Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов культур клеток in vitro представителей семейства Araliaceae

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов культур клеток in vitro представителей семейства Araliaceae"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

005014379

Кочкин Дмитрий Владимирович

КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК IN VITRO ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ARALIACEAE (НА ПРИМЕРЕ PANAX SP?. И POLYSCIAS SPP.)

03.01.05 — физиология и биохимия растений

1

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2012

005014379

Работа выполнена на кафедре физиологии растений Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор

Носов Александр Михайлович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, с.н.с.

ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Соловченко Алексей Евгеньевич

кандидат биологических наук, с.н.с. ГОУ ВПО СПХФА Росздрава

Слепян Лариса Ивановна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ОАО «Биохиммаш» институт прикладной биохимии и машиностроения

Защита состоится > О 2012 года в 15 час. 30 мин. на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1, тел./факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат диссертации размещен на сайте www.bio.msu.ru.

Отзывы (в двух экземплярах) просим направлять по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Кафедра физиологии растений, ученому секретарю Диссертационного совета Д 501.001.46. Факс (495) 939-39-70.

Автореферат разослан "_" февраля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук М А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Своеобразие вторичного метаболизма растений семейства Аралиевых заключается в образовании значительных количеств тритерпеновых гликозидов различной структуры (Еляков, Оводов, 1972; Журавлев, Коляда, 1996). В настоящее время эти соединения обнаружены у представителей 24 родов Araliaceae (Гришковец, 2004), что составляет около трети от общего числа родов в семействе. В качестве агликонов гликозидов аралиевых выступают тритерпеноиды более десяти различных структурных типов (Vincken et al., 2007; Dinda et al., 2010), однако наибольший интерес представляют две основные группы соединений — производные пентадиклического тритерпеноида /?-амирина и тетрациклического тритерпеноида И-даммарендиола. Важно, что гликозиды с агликонами этих типов неравномерно распределены среди растений семейства (Christensen, 2008): производные /¡-амирина обнаружены у всех исследованных аралиевых, тогда как гликозиды с агликонами даммаранового ряда встречаются, за редкими исключениями, только в различных видах женьшеня (род Panax L.).

Систематическое исследование химического состава представителей Araliaceae было начато более полувека назад. За прошедшее время показано, что в каждом изученном объекте тритерпеновые гликозиды представлены в виде сложных смесей, структурное многообразие компонентов которых поражает воображение исследователей. Ярким примером этого являются результаты изучения рода Panax spp., из различных видов которого в настоящее время выделено более 300 индивидуальных гликозидов (Qi et al., 2011).

Работы по получению и исследованию культур клеток растений Araliaceae стартовали одновременно с первыми успехами выяснения полной структуры тритерпеновых гликозидов аралиевых. Первые каллусные и суспензионные культуры клеток ряда видов Panax spp. и Polyscias spp. были получены в середине прошлого столетия (Бутенко, 1964; Слепян и др., 1975). К настоящему времени получены десятки культур клеток видов семейства. В то же время, исследования тритерпеновых гликозидов в полученных культурах, как правило, носят схематичный характер и сводятся к качественному и количественному анализу только тех компонентов, для которых доступны коммерческие стандартные образцы. Например, для культур клеток и тканей различных видов женьшеня обычно определяют содержание семи

нейтральных гинзенозидов (Rgb Re, Rf, Rbb Re, Rb2, Rd) — основных тритерпеновых гликозидов корня настоящего женьшеня (Wu, Zhong, 1999). Очевидно, что результаты подобных исследований не дают представления о возможности образования в клетках in vitro сложного паттерна тритерпеновых гликозидов, характерного для растений семейства Araliaceae in vivo. Таким образом, можно заключить, что детальное изучение путей формирования и особенностей многообразия тритерпеновых гликозидов в культурах клеток и тканей аралиевых является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы: изучить особенности качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в культурах клеток представителей семейства Araliaceae (на примере Panax spp. и Polyscias spp.) и выяснить закономерности его изменения в процессе роста клеток in vitro.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести фитохимический анализ культур клеток двух видов полисциаса {Polyscias filicifolia, P. fruticosa) и двух видов женьшеня (Panax japonicus var. repens и P. ginseng);

2. Провести препаративное выделение и структурную идентификацию основных тритерпеновых гликозидов культур клеток Polyscias spp. и Panax japonicus var. repens',

3. Изучить изменение качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в процессе выращивания исследуемых культур клеток. Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика состава

тритерпеновых гликозидов культур клеток двух видов полисциаса. Впервые доказано образование в культуре клеток in vitro женьшеня японского (Panax japonicus var. repens) неполярных минорных гинзенозидов (гипенозид XVII) и малонильных производных гинзенозидов. Выдвинуто предположение о механизмах формирования и поддержания многообразия гинзенозидов в культуре клеток Рапса japonicus var. repens. Полученные результаты расширяют сложившиеся представления о биосинтетическом потенциале клеток представителей семейства Araliaceae, культивируемых in vitro.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание процессов образования тритерпеновых гликозидов в культурах

клеток ценных лекарственных растений семейства Araliaceae: Polyscias filicifolia, P. frulicosa, Panax japonicus var. repens. Результаты исследования позволяют сформулировать четкие критерии оптимизации условий выращивания данных культур клеток и могут быть основой для создания «умных биотехнологий», направленных на получение растительного сырья, близкого к природному по своим терапевтическим свойствам.

Экспериментальные результаты и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учебном процессе при чтении в ВУЗах курсов лекций по биохимии и физиологии вторичного метаболизма растений.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере» (Якутск, 2010); на XVIII Международной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); на 5-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, 2011); на XV Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2011); на 4-м Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия" (Воронеж, 2011); а также на заседаниях кафедры физиологии растений Биологического факультета МГУ и Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН. Оформлена заявка на патент РФ (№ 2011134609).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена настраницах машинописного текста. Содержит ^ таблиц и & рисунков. Список цитируемой литературы включает ¿^наименований, в том числе ?на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы состоит из J? разделов и включает информацию по биологии видов Panax spp. и Polyscias spp., структурному многообразию и физиологическим функциям тритерпеновых гликозидов в интактных растениях и культурах клеток разных видов женьшеня и полисциаса.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты

Объектами исследования служили:

1. Суспензионная культура клеток женьшеня настоящего (Panax ginseng С. А. Меу.), полученная в 1998 году из каллуса шестилетнего плантационного корня (Ginseng & Tobacco, Южная Корея). Штамм L1. Зарегистрирована во Всероссийской Коллекции Культур Клеток Высших Растений (ВКККВР) под № 68.

2. Суспензионная культура клеток женьшеня японского (Panax japonicus С. А. Меу. var. repens Maxim.), полученная в 1998 году из каллуса корня интактного двулетнего растения (Приморский край, Россия). Зарегистрирована в ВКККВР под №62.

3. Суспензионная культура клеток Polyscias filicifolia Bailey, листового происхождения, получена в 1992 году, штамм БФТ-01-95 («коллекционный штамм»). Зарегистрирована в ВКККВР под № 58.

4. Суспензионная культура клеток Polyscias filicifolia Bailey, листового происхождения, («новый штамм»), получена в 2006 году (Суханова и др., 2010).

5. Суспензионная культура клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms, листового происхождения, получена в 2006 году (Суханова и др., 2010).

2.2. Методы выращивания культур клеток

Культивирование проводили в темноте, при 26°С, на качалке (90 об/мин), в колбах объемом 250 мл. Для культивирования использовали среду Мурасиге-Скуга с 2,5-3,0% сахарозы и соответствующими добавками регуляторов роста для каждой из культур (Чайко и др., 1999; Решетняк и др., 2008; Титова и др., 2007; Суханова и др., 2010). Аппаратурное выращивание культур клеток Polyscias filicifolia и Panax japonicus проводили в биореакторе барботажного типа (1Т, ОКБ А, г. Йошкар-Ола, рабочий объем 500 л). Выращивание проводили при 26°С, расход воздуха на барботаж 0,2-0,5 VVM.

2.3. Исследование ростовых характеристик культур клеток

Анализ ростовых характеристик культур клеток проводили по общепринятым методикам (Носов, 2011). Определяли жизнеспособность клеток и содержание сырой и сухой биомассы клеток в литре среды.

2.4. Методы фнтохимического анализа тритерпеновых гликозидов

Выделение и очистку «гликозидной фракции» из 1,5-2,0 г воздушно-сухой биомассы каждой культуры клеток проводили согласно общепринятым методикам (Furuya et al., 1973; Hostettmann, Marston, 1995). Для идентификации агликонов очищенные «гликозидные фракции» подвергали кислотному гидролизу в смеси Килиани (Wiktorowska et al., 2010) при 80°С, в течение 18 ч. Агликоны экстрагировали этилацетатом.

Предварительный анализ «гликозидных фракций» и агликонов проводили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), на пластинках Kieselgel 60 (Merck, Германия). Для разделения гликозидов использовали систему этилацетат — ледяная уксусная кислота — вода (50:25:25, по объему). Разделение агликонов проводили в системах (по объему): I) бензол — ацетон (3:1); II) бензол — этилацетат (1:1). В качестве стандарта использовали олеаноловую кислоту (Sigma, США). Обнаружение гликозидов проводили с помощью 1% раствора анисового альдегида в смеси этанол — концентрированная серная кислота (10:1), а агликонов — 20% раствора серной кислоты в этаноле (Oleszek, Bialy, 2006).

Анализ гликозидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили на приборе Perkin Elmer Series 200 (США), снабженным бинарным градиентным насосом, автоматическим инжектором и спектрофотометрическим детектором.

Для ВЭЖХ использовали спиртовые экстракты из 20-100 мг воздушно-сухой биомассы каждой культуры клеток. Разделение гликозидов проводили на колонках Pecosphere 3CR С18 (83x4,6 мм, 3 мкм, PerkinElmer, США) и Hypersil BDS С18 (250x4,6 мм, 5 мкм, Thermo Hypersil-Keystone Inc., США) при 25°С, скорости потока элюента 1,5 мл/мин и детектировании на длине волны 207 нм. Элюирование осуществляли смесью ацетонитрил — 4 мМ водный раствор КН2Р04 в различных градиентных режимах.

Доказательство наличия в культуре клеток P. japonicus var. repens эфиров гинзенозидов проводили путем обработки спиртового экстракта биомассы с известным ВЭЖХ профилем 5 мМ раствором щелочи в метаноле (10 мин, температура 25°С).

2.5. Выделение и установление структуры тритерпеновых гл и коз идо в

Выделение индивидуальных тритерпеновых гликозидов осуществляли с помощью колоночной хроматографии низкого давления и препаративной ВЭЖХ (Hostettmann, Marston, 1995; Ruan et al., 2010).

Масс-спектры высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (Belyakov et al., 2010) получены на приборе Bruker micrOTOF II (Bruker Daltonics, Германия). Спектры 'H- и 13С-ЯМР растворов выделенных соединений в смеси пиридин^5/020 регистрировали на приборе Bruker Avance AV600 (Германия), внутренний стандарт тетраметилсилан, температура 303 К. Сигналы в спектрах *Н- и 13С-ЯМР были отнесены (Кондакова и др., 2004) с помощью двумерных экспериментов ЯМР ('Н-'Н COSY, TOCSY, ROESY, 'Н-,3С edHSQC и НМВС).

2.6. Количественный анализ тритерпеновых гликозидов

Содержание индивидуальных тритерпеновых гликозидов в биомассе культур клеток Polyscias fruticosa и Panax japonicus var. repens определяли с помощью ВЭЖХ методом внешней калибровки.

Экстракцию 20-30 мг воздушно-сухой биомассы культур клеток и подготовку проб для ВЭЖХ проводили согласно описанным методикам (Ma et al., 2005; Lee et al., 2011). Разделение гликозидов осуществляли в соответствии с описанными выше условиями. В качестве стандартных образцов использовали гинзенозиды Rgb Rbb Re, Rb2, Rd (Sigma, США), Ro (ТИБОХ ДВО РАН, Россия), а также индивидуальные гликозиды, полученные в ходе проведения исследования. Содержание суммы гинзенозидов Rgi+Re определяли в расчете на Rg,.

2.7. Обработка данных и представление результатов

На графиках и диаграммах представлены средние арифметические значения и стандартные отклонения из трех аналитических повторностей для каждого срока или субкультивирования.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Тритерпеновые гликозиды культур клеток Polyscias spp.

Предварительный фитохимический анализ показал отсутствие в биомассе «коллекционного» штамма культуры клеток Polyscias filicifolia заметных количеств тритерпеновых гликозидов. На ТСХ экстрактов из биомассы «нового» штамма

Р. АИЫ/оИа были обнаружены четыре, а из биомассы Р. {гийсоза — два пятна, имевших типичную для тритерпеноидов синюю окраску. Полный кислотный гидролиз очищенных «гликозидных фракций» из биомассы Р. АИЫ/оИа («новый штамм») и Р. /гиНсоза приводил к образованию в качестве основного продукта соединения, идентичного (по данным ТСХ) стандарту олеаноловой кислоты (рис. 1).

Рис. 1. ТСХ продуктов полного кислотного

гидролиза «гликозидной фракции» из биомассы культур клеток Polyscias filicifolia, «новый штамм» (А) и P. fruticosa (Б). Система растворителей II.

Обозначения:

1 — стандарт /?-ситостерина;

2 — стандарт олеаноловой кислоты;

3, 4 — P. filicifolia, 5 и 10 мкл, соответственно;

5 — гидролизат «Сапарала®» — суммы тритерпеновых гликозидов из корней Aralia elata (Miq.) Seem;

6 — P. fruticosa, 5 мкл.

Совместная ТСХ экстрактов из культур клеток двух видов полисциаса и полученных из Вьетнама листьев интактного растения Р. filicifolia показала, что хроматографические характеристики основных тритерпеновых гликозидов клеточных культур и листьев совпадали. Поэтому для выяснения полной структуры обнаруженных соединений было осуществлено препаративное выделение сапонинов из листьев Р. filicifolia. В индивидуальном виде были получены четыре основных гликозида, которые были обозначены в порядке уменьшения их полярности как Pol 1 (0,8%), Pol 3 (2,5%), Pol 5 (0,2%) и Pol 7 (0,2%). В скобках указан выход соответствующего гликозида от веса воздушно-сухого сырья.

Масс-спектр высокого разрешения отрицательных ионов Pol 1 показал наличие основного иона [М—Н]~ с m/z 1117,5410, который соответствовал соединению С54Н86024 (расчетное значение m/z 1117,5436).

Спектр 'Н-ЯМР Pol 1 содержал сигналы четырех аномерных протонов Н1 моносахаридов при 4,95 (1Н, дублет, У] 2 6,8 Гц, 3-GlcA Н-1), 5,18 (1Н, дублет, Ji>27,8 Гц, 4-Glc Н-1), 5,42 (1Н, дублет, Ju 7,8 Гц, 2-Glc Н-1) и 6,33 (Ш, дублет, J,a 7,8 Гц, 28-Glc Н-1) м. д., семи третичных метальных групп агликона (все синглеты) при 0,81 (Н25), 0,89 (НЗО), 0,91 (Н29), 1,05 (Н24), 1,08 (Н26), 1,22 (Н23) и 1,26 (Н27) м. д. и одного третичного олефинового протона агликона при 5,41 (Н12) м. д. Спектр 13С-ЯМР Pol 1 показал наличие сигналов шести насыщенных четвертичных атомов углерода агликона (данные 'Н-|3С НМВС) при 30,96 (С30), 39,47 (С4), 39,73 (С8), 36,91 (СЮ), 41,99 (С14) и 47,97 (С17) м. д., двух олефиновых атомов углерода при 122,88 (С12), 144,14 (С13) м. д., и двух карбоксильных групп — замещенной у агликона (176,44 м. д., С28) и незамещенной у глюкуроновой кислоты (172,01 м. д., С6, З-GlcA). Кроме того, с помощью двумерных экспериментов ЯМР ('Н-'3С edHSQC) было показано наличие в спектре 13С-ЯМР Pol 1 сигналов трех незамещенных первичных гидроксильных групп гексоз при 62,22 (С6, 28-Glc), 62,42 (С6, 4-GIc) и 62,78 (С6, 2-Glc).

Полученные результаты свидетельствуют, что Pol 1 является бисдесмозидом олеаноловой кислоты, содержащим три остатка yS-D-глюкопиранозы и один остаток ß-D-глюкуронопиранозы. При этом ^-конфигурация аномерных центров моносахаридов была установлена в соответствии с высокими значениями константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) J|,2 (6,8-7,8 Гц) и наличием при ROESY эксперименте типичных для ^-Сахаров корреляционных пиков Н1/НЗ,Н5. Места присоединения углеводных фрагментов к агликону, а также последовательность соединения моносахаридов друг с другом, определены с помощью экспериментов ROESY и НМВС (рис. 2).

Таким образом, на основании полученных результатов сделан вывод, что Pol 1 имеет строение 28-0-/?-о-глгакопиранозилового эфира 3-0-/?-о-глюкопиранозил-(1—►4)-0-[^-о-глюкопиранозил-(1—>2)]-0-^-0-глюкуронопиранозида олеаноловой кислоты и является идентичным полисциазиду Е, найденному ранее в корнях

Polyscias fruticosa (Huan et al., 1998), листьях P. Scutellaria (Paphassarang et al., 1990) и P. guilfoylei (Thi et al., 2009).

і t'H-'H ROHS^

—- :K 'H соту

J^ I

Pol 1 - полисциазидЄ

a«

¿b-7

r f

1 і . I

* \

H

tV-.-" J ч „о

I

V u

-л r\ i3

A

J^f.....

Poi 3

Ky-SM

«од

ir>

«0

I ■"% ^-i

$ -"y^ У 4

oS~

--уЛГ" «' V

ar—ö-^ /-он

Pol 5 = полисциазид А 0

«О

- \ і." ' - ^ ' 1 /

«О—^ _/ I /---^¿^ „

*"" *>

Ой

/>? ^ Л-

4/Ц

"ЧЬ.

иО-Д —<" „.

Рої 7 = ладигинозид А

„оі^—о

j "І

1Г>—г7, і

X

Рис. 2. Химическая структура и ключевые 'Н-'Н COSY, 'Н-13С НМВС и 'Н-'Н ROESY корреляции компонента Pol 1 (А) и химическая структура компонентов Pol З, Pol 5 и Pol 7 (Б).

Проведенный по аналогичной схеме анализ масс-спектров и данных спектров ЯМР соединений Pol 3, Pol 5 и Pol 7 показал, что они идентичны известным гликозидам 28-0-/?-0-глюкопиранозиловому эфиру 3-0-/?-0-глюкопиранозил-(1—>4)-O/i-D-глюкуронопиранозида олеаноловой кислоты, полисциазиду А и ладигинозиду А, соответственно (рис. 2).

С помощью ВЭЖХ было установлено, что основные тритерпеновые гликозиды, обнаруженные в биомассе культур клеток Р. filicifolia («новый штамм») и Р. fruticosa, идентичны гликозидам, выделенным из листьев Р. filicifolia (рис. 3).

з ; <

Е | !

- Ч ! пз ! ; OL I О : ■

ним

1

. !

X

X

U

P. fruticosa

Я Р. filicifolia

Pol I

---t ч/чу

Pol 3

, J ;

7 У

Pol 5 Pol 7 \ \

, , . n ■ 16 ■ „ Время удерживания, мин

20

24

Рис. 3. Профили ВЭЖХ экстрактов биомассы Polyscias filicifolia, «новый штамм» и Р fruticosa.

Обозначения: Pol 1, 3, 5, 7 — пики соединений, времена удерживания которых совпали с таковыми у образцов гликозидов. выделенных из листьев P. filicifolia.

Мажорными компонентами в культуре клеток Р. filicifolia («новый штамм») были гликозиды полисциазид Е и Pol 3, а в культуре клеток Р. fruticosa — Pol 3 и ладигинозид А. В культуре клеток Р. filicifolia («новый штамм») содержание тритерпеновых гликозидов было выше, чем в культуре клеток Р. fruticosa.

Стоит отметить, что выделенные гликозиды ранее уже были найдены в корнях и/или листьях различных видов полисциаса, однако в культуре клеток in vitro эти соединения описаны впервые.

3.2. Изменение содержания тритерпеновых гликозидов в цикле выращивания культуры клеток Р./гиИсо5а

Изменение содержания индивидуальных тритерпеновых гликозидов в цикле выращивания культур клеток полисциаса в колбах изучали на примере Р. /гиНсаа (рис. 4). Установлено, что содержание суммы гликозидов увеличивалось в течение цикла выращивания и максимальное значение этого показателя (0,5% от веса сухой биомассы) отмечалось в конце экспоненциальной фазы роста культуры (14 сутки).

10 15

Сутки рос т

20

0 2 4 7 10 12 14 16 19 Сутки рост

-Сыраябиомасса, г/л Жизнеспособность. %

I. -Сухаябиоыаоса'М.п'л

! - Pol I, 2 - Pol 3, 3 - Pol 5, 4 - Pol 7

Рис. 4. Изменение ростовых характеристик (А) и содержания тритерпеновых гликозидов (Б) в цикле выращивания культуры клеток Ро1у8с1а$ /гийсояа в колбах (154 цикл).

На протяжении цикла выращивания в биомассе культуры клеток Р. fruticosa были представлены все обнаруженные гликозиды — полисциазид А (Pol 5), Pol 3, полисциазид Е (Pol 1) и ладигинозид А (Pol 7). При этом мажорными компонентами были полисциазид Е и ладигинозид А — на их долю в разные периоды выращивания приходилось 10-40% и 40-70% от содержания суммы гликозидов, соответственно.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что

исследованные виды полисциаса сохраняют способность к образованию

определенного набора гликозидов олеаноловой кислоты в культурах клеток. Факт

отсутствия тритерпеновых гликозидов в биомассе «коллекционного» штамма

Р. filicifolia, который к моменту исследования поддерживался в растущем состоянии

11

около 20 лет, позволяет, опираясь на данные литературы (Verpoorte et al., 2002), высказать предположение о том, что длительное выращивание культуры клеток может приводить к существенному снижению содержания олеанановых гликозидов. Однако для доказательства этого утверждения требуются дополнительные исследования.

3.3. Тритерпеновые гликозиды культур клеток женьшеня Рапах spp.

ТСХ анализ «гликозидных фракций» из биомассы культур клеток Рапса ginseng и Р. japonicus var. repens показал наличие нескольких пятен, имевших характерную для тритерпеноидов синюю окраску (рис. 5).

Рис. 5. ТСХ «гликозидных фракций» из биомассы культур клеток Рапах ginseng и Р. japonicus var. repens, выращенных в колбах.

Обозначения:

1-3 — Р. ginseng;

4, 7, 8 — Р. japonicus var.

repens;

5 — смесь гинзенозидов;

6 — «гликозидная фракция» из листьев Р. ginseng (из Подмосковья);

Ro — стандарт гинзенозида

Ro.

Путем сравнения со стандартными образцами надежно удалось идентифицировать только гликозид олеаноловой кислоты — гинзенозид R0. Значительное накопление этого гликозида отмечалось исключительно в суспензионной культуре клеток Р. japonicus var. repens. Культура клеток Р ginseng характеризовалась более бедным, по сравнению с культурой клеток Р. japonicus var. repens, качественным и относительным количественным составом тритерпеновых

гликозидов. Поэтому последующую работу проводили с использованием культуры клеток Р. ¡аротст уаг. герет.

С помощью ВЭЖХ (подвижная фаза с нейтральным рН) было показано присутствие в спиртовом экстракте биомассы культуры клеток Р. ]ароп1си5 уаг. герет восьми основных нейтральных гинзенозидов (Яе, И/, ЯЬЬ Яс, ЯЬ2, ЯЬ3 и ЯД), коммерческие стандартные образцы которых доступны.

Среди компонентов хроматографического паттерна также были обнаружены четыре сильно уширенных и плохо разрешенных пика, максимумы которых зафиксированы на 28,4, 34,9, 35.7 и 40,0 минутах анализа. Элюирование подвижной фазой, составленной из ацетонитрила и 4 мМ водного раствора КН2Р04 (рН 4,8), позволило придать данным пикам симметричную форму и добиться их удовлетворительного разрешения (рис. 6, 1).

< Е

R0 \|

2

Rbl п

Rd

Rf Vk

Rc^b2

Л

Rb3

I

i!

W\/ 1 i ix »

J ______'-..J \>J _______/\ЛЛЛл«._

!

/

' *

ил______a/A.

бремя удерживания, мин

Рис. 6. Изменение профиля ВЭЖХ спиртового экстракта из биомассы Panax japonicus var. repens при мягком щелочном гидролизе.

Обозначения: 1 — обзорная ВЭЖХ спиртового экстракта; 2 — обзорная ВЭЖХ спиртового экстракта, обработанного КОН. R0, Rf, Rbl, Rc, Rb2, Rb3, Rd — пики гинзенозидов, времена удерживания которых совпали с таковыми у стандартных образцов.

Полученные результаты позволяют заключить, что описанные пики

соответствуют соединениям, сродство которых к стационарной обращенной фазе

существенно зависит от кислотности подвижной фазы. Анализ литературы

13

свидетельствует,, что среди всего многообразия гликозидов женьшеня только две группы соединений — так называемые «кислые» гинзенозиды («acidic» ginsenosides) — характеризуются подобным хроматографическим поведением (Fuzzati, 2004). В соответствии с расположением карбоксильной группы в той или иной части молекулы, среди кислых гинзенозидов выделяют: 1) гликозиды олеаноловой кислоты со свободной карбоксильной группой агликона и/или глюкуроновой кислоты; 2) сложноэфирные конъюгаты нейтральных гинзенозидов с двухосновной малоновой кислотой.

Сопоставление хроматографической подвижности самого полярного из описанных соединений (время удерживания в колонке — 9,3 минут, рис. 6, 1) и стандарта гинзенозида Ro, имеющего свободную карбоксильную группу в остатке глюкуроновой кислоты, позволило заключить, что данные гликозиды идентичны.

Хроматографические характеристики соединений, которые элюировались с колонки в пределах 10,7-16,2 минут (рис. 6, 1), позволяют, опираясь на данные литературы (Li et al., 2010), высказать предположение о том, что они являются малонильными эфирами гинзенозидов Rbb Rc, Rb2 и Rd. Косвенным подтверждением этого предположения является тот факт, что после обработки спиртового экстракта биомассы P. japonicus var. repens раствором щелочи происходило исчезновение из профиля ВЭЖХ описанных соединений, одновременно с этим наблюдалось увеличение площадей пиков гинзенозидов Rbi, Rc, Rb2 и Rd (рис. 6, 2).

Кроме описанных выше пиков, на ВЭЖХ хроматограмме спиртового экстракта биомассы культуры клеток P. japonicus var. repens обнаруживались пики гидрофобных соединений, времена удерживания которых лежали в пределах 25-27 мин (рис. 6). При этом особый интерес представляло самое неполярное соединение (отмечено звездочкой на рис. 6, 1).

Для установления точной структуры описанных соединений из биомассы культуры клеток P. japonicus var. repens, выращенной в биореакторе, были получены в индивидуальном виде три основных гинзенозида (1, 2 и 3) с выходами 0,2%, 0,6% и 0,2% от веса сухой биомассы клеток, соответственно (гликозиды обозначены в порядке уменьшения их полярности).

Сопоставление спектров *Н- и ПС-ЯМР и данных масс-спектра соединения 2 с лит. данными (Cho et al., 2010) показало, что оно идентично гинзенозиду Rb|.

Спектр 'Н-ЯМР соединения 1 содержал сигналы четырех аномерных протонов HI моносахаридов при 4,88, 5,05, 5,10 и 5,28 м. д. (все дублеты, J\ >2 7,2 Гц) и восьми третичных метальных групп агликона (все синглеты) при 0,81 (Н19), 0,95 (Н18), 0,97 (Н30), 0,98 (Н29), 1,29 (Н28), 1,59 (Н26) и 1,65 (Н21, Н27) м. д.

Сравнение спектров ,3С-ЯМР соединения 1 и гинзенозида Rh, показывает, что оба они содержат остатки /?-софорозы и /?-генциобиозы, соединенные гликозидными связями с гидроксильными группами агликона — 20(5)-протопанаксадиола — в положениях 3 и 20 соответственно (данные ROESY и НМВС, рис. 7). При этом различие в |3С-ЯМР спектрах этих двух соединений проявлялось только в величине химических сдвигов С5 и С6 терминального остатка глюкозы /?-софорозы. В спектре соединения 1 сигнал С5 смещен на 2,9 м. д. в сильное поле, а сигнал С6 на 2,3 м.д. в слабое поле по сравнению с их положением в спектре гинзенозида Rbj. Сигналы Н6 (НОСН2-группы) этого остатка глюкозы в 1 также смещены в слабое поле на 0,7 и 0,4 м.д.

Полученные результаты свидетельствуют, что соединение 1 является производным гинзенозида Rb,, ацилированным в положение 6 терминального остатка глюкозы /5-софорозы. При этом, однако, сигналы какого-либо ацильного заместителя в спектрах ЯМР соединения 1 обнаружены не были.

Масс-спектр отрицательных ионов соединения 1 показал наличие основного иона [М—Н] с m/z 1193,60, который соответствовал малонильному производному гинзенозида Rbi (малонил-Rbi) (рассчитанная величина для соединения С57Н94026 [М—Н] m/z 1193,60). Масс-спектр положительных ионов содержал пики четырех ионов аддуктов малонил-Rb, с m/z 1195,61 ([М+Н]4), 1212,64 ([M+NH4]+), 1217,59 ([M+Na]+) и 1233,57 ([М+К]+) (все рассчитанные величины для соединения С57Н94026 совпадали с экспериментальными).

На основании данных спектров 'Н-, ,3С-ЯМР и масс-спектров сделан вывод, что соединение 1 является малонил-гинзенозидом Rbi, структура которого представлена на рис. 7. Отсутствие сигналов малонильной группы в спектрах 'Н- и |3С-ЯМР раствора 1 в смеси пиридин-ё5/020, очевидно, объясняется обменом подвижных метиленовых протонов Н2 остатка малоновой кислоты на атомы дейтерия, что не позволяет увидеть сигналы не только этих протонов, но и атома углерода С2, к которому они присоединены (Кондакова и др., 2004).

Рис. 7. Химическая структура и ключевые 'Н-13С НМВС (а) и 'Н-'Н ROESY (б) корреляции компонента 1.

Наличие значительного количества малонильных эфиров гинзенозидов (прежде всего Rbi) в интактных корнях некоторых видов женьшеня является надежно установленным фактом (Christensen, 2008). Между тем образование этих нестабильных производных гинзенозидов, в частности мапонил-гинзенозида Rbi, в культуре клеток женьшеня доказано впервые.

Масс-спектр отрицательных ионов соединения 3 показал наличие основного иона [М—Нр с m/z 945,5383, который соответствовал соединению C48H820is (рассчитанная величина для С48Н820|8, [М—Н] m/z 945,5417).

Спектр 'Н-ЯМР соединения 3 содержал сигналы трех аномерных протонов Н1 моносахаридов при 4,91, 5,07 и 5,11 м. д. (все дублеты, Ji 2 7,8 Гц) и восьми

третичных метальных групп агликона (все синглеты) при 0,81 (Н19), 0,95 (Н18), 0,97 (ИЗО), 0,98 (Н29), 1,29 (Н28), 1,59 (Н26) и 1,65 (Н21, Н27) м. д.

Сопоставление спектров 13С-ЯМР соединения 3 и гинзенозида Rb( показало, что оба они являются производными агликона 20(5)-протопанаксадиола, к С20 гидроксильной группе которого гликозидной связью присоединен остаток [1-генциобиозы. Различаются эти два соединения только строением углеводной цепи, присоединенной к СЗ гидроксильной группе агликона, — у гликозида 3 она представлена одним остатком /J-D-глюкопиранозы (данные ROESY и НМВС, рис. 8).

——'Н-'Н COSY

Рис. 8. Химическая структура и ключевые 'Н-'Н COSY, 'Н-'3С НМВС (а) и 'Н-'Н ROESY (б) корреляции компонента 3.

На основании спектров 'Н-, 13С-ЯМР и масс-спектров сделан вывод, что соединение 3 имеет строение 3-0-/?-0-глгокопиранозил-20-0- [/З-П-глюкопиранозил-(1—►6)-0-/8-0-глюкопиранозил]-20(5)-протопанаксадиола (рис. 8) и является идентичным гипенозиду XVII, который впервые был выделен из листьев гиностеммы Gynostemma pentaphyllum Makino (Cucurbitaceae) (Razmovski-Naumovski et al., 2005).

Гипенозид XVII относится к группе так называемых «минорных» гинзенозидов — довольно пестрой группы гликозидов женьшеня, которые весьма нерегулярно встречаются в растениях в концентрациях, в сумме не превышающих 1-2% от сухого веса образцов (Namba et al., 1986). В тоже время присутствие гипенозида XVII в культурах клеток женьшеня в настоящей работе показано впервые.

3.4. Изменение содержания гинзенозидов в цикле выращивания культуры клеток P. japonicus var. repens в колбах

Для выяснения закономерностей образования индивидуальных гинзенозидов в культуре клеток P. japonicus var. repens было проведено изучение изменения их содержания в течение цикла выращивания этой культуры в колбах.

Полученные результаты представлены на рис. 9. Установлено, что на протяжении цикла культивирования в биомассе присутствовали все исследуемые гинзенозиды — Re+Rgi, Re. малонил-Rbi, Rbb Rc, Rb2, Rd и гипенозид XVII. При этом основной вклад в общее содержание гинзенозидов (более 80%) вносили гинзенозиды Re+Rgi (гликозиды протопанаксатриола — Rg-группа), Ro (гликозид олеаноловой кислоты) и малонил-Rbi (гинзенозид протопанаксадиола — Rb-группа). На долю остальных гинзенозидов (все — производные протопанаксадиола) в различные периоды роста приходилось не более 15% от общего содержания гинзенозидов. Гипенозид XVII всегда присутствовал в биомассе в следовых количествах (мене 0,03% от веса сухой биомассы клеток).

В течение цикла выращивания содержание суммы гинзенозидов менялось слабо, и находилось в пределах 3,1-4,0% от веса сухой биомассы клеток. Следует заметить, что накопление в биомассе культуры клеток P. japonicus var. repens значительного количества гинзенозида Ro вполне согласуется с данными литературы (Еляков, Оводов, 1962; Fujioka et al., 1989; Court, 2000), согласно которым этот вид женьшеня отличается от остальных именно преобладанием в своем составе гликозидов олеаноловой кислоты.

Сутки роста

Рис. 9. Изменение ростовых характеристик (А) и содержания гинзенозидов (Б) в цикле выращивания культуры клеток Рапах¡аротсив уаг. герет в колбах (242 цикл).

Обозначения: 1 — К^+Яе, 2 — Я0, 3 — малонил-КЬ|, 4 — ЯЬь 5 — Яс, 6 — ЯЬг, 7 — ЯД, 8 — гипенозид XVII.

Изучение изменения содержания гинзенозидов при длительном (около 4 лет) выращивании культуры клеток Р. ¡аротсиь уаг. герет в колбах подтвердило описанную закономерность (рис. 10): от 75% до 93% от общего содержания гинзенозидов в сумме составляли Яе+К^], Яо и малонил-ЯЬ].

СК -

s; х

го m

оа cl,;

н

м

>-

ю >.

и

CL Q) Z

о X

Е

•х.ЧХХЧУН

10

30

50

Гинзенозиды, мг/г сухой биомассы

CZ1 ППТ ШВ -Олеан ШЭ-Малон-Rbl ЕЭ- ппд

Рис. 10. Изменение содержания основных групп гинзенозидов (на 21 сутки) в нескольких независимых циклах выращивания культуры клеток Рапах }аротсш уаг. герет в колбах (2006-2010 гг.).

Обозначения:

ППТ — сумма гинзенозидов-производных протопанакса-триола (Rg|+Re); Олеан — гликозид олеаноловой к-ты (Ro); Малон-КЬ) — малонильный эфир гинзенозида ЯЬи ППД — сумма гинзенозидов-производных протопанакса-диола (Rbl+Rc+Rb2+Rd +гипенозид XVII).

Полученные результаты свидетельствуют. что все многообразие тритерпеновых гликозидов культуры клеток P. japonicus var. repens можно разделить на три основные группы: гликозиды протопанаксатриола (Re+Rgi), гликозиды олеаноловой кислоты (Ro) и гликозиды протопанаксадиола (малонил-Rb,, Rbb Rc, Rb2, Rd и гипенозид XVII). При этом гинзенозиды Re+Rgi, R0 и малонил-Rbi, очевидно, являются основными продуктами метаболизма гликозидов каждого структурного типа. Накопление этих гликозидов в клетках P. japonicus var. repens in vitro может достигать значительных значений (до 5% от веса сухой биомассы клеток).

Культура клеток высших растений in vitro является популяцией соматических клеток, основной критерий отбора в которой — стабильно высокая пролиферативная активность клеток (Носов, 1991; 1999). Поэтому образование в культуре клеток P. japonicus var. repens большого количества вторичных метаболитов, таких как гинзенозиды, должно быть неразрывно связано с их перераспределением в метаболически неактивные компартменты клетки (Cai et al., 2011). Объясняется это тем, что тритерпеновые гликозиды являются удобной мишенью для действия различных литических ферментов, в результате чего могут образовываться токсичные прогенины и агликоны (Попов, 2006; Augustin et al., 2011). Однако механизмы, на основе которых осуществляется компартментация гинзенозидов разных структурных

20

классов, по всей видимости, неодинаковы. Так, уникальное строение гликозидов протопанаксатриола, которые содержат редко встречающийся в природе способ присоединения углеводного фрагмента (к шестому положению даммарана), вероятно, делает их устойчивыми к действию различных гликозилгидролаз (Muffler et al., 2011; Qi et al., 2011). Поэтому накопление гинзенозидов Re+Rgi может происходить без существенного ущерба для жизнедеятельности клеток P. japonicus var. repens in vitro. С другой стороны, гинзенозиды группы протопанаксадиола являются уязвимыми для неспецифического расщепления, поскольку /?-гликозидная связь у третьего положения агликона — весьма распространенный в природе структурный мотив (Muffler et al., 2011; Chaturvedi et al., 2011). В настоящее время установлено, что у растений существует несколько механизмов предотвращения неспецифического гидролиза гликозидов (Roytrakul, Verpoorte, 2007; Klein, Roos, 2009). В частности, на примере флавоноидов надежно доказано, что присоединение малоновой кислоты к первичной группе остатка глюкозы делает соответствующие гликозиды устойчивыми к гликозилгидролазам и способствует их перераспределению в вакуоль (Suzuki et а!.. 2001; 2006; 2007; Hofmarm et al., 2006; Naoumkina et al., 2007).

Тот факт, что в клетках P. japonicus var. repens in vitro гинзенозиды протопанаксадиола (прежде всего Rbi) представлены в основном в виде своих малонильных эфиров — по всей видимости, является еще одним примером реализации описанного механизма регуляции метаболизма глико-конъюгатов в растительной клетке. Однако для окончательного доказательства этого утверждения, безусловно, требуются дополнительные исследования.

3.5. Изменение содержания гинзенозидов в цикле выращивания культуры клеток P. japonicus var. repens в биореакторе

Культура клеток высших растений является уникальной системой, эффективное использование которой позволяет решить не только фундаментальные, но и многие практические задачи. В частности, культуры клеток и тканей растений in vitro могут служить альтернативным природному источником лекарственного растительного сырья. При промышленном выращивании культур клеток большое значение имеет оптимизация состава сред культивирования. При этом важным моментом является выбор источника углеводного питания культуры, стоимость которого в большой степени определят рентабельность процесса выращивания (Носов, 2011). В этой связи особое значение имеет выяснение закономерностей

образования гинзенозидов при крупномасштабном выращивании культуры клеток P. japonicus var. repens на средах, содержащих сахарозу разных степеней очистки.

Эксперимент проводили в 500 л биореакторе барботажного типа. Было проведено три последовательных цикла выращивания, общее время культивирования составило 59 суток. Первый цикл выращивания (14 суток) осуществляли с использованием химически чистой сахарозы производства фирмы Merck (Германия), второй и третий (по 21 и 24 суток, соответственно) — смеси 1:1 химически чистой сахарозы и сахарозы пищевой (сахар-рафинад, Гост 22. 94).

5 !

* і

-к" К- - -

лз ?! /

и /

и к

ТI }

о I / ю 5 j ^

ОС А

2 I Г

> ! / о і /

з

цикл

10

2 цикл

30

Сутки роста

3 цикл

50

А Сухая биомасса, г/л

Жизм«споео8мость, % \

90

7Л 1

' и Ф

п

5

п

50 |

о о

30 $

10

Рис. 11. Изменение ростовых характеристик в трех последовательных циклах выращивания культуры клеток Panax japonicus var. repens в 500 л биореакторе.

Анализ ростовых характеристик культуры (рис. 11) показал, что наибольшее накопление биомассы (8,9 г/л по сухому весу) отмечалось только в первом цикле выращивания. При этом во втором и третьем циклах выращивания максимальное накопление биомассы по сухому весу не превышало 7 г/л. Полученные результаты свидетельствуют, что степень очистки сахарозы может оказывать существенное влияние на ростовые характеристики культуры клеток P. japonicus var. repens.

Рис. 12. Изменение содержания гинзенозидов в трех последовательных циклах выращивания культуры клеток Рапах]аротсш уаг. герепя в 500 л биореакторе.

Обозначения: 1 — Яо, 2 — малонил-КЬ(, 3 — 4 — ЯЬь .5 — Яс, 6 — 7 — гипенозид XVII.

Результаты анализа изменения содержания гинзенозидов в биомассе культуры клеток Р. ]аротст уаг. герет, выращенной в барботажном биореакторе, представлены на рис. 12.

Установлено, что в пределах двух первых циклов культивирования содержание суммы гинзенозидов менялось слабо, и находилось в пределах 4-5% от веса сухой биомассы клеток. В третьем цикле происходило существенное увеличение содержания гинзенозидов — наибольшее значение этого показателя (9,3% от веса сухой биомассы клеток) отмечено на 48 сутки культивирования.

Особый интерес вызывает тот факт, что в третьем цикле произошло повышение содержания в биомассе самого неполярного из изученных в настоящей работе гинзенозидов — гипенозида XVII (на 48 сутки культивирования его выход составил 2,3% от веса сухой биомассы клеток).

На основании представленных результатов можно предположить, что усиление образования гинзенозидов (особенно гипенозида XVII) является реакцией культуры клеток Р. ¡аротсиъ \гх. герет на стресс, вызванный изменением качественных характеристик источника углерода в среде культивирования — сахарозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тритерпеновые гликозиды образуют уникальную группу природных соединений, фармакологические свойства и неисчерпаемое структурное разнообразие представителей которой, давно привлекают пристальное внимание специалистов из различных областей естествознания.

В настоящей работе впервые проведено подробное исследование основных тритерпеновых гликозидов культур клеток in vitro представителей двух важных родов семейства Araliaceae — Panax spp. и Polyscias spp. При этом установлено, что в условиях стерильной культуры сохраняется специфика состава тритерпеновых гликозидов, свойственная интакгным растениям. Так, для культур клеток двух изученных видов полисциаса, также как и для интактных растений, свойственно образование гликозидов олеаноловой кислоты. Для культур клеток Panax ginseng и P.japonicus var. repens характерно образование как олеанановых, так и даммарановых гликозидов.

Культура клеток высших растений является экспериментально созданной популяцией соматических клеток, основным критерием отбора в которой является интенсивность пролиферативной активности клеток. Указанное обстоятельство, по всей видимости, накладывает весьма жесткие ограничения на качественные и количественные характеристики содержания тритерпеновых гликозидов в культурах клеток изученных видов Araliaceae. Например, анализ полученных результатов исследования тритерпеновых гликозидов культуры клеток P. japonicus var. repens позволяет предположить, что при длительном выращивании культуры стабильное образование значительных количеств гинзенозидов находится в тесной взаимосвязи с процессами их компартментации. На основании представленных результатов наиболее обоснованным это предположение является по отношению к гликозидам протопанаксадиола, которые в культуре клеток P. japonicus var. repens в основном представлены в виде эфиров с малоновой кислотой. Механизм этого явления, вероятно, кроется в том, что «малонильная метка» принимает непосредственное участие в регуляции распределения между компартментами клетки чувствительных к неспецифическому расщеплению гинзенозидов Rb-группы (рис. 13).

20(Б)-ППД

Jf Ma-Rc Jf Rc

Rb3

^ Ma-Rb3

Пути образования основных гинзенозидов ППД группы в культуре клеток Рапах Japonicus:

-Доказан

—Показан косвенно

КЪмпаргмеш.ишя (ваклоль')

Компартментация конечных продуктов биосинтеза (гипотеза)

Рис. 13. Гипотетическая схема метаболизма гликозидов 20(5)-протопанаксадиола (20(5)-ППД) в культуре клеток Panax japonicus var. repens. За основу взята схема образования гинзенозидов 20(5)-ППД в интактных корнях Panax ginseng (черные стрелки; Shin et al., 2007).

Ma-Rbl, Ma-Rc, Ma-Rb2 и Ma-Rb3 — малонильные производные соответствующих гинзенозидов.

ВЫВОДЫ

1. Доказано наличие тритерпеновых гликозидов (ТГ) с олеаноловой кислотой в качестве агликона в суспензионных культурах клеток Polyscias filicifolia и P. fruticosa, полученных 6 лет назад. При этом в 20-летнем штамме культуры клеток P. filicifolia — ТГ не обнаружены. Установлено, что основные четыре ТГ культур клеток Polyscias spp. идентичны ладигинозиду А, полисциазиду А, полисциазиду Е и 28-0-/?-0-глюкопирапозиловому эфиру З-0-fi-D-глюкогшраиозил-(1—►4)-0-/?-1>глюкуро1Юпиранозида олеаноловой кислоты — гликозидам, выделенным из листьев интактного растения Polyscias filicifolia.

2. Показано различие качественного и относительного количественного состава ТГ суспензионных культур клеток Polyscias filicifolia и P. fruticosa. При

этом культура клеток P. filicifolia характеризовалась накоплением большего количества ТГ, чем культура клеток P.fruticosa.

3. Выявлено существенное различие качественного и относительного количественного состава ТГ суспензионных культур клеток Panax japonicus vaг. repens и P. ginseng. Культура клеток P. japonicus var. repens характеризуется более высоким количественным содержанием гинзенозидов и их большим качественным разнообразием. Для этой культуры установлено присутствие гликозида олеаноловой кислоты (гиизекозид Ro).

4. Для культуры клеток P. japonicus var. repens показано наличие неполярного гинзенозида даммаранового ряда — гипенозида XVII и кислых нестабильных ацильных производных гинзенозидов, основным из которых являлся малонил-гинзенозид Rb,. Образование этих соединений в культурах клеток женьшеня показано впервые.

5. Проведено исследование изменения содержания основных групп гинзенозидов (нейтральные гинзенозиды группы протопанаксадиола и протопанаксатриола, малонил-гинзенозид Rb, и гинзенозид группы олеаноловой кислоты Ro) в процессе длительного выращивания культуры клеток P. japonicus var. repens в колбах. Установлено, что главными компонентами смеси гинзенозидов являлись гинзенозид Ro, гинзенозиды протопанаксатриола (Rgi+Re) и малонил-гинзенозид Rbi.

6. Проведено изучение изменения содержания гинзенозидов при выращивании культуры клеток P. japonicus var. repens в биореакторе полупромышленного объема. Показано, что степень чистоты сахарозы может существенно влиять как на ростовые характеристики культуры, так и на состав гинзенозидов, в частности, приводить к значительному увеличению содержания гипенозида XVII.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В журналах рекомендованных ВАК

1. Кочкин Д.В., Качала В.В., Носов A.M. (2011) Обнаружение малонил-гинзенозида Rbi в суспензионной культуре клеток женьшеня Panax japonicus var. repens. Доклады РАН, 441, 837-840.

2. Суханова Е.С., Кочкин Д.В., Гафиятова Э.И., Носов A.M. (2011) Влияние предшественника синтеза изопреноидов на ростовые и биосинтетические

характеристики культуры клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms. Вестник СВФУ им. А.К. Аммосова, 8, № 4, 40-44.

3. Кочкин Д.В., Носов A.M. (2011) Кислые эфиры гинзенозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens. Вестник МарГГУ, Серия «Лес. Экология. Природопользование», № 3, 61-71.

4. Кочкин Д.В., Зайцев Г.П., Качала В.В., Чижов А.О., Демидова Е.В., Титова М.В., Чирва В.Я., Носов A.M., Кузнецов Вл.В. (2012) Обнаружение гипенозида XVII в суспензионной культуре клеток женьшеня Panax japonicus var. repens. Доклады РАН, 442, 705-708.

В прочих изданиях

5. Кочкин Д.В., Суханова Е.С., Носов A.M. (2010) Тритерпеновые гликозиды в культуре клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms. Материалы международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере. Якутск: ИПК СВФУ, с. 101-104.

6. Соловьева Л.В., Гафиятова Э.И., Суханова Е.С., Кочкин Д.В. (2011) Особенности ультраструктуры клеток суспензионной культуры Polyscias fruticosa (L.) Harms, в связи с синтезом изопреноидов. Тезисы докладов XVIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-МП». М.: МАКС Пресс, с. 224.

7. Кочкин Д.В., Носов A.M. (2011) Кислый эфир гинзенозида Rbi в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens. Материалы 5-го Международного симпозиума "Химия и химическое образование". Владивосток: Изд. Дальневосточного Федерального Университета, с. 24-26.

8. Соловьева JI.B., Гафиятова Э.И., Суханова Е.С., Кочкин Д.В., Абдрахимов Ф.А., Абдрахимова Й.Р., Носов A.M. (2011) Ультраструктура клеток суспензионной культуры Polyscias fruticosa при переходе к стационарной фазе роста. XV Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века". Пущино: Пущинский научный центр Российской Академии Наук, с. 287.

9. Гафиятова Э.И., Соловьева Л.В., Суханова Е.С., Кочкин Д.В., Абдрахимов Ф.А., Абдрахимова Й.Р., Носов A.M. (2011) Характеристика клеток суспензионной культуры Polyscias fruticosa (L.) Harms в связи с биосинтезом тритерпеновых сапонинов. Тезисы 4-го Всероссийского с

международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия". Воронеж: ВГУ, с. 8-10.

Ю.Суханова Е.С., Черняк Н.Д., Кочкин Д.В., Носов A.M. (2011) Штамм культивируемых клеток растения полисциас кустарниковый 6а№2 (Polyscias fruticosa (L.) Harms) в условиях in vitro — продуцент изопреноидов»: Заявка на патент РФ № 2011134609, положительное решение от 29. 09. 2011.

Подписано в печать: 17.02.12

Объем: 1усл.п.л. Тираж:!50 экз. Заказ № 649 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Рождественка, 5/7,стр.1 (495) 623-93-06; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочкин, Дмитрий Владимирович, Москва

61 12-3/595

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Кочкин Дмитрий Владимирович

КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК IN VITRO ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ARALIACEAE (НА ПРИМЕРЕ

PANAX SPP. И POLYSCIAS SPP.)

03.01.05 - «Физиология и биохимия растений»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.М. Носов

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................2

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................4

1.1. Ботаническая характеристика растений рода женьшень (Panax L.) ........4

1.2. Ботаническая характеристика растений рода полисциас (Polyscias

J. R. Forst. & G. Forst.).................................................................5

1.3. Тритерпеновые гликозиды растений рода женьшень (Panax L.)............6

1.4. Количественный и качественный состав и функции три-

терпеновых гликозидов в интактных растениях женьшеня..................20

1.5. Тритерпеновые гликозиды растений рода полисциас {Polyscias J.

R. Forst. & G. Forst.).................................................................23

1.6. Малонил-гликозиды: многообразие и функции...............................26

1.7. Культуры клеток и тканей женьшеня и полисциаса..........................28

1.7.1. Получение культур клеток и тканей женьшеня......................31

1.7.2. Физиологические характеристики культур клеток

женьшеня....................................................................32

1.7.3. Тритерпеновые гликозиды и другие биологически

активные вещества женьшеня в культуре in vitro..................34

1.7.4. Глубинное выращивание суспензионных культур клеток представителей рода Panax..............................................37

1.7.5. Культуры клеток и тканей полисциаса................................40

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................43

2.1. Объекты...............................................................................43

2.2. Методы выращивания культур клеток..........................................43

2.3. Исследование ростовых характеристик культур клеток....................44

2.4. Методы фитохимического анализа тритерпеновых гликозидов..........45

2.5. Выделение и установление структуры тритерпеновых гликозидов ......48

2. 5.1. Выделение тритерпеновых гликозидов из листьев

Polyscias filicifolia..........................................................48

2. 5.2. Выделение тритерпеновых гликозидов из культуры

клеток Panax japonicus var. repens......................................49

2. 5.3. Установление структуры выделенных гликозидов.................50

2.6. Количественный анализ тритерпеновых гликозидов........................51

2. 6.1. Подготовка проб и условия проведения ВЭЖХ анализа..........52

2. 6.2. Проверка описанных методов ВЭЖХ анализа.......................52

2.7. Обработка данных и представление результатов.............................55

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................56

3.1. Тритерпеновые гликозиды культур клеток Polyscias spp...................57

3.2. Изменение содержания тритерпеновых гликозидов в цикле выращивания культуры клеток P. fruticosa....................................66

3.3. Тритерпеновые гликозиды культур клеток женьшеня Panax spp.........67

3.4. Изменение содержания гинзенозидов в цикле выращивания

культуры клеток P. japonicus var. repens в колбах............................78

3.5. Изменение содержания гинзенозидов в цикле выращивания

культуры клеток P. japonicus var. repens в биореакторе.....................82

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................85

ВЫВОДЫ...........................................................................................87

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................89

ПРИЛОЖЕНИЕ..................................................................................119

ВВЕДЕНИЕ

Своеобразие вторичного метаболизма растений семейства Аралиевых заключается в образовании значительных количеств тритерпеновых гликозидов различной структуры (Еляков, Оводов, 1972; Журавлев, Коляда, 1996). В настоящее время эти соединения обнаружены у представителей 24 родов Araliaceae (Гришковец, 2004), что составляет около трети от общего числа родов семейства. В качестве агликонов гликозидов аралиевых выступают тритерпеноиды более десяти различных структурных типов (Vincken et al., 2007; Dinda et al., 2010), однако наибольший интерес представляют две основные группы соединений — производные пентациклического тритерпеноида /?-амирина и тетрациклического тритерпеноида П-даммарендиола. Важно, что гликозиды с агликонами этих типов неравномерно распределены среди растений семейства (Christensen, 2008): производные /?-амирина обнаружены у всех исследованных аралиевых, тогда как гликозиды с агликонами даммаранового ряда встречаются, за редкими исключениями, только в различных видах женьшеня (род Panax L.).

Систематическое исследование химического состава представителей Araliaceae было начато более полувека назад. За прошедшее время показано, что в каждом изученном объекте тритерпеновые гликозиды представлены в виде сложных смесей, структурное многообразие компонентов которых поражает воображение исследователей. Ярким примером этого являются результаты изучения рода Panax spp., из различных видов которого в настоящее время выделено более 300 индивидуальных гликозидов (Qi et al., 201 la).

Работы по получению и исследованию культур клеток растений семейства Araliaceae стартовали одновременно с первыми успехами выяснения полной структуры тритерпеновых гликозидов аралиевых. Первые каллусные и суспензионные культуры клеток ряда видов Panax spp. и Polyscias spp. были получены в середине прошлого столетия (Бутенко, 1964; Слепян и др., 1975а,б). К настоящему времени получены десятки культур клеток видов семейства. В то же время, исследования тритерпеновых гликозидов в полученных культурах, как

правило, носят схематичный характер и сводятся к качественному и количественному анализу только тех компонентов, для которых доступны коммерческие стандартные образцы. Например, для культур клеток и тканей различных видов женьшеня обычно определяют содержание семи нейтральных гинзенозидов (Rgi, Re, Rf, Rbb Re, Rb2, Rd) — основных тритерпеновых гликозидов корня женьшеня настоящего (Wu, Zhong, 1999). Очевидно, что результаты подобных исследований не дают представления о возможности образования в клетках in vitro сложного паттерна тритерпеновых гликозидов, характерного для растений семейства Araliaceae in vivo.

Таким образом, можно заключить, что детальное изучение путей формирования и особенностей многообразия тритерпеновых гликозидов в культурах клеток и тканей аралиевых является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы: изучить особенности качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в культурах клеток представителей семейства Araliaceae (на примере Panax spp. и Polyscias spp.) и выяснить закономерности его изменения в процессе роста клеток in vitro.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести фитохимический анализ культур клеток двух видов полисциаса (Polyscias filicifolia, P. fruticosa) и двух видов женьшеня (Panax japónicas var. repens и P. ginseng);

2. Провести препаративное выделение и структурную идентификацию основных тритерпеновых гликозидов культур клеток Polyscias spp. и Panax japonicus var. repens;

3. Изучить изменение качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в процессе выращивания исследуемых культур клеток.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ботаническая характеристика растений рода женьшень (Panax L.)

Легендарный женьшень является реликтовым растением семейства

аралиевых (Araliaceae Juss.). Это древнее семейство цветковых растений, отдельные представители которого обнаруживаются уже в отложениях мелового периода (Грушвицкий, 1963), в настоящее время включает в себя, по разным данным, от 900 до 1350 видов (Артюкова и др., 2005), объединённых в 47 (Plunkett et al., 2004) или 80 родов (Журавлёв, Коляда, 1996).

При создании научной классификации растений в середине XVIII века Карл Линней дал женьшеню родовое название Panax (от греч. «pan» — все и «acos» — лекарство, что означает нечто всеисцеляющее, панацею), которое, очевидно, впервые употребил Гроновиус во второй книге «Флоры Вирджинии», вышедшей в 1743 году (Грушвицкий, 1961). После работ Линнея, по крайней мере, еще 80 лет шли споры вокруг объёма рода Panax L., пока в 1842 — 1843 гг. русский ботаник К. А. Мейер, обработав обширный материал по женьшеню разного происхождения, не предложил внутриродовую систематику, которая на продолжительное время стала общепринятой. Мейер предложил включить в род женьшень 5 видов, из которых 2 были североамериканскими, а остальные 3 — азиатскими.

В настоящее время не вызывает сомнений самостоятельность по меньшей мере 7 видов рода Panax. Из этих семи видов два растут в Северной Америке — Р. quinquefolium L. (женьшень пятилистный, «американский женьшень») и P. trifolius L. (женьшень трёхлистный, «карликовый женьшень»), а остальные приурочены к Восточной и Юго-Восточной Азии — женьшень настоящий, P. ginseng С. А. Меу. (Северный Китай, Корея, Приморский край России), Р. notoginseng (Burk.) F. Н. Chen (Юго-Западный Китай, часть Вьетнама), женьшень ложный, P. pseudoginseng Wall. (Гималаи, Южный Китай и Непал), женьшень японский, P. japonicus С. А. Меу. (Япония) и, выделенный в 1973 году как отдельный вид, эндемичный для Северного Вьетнама женьшень вьетнамский — P. vietnamensis На et Grushv.

(Журавлёв, Коляда, 1996). При этом следует отметить, что на основании исследования ультраструктуры пыльцевых зёрен (Wen, Nowicke, 1999) и молекулярно-генетического анализа (Choi, Wen, 2000; Komatsu et al., 2004; Zhou et al., 2005; Komatsu, 2006) допускается существование от 11 до 14 видов женьшеня.

Морфология различных видов женьшеня характеризуется заметным сходством. В большей степени это относится к надземной части, которая у зрелых растений представлена, как правило, одногодичным одиночным побегом, несущим на вершине мутовку из 3-5 и более пальчатосложных листьев. Степень изрезанности листьев является видовым признаком. Подземная часть заметно варьирует: корневище бывает сильно укороченным (у культивируемых форм азиатского и американского женыиеней) и сильно удлинённым (у женьшеня японского); главный корень мясистый, веретеновидной (женьшень настоящий и пятилистный) или шаровидной (женьшень трёхлистный и вьетнамский) формы, либо он отмирает (женьшень японский). Из центра листовой розетки выходит цветонос, заканчивающийся одиночным, простым зонтиком, которому иногда сопутствуют один или несколько боковых зонтиков. Цветки мелкие, 4-круговые, 5-членные, завязь нижняя, 1-3-гнёздная. Плоды — нижние ценокарпные костянки, красные, жёлтые или красные с чёрным пятном на вершине (Журавлёв, Коляда, 1996).

1.2. Ботаническая характеристика растений рода полисциас (Polyscias J. R. Forst. & G. Forst.)

Род Polyscias J. R. Forst. & G. Forst, был описан в 1776 г. и содержал тогда

единственный вид — полисциас перистый Polyscias pinnata Forst., который и является номенклатурным типом рода (Слепян и др., 1975). В настоящее время этот род насчитывает около 130 видов и является вторым по величине (после рода Schefflera J. R. Forst. & G. Forst.) в семействе Araliaceae (Eibl et al., 2001). Виды рода распространены в тропиках Старого Света и Австралии. Большей частью это кустарники, реже деревья с перистыми или двоякоперистыми листьями, редко с листьями вторичнопростыми — однолисточковыми.

Представители рода Polyscias довольно активно используются в традиционной медицине стран Юго-Восточной Азии. Так, например, полисциас папортниколистный {Polyscias filicifolia) включен в официальную фармакопею Вьетнама в качестве тонизирующего и кардиотропного средства (Котин, 2001). Схожим спектром действия обладает и близкий к P. filicifolia вид полисциаса кустарникового — Р. fr uticosa.

1.3. Тритерпеновые гликозиды растений рода женьшень {Panax L.)

Изучение химического состава женьшеня началось раньше, чем

систематическое изучение специфики его физиологического действия на организм человека. Началом химического исследования женьшеня считают 1854 год, когда американский химик С. Гарикс сообщил о выделении из Panax quinquefolium аморфного вещества — панаквилона с брутто-формулой С32Н56О14 (Баландин, 1955). Похожее соединение из Panax ginseng впервые выделил русский исследователь Д. Д. Давыдов в 1889 году (Вильялобос, 1989). Однако возможности аналитической химии того времени не позволяли получить действующие вещества женьшеня в нативном состоянии и исследователи, по всей видимости, имели дело со сложными смесями как нативных соединений, так и продуктов их преобразований в результате процесса выделения (Naidenova et al., 1957).

Дальнейшие исследования показали, что химический состав физиологически активных соединений корня женьшеня весьма сложен. В нем обнаружены сесквитерпены (Iwabuchi et al., 1989), полиацетилены (Baranska et al., 2005; Dembitsky et al., 2003; Dembitsky, 2006), полисахариды (Ohtani et al., 1989; Tomoda et al., 1994), пептиды и «необычные» аминокислоты (Li et al., 2002; Wang et al., 2006) — всего более 200 компонентов, обладающих той или иной биологической активностью (Park, 1996; Yang et al., 2006; Kim, 2012). Однако основными и уникальными по своей физиологической активности считаются тритерпеновые гликозиды женьшеня (Dewick, 2002; Komatsu, 2004).

Всестороннее изучение тритерпеновых гликозидов представителей рода

Panax spp. началось в шестидесятых годах прошлого столетия, когда к работе практически одновременно приступили две группы химиков: в СССР под руководством Г. Б. Елякова и в Японии под руководством профессора S. Shibata (Стоник, 2005). К этому времени было уже известно, что для корней Panax ginseng характерно присутствие гликозидов — соединений, молекула которых состоит из неполярного агликона и углеводного фрагмента (Запотылько, 1951), однако точная структура гликозидов женьшеня, прежде всего их агликонов, оставалась неизвестной.

Структура нативных агликонов гликозидов Panax ginseng была окончательно установлена только в середине 1970-х годов. При этом оказалось, что основные гликозиды женьшеня являются производными тетрациклического тритерпеноида П-даммарендиола (Tran et al., 2001; Komatsu et al., 2005). Кроме того, в корнях Panax ginseng в небольших количествах также обнаружены гликозиды пентациклического тритерпеноида — олеаноловой кислоты (Lui, Staba, 1980; Yamaguchi et al., 1988).

В настоящее известно более 300 индивидуальных тритерпеновых гликозидов женьшеня. Интенсивность, с которой сейчас проводится исследование разнообразия этих соединений, иллюстрирует следующий пример. За сравнительно короткий период (январь 2000 г. — сентябрь 2010 г.) из различных видов женьшеня выделены и охарактеризованы 123 индивидуальных гинзенозида, а следующие полгода (октябрь 2010 г. — март 2011 г.) ознаменовались открытием еще 12 новых структур (Qi et al., 201 la).

Все многообразие структур даммарановых гликозидов женьшеня формируется с помощью двух основных стратегий:

1) Модификация агликона;

2) Вариация структуры углеводных фрагментов и позиций их присоединения к агликону.

Модификация агликона

Процессы, приводящие к вариации структуры агликонов гликозидов женьшеня, могут быть условно разделены на две основные группы. Первая группа объединяет модификации, затрагивающие состав и расположение кислородсодержащих функциональных групп в системе четырех конденсированных колец даммаранового скелета П-даммарендиола — простейшего из известных на сегодняшний день агликонов гликозидов женьшеня (рис. 1). При этом основными агликонами даммарановых гликозидов многих видов женьшеня являются 20(5)-протопанаксадиол и 20(5)-протопанаксатриол (СМэгетеп, 2008).

Рисунок 1. Химическая структура агликонов даммарановых гликозидов, выделенных из различных представителей Рапах Ь.

I — Н-даммарендиол; II — 20(£)-протопанаксадиол; III — 20(5)-протопанаксатриол. Остальные представленные соединения имеют только номенклатурные названия.

Однако подавляющее большинство различных вариантов структур

гликозидов женьшеня образуются с помощью преобразований второй группы ег

а!., 20116), которые приводят к небольшому изменению, либо полной перестройке

С17 боковой цепи 20(5>протопанаксадиола и 20(5)-протопанаксатриола (рис. 2 и 3).

но

<3

но. г

X = Н или СН,

ООН

X = Н или ОН

X

он

20

Рисунок 2. Многообразие производных 20(5)-протопанаксадиола (20(5)-ППД), найденных в гликозидах различных представителей Рапах Ь (по данным СЬ^етеп, 2008; СИ & а1., 2011а; Мао й а!., 2012).

Среди этих модификаций в последнее время особый интерес вызывают пути образования гидроперекисей, эпоксидов, а также процесс циклизации С17 боковой цепи, в результате которого образуются пяти- и шестичленные циклические эфиры.

R:

Рисунок 3. Многообразие производных 20(£)-протопанаксатриола (20(5)-ППТ), найденных в гликозидах различных представителей Рапах L (по данным Christensen, 2008; Qi et al., 2011a). 24-ОН-20(5)-ПТ — 24-24-OH-20(S> панаксатриол.

Гидропероксидные производные весьма характерны для надземных органов некоторых видов женьшеня. Например, в бутонах Рапах ginseng содержание таких гликозидов может достигать 0,09% от сухого веса растительного MarepHana(Yoshikawa et al., 2007), а в бутонах Р. quinquefolium — 0,30% (Nakamura

et al., 2007). Однако вопрос о том, являются ли агликоны, содержащие гидропероксидную группу, нативными метаболитами растений, или они образуются в результате неспецифических реакций, происходящих при препаративном выделении сапонинов женьшеня, — пока остается открытым (Yoshikawa et al., 1997). В тоже время, одно из неотъемлемых свойств структуры д�