri., M.L. Narasu (2000) Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnology Advaces, 8, pp. 1-22.
92. Graebe J.E., Novelli G. D. (1966) A practical method for large-scale plant tissue culture. Exp. Cell Res., 41 (3), pp. 509 520.
93. Gui J.F.(1995) Identification and quantification of ginsenosides in various commercial ginseng preparations. European journal of pharmaceutical sciences, 3 (2), pp.77-85.
94. Iwabuchi H., Yoshikura M., Kamisako W. (1989) Studies of the sesquiterpenoids of Panax ginseng. lll.Chem. Pharm. Bull., 37(2), pp. 509 510.
95. Jaime A. Teixeira ola Silva. (2003) Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology. African Journal of Biotechnology, 2(12), pp.683-691.
96. Jamasasaki K. (2003) Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis. Pharm. Biology, 38(1), pp. 16-24.
97. Jang J.J., Staba E.J., Kim Y.Y.(1974) American and Korean ginseng tissue cultures : growth chemical analysis and plantlet production. In vitro, 4, pp. 253 260.
98. Jartoux (Father)(1714) The description of tartarian plant called ginseng. London philosophical trans. 21, pp. 237-247.
99. Jeong G.T., Park D.H., Hwang В., Park K., Kim S.W., Woo J.C. (2002) Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor. Apply Biochemistry Biotechnology. 98, pp. 1115-1127.
100. Jiang Y., Chen L., SunC.W., Zhong G.G., Qi H., MaX.Y.,Xu J.D.(1993) Influence of 11 ginsenoside monomers on action potentials of myocar diocytes. Actapharmacologica sinica, 14 (5), pp. 508 - 512.
101. Joo C.N. (1993) Defense function of ginsenosides against several biochemical disorders in the animal body. The 6th international ginsengsymposium, Seul, Korea.
102. Hahn E.-J., Kim Y.-S.,Yu K.-W., Jeong C.-S., Paek K.-Y.(2003) Adventitious root cultures of Panax ginseng C.A. Meyer and ginsenoside production through large-scale bioreactor system. Journal of Plant Biotechnology, 5(1), pp. 1-6.
103. Han J., Zhong J.-J. (2003) Effects of oxygen pattial pressure on cell growth and ginsenosides production in high density cell cultures of Panax notoginseng. Enzyme and Microbial technology, 32, pp. 498-503.
104. Haralampidis K., Troyanowska M., Osbourn A.E. (2001) Biosynthesis of triterpenoid Saponins in Plants. Biochemical Engineering/Biotechnology, 75, pp.32-47.
105. Hiai S., Oura H., Hamanaka H., Odaka Y. (1975) A color reaction of panaxadiol with wanilin and sulfuric acid. Planta medica, 28, (2) pp. 131 -139.
106. Hirakura K., Morita M.,Nakajama K., Ikeya Y., Mitsuhashi H. (1991) Polyacetylenes from the roots of Panax ginseng. Phytochemistry, 30 (10), pp. 3327-3333.
107. Honda H., Itoh Т., Shiragami N., Unno H. (1993) Phytohormone controle for plant cell culture using bioreactor equipped with in-line feeding column. Journal of chemical engineering of Japan, 26(3), pp.291-296.
108. Hu W.W., Yao H., Zhong JJ. (2001) Improvement of Panax notoginseng cell culture for production of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation in pneumatically agitated bioreactors. Biotechnology progressing, 17(5), pp.838-846.
109. KaizukaH., Takahashi К. (1983) HPLC system for a wide range of naturally occuring glycosides. Journal of Chromatography, 258, pp. 135 146.
110. Kanaoka M.,Kato H.,Shimada F.,Yano S. (1992) Studies on the enzyme -immunoassay of bioactive constituents in oriental medicinal drugs .6. Enzyme immunoassay of Ginsenoside Rb 41 0 from Panax ginseng. Chem. Pharm. Bull, 40,2, pp.314-317
111. Kim D.S., Chang Y.-S., Zedk U., Zhao P., Liu Y.Q., Yang C.-R. (1995) Dammarane saponins from Panax ginseng. Phytochemistry, 40(5), pp. 1493-1497.
112. Kim S„ Kim D.S., Lee Y.H.,Park J.D.,Baek N-N.(1995) Isolation of novel dammarane-glycoside, ginsenoside Rh 44 0, from Korean red ginseng. Proc.of'95 Korean-Japan Symp., pp.107-116.
113. Kim Y., Wyslouzil B.E., Weathers P. (2002) Secondary metabolism of hairy root cultures in bioreactors. In Vitro Cell Del.Biol.-Plant, 38, pp.l-10.
114. Kim Y.-S., Hahn E.-J., Murthy H.N., Paek K.-Y. (2005) Adventitious root growth and ginsenosideaccumulation in Panax ginseng cultures as affected by methyl jasmonate. Biotechnology Letters 26 (21), pp. 16191622.
115. Kando N., Marumoto Y., Shoji J. (1971) Studies on the constituents of Panax Japonicus*s rhizoma.W. The structure of chikusetsusaponin V. Chem. Pharm. Bull., 19, 6, pp. 1103-1105.
116. Ко K.M., Yang D.C., Park S.C. Choi K.S., Choi K.T., Hwang B. (2003) Mass culture and ginsenoside production of ginseng root by two-step culture process. Journal Plant Biology, 39, pp. 63-69.
117. Krahe M. (2001) Biochemical engineering AG. Wald, Switzerland
118. Kubo M., Tani Т., Katsuki Т., Ishizaki K., Arichi S. (1980)
119. Histochemistry. 1. Ginsenosides in ginseng {Panax ginseng C.A.Mey, root). J. of Natural Prodacts, 43 (2), pp.278-284.
120. Kurz W.G.W. (1971) A chemostate for growing plant cells in single cell suspension cultures. Exp. Cell Res., 64, pp. 476-479.
121. Lau A.-S., Woo S.-O., Koh M.-K.(2003) Analysis of saponins in raw and steamed P.notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection. Jornal of chromatography, 1001, pp. 77-87.
122. Lie L., Sheng Y., Zhang J., Wany C., Guo D (2004) HPLC determination of four active saponins and its application to pharmacokinetic studies. Biomed chromatography, 18 (10), pp. 849-856.
123. Liu S., Zhong J.J. (1996) Effects of potassium-ion on cell-growth and production of ginseng saponin and polisaccharide in suspension cultures of Panax ginseng. J. of Biotechnology, 52 (2), pp. 121 126.
124. Liu S, Zhong J.J. (1998) Phosphate effect on production og gingeng saponin and polysaccharide by cell suspension cultures of Panax ginseng and Panax quinquefolium. Process Biochemistry, 33(1), pp.6974.
125. Lee F. C. (1992) Facts about Ginseng. The elixir of life. Korea, 104 P.
126. Lu M.B., Wong H.L., Teng W.L. (2001) Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of P.ginseng. Plant cell report, 20, pp. 674-677.
127. Mathur A., Shukla Y.N, Pal M, Ahuja P.S.,Uniyal G.C. (1994) Saponin production in callus and cell-suspension cultures of Panax quinquefolium. Phytochem., 35 (5), pp.1221-1225
128. Mathur A, Mathur A.K, Sangwan R.S, Gangwar A, Uniyal G.C. (2003) Differential morphogenetic responses, ginsenoside metabolism and RAPD patterns of three Panax species. Genetic resources and crop evolution, 50, pp. 245-252
129. Matsuda H, Samukawa К, Kubo M. (1989) Studies of P.japonicus triterpenoides. Planta Medica, 55, pp. 18-21.
130. Matsuda H, Samukawa K, Kubo M. (1991) Antihepatitic activity of ginsenoside Ro. Planta medica, 57 (6), pp.523-526.
131. Matsuda H., Li Y, Mirakami T, Yamahara J, Yoshikawa M. (1999) Structure-related inhibitory activity of oleanolic acid glycosides on gastric emptying in mice. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 7, pp. 323-327.
132. Morita T, Tanaka 0,Kohda H. (1985) Saponin composition of rhizomes of Panax japonicus collected in South Kyushu, Japan, and its significance in oriental traditional medicine. Chem.Pharm. Bull., 33 (9), pp. 3852 3858.
133. Morita T, Zhou J, Tanaka 0. (1986) Saponins of Panax pseudoginseng Wall Subsp. pseudoginseng Hara collected in Nielani, Tibet,China. Chem.Pharm.Bull, 34(11), pp.4833 4835.
134. Nishiyama N, Cho S.I., Kitagawa I, Saito H. (1994) Malonylginsenoside Rb 41 0 potentiates nerve growth factor (NGF) -induced neurite outgrowth of cultured chick embryonic dorsal root ganglia. Biol. Pharm. Bull., 17 (4), pp.509-513.
135. Nagai M,Tanaka O, Shibata S. (1971) Chemical studies on the oriental plant drugs XXVI.Saponins and sapogenins of Ginseng. The absolute configuration of cinenic acid and panaxadiol. Chem. Pharm. Bull., 19(11), pp. 2349-2353.
136. Nalawade S.M, Sagare A.P, Lee C.-Y, Kao C.-L, Tsay M.-S. (2003) Studies on tissue culture of Chinese medicinal plant resources in Taiwan and their sustainable utilization. Bot. Bull. AcadSin, 44, pp.79-98.
137. Ohtani K, Kasai R., Hatono S, Tanaka 0, Mizutani K. (1989) Reticuloendothelial system activating polysaccharides from rhizomes of Panax japonicus. 1. Tochibanan-A and Tochibanan-B. Chem. Pharm.1. Bull, 10, pp. 2587-2591.
138. Pichersky E., Gang D.R. (2000) Genetics and biochemistry of secondary metabolism in plants: an evolutionary perspective. Trend plant scince, 5(10), pp. 439-445
139. Proctor J.T.A. (1996) Ginseng: old crop, new directions. In: Journal Janick, Progress in new crops, pp.565-577.
140. Rao R., Ravishankar S., Ravishankar G.A. (2002). Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol. Adv., 20, pp. 101-153.
141. Saito A., Lee Y., Takagi K., Shibata S., Shoji J., Kondo N. (1977) Pharmacological syudies of Panacis japonici rhizoma. Chem. Pharm. Bull., 25 (5), pp. 1017- 1020.
142. Sajc, L., Grubisic D., Vunjak-Novakovic G. (2000). Bioreactors for plant engineering: an outlook for further research. Biochem. Engeneering Journal. 4, pp. 89-99.
143. Sanada S., Kondo N., Shoji J., Tanaka O., Shibata S. (1974) Structures of ginsenoside -Ro, -Rb 41 0, -Rb 42 0, -Rc and -Rd. Chem. Pharm. Bull, 22 (2), pp. 421-428.
144. Shukla Y.N., Thakur R.S. (1990) A triterpenoid saponin from Panax pseudo-ginseng subsp. himalaicus var. angustifolius. Phytochemistry, 29(1), pp. 239-241.
145. Shibata S.,Tanaka O.,Shoji J., Saito H. (1985) Economic and medical plant research. Academic press Inc., London, 1, pp. 217 284.
146. Shibata S. (2001) Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds. Journal of Korean medical science, 16, pp. 28-37.
147. Sivakumar G., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2005) Optimization of organic nutriens for ginseng hairy roots production in large scale bioreactors. Current science, 89 (4), pp. 641 - 649.
148. Shao C.-J., Xu J.D.,Kasai R.,Tanaka 0. (1989) Saponin from flowerbuds of Panax ginseng cultivated at Jilin, China. Chem. Pharm. Bull., 37 (7), pp. 1934 1935.
149. Scragg AH. (1992) Bioreactors for mass cultivation of plant cells. In: Fowler MW, Warren GS (eds). Plant Biotechnol. Oxford: Peragmon Press, pp. 251-268
150. Smart N.J., Fowler M.W. (1984) An airlift column bioreactor suitable for large-scale cultivation of plant cell suspensions. J. Exp. Bot., 35 (153), pp. 531 537.
151. Smolemskaja I., Reshetnjak 0., Nosov A., Zarinians S., Chayko A., Smirnova Y. (2007) Ginsenoside production, growth and cytogenetic characteristics of sustained Panax japonicus var. Repens cell suspension culture. Biologiaplantarum, 51(2), pp.235-241.
152. Soldati F., Sticher O. (1980) HPLC separation and quantitative determination of ginsenosides from Panax ginseng, Panax quinquefolius and from ginseng drug preparation. 1-nd commun. Plantamedica, 38 (3), pp.348-357.
153. Su W.W. (1995) Bioprocessing technology for plant suspension cultures. Apply biochemical biotechnology, 50, pp. 189-230
154. Su W.W. (2000) Perfusion bioreactors. In: Encuclopedia of cell technology, 1, pp. 230-242.
155. Su W.W., Arias R. (2003) Continuous plant cell perfusion culture: bioreactor characterization and secreted enzyme production. Journal of bioscience and bioengineering, 95 (1), pp. 13-20.
156. Suzuki Y.,Ito Y., Konno C.,Furuya T.(1991) Effects of tissue culturedginseng on the function of the stomach and small-intestine. Yakugaku Zasshi, 111(12), pp. 765-769.
157. Tal В., Rokem J.S., Goldberg I. (1983) Factors affecting growth and product formation in plant cells grown in continuous culture. Plant Cell Rep., 2 (4), pp. 219-222.
158. TanakaH. (1987) Large-scale cultivation of plant cells at high density: A review. Process Biochem., 22 (1), pp. 106 113.
159. Tanaka 0.,Nagai M., Shibata S. (1966) Chemical studies on the oriental plant drugs. The steriochemistry of protopanaxadiol, a genuine sapogenin of ginseng. Chem. Pharm. Bull.,\A (10), pp. 1150-1156.
160. Tanaka 0., Nagai M.,Ohsawa Т.,Tanaka N., Shibata S. (1967) Stereochemistry of protopanaxadiol: acid catalysed epimerization of C-20 -hydroxyl of betulafolientriol, protopanaxadiol and their derivatives. Tetrahedron Lett., 5, pp.391-396.
161. Tanaka O., Yahara S. (1978) Damarane saponins of leaves of Panax pseudoginseng subsp. himalaicus. Phytochemistry, 17 (8), pp.l353 -1358.
162. Tanaka O. (1990) Recent studies on glycosides from plant drugs of Himalaya and Southwestern China chemogeographical correlation of Panax species. Pure and applied chemistry, 62 (7), pp. 1281-1284.
163. Tanaka O., Han E.C. (2000) Saponins of plants of Panax species collected in Central Nepal, and their chemataxonomical significance. Chemical and Pharmaceutical Bull. Tokyo, 48(6), pp. 889-892.
164. Thanh N.T., Murthy H.N., Yu K-.W., Yong C.-S., Hahn E.-J., Раек K.-Y.(2004) Effect of inoculum production by large scale cell suspension cultures of Panax ginseng. Journal Plant Biotechnology, 6(4), pp. 265268.
165. Thanh N.T., Murthy H.N., Yu K-.W., Jeong S, Hahn E.-J., Раек K.-Y.(2006) Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng. Plant physiology, 163 (12), pp. 1337-1341.
166. Tripathi L., Tripathi J.N.(2003) Role of biotechnology in medicinal plants. Tropical journal ofpharmaceutical research, 2(2), pp. 243-253.
167. Vanisree M., Lee C.-Y., Lo S.-F., Nalawade S.M., Lin C.Y., Tsay H.-S. (2004) Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures. Bot. Bull. Acad.Sin., 45, pp. 1-22.
168. Veliky J.A., Martin M. (1970) A fermentor for plant cell suspension culture. Can. J. Bot., 16, pp. 223 226.
169. Wang Z., Zhong-jan J., Zhu Zi-ging, Yang Chong-ren, Zhou J., Kasai R., TanakaO., (1985) The triterpenoid saponins of rhizomes of Panax japonicus C.A.Mey var.anqustifolius (Burk) Cheng et chu. Acta
170. Botanica sinica, 27 (6), pp.618-624.
171. Wang W, Zhang Z.-Y, Zhong J.- J. (2004) Enhancement of ginsenoside biosynthesis in high-density cultivation of Panax notoginseng cells by various strategies of methyl jasmonate elicitation. Appl. Microbiol. Biotechnol.
172. Wang Z, Zhong-jan J, Zhu Zi-ging, Yang Chong-ren, Zhou J, Kasai R, Tanaka O. (1985) The triterpenoid saponins of rhizomes of Panax japonicus C.A.Mey var.anqustifolius (Burk) Cheng et chu. Acta Botanica sinica, 27 (6), pp.618-624.
173. Wang D.Q, Feng B.S, Wang X.B,Yang C.R.,Zhou J. (1989) Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus vox.major collected in Quinling Mountains China. Yao xue-Xue-Bao, 24(8), pp.633-636.
174. Wang W, Zhong J.J. (2002) Manipulation of ginsenoside heterogeneity in cell cultures of P. notoginseng by addition of jasmonates. Journal Bioscience bioeng., 93, pp. 48-53.
175. Wang J.-Y, Li X.-G, Zheng Y.-N, Yang X.W. (2004) Isoginsenoside-Rh3, a new triterpenoid saponin from the fruits of Panax ginseng C. A. Mey. J Asian Nat Prod Research, 6, pp.289-93.
176. Washida D, Shimomura K, Nakajima Y., Takido M,Kitanaka S. (1998) Ginsenosides in hairy roots of Panax hybrid. Pytochemistry, 49 (8), pp. 23312-2335.
177. Wilson G. (1976) A simple and inexpensive design of chemostate enabling steady-state growth of Acer pseudoplatanus L. cells under phosphate-limiting conditions. Ann. Boanic., 40, pp.27-31.
178. Wilson S.B, King P.J., Street H.E. (1971) Studies on the growth in culture of plant cells. XII. A versatile system for the large-scale batch or continuous culture of plant cell suspensions. Journal Exp. Botanic, 22 (70), pp. 177-207.
179. Woragidbum-rung K., Sae-Tang P, Yao H, Han J., Chovatcharin S, Zhong J.J. (2001) Impact of conditioned medium on cell cultures of Panax notoginseng in air-lift bioreactor. Process. Biochemistry, 33, pp. 209-213.
180. Wu J, Zhong J-J. (1999) Production of ginseng and its bioactive components in plant cell culture: Current technological and applied aspects. Journal of Biotechnology, 68, pp.89-99.
181. WuJ.Y, Wong К, Но K.P., Zhou L.G. (2005) Enhancement of saponin production in Panax ginseng cell culture by osmotic stress and nutrient feeding. Enzyme and microbial technology, 36 (1), pp. 133-138.
182. Yadov J.S, Maiti A. (2002) Asymmetric total syntheses of panaxytriol and panaxydol, potent antitumor agents from Panax ginseng. Tetrahedron, 55, pp. 4955-4961.
183. Yahara S, Kasai R, Tanaka O. (1977) New dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A.Meyer (1), chikusetsusaponins145 0,-L 49a 0 and -L 410 0. Chem. Pharm. Bull, 25 (8), pp. 20412047.
184. Yahara S, Tanaka O, Nishioka I. (1978) Dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A. Meyer. 111. Saponins of the specimens collected in Tottori-ken, Kyoto-shi and Niigata-ken. Chem. Pharm. Bull., 26 (10), pp. 3010-3021.
185. Yip T.T, Lau C.N.B, But P.P.H, Koug Y.C. (1985) Quantitative analysis of ginsenosides in fresh Panax ginseng. American J. of Chinese Med., XI11, 1-4, pp. 77 88.
186. Yu K.W., Murthy H.N, Hahn E.-J, Paek K.-Y. (2005) Ginsenosidesproduction by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality. Biochemical Engineering Journal 23, pp.53-56.
187. Yu K.W., Gao W.Y., Son S.H., Раек K.Y. (2000). Improvement of ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitors in hairy root culture of ginseng {Panax ginseng C.A. Mayer). In vitro Cell. Dev. Biol. 36 pp. 424-428.
188. Yun T.-K. (2003) Brif of introductuon of Panax ginseng C.A.Meyer. Journal Korean Medical Science, 16 pp.3-5.
189. Zhang J.T.,Yang Y.,Qu Z.W.,Jiang X.Y.,Liu M. (1993) Studies on nootropic mechanism of ginsenoside Rbj and Rgj. Proceedings of the 6th international ginseng symposium, Korea ginseng &tobacco research institute, pp. 69-74.
190. Zhang Y.H., Zhong J.J.,Yu J.Y. (1996) Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng Manipulation of medium sucrose. J. of Biotechnology, 51 (1), pp. 49-56.
191. Zhang Y.H., Zhong J.J. (1997) Hyper-production of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation of Panax notoginseng in an air-lift bioreactor. Enzyme and microbial, technology, 21, pp. 59-63.
192. Zhang H., Lu Z., Tan G.T., Qiu S., Farnsworth N.R., Pezzuto J.M., Fong H.H. (2002) Polyacetyleneginsenoside-Ro, a novel triterpene saponin from Panax ginseng. Tetrahedron letters, 43, pp. 973-377.
193. Zhong J.J., Bai Y., Wang S.J. (1996) Effects of plant growth regulators on cell-growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology, 45 (3), pp. 227-234.
194. Zhong J.J., Zhu Q.X. (1995) Effect of initial phosphate concentration on cell growth and ginsenoside saponin production by Suspended cultures of Panax notoginseng. Applied biochemistry and biotechnology, 55 (3),pp. 241-247.
195. Zhou, J., Huang W.-G., Wu M.-Z., Yang C.-R., Feng K.-M., Wu Z.-Y. (1975) Triterpenoids from Panax Linn, and their relationship with taxonomy and geographical distribution. Acta Phytotaxonomica Sinica, 13(2), pp.29-45, plates 6-7.
196. Zhou, L. G., Zheng G. Z., Wang S.L. (1991). Comparative studies on large scale cell culture of Panax notoginseng, Panax ginseng and Panax quinquefolium. Chinese Journal of Botany, 3(2), pp.161-165.
197. Zhu S., Zou K., Fushimi H., Cai S., Komatsu K. (2004) Comparative study on triterpene saponins of ginseng drugs. Planta medica, 70, pp. 666-677.
198. Zenk М.Щ1978) The impact of plant cell culture on industry. In: Frontiers of plant tissue culture 1978. Ed. Thorpe T. A., University of Calgary, Calgary, pp. 1 -13.
199. Zin T.D., Kondo N., Shoji J. (1976) Studies of P.japonicus rhizoma. The structures of chikusetsusaponins 1, la, lb, lVa and glycoside PI. Chem. Pharm. Bull., 24 (2), pp.253-261.
200. Zou K., Zhu S., Tohda C., Cai S., Komatsu K. (2002) Dammarane-type saponins from P.japonicus. J. Nat. production, 65, pp. 346-351.
201. Zou K., Zhu S., Meselhy M. R., Tohda C., Cai S., Komatsu K. (2002) Dammarane-type saponins P. japonicus and their new rite outgrowth activity in SK-N-SH cells J. Nat. production, 65, pp. 1288-1292.
-
Демидова, Елена Викторовна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.12
- Качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов культур клеток in vitro представителей семейства Araliaceae
- Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax
- Сравнительный анализ содержания вторичных метаболитов и ростовых характеристик культур клеток Polyscias fruticosa и Polyscias filicifolia
- Физиологические характеристики суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia, Panax japonicus и Dioscorea deltoidea при масштабировании процесса выращивания
- Изучение мембранотропной активности некоторых тритерпеновых гликозидов
