Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тритерпеновые гликозиды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata) - структура, таксономическое распределение, эволюция
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Тритерпеновые гликозиды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata) - структура, таксономическое распределение, эволюция"
РГ6 од
О а ФЕВ 1993
На правах рукописи
КАЛИНИН Владимир Иванович
Тритерпеновые гликозиды голотурий (Но1оШигю1с1еа, Echinodermata) - структура, таксономическое распределение, эволюция
03.00.04 - биохимия
Автореферат
Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Владивосток 1998
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН
Научный консультант:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Стоник В. А. доктор биологических наук, профессор Васьковский В. Е. доктор химических наук, профессор Усов А. И. доктор биологических наук Дроздов А. Л. Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН
Защита состоится " ^" 199Б г. в " часов на заседании
Диссертационного Совета Д.003.99.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100-летия Владивостока, 159, ДВГИ)
Автореферат разослан
¿£_1998 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук старший научный сотрудник
О-ХЛ-О-у Прокопенко Т. И.
/У
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Интерес к тритерпеновым гликозидам голотурий (класс Holothuroidea, тип Echinodermata) во многом определяется тем, что тритерпеновые гликозиды, широко распространенные в растениях, в животном мире характерны только для голотурий (Habermehl, Krebs, 1990) и лишь иногда встречаются в губках. После хроматографических скрининговых работ, выполненных в середине семидесятых годов в Тихоокеанском институте, биоорганической химии, стало ясно, что эти вещества обладают таксономической специфичностью и, следовательно, имеются перспективы для их использования в качестве химических признаков в систематике голотурий (Elyakov et al., 1973, 1975). Тем не менее, к началу наших исследований были опубликованы достоверные данные только о двух полных структурах гдикозидов из голотурий отряда Aspidochirotida. Недостаточность структурной информации об этих веществах тормозила их использование в качестве таксономических маркеров голотурий и затрудняла исследование зависимости биологической активности этих веществ от их химического строения.
Тритерпеновые гликозиды голотурий достаточно сложны по химическому строению, а irx структуры варьируют по многим относительно независимым признакам: числу и расположению двойных связей, гидроксильных, ацетатных и других функциональных групп в агликоне, а также по числу, положению и природе моносахаридных остатков, числу и положению сульфатных групп в углеводных цепях. Эти вещества специфичны для подсемейств, родов и (в некоторых таксонах) видов голотурий. Они обладают мощным мембранолитическим действием, связанным с образованием комплексов с А5-стерпнами мембран клеток-мишеней (Лнисимов, 1987). Это обуславливает широкий спектр их биологической активности, в том числе сильное ихтиотокспческое действие, которое является следствием повреждения жаберных капилляров рыб (Nigrelii. Jakowska, i960) и способствует эффективной защите
голотурий - малоподвижных животных, как правило, мяготелых лишенных жеыткого скелета, против хищных рыб.
Эти обстоятельства, а также хорошая таксономическая изученности класса Но1оишпо1с1еа, делают гликозиды голотурий уникальным модельным объектом для исследования общих закономерностей эволюции вторичных метаболитов.
В основе настоящего исследования лежит предположение, что сравнение особенностей строения гликозидов в тех или иных таксономических группах позволяет выявить основные тенденции в эволюции этих веществ. Мы полагаем, что такая эволюция шла с усилением защитного ихтиотокспческого действия. Измерение мембранолитической активности, в таком случае, могло помочь проверить филогенетические гипотезы, а также определить движущие силы эволюции гликозидов и уточнить ее ход.
Целью настоящей работы являлось выявление основных тенденций эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий и сопоставление их с известными общеморфологическими закономерностями эволюции живых организмов.
Для этого проводилось изучение структуры гликозидов из химически малоисследованных представителей отрядов Азр1с1ос11Ногк1а и Оепс1гос1игоПс1а, изучалась возможность использования полученных и литературных данных дня целей систематики и филогении голотурий, исследовалась зависимость мембранолитической активности гликозидов от особенностей их структуры.
Научная новизна исследования состоит в определении полной химической структуры девяти новых тритерпеновых гликозидов голотурий, а также в обнаружении пяти известных тритерпеновых гликозидов в неизученных ранее животных. Впервые были выделены представители новых структурных групп гликозидов голотурий, а именно, вещества, содержащие 18(16)-лак10н в агликоне, а также гликозиды с 18(16)-лактоном и укороченном боковом цепыо.
На основе полученных и литературных структурных данных выполни) анализ таксономического распределения тритерпеновых гликозидов в классе Но1оишпо1с1еа, подтвержден сделанный ранее с помошыо хроматографии вывод о таксономической специфичности гликозидов голотурии. Полученные
результаты позволили обсудить филогению семейств ЯпсИоросШае и НокнишМае, провести ревизию рода ВокасксЫа семейства Но1оиш1'ис!ае с выделением нового рода Репкопо11шгт, а также сделать вывод о таксономической обособленности северо-тихоокеанских стихоподид.
Обнаружена направленность и гомологическая изменчивость в эволюции глпкозидов голотурий, что позволяет предсказывать структуры неизвестных в настоящее время соединений и, в определенной мере, их таксономическую локализацию. Выявлены основные направления эволюции как агликонов, так и углеводных цепей гликозидов.
Для уточнения выявленных закономерностей эволюции гликозидов исследована гемолитическая активность специально полученной нами серии из 24 гликозидов и их производных.- Установлена зависимость мембранолитического действия гликозидов голотурий от особенностей строения агликона, числа моносахаридных звеньев углеводной цепи, характера ее разветвления, числа и положения сульфатных групп в углеврдной цепи, а также наличия или отсутствия З-О-метильной группы в терминальном моносахаридном остатке.
Предложен новый подход к исследованию эволюции биомолекул, заключающийся в использовании для этой цели морфологических методов и концепций. На примере гликозидов голотурий показано, что нижним пределом морфологического анализа является не клеточный, как считаюсь большинством морфологов, а молекулярный и даже субмолекулярный уровень.
Эволюция структур и функций тритерпеновых гликозидов проанализирована с помощью концепции модусов органогенеза, ранее применявшейся почти исключительно в сравнительной анатомии. Для глпкозидов голотурий выявлены случаи эволюции но модусам интенсификации функций, расширения функций, субституции функций, субституции органов, компенсации функций и др. На примере эволюции гликозидов выявлен новый модус - "стабилизация функций эволюционной блокировкой".
На основании системно-теоретического (холистского) подхода к описанию морфо-функциональных комплексов живых организмов, развиваемого школой
Ван-дер-Клааува - Дуллемейера, предложен метод графического неколичественного моделирования структурно-функциональных отношений биомолекул, позволяющий описывать зависимость биологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий от особенностей их строения и предсказывать изменения такой активности при структурных модификациях молекул.
Глубокое внутреннее сходство процессов биосинтеза и онтогенеза, позволило применить к анализу эволюции биосинтеза гликозидов голотурий теорию филэмбриогенезов. Для гликозидов голотурий прослежена эволюция их биосинтеза по таким модусам, как анаболии, девиации, а также гетерохронии и гетеротопии.
На основании филогенетической интерпретации хемотаксо комических данных по тритерпеновым гликозидам голотурий предложена общая процедура применения морфологических закономерностей эволюции для конструирования и поляризации структурных филогенетических рядов биомолекул.
Сопоставление выявленных эволюционных тенденций гликозидов с данными по их мембранолитиченской активности, проведенное методами морфо-функционального анализа, позволило подтвердить эти тенденции и показало адаптивный характер эволюции гликозидов, в ходе которой увеличивалась их мембранолитическая активность и улучшались транспортные свойства при уменьшении «метаболической стоимости» их биосинтеза.
Эти основные положения исследования выносятся на защиту.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на У-м и У1-м Всесоюзных симпозиумах по иглокожим во Львове (1983 г.) и Таллинне (1987 г.). на VI 1-й молодежной конференции по синтетическим и природным физиологически активным соединениям в Ереване (1984 г.), на 8-й конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии в Риге (1991 г.), а также на 210-й национальной конференции Американского химического общества в Чикаго (1995 г.)
Публикация результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в 24 статьях в таких научных журналах, как "Химии
природных соединений", ''Биология моря", "Вестник ДВО РАН", "Журнал общей биологии", "Journal of Natural Products (Lloydia)", "Journal of Natural Toxins", "Toxicon" и "Journal of Theoretical Biology". По результатам работы опубликованы также монография и глава в международном сериальном издании "Echinoderm Studies".
Кроме того, в виде тезисов отдельные части работы опубликованы в материалах Всесоюзных и Международных симпозиумов и конференций.
Структура диссертации. Диссертация включает Введение, Краткий литературный обзор, в котором рассмотрено установление полной структуры гликозидов голотурий и исследование их биологической активности, причем главное внимание уделено работам, предшествующим настоящему исследованию. Основной раздел диссертации посвящен изложению и обсуждению результатов, полученных при химическом изучении тритерпеновых гликозидов голотурий и исследовании гемолитической активности специально полученной серии веществ. В нем обсуждается использование тритерпеновых гликозидов в систематике и филогении голотурий, а также использование морфологических методов и закономерностей к изучению эволюции гликозидов. В Экспериментальной части описаны основные методики, использованные в работе. Завершают диссертацию Выводы и Список цитированной литературы. Диссертация изложена на 2S9 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц. Список литературы включает 297 цитируемых работ.
Автор выражает искреннюю признательность за критические замечания и полезные рекомендации сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН академику РАН П. Г. Горовому, к.х.н. О. Б. Максимову, д.б.н. М. ¡VI. Анисимову и д.б.н. В. В. Михайлову, сотрудникам ЗИН РАН к.б.н. А. В. Смирнову и к.б.н. Е. Н. Грузову. а также к.б.н. А. Н. Малютину (ИБМ ДВО РАН) и д.б.н., профессору М. Г. Пименову (Ботанический сад МГУ). Мы хотели бы особо отметить ценные рекомендации д.б.н., профессора Н. Н. Иорданского (ИПЭЭ им. А. Н. Сеперцова РАН), касающиеся методологии анализа структурно-функциональных отношений гетерогенных адаптивных комплексов.
Автор благодарит сотрудников ТИБОХ ДВО РАН д.х.н. Т. Н. Макарьеву, к.х.н. С. А. Авилова, к.б.н. Н. Г. Прокофьеву, н.с. Г. Н. Лихацкую, м.н.с. Е. Б. Щенцову, м.н.с. О. А. Дроздову, выполнивших ряд экспериментов, а также к.х.н. А. И. Калиновского, к.х.н. В. В. Исакова, к.х.н. Ю. Н. Елькина, и н.с. П. С. Дмитренка за помощь в получении и обработке спектральных данных и д.б.н. В. С. Левина, выполнившего сравнительно-морфологические исследования ряда изученных голотурий.
1. Установление полных структур гликозидов голотурий.
1.1. Установление структуры голотурина Ао из голотурии ЯоЫшпп е(/и/13
Основной компонент фракции, голотурии Ат (1) при кислотном гидролизе дал агликон (2), идентифицированный по УФ-спектру (А.тах 237, 244, 252 нм), спектру ЯМР 13С и физическим константам с заведомым голоста-7(8),9(11)-диеп-Зр,17а-дпол1)м (2). Моносахариды в гидрелизате определили как ксилозу, хиновозу, З-О-метилгдюкозу и глюкозу (Г.1:!:1) методом ГЖХ-МС в виде
перацетатов альдононитрилов. Гидролизат дал положительную пробу на сульфат-ион с ВаСЬ.
В спектре (1) имеются характерные для 12а-окси-9(11)-енового фрагмента сигналы при 154,1 (с, С-9), 115,7 (д, С-II), 71,7 (д, С12) м.д., следовательно (I) является сульфатированным тетраозидом голоста-9(11)-ен-Зр,12а,17а-триола. Сольволизом смесью пиридин-диоксан получили десульфатированное производное (3). Метилирование (3) по Хакомори с последующим метилированием и ацетилпрованием привело к набору соответствующих а- и |S-мешлгликопиранозидов, метилированных и частично ацетилированных в соответствии со структурой (3) и идентифицированных ГЖХ-МС. При периодатном окислении (3) разрушились ксилоза и хиновоза, а при окислении (1) - только остаток хиновозы.
Полученные результаты показали, что углеводная цепь (1) является неразветвленной, З-О-метилглюкоза занимает концевое положение, а сульфатная группа присоединена к ксилозе. Положение сульфатной группы при С-4 в ксплозном остатке установлено сравнением спектров ЯМР |3С (1) и (3). Сигнал метиленового углерода С-5 ксилозного остатка при 64,1 м.д. в спектре (1) смещается к 66,5 м.д. при десульфатировании, что характерно для ß-эффекта сульфатной группы. Соответствующие сдвиги претерпевают сигналы С-3 (+1,6 м.д.) и С-4 (-4,5 м.д.). Сигналы аномерных углеродов при 104,5 105.2, 105,0 и 104,6 м.д. указывают на ß-конфигурацию гликозидных связей.
При периодатном окислении (I) разрушается хиновоза, а при деградации по Смиту и последующем десульфатировании образуется прогенин (4). Следовательно, к агликону присоединена ксилоза, а к ней, в свою очередь -хиновоза. Терминальный моносахарид по данным метилирования - З-О-метилглюкоза, п. следовательно, к хиновозе присоединен остаток глюкозы. Катион при сульфатной группе как аммоний определен реакцией Несслера. Сравнение спектров ЯМР 13С глпкозпда (I) и модельного агликона .(2) показало, что углеводная цепь присоединена к положению 3 агликона, так как сигнал С-3 (89,-1 м.д.) и спектре глпкозпда сдвинут в слабое поле по сравнению с сигналом Г-Ч (7S.2 м.д.) гешша (2).
Таким образом, структура голотурина Ат была определена как 3-0-|3-0-метил-р-0-гл10Копиранозил-(1-^3)-р-0-глюкопиранозил-(1->4)-р-0-хипово-пиранозил-(1—>2)-4-0-аммоний сульфат-р-0-ксилопиранозил|-голост-9( 11]-ен-3[М2а,17а-триол.
1.2. Установление структуры псолюсозидов А и В из голотурии Рхо/и.ч/аЬпсп.
Основной компонент гликозидной фракции, псолюсозид А (5). дал при кислотном гидролизе сумму агликонов (6) и (7), в ЯМР 13С спектре которой наблюдаются сигналы двух двойных связей в боковой цепи, а именно: 24(25) при 123,3 (с-24,д) и 132,0 м.д. (С-25, с), а также 25(26) - при 145,2 (С-25,с) и 110.5 м.д. (С-26, т).
Гидрирование суммы (6) и (7) привело к (8), идентифицированному по ЯМР 'Н и масс-спектрам с известным голост-9(11)-ен-Зр-ол-16-оном (голотокспногенином). Моносахариды в гидролизате определили как ксилозу, хиновозу, З-О-метилглюкозу и глюкозу (1:1:1:1).
Поскольку сигналы агликонной части в спектре (5) совпали с соответствующими сигналами известного ранее голотокспна А|. агликоном которого является (6), следовательно, псолюсозид А является гетраозидом голоста-9( I 1),25(26)-диен-Зр-ол-16-она.
Результат сольволитического расщепления псолюсозида А, при котором получили десульфатированное производное (9), свидетельствовал о наличии сульфатных групп. Сравнение спектров ЯМР 1:'С (5) и (9) показало, что таких групп две и присоединены они к положениям С-6 остатков глюкозы и 3-0-метплглюкозы. Протпво-пон при сульфатных группах был определен как натрий методом лтмно-абсорбционнйи спектроскопии.
СНгСЖ (?СН>/
СНгОЯ
НО
СНз
)—О
5. 1*=50з№,
9. 1*=н, ^¿О^у
10. ^н, ^-К^/у
.....................►
Метилирование (9) с поелеЛугощим метанолизом и ацетилированием привело к набору продуктов, идентичных таковым, полученным в результате метилирования десульфатированного голотурина А2 (3). При мягком кислотном гидролизе гидрированного производного (10) получили агликок (8) и прогекпны (11), (12) и (13), строение которых подтверждали данными спектров ЯМР |3С и ЯМР 'Н высокого разрешения и моносахаридным анализом. Сигналы аномерных атомов углеродов при 104,0, 104,5, 103,1 и 103,9 мл. в спектре ЯМР |3С (5) указывали на [З-конфш урацшо гликозидных связей.
Исходя из вышеописанных данных структура псолюсозща А определена как 3-0-| б'-О-натрнй сульфат-3-0-метил-Р-0-глгокопиранозил-(1->3)-6"-0-натрнй сулы1лат-р-0-глюкопиранозил-(1—>4)-p-D-xинoвoпиpaнoзил-([->2)-fЗ-D-кcи^югIпp;uloзнлl-гoлocтa-9(l 1),25(26)-диен-Зр-ол-16-он. Ранее гликозиды с двумя сульфатными группами ни в животных, ни в растениях не находили.
Кроме того, из гликозидной суммы Р. fabrica мы выделили также минорный компонент, названный псолюсозидом В (14). При мягком кислотном гидролизе его гидрированного десульфатированного производного (15) 2 н серной кислотой в присутствии бутанола получили генин, названный онекотаногенином (16).
Сравнение ЯМР 'Н спектров онекотаногенина и модельного полусинтетического производного (17), полученного ранее из гликозидов Cucumnria japónica, показало совпадение химических сдвигов и констант спин-спинового взаимодействия Н-За, Н-7, H-9ß, Н-15а, H-15ß, Н-16, CHj-31, СН3-32. Сдвиги сигналов СНз-21 и Н-17 на 0,16 и 0,47 мл., соответственно, в слабое поле в ЯМР 'Н спектре (16) по сравнению с (17) можно объяснить влиянием ацетшшрования гидроксила при С-20. Этим обстоятельством объясняется сдвиг сигнала С-20 в спектре ЯМР|3С онекотаногенина (16) к S4,2 м.д. от 72 м.д. в спектре модельного известного ранее производного (IS).
Для окончательного доказательства структуры онекотаногенина мы провели его химическую корреляцию с ранее известным агликоном (19), для которого имелись данные рентгеносггруктурного анализа. Восстановление алюмогидридом лития с последующим ацетилированием как (16), так и (19) привело к общему продукту (20). Таким образом строение онекотаногенина определено как (16).
Сравнение спектров ЯМР |3С псолюсозида В (14), о котором наблюдаются сигналы С-25 (144,8 м.д.) и С-26 (110,4 м.д.), свидетельствующие о наличии 25(26)-двойной связи, со спектром онекотаногенина показало, что нативным генином является - 25(26)-дегидропроизводное онекотаногенина (21).
Моносахариды псолюсозида В (14) были определены как ксилоза -глюкоза (1:3), FAB масс-спектр (14) содержит интенсивный ион M"-Na-H при 1209 m/z, подтверждает данные моносахаридного анализа.
После сольволиза нагреванием в смеси ппридин-диоксан (14) дал десульфатированное производное (22), в FAB масс-спектре которого присутствует пик М'-Н при 1129 m/z, указывающий на наличие только одной сульфатной группы.
Метилирование (22) по Хакомори с метанолизом и ацетилированием дали набор а- и (З-метилгликопиранозидов, соответствующий структуре 14. При периодатном окислении (14) все глкжозные остатки разрушились. Из этих результатов следовало, что углеводная цепь в (14) разветвлена по ксилозе, а на ее концах находятся остатки глюкозы.
24. я
21
СИ, он
14 (^ЭО^а 22
27. ^ =Э0зМа
1............- 23
о^он
|
н 1
Последовательность моносахаридных звеньев определили, изучив продукты мягкого кислотного гидролиза (15). Получили прогенины (23), (24) и (25), содержащие глюкозу и ксилозу в соотношениях 1:1. 2:1 и 2:1. соответственно. Деградация но Смиту гидрированного псолюсозида В (27),
приведшая к моноксилозиду (26), показала, что к агликону в псолюсознде В присоединена ксилоза.
Результаты метилирование прогенинов (23), (24) и (25) с последующим метанолизом и ацетилированием позволили однозначно определить последовательность моносахаридных звеньев в (14). Строение всех прогенинов было также подтверждено данными спектров ЯМР |3С. Сигналы аномерных атомов (14) в ЯМР 13С спектре однозначно указывали на р-конфигурацию гликозидных связей.
ОАс
Рис. 1. Фрагментация псолюсозида В (FAB масс-спектр)
Положение сульфатной группы при С-6 одного из глюкозных остатков доказывали сравнением ЯМР |3С спектров (14) и (22), а также химически. Для этого провели ацетилирование (14) с последующим сольволитичсским десульфатированием, метилированием диазометаном в присутствии В Fj и кислотным гидролизом, в продуктах которого, в виде перацетата альдононнтрила ГЖХ-МС идентифицировали 6-О-метилглюкозу. Противоион определили как натрий. Положение сульфатной при терминальном остатке глюкозы верхней полуцепи однозначно следовало из фрагментации псолюсозида В в FAB'"^ масс-спектре.
Таким образом, полное строение псолюсозида В установлено как 1S(I6)-лактон-З-О-! |р-0-глюкопиранозил-(1->4)-Р-0-глюкопиранозил-(1->2)|-|6-0-сульфат-р-0-глюкопиранозил-(1—>4)|-р-0-ксилопиранозил }-208-ацетокси-голоста-7(8),25(26)-диен-Зр-ол (14). Псолюсозид В был первым гликозидом неголостановой природы из голотурий с установленной полной структурой.
1.3. Гликозиды голотурии Psolus eximius
Химические сдвиги агликонной части в ЯМР |3С и 'Н-спектрах эксимисозида A (2S) - основного компонента гликозидной фракции Pso/us eximius, соответствовали таковым в спектрах кукумариозида G4 (42) из Eupentacm fmudntrix, структура которого была установлена нами ранее (см. раздел 1.4). Действительно, в спектре ЯМР |3С наблюдались сигналы при 120,6 м.д. и 145,6 м.д., соответствующие 7(8)-двойной связи, сигналы 1бр-ацетокси группы (170,0 м.д. и 21,3 м.д.). Сигналы С-23 (144,1 м.д.) и С-24 (120,0 м.д.) указывали на наличие двойной связи в боковой цепи, а резонансы С-25 (69,9), а также метальных групп С-26 (30,0) л С-27 (30,7) указывали на наличие гидроксильной группы при С-25.
он
о
28
В 'Н ЯМР спектре (28) также наблюдались сигналы, соответствующие 7(8)-двойной связи (5,65 м.д.), ацетатной группе (1,98 м.д.) и терминальным метильным группам боковой цепи, содержащей гидроксил при С-25 (1,53 м.д.). В этом спектре также наблюдались сигналы изолированной четырехспиновой системы ABXZ, в которой два протона (Н-22 и Н-22') относятся к метиленовой группе XZ, два других - к протонам при двойной связи (Н-23 и Н-24) с константой спин-спинового взаимодействия 15,5 Гц, указывающей на трансконфигурацию двойной связи в боковой цепи. 'Н-'Н COSY. HMQC, и NOESY спектры подтвердили отнесения сигналов протонов и углеродов в ЯМР спектрах и относительную стереохимию всех хиральных центров в агликоне. Следовательно, агликоном гликозида (2S) является 1бр-ацетоксиголоста-7..23Е-диен-Зр,25-диол.
Резонансы атомов углерода углеводной цепи (2S) в спектре ЯМР |3С совпали с соответствующими сигналами в спектрах теленотозида В из голотурии Thelenota ananas, структура которого была установлена ранее, и прогенина, полученного при ферментативном гидролизе стихопозида D из голотурии Stic/ioptis vnriegati/s, что указывало на идентичность углеводных цепей этих веществ и эксимисозида А (28).
Сигнал 1153 (M + Na) в FAB масс-спектре (28) соответствовал наличию глюкозы, ксилозы и З-О-метилглюкозы в соотношении (1:2:1) в углеводной цепи (28) и ацетоксиголостадиенола в качестве его агликона. Последовательность моносахаридных остатков в углеводной цепи (28) подтверждалась фрагментацией в FAB<+) масс-спектре (Рис. 2). Действительно, в спектре наблюдались ионы, соответствующие распаду иона с 1153 m/z (M+Na) путем последовательного отрыва моносахаридных звеньев, начиная с терминального (m/z 977, 959, 845. S27, 6S3, 665, 533), а также пики, соответствующие фрагментам углеводной цепи (m/z 331, 314, 493, 625) (рис. 2).
На основании всех вышеприведенных данных структура эксимисозида А (28) определена как 3-0-|3-0-метпл-р-0-глюкош1ранозпл-( I >3)-|5-D-
ксплопиранозил-(1-^4)-р-0-глюкопира1юзил-(1->2)-р-0-кс>шопиранозил|-16р-ацетоксиголоста-7,23Е-диен-Зр,25-диол.
1153 (M+Na) 1093(M+Na-CH3COOH)
НО-1 ->-1005
ОН (+Na>
579(+Na) у 665{-H +Na) У 683(+H+Na)
959(-H+Na) 4 977(+H+Na)
Рис. 2. Фрагментация гликозида (2S) в положительном FAB'+> масс-спектре.
Глюкоза в качестве второго моносахаридного остатка и 23(24)-двойная связь в агликоне являются достаточно редкими структурными чертами глнкозидов голотурий.
1.4. Гликозиды голотурии Eupentacta pseiuloqiiinqtiesemita
Кукумарнознд Н (29) - основной компонент гликозидной суммы, при кислогном гидролизе дал ксилозу, хиновозу. глюкозу и З-О-метилксплозу (2:1:1:1) и обнаружил максимум поглощения в УФ-спектре при 240 нм. В его
ЯМР |3С спектре сигналы агликонной части были идентичны, а сигналы углеводной цепи близки к сигналам кукумариозида С2 (30) из Е./гаш1а!пх.
Сольволитическое десульфатирование (29) смесью пиридин - диоксан (1:1) показало наличие в (29) сульфатной группы И привело, к. известному соединению (30), идентифицированному по ЯМР 13С спектру и физическим константам. Положение сульфатной группы установили сравнением ЯМР 13С спектров (29) и (30), противоион при сульфатной группе определили как натрий.
Таким образом структура кукумариозида Н (29) определена как 16р-ацетокси-3-0-{|3-0-метил-р-0-ксилопиранозил-(1->3)-Р-0-глюкопиранозил-(1->4)|-|р-0-ксшюпираноз;1Л-(1->2)]-р-0-хиновопиранозил-(1—>2)-4-0-натрий сульфат-р-0-ксилопиранозил}-голоста-7,22,24Е-триен-Зр-ол.
1.5. Гликозиды из Еиремасм/гти1ппгх
МаОзЭ
он
Мягкий гидролиз минорного гликозпда из Е. /гпш/аигх кукумариозида С> (31) в системе 2 н серная кислота - толуол и последующее ацетилппование привел» к получению ацетилированного производного (32). Мы назвали гении
(33), который лежит в основе соединений (31) и (32), посьетогенином в соответствии с местом сбора Еfrmulatrix.
Химические сдвиги Н-7, Н-9(3, Н-15, Н-16, Н-17, СН3-10, СН3-4р, СНз-4а и CHj-14 в 'Н Я1МР спектре (32) подобны аналогичным сдвигам в спектре онекотаногенина (16) - 25,26-дигидропроизводного агликона псолюсозида В. выделенного нами ранее из голотурий, относящихся к роду Psoh/s. Эксперименты ЯЭО с облучением сигнала при 1,38 м.д. (СНз-14) привели к усилению сигналов при 2.S9 м.д. (Н-17) и 5,55 м.д. (Н-7), демонстрируя присутствие 7(8)-двойной связи. Нулевое значение J|6,i7 соответствовало таковому для онекотаногенина. Химический сдвиг Н-16 свидетельствовал в пользу присутствия 18(16)-лакгона. Сигналы для СНз-20 (5 1,76 д), Н-22 (5 4,90, м) и Н-22' (5 4,95, м) были характеристичны для изопропенильного фрагмента в (32).
Сигналы от С-1 до С-19 и сигналы от С-30 до С-32 в спектре ЯVII' |3С глпкозида (31) соответствовали аналогичным сигналам в спектре полпцпклической системы псолюсозида В. Три сигнала, наблюдавшиеся при 139.9. 113,9 и 21,9 м.д. и не относящиеся к ланостановой циклической системе с 18( 16)-лактоном, свидетельствовали о присутствии изопропенильной группы к
качестве боковой цепи. Количество сигналов в |3С ЯМР спектре агликонной части (31) демонстрировало присутствие 25 атомов углерода. Сравнение этих спектральных данных с аналогичными для (26) позволило предположить, что изопропенильная группа должна быть присоединена к С-17. Предлагаемая структура (33) для посьетогенина подтверждалась также пиком молекулярного иона при m/z 426 в масс спектре ацетата (32).
Рис. 3. Фрагментация гликозида (31) в LSItvlS(+> спектре
Гликозид (31) дал при кислотном гидролизе D-ксилозу, D-глюкозу, D-хиновозу и D-3-О-метилксилозу (1:1:1:1). Сольволпз (31) дал десульфатнрованное производное (34). Положение сульфатной группы при С-4 первого ксилозного остатка определили сравнением спектров ЯМР lJC гликозида (31) и производного (34).
Пик при m/z 1095 |М№1+№|+ в спектре LSIMS(+\ анализ данных-ЯМР и моносахаридный анализ полностью подтвердили присутствие четырех моносахаридных остатков, сульфатной группы и посьетогенина (33) в качестве натнвного агликона в гликозиде. Все сигналы углеводной цепи в спектре ЯМР
|!С гликозида (31) были идентичны сигналам известного ранее кукумариозида 0|, выделенного ранее из Е. /тиНШгЬс, и соответствовали организации углеводной цепи, показанной формулой (31).
Рис. 4. Фрагментация десульфатированного производного (34) в ЬЗМБМ спектре
Для подтверждения последовательности моносахаридных звеньев мы провели деградацию по Смиту гликозида (31). В результате мы получили прогенин (35), содержащий ксилозу, и биозидное производное (36), содержащее З-О-метнлксилозу и глюкозу (1:1). Эти данные в комбинации с данными ЯМР ПС спектра однозначно подтвердили структуру углеводной цепи (31). Кроме того, последовательность моносахаридных остатков была доказана фрагментациями в Ь51М8(+) и Ь51М5<"> спектрах (31) и (34) (Рис. 3 и 4).
Таким образом, структура кукумариозида во (31) установлена как 18'(16)-лактон-23,24,25,26,27-пентанор-3-0-|3-0-метил-р-0-ксилопиранозил-(1->3)-р-0-гл!окопнранозил-(1—>4)-р-0-хиновопиранозил-( 1—>2)-4'-0-натрпй сульфат-р-0-ксплоппраиозил|-ланоста-7(8),20(22)-диен-3р-ол.
Гликозиды с 18(16)-лактоном и укороченной боковой цепью в агликоне не были ранее выделены из голотурий, и таким образом гликозид (31) является представителем новой серии гликозидов голотурий.
Минорный кукумариозид вз (39) из Е /гти1а1гих также являлся сульфатированным тетраозидом. Из сравнения ЯМР |3С спектров кукумариозпда 03 (39) и известного ранее кукумариозпда (37) и ж десульфатированных производных (41) и (40), соответственно, следовало, что эти вещества имеют идентичные углеводные цепи и различаются только строением агликопов. С другой стороны, сигналы апшконных частей кукумариозпда О] (39) в спектрах ЯМР '-С и 'Н и кукумариозпда С|, выделенного ранее из той же гологурии и имеющего в качестве аглпкона 1бр-ацетокси-голоста-7,222,24-триен-3|3-ол. полностью совпали. На основании этих данных был сделан вывод, что строение кукумариозпда Оз соответствует формуле (39).
Для подтверждения этого вывода из десульфатированного кукумариозпда Оз (40) получили тетрагидроиропзводное (38), идентичное по своим физико-химическим и спектральным характеристикам, а также данным моносахарпдного анализа гидрированному десульфатированному производному известного кукумариозпда С).
Н(
он
он
он
Таким образом, кукумариозид G3 (39) является З-СНЗ-О-метил-ß-D-ксилопиранозил-(1->3)-р-0-глюкопиранозил-(1->4)-р-0-хиновопиранозил-(1->2)-4'-0-натрий сульфат-р-0-ксилопиранозил|-16(3-ацетоксиголоста-7.222,24-триен-Зр-олом.
Кукумариозид G3 - первый морской тритерпеновый гдикозид, содержащий как диеновую систему в боковой цепи, так и четное количество моносахаридных звеньев.
В масс-спектре LSliVlS'+) минорного гликозида кукумариозида G4 (42) наблюдаются пики ионов с m/z '233 (Мк+Н)+, ¡239 (MNn+Na)+, 1255 (Мма+К)+. После добавления в глицериновую матрицу NaCl в этой области проявляется только пик иона с m/z 1239. Сравнение массы этого иона с массой иона (M|sja+Na)+ в спектре кукумариозида G; (37) в режиме высокого разрешения показало, что составы этих ионов отличаются на атом кислорода. Следовательно, в брутто-формуле кукумариозида G4 на один атом кислорода больше, чем в брутто-формуле кукумариозида G|.
Строение агликоннон части кукумариозида G4 (42) определено сравнением спектров ЯМР |3С (42), его десульфатированного производного (43) и кукумариозида G| (37). Сигналы С-1 - С-21, С-30 - С-32 близки или совпадают в спектрах этих соединений, что говорит об идентичности строения полпциклнческого фрагмента агликонов этих гликозидов. Этот вывод подтверждается и совпадением соответствующих сигналов в спектрах ЯМР 'Н (42) и (37). В спектре ЯМР L!C (42) имеются также шесть сигналов атомов углерода, принадлежащих к боковой цепи агликона: два из них соответствуют углеродам, соединенным двойной связью |!43,5 (д) и 120,2 (д) м.д.|, один принадлежит атому углерода, связанному с гидроксильной группой 169,9 (с) м.д.|, два сигнала соответствуют метильпым группам 130,0 (к) и 30,1 (к) м.д.| и один сигнал - атому углерода СРЬ-группы |41,6 (т) м.д.|.
В спектрах ЯМР 'Н, кроме 6Н синглета при 1,53 м.д., соответствующего двум метальным группам, наблюдается изолированная четырехспиновая система типа АВХ2, в которой два протона относятся к метиленовой группе (Х2.), а два других - к протонам при двойной связи. Константоа спин-спинового взаимодействия 15,5 Гц двух последних протонов говорит об их трансконфигурации. Этим данным соответствуют два варианта строения боковой цепи агликона: А или Б. Спектр (42), в котором имеются пики с т/г 551
(Аё10Н + №)+ и 533 (551-Н20)+, подтверждает, что агликон кукумариозида является ацетокси-голостадиендиолом.
В спектре ЯМР |3С холеста-7,22Е-диен-3[3-ола наблюдается сигнал С-24 при 42,0 м.д. В случае гидроксилирования этого вещества по С-25 (вариант Б дли боковой цепи), произошел бы сдвиг сигнала С-24 в слабое поле на 4-5 м.д. В то же время в спектре кукумариозида 04 значение 41,6 м.д. для сигнала метилепового углерода в боковой цепи свидетельствует о том, что этот сигнал следует отнести к С-22 и, следовательно, строение агликона соответствует формуле (42) (вариант А для боковой цепи).
Рис. 5. Фрагментация кукумариозида G4 (42) в LSIMSM спектре (в массовых числах осколочных ионов учтено наличие атома натрия вместо водорода)
Кислотный гидролиз (42) дал смесь ксилозы, хиновозы, глюкозы и 3-0-метплглюкозы в соотношении 1:1:1:1, идентифицированных ГЖХ в виде перацетатов альдононитрилов. Сравнение спектров ЯМР |3С углеводных частей кукумариозидов G4 и G;, а также их десульфатированных производных, позволило сделать вывод об их полной идентичности. Этот вывод подтвердили масс-спектрометрпческпмп данными. Так, в спектре LSlMS(+) гликозида (42) (рис. 5) имеется пик иона (1239-SÜ3Na+ Н)+ с m/z 1137, распадающегося далее путем альтернативного, либо последовательного удаления углеводных шеньев, начиная с терминального (m/z 991, S29, 6S3, 551). В спектре присутствуют также пики, соответствующие фрагментам углеводной цепи (m/z 609, 477, 331).
Таким образом, структура кукумариозида G4 (42) определена как 3-0-| 3-0-мстил-[!-0-ксилопиранозпл-(1 —>3)-р-0-глюкопиранозпл-( I ->4)-(i-D-
хиновопиранозил-(1->2)-4'-0-иатрий сульфат-р-0-ксилопиранозил|-1бр-
ацетоксиголоста-7,23 Е-диен -Зр ,25-ол.
1.6. Гликозиды голотурии Р5е1Шоз11С.Иорш ¡гасЛш
Основным компонентом гликозидной фракции является п,севдостихопозпд А (45).
Сравнение его ЯМР 13С спектра со спектром модельного производного (44), полученного ранее при изучении стихопозида Е из голотурии ЗЧскориБ сЫогопо1ш, показало хорошее совпадение дая сигналов атомов углерода С-1 - С-16 для обоих соединений, однако в спектре (45) имелся сигнал 210,5 м.д., указывающий на наличие кето-группы в боковой цепи.
Кроме того, в спектре (45) обращал на себя внимание сдвиг сигнала С-20 в слабое поле до 89,3 м.д. Аналогичный сигнал в спектре 7(8)-ненасыщенного голостанового производного (44) наблюдается при 83,7 м.д. Соответственно, сигнал С-17 в спектре (45) находится при 52,8 м. д., тогда как в модельном соединении (44) - при 54,4 м.д. Такие сдвиги объясняются а- и р-эффектами кетогруппы, если предположить, что она занимает положение 22.
Для подтверждения нашего предположения о структуре агликона псевдостихопозида А как голост-7(8)-ен-Зр-ол-22-она (50) мы получили этот агликон вместе с прогенинами (47) и (48) при мягком кислотном гидролизе (45) в системе 2 н серная кислота - бутанол. В спектре ЯМР 'Н (50) наблюдались сигналы олефинового протона при 5.57 м.д. (Н-7) и карбинильного протона при 3,21 м.д. (Н-3), связанные с 7(8) положением двойной связи и Зр-положением гидроксигруппы, соответственно. Положение Зр-гидроксигруппы подтвердили сравнением ЯМР 'Н спектров (50) и продукта его окисления по Джонсу (51). В спектре продукта окисления (51) сигналы протонов С-30 и С-31 метилъных групп смещаются в слабое поле и сближаются, что характерно для ланостановых и голостановых производных.
ЯМР 'Н спектроскопические эксперименты также позволили исключить для соединения (50) 24-положение кетогруттпы. Действительно, при облучении частотой, соответствующей резонансу CH-j-26 и СНз-27, был выявлен мультиплетный сигнал Н-25 при 1,55 м.д. Его сильнопольное положение указывает на отсутствие карбонильной группы при С-24. Масс-спектр (50) (М+ 470 m/z) в качестве наиболее интенсивного сигнала имеет пик с m/z 99, образующийся, очевидно, за счет С-20 - С-22 разрыва, что вполне определенно указывает на присутствие кетофункиии при С-22.
Мы провели также химическую деградацию агликона (50). Генин (50) восстановили алюмогидридом лития, а затем окислили водным раствором периодата натрия в присутствии бутанола. Продукты окисления ацетилировали, очистили препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле и
анализировали ГЖХ-МС. Среди полученных продуктов идентифицировали соединение, масс-спектр которого отвечает формуле (52).
Действительно, в спектре (52) имеются пики при т/г 398 (М+-CHjCOOH), 3S3 (М+-СН3СООН-СН3), 355 (М+-СН3СООН-СН3СО), 33S (М+-2СН3СООН), 323 (М+-2СН3СООН-СН3), 295 (М+-2СН3СООН-СН3СО). Столь значительное уменьшение молекулярного веса после периодэтного окисления свидетельствует об образовании при восстановлении лактона и кетофункции полиола, имеющего а-диольный фрагмент. Это однозначно подтверждает положение кетогруппы в (50) как 22-. Нативный гении (50), структура которого таким образом доказана, мы назвали урупогенином по месту сбора животных (Курильские о-ва, о-в Уруп).
Моносахариды псевдостихопозида А определены как ксилоза, хиновоза и З-О-метилглюкоза (2:1:1). Сольволитическое десульфатирование (45) смесью пиридин - диоксан (1:1) привело к производному (46). При метилировании (46) по Хакомори с последующим метанолизом и ацетилированием мы получили а-и р-метилгяикопиранозиды, соответствующие структуре углеводной цепи (46).
Прогенин (47), полученный при мягком кислотном гидролизе (45), содержал по данным ЯМР |3С и моносахаридного анализа остаток ксилозы, а прогенин (4S) - остатки ксилозы и хиновозы. Таким образом, первым моносахаридным остатком в углеводной цепи являются ксилоза, вторым -хиновоза, четвертым - З-О-метилглюкоза, а третьим, соответственно, ксилоза. Сигналы аномерных атомов углерода при 105,1, 105,1 , 105,1 н 104,0 м.д. свидетельствовали о p-конфигурации гликозидных связей.
Положение сульфатной группы при С-4 первого остатка ксилозы определили сравнением спектров ЯМР UC псевдостихопозида А (45) и его десулъфатированного. производного (46). При этом наблюдали сдвигающие эффекты, характерные для сульфата при С-4 ксилозного остатка.
Таким образом, полное строение псевдостихопозида А установлено как 3-0-|-3-0-мет11Л-Р-0-глюкопиранозил-(1->3)-Р-0-ксплопиранознл-М->4)-р-0-хиновопнранозид-( 1 ->2)-4-0-натрпй сул ы^лт-р-П-ксилоппрапозп.'П-годост^ХЭ-еп-ЧИ-ол^-он (45).
2. Строение тритерпеновых гликозидов и систематика голотурий
2.1. Строение тритерпеновых гликозидов, систематика и филогения
Но1оишпо1с1еа
Выполнен анализ таксономического распределения приблизительно девяноста гликозидов из более, чем пятидесяти видов голотурий, относящихся преимущественно к отрядам А5р1с1ос1шоис1а и Оепс1гос1игоПс1а. Установлено, что в сем. Но!ог1шгй'с1ае (отр. Азр1(1ос1цгоис1а) представители родов НоЫ/шгт и Аси'пору^^а содержат в качестве основных компонентов гликозидных фракций сульфатированные биозиды и тетраозиды, отличающиеся друг от друга деталями строения боковой цепи агликона, и, как правило, имеющие в агликоне гидроксильную группу в положении 17. Исключение представляет средиземноморская голотурия НоЫкипа /опкаН. Ее гликозиды, вместо сульфатной группы в четвертом положении первой ксилозы, содержат присоединенный в это же самое место остаток глюкозы и не содержат сульфатной группы. Однако по всем остальным признакам: наличию 17а-гпдроксильной группы для основных компонентов, окисленности боковой цепи и другим они достаточно близки к другим гликозидам голотурий родов Но!ог1шг1п и Ла1пору°с1. Морфологические и экологические данные, а также информация о строении тритерпеновых гликозидов позволяют, по нашему мнению, поставить вопрос о выделении Н./огхкаИъ отдельный род.
Большинство голотурий рода Во/киксЫа содержат в качестве основных компонентов гликозидных фракций бивиттозиды (бохадшпозиды), гексаозиды, не имеющие сульфатной группы, а агликоны этих веществ не содержат 17а-гпдрокспльной группы. Исключение представляет Во/тгЫип содержащая
в качестве основного компонента голотурии А? (1) - сульфатированный тетраозпд, найденный ранее в Но1о!1шпа аН. здаЬга, Н. /¡огМапа, Н. лхю!о«а, //. а/га, а также в Ас/шору°а ттт'/юпп, А. /1атгпеа и А. ес/иш/ез. На основании анализа комплекса биохимических, морфологических и экологических данных (форма тела, число щупалец, строение спикул стенки тела, выбрасывание
кювьеровых органов и т. д.) мы выделили этот вид во вновь установленный род Pearsonothuria. Диагноз рода приведен в работе |5|.
Для представителей сем. Sticliopodidae (отр. Aspidocliirotida): Stichopus cMoronotus, S. variegatus, S. hermanni, Astichopus multifidus, Thelenota ananas, T. anax - основными гликозидными компонентами являются гексаозиды, не имеющие сульфатной группы, агликоны которых содержат 7(8)-двойную связь и 23-ацетокси-группу.
Северо-тихоокеанские стихиподиды - Stichopus japónicas и S. californicus имеют существенные отличия от других изученных представителей семейства в строении агликона, а именно: наличие кетогруппы в положении 16, отсутствие 23-ацетоксигруппы, а также наличие 9(11)-двойной связи вместо 7(8)-двойной связи. Сходные по строению . агликоны имеют и многие представители Dendrochirotida - отряда, по палеонтологическим данным более близкого к предковым формам голотурий, чем отряд Aspidocliirotida. Учитывая ряд морфологических особенностей стихоподид, прежде всего расположение гонад двумя пучками, химическое строение гликозидов в этом семействе можно трактовать как показатель примитивности, причем S. japónicas и S. californicus, вероятно, наиболее примитивны среди химически изученных представителей семейства.
Эти виды имеют между собой и отчетливое морфологическое сходство, отличаясь в то же время от chloronotus - типового вида рода Stichopus (спикулы стенки тела, щупалец, клоаки и ножек). Это свидетельствует, во-первых, о безусловной необходимости выведения этих двух видов из рода Stichopus и, во-вторых, об их конгенеричности.
Имеется также определенное сходство в строении гликозидов Bohadschin и Stichopodidae (степень окисленности агликонов, отсутствие сульфатной группы, количество моносахаридных остатков, общая "архитектура" углеводной цепи). Это свидетельствует в пользу наибольшей примитивности Bohadschia среди других представителей Holothuriidae. Биохимические данные не подтверждают мнение о близости актинопиг и бохадчий. По-видимому, морфологическое и экологическое сходство указанных групп является результатом параллельном или
конвергентной эволюции этих групп в близких условиях коралловых мелководий тропической зоны океана. В пользу этой точки зрения свидетельствуют и недавно опубликованные паразитологические данные.
Голотурия Н. /опкаЦ занимает обособленное положение в семействе, промежуточное между НоЫ/гипа и Ас1июру§п, с одной стороны, и ВоИае1зс/иа, с другой, будучи ближе к НоЬЛипа и Лс!1!юру°а, чем к Во/гагксЬю.
АэйсЬориз ЭМсЬориз \ ТЬе1епо(а
Р. (=3) саМогЫсиэ А. (=5) ^арошсиэ
Н. ^гэкаИ
Реаг50П0У1има АсЙпоруда \ Но1о№иг1а
Holothuг¡idae
НоЫЬипо'1йеа
Рпс. 5.
Схема филогенетических отношений представителей А.чр1с!ос1п'гоС1с1а, построенная с использованием данных о строении тритерпеновых глпкозидов
Гликозиды в ОепсЬосЫгойсЬ отличаются большим структурным разнообразием, чем в А5р1с1ос1игоИс1а. Если для А5р1с10с1ш'0^с1а гликозпды являются таксономическими маркерами групп близкородственных родов, то для Оепс1гос1игопс1а различия по составу гликозидных фракций между представителями даже близких видов бывают достаточно велики.
Гликозпды Оепс1гос1шойс1а часто содержат структурные фрагменты, весьма необычные для других изученных тритерпеновых гликозидов голотурий, такие как: пентасахаридные углеводные цепи, разветвленные по остатку хиновозы; относительно большое число сульфатных групп, положение которых отличается от обычного местонахождения сульфата при С-4 первой ксилозы; 18(16)-лактон вместо 18(20)-лактона в агликоне или вообще отсутствие лактона. Даже в пределах одной гликозидной фракции из одного сбора животных различия между веществами бывают очень большими. Например, псолюсозид В из Р. /пЬпси имеет 18(1б)-лактон, а псолюсозид А - 18(20)-лактон; у псолюсозида В -7(8)-двойная связь в агликоне, в то время как у псолюсозида А - 9(11)-двойная связь; у псолюсозида В углеводная цепь состоит только из остатков ксилозы и глюкозы и разветвлена, в то время как псолюсозид А содержит линейную углеводную тетрасахаридную цепь с классическим для гликозидов голотурий набором моносахаридов: глюкоза, ксилоза, З-О-метилглюкоза и хиновоза.
Такой разброс в структурах гликозидов отчасти может быть связан с интенсивным эволюционным поиском наиболее удачных структурных вариантов, т.е. здесь проявляется давно известная палеонтологам закономерность: чем ближе таксон к тому эволюционному этапу, на котором формировалась данная морфо-функциональная система. тем больше конструктивное многообразие этой системы в данном таксоне. Это, безусловно, свидетельствует о большем филогенетическом возрасте Ое1к1гос1нгопс1а по сравнению с А.$р°1с1ос1игопс1а, тем более, что гликозпды дендро.хиротпд, как правило, менее окислены, что также можно рассматривать как показатель их примитивности.
2.2. Гомологическая изменчивость и направленность в эволюции
тритерпеновых гликозидов голотурий
При анализе таксономического распределения гликозидов в разных отрядах, семействах и родах голотурий нам удалось выявить структурные фрагменты гликозидов, возникающих в ходе эволюции параллельно и независимо. Уровни, через которые проходила эволюция биосинтеза аглнконов от ланостановых к различным голостановым производным, представляется нам следующим образом: это, по-видимому, окисление по положениям 16 и 18 с образованием 18(16)-лактона, окисление С-18 и С-20 с образованием 18(20)-лактона и дальнейшим окислением по положению 16, что ведет к голостановым производным и, в частности, к голотоксиногенину (голоста-9(11),25(26)-диен-Зр-ол-16-ону), окисление боковой цепи по С-22 и С-23, блокирование окисления по положению 16 и, наконец, окисление по С-12 и С-17 атомам. Эти уровни различные таксоны проходят асинхронно, в результате чего образуется мозаичное разнообразие агликонов, гомологические ряды ш изменчивости. В углеводных цепях тритерпеновых гликозидов уровни представляются нам так; переход от цепей, состоящих из глюкоз и ксилоз, к цепям, содержащим хиновозу; переход от высокоразветвленных и содержащих нечетное количество моносахаридов углеводных фрагментов к фрагментам, имеющим менее разветвленное строение и 2, 4 или 6 моносахаридных остатков; переход от сульфатированиых по С-6 углеводных цепей к цепям, имеющим сульфатную группу при С-4 ксилозы или лишенным сульфатной группы.
Как правило, гликозиды если из разных таксономических групп имеют идентичные углеводные цепи, то у них - неодинаковые агликоны и наоборот. Эволюция агликонов и углеводных цепей относительно независима, и вероятность полного совпадения структур очень мала, хотя такие случаи возможны.
С помощью закона гомологических рядов Н. И. Вавилова (Вавилов. 19225 1987) можно предсказать строение еще неизвестных гликозидов. а в ряде случаен
и их таксономическую локализацию, причем для химически малоизученных таксономических групп действует своего рода неопределенность - чем более точно мы можем предсказать структуру гликозида, тем менее точно мы можем предсказать ее таксономическую локализацию и наоборот.
Наличие сходных циклов изменчивости гликозидов в разных таксономических отрядах голотурии свидетельствует о том, что они длительное время развивались параллельно. Таким образом, данные о строении тритерпеновых гликозидов дают ценную информацию о филогении семейств и отрядов класса НоЫ1шпо1с1еа, однако наличие параллелизмов крайне затрудняет подобный анализ для межотрядных отношений.
Таким образом, изучение таксономического распределения гликозидов в голотуриях позволило нам сформулировать гипотезы об эволюции этих соединений.
Одним из независимых методов проверки филогенетических гипотез, выведенных из таксономического распределения тех или иных признаков, является морфо-функциональный анализ. Сама применимость методов этого анализа для тритерпеновых гликозидов голотурий показала бы возможность распространения их и на другие группы вторичных метаболитов. Однако такой анализ возможен только при наличии количественных данных о биологической функции. Мы проанализировали литературные сведения, касающиеся мембранолитической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, которая коррелирует с их природной защитной функцией. Кроме того, мы получили 24 |гликозида и их производных для изучения гемолитического действия, как частного случая такой активности.
3. Гемолитическая активность тритерпеновых гликозидов голотурии отряда Оепс1гос1игопс1а
3.1. Гемолитическая активность гликозидов голотурии ЕирепШсШ /гаш/аГпх и их производных
Результаты исследования гемолитической активности I I гликозидов и п\ производных из Е. /ттШп'х по метолу (Шш. ОпшогЬ. 1990). а также трех
веществ из других голотурий отряда Оепс1гос1игоП(1а, взятых для сравнения, представлены в таблице 1 и на рис. 1 и 2.
53. к=н
54. Л=Ху1-
55. К=<Зшп-(|-»2)-Ху1-
56.- Я=Оит-( 1->2)-4-050-,Ма-Ху1-
57. К=3-О-Ме-Ху1-(1->3)-О1с-(1->-»)-0ит-(1->2)-Ху1-
37. К=3-О-Мс-Ху1-(1^3)-О1с-(!->4)-0ит-(|^2)-4-О5О,Ып-Ху1-
38. К=3-О-Мс-Ху1-(1-»3)-О1с-(1->4)-0шп-(1->2)-Ху1-
5,4. К=3-0-Мс-Ху1-(1->3)-0!с-(1->4)-Оиш-(1->2)-4-0301Я1-Ху1-
59. 3-0-Мс-Ху1-(1-+3)-С1с-( 14)|-¡Ху1-(1->2)|^шп-( 1->2)-Ху1-
60. К=|3-О-Мс-Ху1-(1->3)-С!с-(1->4)|-[Ху1-(1->2)|-01пп-(1->2)-4-О5О;К:1-Х\1-
61. К=|3-0-Мо-С1с-(1-*3)-Ху1-(1-»4)|-|Ху1-(|-»2)|-Оиш-(1->2)-4-050^;|-Х\1-
62. К=|а1с-(1-^3)-С1с-(1->4)|-|Ху1-(|^2)1-Оит-(1->2)-4-ОЗОЛ-Х\1-
63. К=Ху1-(1->2)-Ошп-(1->2)-4-050;Мл-Ху1
31. К=.)-О-Мс-Ху1-(1->3)-(;|с-(1^4)-0и1'»-(|->2)-4-О5О^|л-Ху1-
Вес глнкозпдныс снял! имеют ^-конфигурации; моносахарпдпыс остатки относится к 0-ряду и находятся и пирапозных (формах
Таблица I. Гемолитическая активность, скорость и время задержки гемолиза и скорость выхода К+ индуцированная гликозидами и их
производными
Всщсстио ЕО5(, (М) Время задержки Наклон крииои Ук" (цМ/.чин)
(сск) (1 /сск)
53 >1.12x10"3 (нет гемолиза за 4 мин.)* 0.5
54 0.64x10"5 105* 0.004 3
55 0.25х10-5 11* 0.043 6
56 0.78х10"6 8 0.041 150
57 0.25x10"6 12 0.040 120
37 0.25x10-6 9 0.31 140
ЗБ 0.10x10"6 8 0.041 60
5в О.ЮхЮ"6 3 0.63 100
59 0.60x10"6 46 0.014 30
60 0.40x10"6 27 0.025 35
61 0.25x10"6 15 0.039 24
62 0.20x10-5 3* 0.160 3
63 О.ЮхЮ"3 1.5* 0.250 2
31 0.35х10-5 24* 0.010 0.5
* - концентрация вещества 1x10-5 М; во всех других случаях - 1х10"6 **- скорость выхода К+ при концентрации вещества 1x10-6 М
Из этих данных следует, что на гемолитическую активность (включая выход К~ из эритроцитов как начальную стадию гемолиза) гликозидов голотурий влияет как структура агликона, так и строение углеводной цепи гликозидов. В агликоне требуется наличие 18(20), а не 18(16)-лактона. В углеводной цепи важно наличие линейного тетрасахаридного фрагмента. Сульфатная группа при С-4 первого ксплозиого остатка почти не влияет на минимальную эффективную дозу гликозидов, имеющих линейный тетрасахаридный фрагмент, хотя скорость гемолиза ;иш пмеюпшч ее веществ несколько выше. В то же время, для биозпдов наличие такой сульфатной группы является критически важным.
Эги результаты хорошо коррелируют с данными, полученными ранее для антифунгальной активности. Кроме того, наличие дополнительного остатка ксилозы, присоединенного к С-2 остатка хиновозы, в гликозидах, имеющих линейный тетрасахаридный фрагмент, снижает гемолитическую активность.
Причем наличие сульфата при С-4 первого остатка ксилозы несколько компенсирует такое снижение активности.
MINUTES
Рис. 1
Влияние гликозидов и их производных на скорость гемолиза
- ЗБ -
1ек С , М
Рис. 2. Влияние гликозидов и их производных на скорость выхода К+. Данные представлены в двойной логарифмической шкале
2.2. Гемолитическая активность гликозидов голотурий семейства Cucumariidae
Данные о гемолитической активности 9 гликозидов и их производных из С. japónica, а также трех веществ из других голотурий отряда Dendrochirotida, взятых для сравнения, представлены в таблице 2 и на рис. 3 и 4.
9. (DsPsA) R~3-0-Mc-Glc-(l—>3)-Glc-(l->4)-Quin-(l->2)-Xyl
64. (Л,-2) R- |3-0-Mc-Glc-(l->j)-Gle-(!->4)]-|Xyl-(l—>2)|-Quín-([—>2)-4-0S05NLi-Xyl
65. (Л,,-2) R=|6-0S03Na-3-0-Mc-G!1:-(l->3)-GIe-(l->4)l-|Xyl4l->2)|-Q"iii-(l->2)-4-0S0,N¡i-Xyl
66. (Aj-2) R=|3-O-Mc-Glc-(l->3)-6-OS03N:i-Gle-(l-»4)|-|Xyl-(l->2)|-0»¡"-(l->2)-4-O.SO.,N;i-Xyl
67. (,\7-l) R=|6-OSO3Na-3-O-Mc-G!c-(I->3)-6-OSO3N:i-Glc-(l->4)|-|Xyl-(l->2)|-0iuii-(l->2)-
-4-0S03Na-XyI
6S. (Ds/\,-2) R=|3-0-Mc-GIe-(l->3)-GIe-(l->4)|-|Xyl-(l->2)l-Qii¡n-(l->2)-Xyl 62. (A.,-2) R—lG]c-(l->3)-G]c-(I~>4)|-|Xyl-(l->2)|-Qu¡n-(l—>2)-4-0S03Na-Xyl 69. (Ds/Vr2) R~|Glc-(l->3)-Glc~(l->4)j-|Xyl-(l->2)|-Qiun-(l->2)-Xyl
70. (А7-3) Я=|6-О5Оз№-3-О-Ме-О1с-(|^3)-6-О8Оз№-О1с-(1^4)|-|Ху]-(1^2)|-01ип-(1-»2)-
-4-ОЗОзМп-Х\'1
71. (05А7-3) К=13-О-Мс-О1с-(1->3)-Ок-(1->4)|-|Ху1-(1->2)|-0ши-(1-»2)-Ху1
Результаты, полученные при изучении гемолитической активности и выхода К+ из эритроцитов, показывают, что мембранолитическое действие гликозидов и их производных зависит от положения сульфатных групп в углеводной цепи, наличия или отсутствия З-О-метильных групп в терминальном моносахаридном остатке, а также от деталей строения агликона (см. Табл. 2 и Рис. 3 и 4).
Таблица 2. Гемолитическая активность кукумариозидов, псолюсозидов и их производных, а также скорость индуцируемого ими выхода К+ из эритроцитов
Вещестио Время задержки Наклон ЕО30 УК+
Аббревиатура, (Ы) (сек) (1/сек) (Ю-6 М) (иМ/тш)
С, (37) 9* 0.007 1.8 28.2*
Р5А (5) нет гемолиза за 4 мин* _** 16.6*
ОзРэА (9) 26* 0.006 _** 12.0*
Ат2 (64) 5 0.075 0.87 32.4*
А6-2 (65) 105 0.010 1.9 6.6'
А3 (66) 21 0.025 1.25 62.0*
А7-1 (67) 120 0.005 2.5 21.6*
ОяА,-2 (68) 38 0.025 2.5 15.8*
А4-2 (62) нет гемолиза за 4 мин 2.5 5.0*
0.^-2 (69) 13 0.015 1.9 20.0*
А7-3 (70) 44 0.08 2.5 98.0*
ОэАу-З (71) 1 0.14 0.87 73.0*
'Концентрация вещества 2.5x10"° (VI; для остальных случаев - 5хЮ"6 М. **Е05() не определялась.
О О
а <э
С,» У0 120
ГШГ. ЯСС
Рис. 3. Ход гемолиза, нндуциронанного гликозидамн н их производными.
Для кривых, обозначенных жирными линиями, концентрация веществ - 5х10"6М; для кривых обозначенных пунктиром, концентрация веществ - 2,5х10"6М
Сстсспичиюп , М
Рис. 4. Влияние гликозидов и их производных на скорость выхода К+ из эритроцитов
Сульфатные группы, присоединенные к положению 4 первого ксилозного остатка и положению 6 третьего глюкозного остатка разветвленных пентаозияов. имеющих З-О-метильные группы в терминальных моносахаридных звеньях, увеличивают выход К+ из эритроцитов. Сульфатная группа при С-4 первого ксилозного остатка увеличивает гемолитическую активность, в то врем» как сульфат при С-6 третьего моносахаридного остатка уменьшает се. Сульфатная группа при С-6 терминальной З-О-метилглюкозы существенно уменьшает .гемолитическую активность и скорость выхода К+.
Присутствие сульфатной группы при С-4 первого ксилозного остатки в глнкозпдах, не имеющих З-О-метильных групп при терминальных моносахаридных звеньях, уменьшает гемолитическую активность и выход К+. Присутствие 16-кетогруппы в агликонах, имеющих 7(8)-двойную связь, значительно уменьшает активность.
4. Морфологические концепции и подходы к изучению эволюции трнтерпеновых гликозидов голотурий
Одним из современных методов анализа структурно-функциональных отношений сложных адаптивных комплексов и их эволюции является системно-теоретический или холистский подход. Другой концепцией, позволяющей менее точно, но более удобно на практике анализировать такую эволюцию, является более традиционная концепция модусов органогенеза. Мы применили оба этих подхода.
4.1. Системно-теоретический подход к описанию структурно-функциональных отношений гликозидов голотурий и их эволюции
Системно-теоретический (холистский) . подход к моделированию отношений структура-функция Ван-дер-Клааува - Дуллемейера (Dullenieijer, 1974) применяется анатомами для анализа сложных морфо-функционадьных комплексов.
Комплекс более или менее произвольно разбивают на структурные элементы. Выявляют совокупности элементов, вносящих вклад в какую-либо дискретную функцию (активность), то есть функциональные компоненты, которые могут частично перекрываться своими структурными элементами. Активности связывают стрелками, отображающими функциональные отношения, со структурными элементами, п также с соответствующими a:iairritwiwMii ролями, в которые вносят вклад эти активности.
Наиболее важные функциональные связи (доминирующие) при этом выделяют жирными линиями. Получаемые сетевые диаграммы структурно-функциональных отношений элементов морфо-функциональных комплексов проверяют, мысленно разобщая те или иные функциональные связи, и сопоставляют результат с реальными экспериментальными данными. С помощью подобной сетчатой диаграммы можно наглядно прогнозировать те или иные изменения в функционировании комплекса в результате эволюционных или модификационных изменений его элементов, выявлять более важные участки комплексов (центры реализации) и менее важные (функциональную периферию).
Мы построили такую диаграмму для тритерпенового гликозида из Но!о1!шпа¡рр. голотурина А? (О, которая представляет собой модель структурно-функциональных отношений элементов его структуры (рис. 5). Мы проанализировали влшние структурных особенностей гликозида на регуляцию размножения самих голотурий, отпугивание хищников, аллелопатию, борьбу с обрастателями и грибами, а также связь этих адаптивных ролей с функциональными компонентами, относящимися к мембранотропному действию гликозида, а именно: "проникновение в мембрану", "образование комплекса со стеринами мембран", образование каналов, пор и последующий лизис", "гидрофильность". Структурные элементы и функциональные исвязываются обычными функциональными связями, а также опорными (химическими) и резервными. При построении диаграммы учли также данные о механизме действия гликозидов (Попов и др., 1982; Лихацкая и др., 1991).
Продолжив такой анализ в эволюционном, а точнее в типологическом измерении мы составили обобщенную диаграмму для группы гликозидов из голотурий сем. НоЬйшгМае, близких к голотурину А2 по структуре (рис. 6). При этом нам пришлось ввести понятия переключателя для взаимоисключающих структурных элементов и отрицательной функциональной связи.
СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ связи
- опорные (химические)
- резерппая -прочие
Рис. 6.
Диаграмма гипотетических взаимоотношении функциональных компонентов и структурных элементов для тритерпенового глпкознда из голотурий сем. Но1о11шгис1ае - голотурина А2 (1)
СТРУКТУР! IЫ Е Э Л ЕМ Е1ГГЫ
12а-о|Г[
17а-0П |
22,25-эиокспд
I ЛЛ110СТ-9(11)-Е||-3[1-ОЛ к-1 18(20)-ЛАКТО|Г|.Л
, Ч._
0шп-(1->-2)
7-^
Ху!
3-ОМе-С1с-(1-»3)
-^-
X
I 3-ОМс- С1с- (1—3) |— С1с-(1->-4)|
4-ОБОзКа
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
АКТИВНОСТИ
.{ПРОНИКНОВЕНИЕ : МЕМБРАНУ
ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСА СО СТЕРИНАМИ
ОБРАЗОВАНИЕ ПОР . I-1
И ПОСЛЕДУЮЩИЙ «-Ц АЛЛЕЛОПАТИЯ -ЛИЗИС КЛЕТОК : -
АДАПТИВНАЯ РОЛЬ
¿.РЕГУЛЯЦИЯ ТРАЗМНОЖЕНПЯ
БОРЬБА С ГРИБКАМИ И ОБРАСТАТЕЛЯМИ
ГИДРОФИЛЫЮСТЬ
. ОТПУГИВАНИЕ ХИЩНИКОВ
М*с т
ОБОЗНАЧЕНИЯ
-{> - опорные (химические) . резерипая -прочие
-офпцателшая с »язь - переключатель
Рис. 7.
Диаграмма структурно-функциональных отношений глпкозпдов голотурий сем. Но1от1ш1|';с1пе
Обе диаграммы показывают достаточно сложный, многовариантный характер действия естественного отбора на структурные характеристики гликозида, реализующегося через "вход" в систему. То есть отбор оказывает "давление" не на сами структурные элементы гликозида, а на адаптивные роли, те в свою очередь на активности, а они уже, причем самым различным образом, на структурные элементы. Иными словами более или менее сходные адаптивные запросы на входе в систему могут реализовываться через самые разные функциональные пути, что ясно видно на представленной выше схеме. Множественность структурных решений одной и той же биологической задачи мы предлагаем назвать морфологической вырожденностью биологических функций. Морфологическая вырожденность функций является столь же важным условием эволюции органов и функций как мультифункщ.жальность и возможность количественных изменений функции. Вводимое нами понятие вырожденности функций в какой-то мере перекрывается с понятиями множественности обеспечения функций (Маслов, 1980) или мультиорганности (П. Ошмарин, А. Ошмарин, 1988; Ястребов, 1995), но является более общим.
Доминантным функциональным компонентом на этих диаграммах является "защита от хищников", остальные функциональные компоненты имеют подчиненное значение. Среди них, в свою очередь, доминантными будут "образование каналов, пор, последующий лизис" и "образование комплекса со стеринами мембран". Какого-то "центра реализации" они практически не образуют, поскольку связаны как со многими структурными элементами, так и с другими функциональными компонентами слишком большим числом связей.
По-видимому, такой анализ будет наиболее результативен для биологически активных соединений высокой и средней молекулярной массы. Для веществ с относительно малой степенью перекрывания функциональных компонентов (к ним можно отнести не только высокомолекулярные токсины, но и ферменты, иммуноглобулины и др.) можно выделить своего рода "активные центры" или "центры реализации" по Дуллемейеру и так называемую ''функциональную периферию".
Низкомолекулярные и вторичные метаболиты из-за значительной степени перекрывания функциональных компонентов будут менее удобными объектами для применения такого подхода. Действительно, для многих соединений биологическая активность в значительной степени определяется не какими-то отдельными элементами, а общей геометрией молекул. Молекулы со значительной степенью перекрывания функциональных компонентов должны в ходе эволюции сохранять, причем очень жестко, общий план строения и все функциональные связи, меняя лишь элементы, не нарушая при этом системную гомологию, по терминологии Н. Н. Иорданского (1990).
Для веществ, имеющих более четко выраженные "центры реализации", и, соответственно, меньшую степень перекрывания функциональных компонентов, таких, например, как разнообразные ферменты, в ходе эволюции более или менее стабилен "центр реализации" (активный центр), а функциональная периферия достаточна изменчива.
Таким образом, исходя из показанной высокой степени перекрывания функциональных компонентов для молекул тритерпеновых гликозидов, в ходе эволюции этих веществ должен жестко сохраняться их общий план строения. Это соответствует реальной картине таксономического распределения тритерпеновых гликозидов голотурий.
4.2. Концепция модусов органогенеза
Для приближенного описания эволюции структур и функций морфологами-анатомами уже более сотни лет используется концепция модусов органогенеза, т. е. способов эволюционных изменений каких-либо органов и структур в направлении полезном для целого организма (Северцов, 1939). Различают такие модусы органогенеза как интенсификацию, расширение или смену функций, филогенетические субституции и др., причем один модус может действовать как составная часть другого, поскольку их границы нередко перекрываются. Эта концепция, по нашему мнению, применима и к
молекулярному и даже субмолекулярному" уровню организации живых организмов.
Сопоставив выявленные при изучении таксономического распределения гликозидов тенденции их эволюции с литературными данными по мембранолитической активности этих веществ, а также собственными результатами исследования гемолитической активности двух специально полученных серий гликозидов и их производных из отряда Оенс1гос1шоПс1а, мы обнаружили, что такая активность увеличивается (иногда скачкообразно) в ходе эволюции, или, по крайней мере, не уменьшается, то есть их эволюция носит ярко выраженный адаптивный характер.
Эволюция гликозидов сопровождается интенсификацией их защитной функции против хищных рыб. Так, при переходе от гликозидов, не содержащих хиновозу, к веществам, имеющим этот моносахарид, мембранолитнческая активность возрастает в 4 - 8 раз. При переходе от содержащих голотоксиногенин гликозидов к гликозидам с 7(8)-двойной связью и 23-ацетоксигруппой активность возрастает в 2 - 3 раза. При переходе от аглнконов. не содержащих лактон или имеющих 18(1б)-лактонную группу, к соединениям с 18(20)-лактоном в агликоне гемолитическая активность возрастает в 80 - 100 раз. что является показателем не просто интенсификации защитной функции, а скорее расширения функций гликозидов в ходе их эволюции. Первоначально эти вещества, по-видимому, играли роль регуляторов размножения, пнгибируя транспорт Са2+ через мембраны ооцитов и тем самым синхронизируя их созревание (Аппшн, АпЫпюу, 1992), а затем стали и мощным защитным средством против появившихся в ордовике (т. е. позже самих голотурий) хищных рыб.
Часто гликознды. содержащие "активный" аглнкоп, не имеют хнновозы в углеводной цепи и наоборот. Здесь и в подобных случаях наблюдается действие принципа компенсации функции на молекулярном уровне.
Наиболее интересны выявленные нами случаи филогенетического замещения, проявляющиеся в эволюции гликозидов голотурий. Так, эволюционное замещение сульфатной группой бнозпдной составляющей при
первом остатке ксилозы в угл'еводных цепях тритерпеновых гликозидов голотурий сем. Но1оМшпМае является примером эволюции по типу субституции органов по Н. Клейненбергу. Дальнейшее замещение сульфатом биозидной составляющей при С-4 хиновозы в Но1оИшгис1ае (рис. 7) и замещение сульфатом ксилозного остатка при С-2 хиновозы в Оепс1гос1шоПс1а, а также замещение кислородных функций в положении 16 агликонов гликозидов голотурий 12а-ОН группой или 23-ОАс, 22- или 23-кетогруппами - пример эволюции, аналогичной субституции функций по А. Н. Северцову.
Движущей силой вытеснения сульфатом при С-4 первой ксилозы тех или иных моносахаридных остатков является снижение метаболической стоимости биосинтеза гликозидов при сохранении их гидрофильности, необходимой для экскреции этих веществ в морскую воду, что, безусловно, идет на пользу организму-продуценту. В случае "вытеснения" сульфатом пятого моносахаридного остатка в гликозидах Вепс1гос1ш'оис!а, кроме того, наблюдается и выигрыш, связанный с усилением мембранотропного действия гликозида.
Если субституция 16-кетогруппы в агликонах с 7(8)-двойной связью какими-либо другими кислородными функциями в боковой цепи агликона ведет к прямому увеличению мембранолитической активности, то для веществ с 9( 11 )-двойной связью эволюционное вытеснение 16-кетогруппы не дает выигрыша ни в метаболической стоимости, ни в биологической активности. Движущей силой в этом случае может являться только исключение самой возможности образования 18( 16)-лактонного цикла при нарушениях в последовательности биосинтетпческих реакций, что привело бы к потере защитных свойств гликозида. Подобные циклизации протекают, если имеются свободная карбоксильная группа при С-18 и гидроксильные группы при С-1Э и С -16, преимущественно с образованием 18(16)-лактона. Отсутствие кислородной функции при С-16 абсолютно исключает такую циклизацию. Здесь проявляется эволюция по новому, не описанному ранее модусу органогенеза, который мы предлагаем назвать эволюционной блокировкой.
Рис. в. Переход от субституции органов по Клейненбергу к субституции функций по Северцову при последовательном эволюционном •замещении биозидных компонентов сульфатной группой в Но1о11шгпс1ае
Интереснейшим случаем субституции функций является эволюционное "вытеснение" специализированных иовьеровых органов, выбрасываемых некоторыми представителями Но1оишгмс1ае в воду при нападении хищников, 17а-гидроксильной группой! и дополнительными кислородными функциями в боковой цепи агликонов. резко увеличивающими гидрофнльность гликозидов. Высокая гидрофнльность гликозидов делает просто ненужным выброс специализированных органов, насыщенных этими веществами в воду - выход
гликозидов достаточен для отпугивающего действия и сам по себе. В данном случае действие субституции функций проявляется не на молекулярном, а уже на организменном уровне.
Таким образом, с помощью концепции модусов органогенеза можно объяснять результаты биохимического эволюционного процесса, выявлять его движущие силы, что позволяет решать проблему полярности хемотаксономических признаков (обратимости морфологического ряда). В применении к эволюции гликозидов голотурий эта концепция позволила уточнить ее основные направления, в том числе переходы от веществ с разветвленными углеводными цепями к линейным тетраозидам и сульфатированным биозидам и др., происходящим по типу филогенетической субституции.
4.3. Теория филэмбриогенезов и биосинтез гликозидов голотурий
Существует глубокое внутреннее сходство между индивидуальным развитием (онтогенезом) организмов и биогенезом природных соединений, поскольку оба процесса являются результатом посгадийного развертывания генетической программы. Если эволюцию той или иной морфологической структуры, системы или целого организма можно рассматривать как эволюцию ее онтогенеза, то эволюция биомолекулы есть не что иное, как эволюция ее биосинтеза. Вследствие этого теория филэмбриогенезов А. Н. Северцова (1939) применима к анализу эволюции биосинтеза, где также можно наблюдать способы эволюции, близкие к северцовским модусам филэмбриогенезов -анаболию (надставка конечных стадий), девиацию (изменения на средних стадиях биосинтеза), гетерохронии (сдвиг стадий биосинтеза по времени) и гетеротопии (сдвиг структурных элементов в ходе биосинтеза, т. е. молекулярные перегруппировки).
Подобно онтогенезам, биосинтезы можно разделить на мозаичные и регуляторные. Эволюция регуляторных биосинтезов идет пузем анаболии. Здесь бпоспптетпчеекпе и филогенетические "предшественники" совпадают, и в ходе
эволюции наблюдается определенное совпадение последовательностей бпосинтетических и филогенетических стадий, т. е. рекапитуляция.
Известно, что биосинтез тритерпеновых гликозидов голотурий осуществляется из ацетата через сквален циклизацией последнего в ланостерин или его 9(11)-изомер (паркеол) и последующие окислительные превращения этих тетрациклических тритерпеноидов (Elyakov et. al, 1975; Makarieva et al, 1993; Kerr et al, 1994). Стадии биосинтеза, ведущие к ланостерину. являются регуляторныыи, т. е. они более или менее отвечают модусу анаболии. Это характерно для начальных стадий биосинтеза многих вторичных метаболитов.
По модусу анаболии, очевидно, происходит эволюция агликонов в семействе Holothuriidae от веществ, не имеющих 17а-гидроксила, к веществам, содержащим эту кислородную функцию, и далее к веществам, имеющим 22,25-эпоксид. Здесь последовательность филогенетических трансформаций соответствует биосинтетической последовательности превращений.
В эволюции мозаичных биосинтезов часто встречаются девиации, гетерохронии и гетеротопии, вызывающие несовпадения биогенетических и филогенетических последовательностей стадий. В случае тритерпеновых гликозидов такой девиацией является переход от агликонов с 9(11)-двойной связью к веществам с 7(8)-двойной связью, который из-за чисто химических причин может произойти либо на стадии миграции 8(9)-двойной связи в тетрациклическом ядре ланостерина, либо на стадии циклизации сквалена. Примером девиации, только девиации отрицательной, является редукция (эволюционное удаление) кислородной функции в положении 16, поскольку она происходит, как правило, лишь после стадий эволюции, на которых появились дополнительные кислородные функции при С-22, С-23 или С-12.
Из модусов филэмбрногенезов одним из наиболее важных для эволюции являются гетерохронии, т. е. ретардации (задержки в появлении стадии) и акцелерацип, т. е. сдвиг появления тех или иных структур на более ранние стадии. Например, углеводные цепи, причем вполне развитые, мы находим и в гликозидах с самыми примитивными агликонамп. У представителей семейств Stichupodidae и Holothuriidae среди гликозидов встречаются бпозпды и
тетраозиды с вполне развитыми агликонами и в то же время гексаозиды с 12а-гидроксильными группами и без, с 25(26)-двойными связями и без, с окисленными и не окисленными боковыми цепями. В гликозидах Еирепшс.ш у!гаис1а1г1х диеновые системы в боковой цепи агликонов преимущественно имеются у пентасахаридных гликозидов, однако недавно мы нашли в'минорных количествах гликознд и с диеновой системой, с четырьмя сахарами, а также с сульфатом. Окисление боковой цепи с последующим образованием 22,25-эпоксигруппы в Но1оШгис1ае идет, как правило, после окисления С-17. Однако известны минорные гликозиды и без С-17 гидроксила, но с эпоксигруппой или С-25 ацетатной группой.
Таким образом, многие филогенетические изменения в структуре гликозидов, возникнув путем анаболии, сдвигаются путем акцелераций на все более и более ранние стадии биосинтеза, и в конечном итоге многие биосинтетические превращения происходят практически параллельно. В результате наблюдаемые иногда рекапитуляции оказываются вторичными, т. е. не соответствующие реальной филогенетической последовательности. Следовательно, выявление рекапитуляций на уровне всей молекулы гликозида имеет не слишком большой смысл: более рационально эволюцию агликонов рассматривать отдельно от эволюции углеводных цепей.
Сдвиги биосинтетических стадий могут создавать условия и для новых биохимических реакции. Пожалуй, наиболее важный случай гетерохронии в эволюции гликозидов голотурий - переход от 18(16)- к 18(20)-лактонам, процесс, который можно было бы назвать "голостанизацией". Как показали химические исследования, проведенные ранее, в случае образования интермедиата с С-18 карбоксилом и гндрокспламп при С-20 и С-16 происходит замыкание лактона на С-16, а не на С-18. Поэтому образование 18(20)-лактона может происходить лишь в отсутствии С-16 гидроксила. В пользу этой гипотезы говорит и последующая полная редукция С-16-кислородных функций в ходе дальнейшей эволюции, поскольку эт1 соответствует давно известному в сравнительной анатомии правилу Менерта о том, что органы, закладка которых задерживается по времени, в холе дальнейшей эволюции редуцируются.
Определенное значение для эволюции онтогенезов имеют гетеротопии, т. е. сдвиги тех или иных органов или их частей с мест их закладки в процессе индивидуального развития организмов. Подобные явления также можно отметить и для эволюции биосинтеза в тех случаях, когда в его ходе имеются молекулярные перегруппировки. Например, сдвиги метальных групп в процессе циклизации сквалена в ходе биосинтеза агликонов гликозидов голотурий вполне можно рассматривать как очень характерные случаи гетеротопии.
Применение теории филэмбриогенезов к изучению эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий показало, что первые стадии этого процесса имели, по-видимому, анаболический характер. На более Дюздних стадиях большее значение приобретали девиации и гетерохронии, что вело к несовпадению филогенетических и биосинтетических последовательностей для этих биомолекул.
Таким образом, при построении филогенетических рядов биомолекул необходимо учитывать возможность несовпадения хода филогенеза и последовательностей стадий биосинтеза.
4.4. Морфо-функцпональный подход к изучению структурно-функциональных
отношений биомопекул и их эволюции
Сформулируем общую процедуру применения морфологических закономерностей эволюции для построения филогенетических рядов бпомолекул. Для составления такого ряда необходимо: 1) сопоставить структуры и таксономическое распределение сравниваемых бпомолекул и, исходя из этого, построить гипотетический ряд; 2) провести биогестирование выбранного ряда веществ на активность, близкую по механизму к природной функции: 3) полученные структурно-функциональные зависимости проанализировать, принимая во внимание сравнительно-анатомические модели эволюции функций (модуы органогенеза), а именно филогенетическую субституцию органов (по Клеиненбергу) или функций (но Северцову); при этом учесть модус интенсификации функций. Если увеличение биологической активности в
выбранном ряду не происходит или происходит незначительное снижение биологической активности, то необходимо учесть возможности: а) интенсификации функций за счет улучшения транспортных свойств (растворимости или летучести), б) выигрыш в метаболической стоимости, в) эволюционную блокировку нежелательных отклонений в биосинтезе. В случае необходимости скорректировать ряд; 4) учесть возможные способы трансформаций биосинтеза членов ряда. Совпадение биогенетической и филогенетической последовательности подтверждает правильность выбранной гипотезы. При несовпадениях этих последовательностей обратить особое внимание на способы, вызывающие отклонения от анаболического пути эволюции биосинтеза. Если эти отклонения не возможно объяснить такими способами эволюции биосинтеза как девиации, гетерохронии и гетеротопии, скорректировать гипотезу.
Подобная процедура применима далеко не во всех случаях, но использование даже ее отдельных частей представляется полезным.
Нижним пределом морфологаческого анализа, безусловно, является молекулярный и даже субмолекулярный уровень. В то же время на этом структурном уровне действуют и свои, чисто химические законы. Возникающий на стыке эволюционной морфологии и сравнительной биохимии подход, заключающийся в применении сравнительно-морфологического метода на молекулярном уровне. с целью выявления общеморфологических закономерностей биохимической эволюции мы предлагаем назвать химической морфологией.
4.5. Заключение
Таким образом, используя различные подходы, мы построили филогенетические гипотезы эволюции трптерпеновых гликозидов голотурий, проверили эти гипротезы количественно!! оценкой биологической активности, близкой к их защитно!! биолтогическоп функции, уточнили некоторые детали такой эволюции с помощью методов морфо-функшюналыюго анализа. По
нашим данным, важнейшими эволюционными тенденциями для этих веществ являются переходы от неголостановых к голостановым производным, от веществ, содержащих углеводные цепи, построенные из остатков глюкозы и ксилозы, к хиновозу-содержащим гликозидам, от веществ с разветвленными углеводными цепями к гликозидам, имеющим линейный тетрасахаридный фрагмент и утратившим сульфатные группы в положениях С-б глюкозных и 3-0-метилглюкозных остатков.
ВЫВОДЫ
!. Установлена полная химическая структура девяти новых тритерпеновых гликозидов голотурий из отрядов Aspidochirotidi и Dendrochirotida. Пять известных тритерпеновых гликозидов найдены в неизученных ранее голотуриях.
2. Впервые выделены представители новых структурных групп гликозидов голотурий, а именно, гликозиды, содержащие сульфатные группы в положении С-6 глюкозных и З-О-метилглюкозных остатков, а также имеющие по две сульфатные группы в углеводной цепи, вещества, содержащие 18(16)-лактон в агликоне, и гликозиды с 18(16)-лактоном и укороченной боковой цепью.
3. Выполнен анализ таксономического распределения приблизительно девяноста гликозидов из более, чем пятидесяти видов голотурий, относящихся преимущественно к отрядам Aspidocliirotida и Dendrochirotida. Подтверждена таксономическая специфичность гликозидов голотурий. На основании данных о структуре гликозидов обсуждена филогения семейств Sticliopodidae и Holothuriidae, проведена ревизия рода Bohadschin этого семейства с выделением нового рода Pearsonothuria, получены данные о таксономической обособленности северо-тихоокеанских стихоподид.
4. Изучение таксономическою распределения гликозидов показало, что в эволюции гликозидов голотурий имеется определенная направленность и гомологическая изменчивость. Эволюция носит мозаичный характер, в ней существуют уровни, которые разные группы голотурий проходят параллельно и асинхронно. Общая направленность такой эволюции - от ланостановых
- -
производных через соединения с 18(16)-лактоном к соединениям голостанового ряда; от голостановых производных с кислородными функциями при С-16 к веществам, не имеющим кислородных функций в этом положении; от углеводных цепей, состоящих из ксилоз и сульфатированных глюкоз, к содержащим хиновозу и имеющим сульфатную группу при С-4 ксилозы или утратившим последнюю. Наличие сходных циклов изменчивости гликозидов в различных отрядах голотурий свидетельствует о длительном параллельном развитии этих отрядов.
5. Исследована гемолитическая активность полученной нами для проверки гипотез об эволюции гликозидов серии из 24 этих веществ и их производных. Установлена зависимость мембранолитического действия гликозидов от особенностей строения агликона, числа моносахаридных звеньев углеводной цепи, характера ее разветвления, числа и положения сульфатных групп в углеводной цепи, а также наличия или отсутствия З-О-метильной группы в терминальном моносахаридном остатке.
6. Проанализированы структурно-функциональные зависимости для всех гликозидов голотурий, для которых выполнены количественные определения мембранолитического (в том числе гемолитического) действия. На основании системно-теоретического (холистского) подхода Ван-дер-Клааува - Дуллемейера к описанию морфо-функциональных комплексов выполнено графическое неколичественное моделирование структурно-функциональных отношений гликозидов голотурий. Показано, что увеличение защитного действия может реализоваться в ходе эволюции изменением совершенно различных структурных фрагментов гликозида. Возможность решения одной и той же биологической задачи различными способами предлагаете:! назвать морфологической' вырожденностью биологических функций.
7. Структурно-функциональные отношения и эволюция гликозидов проанализированы с помощью концепции модусов органогенеза. Для гликозидов голотурий выявлены случаи эволюции по модусам интенсификации функций, расширения функций, субституции функций, субституции органов, компенсации функций. В эволюции гликозидов выявлен новый модус - стабилизация
функций эволюционной блокировкой. Показано, что эволюция гликозидов голотурий имеет ярко выраженный адаптивный характер, причем в ее ходе наблюдается увеличение защитного действия или выигрыш в «метаболической стоимости» биосинтеза соответствующего гликозида.
8. На примере тритерпеновых гликозидов голотурий показано глубокое внутреннее сходство процессов биосинтеза и органогенеза, позволившее применить к анализу эволюции биосинтеза гликозидов голотурий теорию филэмбриогенезов. Для гликозидов голотурий прослежена эволюция их биосинтеза по таким модусам как анаболия, девиация, а также гетерохронии и гетеротопия.
9. Применение к исследованию эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий нового подхода, заключающегося в использовании для этой цели общеморфологических методов и концепций, показало, что нижним пределом морфологического анализа является не клеточный, а молекулярный и даже субмрлекулярный уровни. С помощью этого подхода, на основе количественных данных по биологической активности подтверждены и уточнены выводы об эволюции гликозидов, сделанные нами при изучении таксономического распределения этих веществ.
Основные публикации по теме диссертации:
1. Калинин В. И., Стоник В. А., Авилов С. А., Еляков Г. Б. Гликозиды голотурии Hobthuria edtdis // Химия природ, соединений. 1981. N 3. С. 403 - 404.
2. ' Калинин В. И.. Стоник В. А. Гликозиды морских беспозвоночных. Структура голотурнна Ат из голотурии Holothnria edtdis // Химия природ, соединений. 19S2. N 2. С. 215 - 219.
3. Калинин В. И., Стоник В. А. Гликозиды голотурии Bohadschia graeffei// Химия природ, соединений. 1982. N б, 7S9 - 790.
4. Калинин В. И., Степанов В. Р., Стоник В. А. Псолгосозид А -новый тритерпеновый гликозпд из голотурии Psoitis fabricii 11 Химия природ, соедин. I9S3. N 6. С. 7S9 - 790.
5. Левин В. С., Калинин В. И., Стоник В. А. Опыт использования химических признаков при пересмотре таксономического статуса голотурии ВоИтЫиас выделением нового рода // Биол. моря. 1984. N 3. С. 33 - 38.
6. Левин В. С., Калинин В. И., Мальцев И. И., Стоник В. А. Строение тритерпеновых гликозидов и систематика щитовидношупальцевых голотурий // Биол. моря. 1985. N 2. С. 3 - 11.
7. Калинин В. И., Калиновский А. И., Стоник В. А. Структура псолюсозида А - основного тритерпенового гликозида из голотурии Ло/оу/пЬпсп // Химия природ, соединений. 1985. N 2. С. 212 - 217.
8. Левин В. С., Калинин В. И., Федоров С. Н., Смайли С. Структура тритерпеновых гликозидов и систематическое положение двух видов голотурий семейства 8ис1юросНс1ае // Биол. моря. 19в6. N 4. С. 72 - 77.
9. Калинин В. И., Калиновский А. И., Стоник В. А. Онекотаногенин -новый тритерпеновый генин из голотурии Л»//«1 /аЬпси // Химия природ, соедин. 1987. N 5. С. 674 - 678.
10. Калинин В. И., Афиятуллов Ш. Ш., Калиновский А. И. Тритерпеновые гликозиды голотурии ЕирепШс1п pseшloql¡inqlleselluUl // Химия природ, соединений. 1988. N 2. С. 221 - 225.
11. Калинин В. И., Калиновский А. И., Стоник В. А., Дмитренок П. С., Елькин 10. Н. Структура псолюсозида В - неголостанового тритерпенового гликозида из голотурий рода Рзокк // Химия природ, соединений. 1989. N 3. С. 361 - 368.
12. Калинин В. И., Стоник В. А., Калиновский А. И., Исаков В. В. Структура псевдостихопозида А - основного тритерпеновго гликозида из голотурии /Ъе/н/си/!с/юр!К /гас/на// Химия природ, соединений. 1989. N 5. С. 678 - 684.
13. Калинин В. И:, Стоник В. А., Авилов С. А. Гомологическая изменчивость и направленность • в эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий (Но1оишпо1с1еа, Ес1ипос1егта1а) // Жури. общ. биологии. 1990. "Г. 51. N 2. С. 247 - 260.
14. Калинин В. И., Стоник В. А. Эволюция вторичных метаболитов морских организмов: параллелизмы, конвергенция, биохимическая координация, химическое детерминирование//Вестник ДВО АН СССР. 1990. N 2. С. 120 - 129.
15. Авилов С. А., Калинин В. И., Калиновский А. И., Стоник В. А. Кукумариозид G2 - минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix// Химия природ, соединений. 1991. N 3. С. 438 - 439.
16. Калинин В. И., Стоник В. А. Химическая морфология - новый подход к изучению биохимической эволюции // Вестник ДВО АН СССР. 1991. N I. С. 54 - 65.
17. Калинин В. И. Морфологические закономерности в эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий (Holothurioidea, Echinodermata) // Журн. общ. биологии. 1992. Т. 53, N 5. С. 672 - 688.
1S. Калинин В. И., Авилов С. А., Калиновский А. И., Стоник В. А. Кукумариозид G3 - минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrixI! Химия природ, соедин. 1992. N 5. С. 729 - 730.
19. Калинин В. И., Авилов С. А., Калиновский А. И., Стоник В. А., Мпльгром Ю. М., Рашкес Я. В. Кукумариозид G4 - новый тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix // Химия природ, соединений. 1992. N 6. С. 69! - 694.
20. Kalinin V. 1., Volkova О. V., Likhatskaya G. N„ Prokofieva N. G., Agafonova 1. G., Anisimov M. M., Kalinovsky A. I., Avilov S. A., Stonik V. A. Hemolytic Activity of Triterpene Glycosides from Cucumariidae Family Holothurians and Evolution of This Group of Toxins// J. Nat. Toxins. 1992. V. 1, N 2. P. 17 - 30.
21. Калинин В. И., Левин В. С., Стоник В. А. Химическая морфология: Тритерпеновые гликозпды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata). Владивосток: Дапьнаука, 1994. 2S4 с.
22. Avilov S. A., Kalinin V. I., Makarieva T. N„ Stonik V. A., Kalinovsky A. 1., Rashkes Y. W., Milgrom Y. M. Structure of Cucumarioside Gi. a Novel Nonliolostane Glycoside from the Sea Cucumber Eupentacta fraudatrix / j J. Nat. Prod. 1994. V. 57, N 8. P. 1166 - 1171.
23. Kalinin V. I., Anisimov M. M., Prokofieva N. G., Avilov S. A., Afiyatullov Sli. Sh., Stonik V. A. Biological Activities and Biological Role of Triterpene Glycosides from Holothuroids (Echinodermata) // Echinodemi Studies / Ed. Jangoux M., Lawrence J. M. A. A. Balkema, Rotterdam, Brookfield: 1996. V. 5. P. 139 - 181.
24. Kalinin V. 1., Prokofieva N. G., Likhatskaya G. N., Sclieutsova E. B., Agafonova 1. G., Avilov S. A., Drozdova O. A. Hemolytic Activities of Triterpene Glycosides from the Holothurian Order Dendrochirotida: Some Trends in the Evolution of This Group of Toxins // Toxicon. 1996. V. 34. N. 4. P. 475 - 483.
25. Kalinin V. I.. Stonik V. A. Application of Morphological Trends of Evolution to PUylogenetic Interpretation of Chemotaxonomic Data // J. Theor. Biol. 1996. V. 180. P. 1 - 10.
26. Kalinin V. I., Avilov S. A, Kalinina E. Y., Korolkova O. G., Kalinovsky A. I., Stonik V. A., Riguera R., Jimenez C. Structure of Exinùsoside A, a Novel Triterpene Glycoside from the Far-Eastern Sea Cucumber Psolus eximius // J. Nat. Prod. 1997. V. 60, N 8. P. S17 - 819.
Владимир Иванович Калинин
ТРИ'ГЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ (HOLOTHURIOIDEA, ECHINODERМАТА) - СТРУКТУРА, ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ, ЭВОЛЮЦИЯ
Автореферат
И ад. лиц. ЛР № 040118 от 15.10.96 г. Подписано к печати 26.01.98 г. Формат 60x84/16. Бумага типографская № 1. Печать офсетная. Усл. п. л. 3,9. Уч.-изд. л. 3,15. Тираж 100 экз. Заказ 51
Отпечатано в типографии издательства "Дальнаука" ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио, 7
-
Калинин, Владимир Иванович
-
доктора биологических наук
-
Владивосток, 1998
-
ВАК 03.00.04
- Дальневосточные голотурии рода Cucumaria
- Влияние гидролизата и экстракта из кукумарии японской на морфологию яичников крыс в разные стадии эстрального цикла
- Репродуктивная биология промысловой голотурии Cucumaria Frondosa (Gunnerus, 1776) Баренцева моря
- Механизмы взаимодействия тритерпеновых и стероидных гликозидов с липидными мембранами
- Биологическая активность и механизм действия некоторых полигидроксистероидов и тритерпеновых гликозидов
