Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия кукумариозида А2-2

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия кукумариозида А2-2"

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Амшшн Дмитрии Львович

Официальные оппоненты:

Шкрыль Юрий Николаевич

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Попов Сергей Владимирович

доктор биологических наук, Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, г. Сыктывкар, заведующий отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

физиологически активных веществ, г. Черноголовка, Московской области

Защита состоится «26» декабря 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д.005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50. e-mail: dissoveli'alpiboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте www.iiiboc.clvo.ru

Автореферат разослан «2.S» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тритерпеновые гликозиды голотурий изучаются на протяжении длительного времени. Установлено, что они обладают широким спектром биологической активности. Для этих соединений отмечены такие свойства, как антимикробная, хемопревентивная, иммуномодулирующая, иммуноадьювантная и противовоспалительная, активности. Кроме того, тритерпеновые гликозиды обладают выраженной мембранолитической активностью, проявляющейся в микромолярном диапазоне концентраций. Механизм мембранолитического действия этих соединений хорошо изучен и заключается в способности гликозидов изменять ионную проницаемость мембран клеток посредством взаимодействия со стеринами мембран (главным образом с холестерином) и формирования ионопроводящих структур в липидном матриксе.

В то же время известно, что в низких нецитотоксических концентрациях, некоторые из этих соединений активируют целый ряд внутриклеточных процессов. Ранее было показано, что тритерпеновый гликозид кукумариозид А2-2, выделенный из дальневосточной голотурии Cucumaria japónica, в наномолярных концентрациях обладает иммуностимулирующим действием, которое выражаются, главным образом, в активации клеточного звена иммунитета: усиливается адгезия, распластывание и подвижность макрофагов, усиливается фагоцитоз и формирование активных форм кислорода, увеличивается скорость пролиферации лимфоцитов, количество антител-образующих клеток селезенки, индуцируется синтез некоторых цитокинов. Введение препарата кумазид экспериментальным животным приводит к существенному увеличению их резистентности к различным патогенным инфекциям, к торможению роста некоторых видов опухолей и увеличению средней продолжительности жизни животных при облучении сублетальными дозами радиации. Результатом успешной работы ТИБОХ ДВО РАН в этом направлении является созданный на основе моносульфатированных тритерпеновых гликозидов голотурии Cucumaria japónica (главным образом, кукумариозида Аг-2) эффективный иммуностимулирующий препарат кумазид, предназначенный для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний человека и прошедший все официальные доклинические испытания.

Однако, несмотря на большое количество работ, связанных с изучением физиологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, механизм их иммуномодулирующего действия на клеточном и субклеточном уровне изучен недостаточно. Имеющиеся в литературе данные об иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления стимулирующего эффекта. Практически полностью отсутствуют сведения о мембранных и внутриклеточных мишенях действия гликозидов, сигнальных путях и фармакокинетике этих соединений в органах-мишенях.

Целью псследоваппя являлось выяснение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия и изучение фармакокинетического поведения тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2, выделенного из голотурии Cucumaria japónica.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. провести сравнительное изучение и установление концентрационных диапазонов цитотоксической и лизосомальной активности кукумариозида Аг-2 in vitro,

2. изучить взаимодействие кукумариозида Аг-2 с мембранами иммунокомпетентных клеток, включая исследование изменения микровязкости и мембранного потенциала под действием гликозида, а также определение мест связывания кукумариозида Аг-2 с биомембранами;

3. исследовать влияние кукумариозида Аг-2 на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и фармакологически определить природу рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са2+ ответе клеток на действие гликозида;

4. провести иммуноцитохимическое исследование перитонеапьных макрофагов, принимающих участие во взаимодействии с кукумариозидом А2-2;

5. провести исследование фармакокинетического поведения кукумариозида Аг-2 в органе-мишени (селезенке мыши).

Основпые положения, выпоснмые на защиту.

1. Кукумариозид А2-2 в наномолярных концентрациях связывается с мембранами иммунокомпетентных клеток мыши и вызывает временное обратимое изменение микровязкости мембран и мембранного потенциала, сопровождающееся резким обратимым входом Са в цитоплазму клеток из внеклеточной среды.

2. На мембранах макрофагов существует два сайта связывания кукумариозида А2-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации.

3. Пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са2+ проводимость в мембранах макрофагов и активацию иммунных клеток, являются молекулярными мишенями действия кукумариозида А2-2, который выступает в качестве аллостерического модулятора этих рецепторов.

4. При внутрибрюшинном способе введения мышам кукумариозид А2-2 быстро достигает максимальной концентрации в органе-мишени (селезенке) и относительно быстро выводится, практически не претерпевая метаболические превращения. Гликозид локализуется, главным образом, в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, в центральной части органа.

Научная новизна. В ходе данной работы было впервые изучено взаимодействие тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2 с иммунокомпетентными клетками мыши. Показано, что в основе иммуномодулирующего действия исследуемого природного соединения лежит его способность взаимодействовать, прежде всего, с клеточными мембранами и изменять их физико-химические свойства. Впервые показано, что кукумариозид Ai-2 обратимо увеличивает микровязкость биомембран. Такое взаимодействие приводит к обратимому изменению мембранного потенциала, деполяризации биомембран и резкому обратимому увеличению концентрации ионов Са2+ в цитоплазме за счет его поступления из внеклеточного пространства. Впервые показано, что на мембранах макрофагов мыши существуют как минимум два сайта связывания кукумариозида Аг-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации. Впервые установлено, что одними из молекулярных мишеней действия кукумариозида Аг-2 являются мембранные пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са2+ проводимость в мембранах макрофагов и активацию клеток. Показано, что кукумариозид Аг-2 действует в качестве аллостерического модулятора пуриновых рецепторов. Связываясь с ними, гликозид усиливает ответ клеток на АТФ и частично снимает эффект десенсибилизации рецепторов. Установлено, что в перитонеальной полости мыши присутствует популяция крупных зрелых F4/80+ макрофагов, характеризующихся наличием высокой плотности пуриновых рецепторов Р2Х1 и Р2Х4 типа. Очевидно, именно крупные F4/80+ / Р2Х+ перитонеальные макрофаги принимают участие в Са2+ ответе на аппликацию кукумариозида А2-2. Методами радиоспектроскопии, MALDI-TOF MS и MALDI-IMS впервые изучены и определены фармакокинетические параметры поведения кукумариозида Аг-2 в селезенке мыши при внутрибрюшинном введении препарата. Обнаружено, что кукумариозид Аг-2 локализуется, главным образом, в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, в центральной части органа, где располагается красная и белая пульпа.

Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2 и углубляют существующие представления о влиянии низкомолекулярных биорегуляторов на клетки иммунной системы. Фундаментальные знания, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, дают фармакодинамическую и фармакокинетическую характеристику кумазида и создают методологическую основу для изучения механизма действия новых лекарственных средств, созданных на основе тритерпеновых гликозидов голотурий.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине» (Владивосток, 2011), 9 1ST Asia pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Владивосток, 2011), XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2011, 2012), II Международной конференции "Перспективные направления биомедицинских технологий" (г. Владивосток, 2012), Symposium on marine enzymes and

polysaccarides (Нячанг, Вьетнам, 2012), 2nd Bi-Annual International Practical Cytometry Workshop (Москва, 2011), II Международной конференции "Перспективные направления биомедицинских технологий" (г. Владивосток, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2013), 2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam (Ханой, Вьетнам, 2013), 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 2013).

Личный вклад автора. Автором самостоятельно были проведены исследования цитотоксической и иммуномодулирующей активности кукумариозида Аг-2, изучено влияние гликозида на микровязкость биомембран, мембранный потенциал клеток, определены места связывания 3Н-кукумариозида А.г-2 с биомембранами, с помощью техники флуоресцентных зондов исследовано влияние гликозида на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и проведено фармакологическое определение природы рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са2+ ответе клеток на действие гликозида, проведено иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов для определения субпопуляций клеток, принимающих участие в иммунном ответе, осуществлены необходимые расчеты и статистическая обработка данных. Исследование фармакокинетики кукумариозида Аг-2 и его пространственного распределения в селезенке мыши методом MALDI-TOF MS и MALDI-IMS выполнено совместно с к.х.н., зав.лаб. Дмитренком П.С. (лаб. инструментальных и радиоизотопных ТИБОХ ДВО РАН). Электрофизиологические исследования проводили на базе лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН (г. Пущино) совместно с с.н.с., к.б.н. Асташевым М.Е. Компьютерное моделирование осуществлено кф.-мн., с.н.с., Зелепуга Е.А. (лаб. химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН).

Работа выполнена в Лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН при финансовой поддержке ФЦПК Минобрнауки России (№ 14.132.21.1327), грантов РФФИ (№ 12-04-32232 и № 11-04-01084), гранта Дальневосточного отделения РАН № 12-III-B-05-022, гранта Дальневосточного и Уральского отделений РАН (№ 09-Н-УО-05-002), программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ-546.1012.4.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 13 тезисов докладов конференций.

Структура п объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 262 публикаций. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 5 таблиц и 39 рисунков.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю, кандидату биологических наук Дмитрию Львовичу Аминину. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН: кандидату химических наук Александре Сергеевне Сильченко и доктору химических наук Сергею Анатольевичу Авилову за любезное предоставление кукумариозида Аг-2, кандидату химических наук Виктории Николаевне Давыдовой за помощь при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии, кандидату химических наук Павлу Сергеевичу Дмитренку за неоценимую помощь в организации и проведении исследований методом MALDI-TOF MS и MALDI-IMS, научному сотруднику Наталье Юрьевне Ким за помощь при проведении исследований методом флуоресцентной спектроскопии, кандидату физико-математических наук Елене Александровне Зелепуга за осуществление компьютерного моделирования, кандидату биологических наук Екатерине Александровне Юрченко и кандидату биологических наук Татьяне Юрьевне Горпенченко (лаборатория биотехнологии БПИ ДВО РАН) за помощь при проведении иммуноцитохимических исследований и конфокальной микроскопии, кандидату биологических наук Максиму Евгеньевичу Асташеву (лаборатории клеточной нейробиологии, Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино) за помощь в электрофизиологических исследованиях и всем сотрудникам лаборатории биоиспытаний и механизма действия БАВ ТИБОХ ДВО РАН.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пислягин, Евгений Александрович, Владивосток

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

04201453553

На правах рукописи

Пислягин Евгений Александрович

Молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия кукумариозида А2-2

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель : к.б.н Аминин Дмитрий Львович

Владивосток - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ........................................................................................................................................2

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.................................................................................................................9

1.1. Биологическая активность и механизм действия тритерпеновых..............................................9

гликозидов...............................................................................................................................................9

1.1.1. Структура тритерпеновых гликозидов...................................................................................9

1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов........................................................................9

1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов......................................................11

1.1.4. Физико-химические основы механизма цитотоксического и мембранолитического действия тритерпеновых гликозидов..............................................................................................14

1.1.5. Иммуномодулирующая активность тритерпеновых гликозидов голотурий....................17

1.2. Р2Х рецепторы...............................................................................................................................25

1.2.1. Классификация пуринорецепторов.......................................................................................25

1.2.2. Строение Р2Х рецепторов......................................................................................................27

1.2.3. Физико-химические свойства Р2Х рецепторов....................................................................28

1.2.4. Распространение Р2Х рецепторов и их физиологическая роль.........................................31

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................................................35

2.1. Кукумариозид Аг-2........................................................................................................................35

2.2. Животные........................................................................................................................................35

2.3. Получение клеток...........................................................................................................................35

2.4. Определение жизнеспособности клеток......................................................................................36

2.5. Определение цитотоксической активности.................................................................................37

2.7. Измерение микровязкости мембран клеток................................................................................38

2.8. Измерение мембранного потенциала клеток..............................................................................38

2.9. Связывание 3Н-кукумариозида Аг-2 с перитонеальными макрофагами мыши.......................39

2.10. Микроцитофлуориметрическая оценка транспорта Са2+ в клетках........................................40

2.11. Регистрация трансмембранных токов в клетках методом пэтч-кламп...................................41

■ 2.12. Иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов...................................42

2.13. Исследование фармакокинетики кукумариозида Аг-2.............................................................43

2.14. МАЬОЫМв..................................................................................................................................43

2.15. МАП)1-ТОР МБ...........................................................................................................................45

к 2.16. Построение модели пространственной структуры тР2Х4 рецептора мыши и

I

\ кукумариозида Аг-2..............................................................................................................................45

2.17. Статистический анализ................................................................................................................47

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................................48

V г 11

3.1. Цитотоксическая активность кукумариозида Аг-2................................................................48

3.2. Иммуностимулирующая активность кукумариозида Аг-2........................................................51

3.3. Взаимодействие кукумариозида Аг-2 с мембранами иммунокомпетентных клеток..............52

3.3.1. Влияние на микровязкость мембран лимфоцитов селезенки мыши.................................52

3.3.2. Связывание 3Н-кукумариозида Аг-2 с перитонеальными макрофагами мыши................54

3.3.3. Влияние кукумариозида Аг-2 на мембранный потенциал перитонеальных макрофагов мыши..................................................................................................................................................57

3.4. Изучение влияния кукумариозида А2-2 на транспорт

Са в перитонеальных макрофагах мышей....................................................................................................................................................59

3.5. Влияние кукумариозида Аг-2 на функционирование пуриновых рецепторов в макрофагах.............................................................................................................................................64

3.6. Регистрация ионных токов в одиночной клетке.........................................................................69

3.7. Типирование популяции перитонеальных макрофагов мыши, принимающих участие в Са2+ ответе на кукумариозид Аг-2.......................................................................................................74

3.8. Компьютерное моделирование пространственной структуры комплекса кукумариозида Аг-2 с пуриновым рецептором Р2Х4...................................................................................................80

3.9. Исследование фармакокинетики кукумариозида Аг-2...............................................................84

3.9.1. Исследование фармакокинетического поведения кукумариозида Аг-2 в гомогенате селезенки мышей...............................................................................................................................84

3.9.2. Идентификация и количественное определение кукумариозида Аг-2 в гомогенате селезенки мыши................................................................................................................................86

3.9.3. Исследование стабильности кукумариозида Аг-2 в тканях селезенки и оценка метаболических превращений.........................................................................................................88

3.9.4. Оценка пространственного распределения кукумариозида Аг-2 методом МА1Л)1-1МБ......................................................................................................................................................89

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................................................94

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................................97

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................100

ВВЕДЕНИЕ

Тритерпеновые гликозиды голотурий изучаются на протяжении длительного времени. Установлено, что они обладают широким спектром биологической активности. Для этих соединений отмечены такие свойства, как антимикробная, хемопревентивная, иммуномодулирующая, иммуноадьювантная и противовоспалительная активности. Кроме того, тритерпеновые гликозиды обладают выраженной мембранолитической активностью, проявляющейся в микромолярном диапазоне концентраций.

Механизм мембранолитического действия этих соединений хорошо изучен и заключается в способности гликозидов изменять ионную проницаемость мембран клеток посредством взаимодействия со стеринами мембран (главным образом с холестерином) и формирования ионопроводящих структур в липидном матриксе. Вследствие образования ионных каналов и пор в мембранах нарушается ионная избирательность клеток и их ионный гомеостаз, усиливается выход из клеток жизненно важных компонентов и ингибируется ряд мембран-ассоциированных ферментов, что в итоге приводит к гибели клеток. Вероятно, что именно этим мембранотропным механизмом действия и обусловлены цитотоксическая, гемолитическая и противогрибковая активности тритерпеновых гликозидов.

В то же время известно, что в низких, нецитотоксических концентрациях, некоторые из этих соединений активируют целый ряд внутриклеточных процессов. Ранее было показано, что тритерпеновый гликозид кукумариозид Аг-2, выделенный из дальневосточной голотурии Cucumaria japónica, в наномолярных концентрациях обладает иммуностимулирующим действием, которое выражаются, главным образом, в активации клеточного звена иммунитета: усиливается адгезия, распластывание и подвижность макрофагов, усиливается фагоцитоз и формирование активных форм кислорода, увеличивается скорость пролиферации лимфоцитов, количество антител-образующих клеток селезенки, индуцируется синтез некоторых цитокинов. Введение препарата кумазид экспериментальным животным приводит к существенному увеличению их резистентности к различным патогенным инфекциям, к торможению роста некоторых видов опухолей и увеличению средней продолжительности жизни животных при облучении сублетальными дозами радиации. Результатом успешной работы ТИБОХ ДВО РАН в этом направлении является созданный на основе моносульфатированных тритерпеновых гликозидов голотурии Cucumaria japónica (главным образом, кукумариозида Аг-2) эффективный иммуностимулирующий препарат кумазид, предназначенный для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний человека и прошедший все официальные доклинические испытания.

j*

Однако, несмотря на большое количество работ, связанных с изучением физиологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, механизм их иммуномодулирующего действия на клеточном и субклеточном уровне изучен недостаточно. Имеющиеся в литературе данные об иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления ими стимулирующего эффекта. Практически полностью отсутствуют сведения о мембранных и внутриклеточных мишенях действия гликозидов, сигнальных путях и фармакокинетике этих соединений в органах-мишенях.

Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия и изучение фармакокинетического поведения тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2, выделенного из голотурии Cucumaria japónica.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. провести сравнительное изучение и установление концентрационных диапазонов цитотоксической и лизосомальной активности кукумариозида Аг-2 in vitro;

2. изучить взаимодействие кукумариозида Аг-2 с мембранами иммунокомпетентных клеток, включая исследование изменения микровязкости и мембранного потенциала под действием гликозида, а также определение мест связывания кукумариозида Аг-2 с биомембранами;

3. исследовать влияние кукумариозида Аг-2 на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и фармакологически определить природу рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са2+ ответе клеток на действие гликозида;

4. провести иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов, принимающих участие во взаимодействии с кукумариозидом Аг-2;

5. провести исследование фармакокинетического поведения кукумариозида Аг-2 в органе-мишени (селезенке мыши).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Кукумариозид Аг-2 в наномолярных концентрациях связывается с мембранами иммунокомпетентных клеток мыши и вызывает временное обратимое изменение микровязкости мембран и мембранного потенциала, сопровождающееся резким обратимым входом Са2+ в цитоплазму клеток из внеклеточной среды.

2. На мембранах макрофагов существует два сайта связывания кукумариозида Аг-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации.

2+

3. Пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са проводимость в мембранах макрофагов и активацию иммунных клеток, являются

«i

¡

It,

Ifeiv't-' ■ o¿,\'v.<\v.<,;b'' \,;¡....., 'h.'iíjf

Я' J и" i

молекулярными мишенями действия кукумариозида Аг-2, который выступает в качестве аллостерического модулятора этих рецепторов.

4. При внутрибрюшинном способе введения мышам кукумариозид к.г-2 быстро достигает максимальной концентрации в органе-мишени (селезенке) и относительно быстро выводится, практически не претерпевая метаболические превращения. Гликозид локализуется, главным образом, в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, в центральной части органа.

Научная новизна. В ходе данной работы было впервые изучено взаимодействие тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2 с иммунокомпетентными клетками мыши. Показано, что в основе иммуномодулирующего действия исследуемого природного соединения лежит его способность взаимодействовать, прежде всего, с клеточными мембранами и изменять их физико-химические свойства. Впервые показано, что кукумариозид Аг-2 обратимо увеличивает микровязкость биомембран. Такое взаимодействие приводит к обратимому изменению мембранного потенциала, деполяризации биомембран и резкому обратимому увеличению концентрации ионов Са2+ в цитоплазме за счет его поступления из внеклеточного пространства. Впервые показано, что на мембранах макрофагов мыши существуют как минимум два сайта связывания кукумариозида Аг-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации. Впервые установлено, что одними из молекулярных мишеней действия кукумариозида Аг-2 являются мембранные пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са проводимость в мембранах макрофагов и активацию клеток. Показано, что кукумариозид Аг-2 действует в качестве аллостерического модулятора пуриновых рецепторов. Связываясь с ними, гликозид усиливает ответ клеток на АТФ и частично снимает эффект десенсибилизации рецепторов. Установлено, что в перитонеальной полости мыши присутствует популяция крупных зрелых Р4/80+ макрофагов, характеризующихся наличием высокой плотности пуриновых рецепторов Р2Х1 и Р2Х4 типа. Очевидно, именно крупные Р4/80+ / Р2Х+ перитонеальные макрофаги принимают участие в Са2+ ответе на аппликацию кукумариозида Аг-2. Методами радиоспектроскопии, МА1Ю1-ТОР МБ и МАЬБЫМБ впервые изучены и определены фармакокинетические параметры поведения кукумариозида Аг-2 в селезенке мыши при внутрибрюшинном введении препарата. Обнаружено, что кукумариозид Аг-2 локализуется, главным образом, в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, в центральной части органа, где располагается красная и белая пульпа.

Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2 и углубляют существующие представления о влиянии низкомолекулярных

<

% '

^пг-ч!" »/л и ' ^ > Ь А 7л'/¡, О -V - ?

биорегуляторов на клетки иммунной системы. Фундаментальные знания, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, дают фармакодинамическую и фармакокинетическую характеристику кумазида и создают методологическую основу для изучения механизма действия новых лекарственных средств, созданных на основе тритерпеновых гликозидов голотурий.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине» (Владивосток, 2011), 9th 1ST Asia pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Владивосток, 2011), XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2011, 2012), II Международной конференции "Перспективные направления биомедицинских технологий" (г. Владивосток, 2012), Symposium on marine enzymes and polysaccarides (Нячанг, Вьетнам, 2012), 2nd Bi-Annual International Practical Cytometry Workshop (Москва, 2011), II Международной конференции "Перспективные направления биомедицинских технологий" (г. Владивосток, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2013), 2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam (Ханой, Вьетнам, 2013), 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 2013).

Личный вклад автора. Автором самостоятельно были проведены исследования цитотоксической и иммуномодулирующей активности кукумариозида Аг-2, изучено влияние гликозида на микровязкость биомембран, мембранный потенциал клеток, определены места

л

связывания Н-кукумариозида Аг-2 с биомембранами, с помощью техники флуоресцентных зондов исследовано влияние гликозида на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и проведено фармакологическое определение природы рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са2+ ответе клеток на действие гликозида, проведено иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов для определения субпопуляций клеток, принимающих участие в иммунном ответе, осуществлены необходимые расчеты и статистическая обработка данных. Исследование фармакокинетики кукумариозида Аг-2 и его пространственного распределения в селезенке мыши методом MALDI-TOF MS и MALDI-IMS выполнено совместно с к.х.н., зав.лаб. Дмитренком П.С. (лаб. инструментальных и радиоизотопных ТИБОХ ДВО РАН). Электрофизиологические исследования проводили на базе лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН (г. Пущино) совместно с с.н.с., к.б.н. Асташевым М.Е. Компьютерное моделирование осуществлено к.ф.-м.н., с.н.с., Зелепуга Е.А. (лаб. химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН).

Работа выполнена в Лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ Федерального государственного бюджетного у