Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полярных липидов и тритерпеновых гликозидов из морских организмов на конформацию и иммуногенность белковых антигенов тубулярных иммуностимулирующих комплексов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние полярных липидов и тритерпеновых гликозидов из морских организмов на конформацию и иммуногенность белковых антигенов тубулярных иммуностимулирующих комплексов"

На правах рукописи

Воробьева Наталья Сергеевна

Влияние полярных липидов и тритерпеновых гликозидов из морских анизмов на конформацию и иммуногенность белковых антигенов тубулярных иммуностимулирующих комплексов

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет» МОН РФ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Санина Нина Михайловна

Официальные оппоненты: Булгаков Виктор Павлович

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, Биолого-почвенный институт ДВО РАН, главный научный сотрудник

Ермак Ирина Михайловна

доктор химических наук, старший научный сотрудник, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, главный научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «6» марта 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совет 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Д РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ Д РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки Д РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «/&» января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

алышсть темы. В 1981 году Корана Х.Г. с сотр. (Huang et al., 1981) впервые показали, что ация денатурированного бактериородопсина в фосфолипидном окружении приводит к овлению функциональных свойств белка. С тех пор проблема липид-белковых ействий и их связи с конформационными и функциональными изменениями белков я ключевой для современной биохимии и биологии в целом. Однако эта проблема на не только в теоретическом аспекте: в результате ее решения может появиться мощный ент для работы в таких практических областях как медицина, биотехнология, енерия и дизайн белков (Stanley, Fleming, 2008; Popot, 2014). В частности, известно, что ование липидных частиц (липосом, ISCOMATRIX*1, тубулярных иммуностимулирующих ксов (ТИ-комплексов)) в качестве адъювантных носителей антигенов в вакцинах нового шя позволяет предположить, что варьирование липидного окружения белковых антигенов способствовать повышению их иммуногенности. Наночастицы ТИ-комплексов, состоящие галактозилдиацилглицерина (МГДГ) из морских макрофитов, тритерпенового гликозида риозида (КД) А2-2 из голотурии Cucumaria japónica и холестерина (Хол), представляются ее перспективными адъювантными конструкциями для современных субъединичных так как стимулируют более высокий иммунный ответ по сравнению с самыми сильными нтами - ISCOMATRIX*' и полным адьювантом Фрейнда (Kostetsky et al., 2011). Липидный с для антигена ТИ-комплекса формирует МГДГ, физико-химические свойства которого, а других полярных липидов из морских пойкилотермных организмов изменяются в юсти от таксономического положения вида и сезона (Sanina et al., 2002, 2004, 2008). Это быть использовано для модуляции структурно-функциональных свойств белков не только но и in vitro, в частности для повышения иммуногенности белковых антигенов в составе венных липид-содержащих систем таких, как ТИ-комплексы.

ко несмотря на более тридцатилетнюю историю исследований влияния липидов на рно-функциональные свойства белков и увеличивающийся поток публикаций по этой нформация о полной цепи взаимосвязи от физико-химических свойств липидов к липид-рованной конформации белков и их функциям, особенно такой функции как генность, очень ограничена, вероятно, из-за повышенной сложности и трудоемкости енного с этим анализа. Еще менее ясно, как влияет на конформацию и иммуногенность а структура сапонинового компонента ТИ-комплексов, хотя свойство сапонинов лизировать белки привело к открытию иммуностимулирующих комплексов (ISCOM) -та ТИ-комплексов (Санина, Попов, 2004).

зованные сокращения:

С — высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия; ГМ-КСФ — цитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, ДСК - дифференциальная ющая калориметрия; ЖК - жирная кислота; ИЛ - интерлейкин; ИН - индекс ненасыщенности;

интерферон; КД - кукумариозид; МГДГ - моногалактозилдиацилглицерин; МНЖК -асыщенная жирная кислота; МЭЖК - метиловый эфир жирной кислоты; НЖК - насыщенная кислота; ПНЖК - полиненасыщенная жирная кислота, ТИ-комплекс - тубулярный тимулирующий комплекс; ТСХ - тонкослойная хроматография; ФХ - фосфатидилхолин; ФЭ -вдилэтаноламин; Хол - холестерин, ЧСА - человеческий сывороточный альбумин; EFTEM - Energy Transmission Electron Microskopy (просвечивающая электронная микроскопия с энергетической цией); ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (твердофазный иммуноферментный анализ);

рекомбинантный нерасщепленный мономер гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 rnia/04/2009); ISCOM - иммуностимулирующий комплекс с встроенным антигеном; TRIX8 - иммуностимулирующий комплекс без антигена; YOmpF - OmpF-подобный порин из ицательной бактерии Yersinia pseudotuberculosis.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было исследование влияния полярных липидов и тритерпен гликозидов из морских организмов на конформацию и иммуногенность белковых антигенов комплексов.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и определить физико-химические свойства полярных липидов из разных bi морских макрофитов и беспозвоночных, предназначенных для приготовления ТИ-комплексов.

2. Выделить и идентифицировать индивидуальные кукумариозиды из Cucumaria japo предназначенных для использования в качестве сапониновой составляющей ТИ-комплексов.

3. Исследовать влияние МГДГ из разных видов морских макрофитов на иммуногенно конформацию белковых антигенов ТИ-комплексов.

4. Исследовать влияние фосфолипидов— фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтанолаи (ФЭ) из разных видов морских беспозвоночных на иммуногенность белковых антигенов комплексов.

5. Исследовать влияние индивидуальных кукумариозидов и их фракций из С. japonic иммуногенность и конформацию белковых антигенов ТИ-комплексов.

В качестве модельных антигенов ТИ-комплексов были выбраны мембранные белки (О подобный порин из грамотрицательной бактерии Yersinia pseudotuberculosis (YO рекомбинантный нерасщепленный мономер гемагглютинина вируса гриппа Ai (A/Catífornia/04/2009)) (НАО)) и водорастворимый белок — человеческий сывороточный альб (ЧСА).

Научная новизна. Впервые изучено влияние физико-химических свойств полярных липид морских макрофитов и беспозвоночных и химической структуры тритерпеновых гликоз (кукумариозидов) из морских беспозвоночных на конформацию белков и их иммуногенн Впервые показано, что различное влияние полярных липидов и кукумариозидов из мор беспозвоночных на конформацию белков позволяет регулировать иммуногенность разли белковых антигенов ТИ-комплексов путем подбора липидного компонента. Использов липидной «нанофлюидики» можно рассматривать как преимущество новой стратегии повышения иммуностимулирующего потенциала липид-белковых комплексов.

Эффективность вакцинных препаратов, созданных на основе ТИ-комплексов, зависит не то от их липидных и сапониновых составляющих, но и свойств белкового антигена. Впе показано, что ТИ-комплексы могут быть использованы как адъюванты для водораствори белковых антигенов в составе субъединичных вакцин.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разраб и оптимизации субъединичных вакцинных препаратов на основе липидных/сапонин адъювантных носителей антигенов. Это позволит расширить сферу их применения в кач адъювантов водорастворимых антигенов. Результаты данной работы могут быть использо при проведении теоретических и практических занятий для студентов - биологов и медик соответствующих ВУЗах.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на следующих конференциях: XII, XIII Всероссий молодежных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии (Владиво 2009, 2010), IX, X региональных конференциях студентов, аспирантов вузов и на; организаций Дальнего Востока России по актуальным проблемам экологии, морской биолог биотехнологии (Владивосток, 2010, 2011), 52nd International Conference on the Bioscience of L (Варшава, 2011), 4th Asian Symposium on Plant Lipids (Гонконг, 2011), 2nd Annual Internal Congress of Marine Biotechnology (Далянь, 2012), VI Всероссийском с международным уча Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), 38th Congress (Санкт-Петербург, 2013), 15th International Congress of Immunology (Милан, 2 International Conference «Biotechnology and Quality of Life» (Москва, 2014).

икацпи. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 статьи в ведущих 1руемых научных журналах, 1 патент и 11 тезисов.

ктура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов дов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 ах, иллюстрирована 24 рисунками и содержит 11 таблиц. Список литературы насчитывает шенований.

одарности. Автор выражает благодарность Калинину В.И., Сильченко A.C., Авилову С.А., вскому А.И., Ким Н.Ю., Аминину Д.Л. (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток), Шнырову В.Л. рситет г. Саламанка, Испания), Мазейка А.Н., Цыбульскому A.B., Веланскому П.В., вой Л.А. (ФГАОУ ВПО ДВФУ МОН РФ, Владивосток) за помощь в получении и анализе , Новиковой О.Д. и Портнягиной О.Ю. (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток) за авленный порин для проведения работы. Глубокую признательность и благодарность Костецкому Э.Я. и своему научному руководителю Саниной Н.М. за помощь и жку в работе.

та выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ ания 4.2007.2011, 4.583.2011 и 172.2014, госконтракт П340, проект АВЦП 2.2.2/603), ельства РФ (контракт 11.G34.31.0010, госконтракт ФЦП 02.740.11.5088), Президента РФ П-3367.2013.4) и CRDF (грант RUXO-003-VL-06-BP4M03).

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

выделения МГДГ использовали морские макрофиты Sargassum pallidum, Laminaria , Ulva fenestrana, Zostera marina и Ahnfelíia tobuchiensis, для выделения ФХ и ФЭ - морские оночные Strongylocenlrotus intermedins и Distolasterias nippon. Экстракцию общих липидов ских макрофитов и беспозвоночных проводили по методу Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, Препаративное выделение МГДГ осуществляли на колонке с силикагелем 43-60 мкм Германия) при элюировании системой хлороформ-ацетон (1:1, об/об). ФХ выделяли на е с нейтральной окисью алюминия системой хлороформ-метанол-25%-ный аммиак .4, об/об). ФЭ выделяли на колонке с силикагелем этой же системой. Анализ липидов или методом ТСХ с использованием силикагеля, приготовленного по методу (Svetashev, sky, 1972).

в виде МЭЖК, которые получали по методу (Carreau, Dubacq, 1985), анализировали м ГЖХ на хроматографе Agilent 3700 с пламенно-ионизационным детектором (Agilent, Использовали капиллярную колонку Carbowax-20M 25 мх0.2 мм, газ-носитель - гелий, тура термостата - 200 °С (Kramer et al., 1985). Идентификацию ЖК проводили при î метода "углеродных чисел" (Christie, 1988).

ровязкость образцов МГДГ определяли методом латеральной диффузии флуоресцентного ирена (Galla, Sackmann, 1974) на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Hitachi, Япония), шение между интенсивностью флуоресценции эксимера и мономера (Ie/Im) отражало ь эксимеризации пирена, которая пропорциональна жидкостности липидной пробы, ическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения lot 3.02 (Jandel Scientific, США).

мариозиды выделяли из голотурии С. japónica. Стенку тела голотурии С. japónica изировали и обрабатывали 50%-ным этанолом при кипячении в течение 3 ч. Для удаления акта солей и водорастворимых примесей использовали гидрофобную хроматографию на оме-1, фракция 0.5-1 мм (НПО «Биолар», Латвия). Колонку заполняли сорбентом в 95%-ноле, который затем уравновешивали водой. Водный экстракт наносили на колонку, и фовавшисся вещества промывали дистиллированной водой до отрицательной реакции на -ион. Сумму тритерпеновых гликозидов и стеринов элюировали 50%-ным этанолом, риозиды идентифицировали с помощью микро-ТСХ в системе хлороформ-этанол-вода 0:17, об/об). Полученную фракцию обезвоживали с силикагелем 40-63 мкм (Merck, ия) и элюировали стерины системой хлороформ-этанол (3:1, об/об). Тритерпеновые вды элюировали системой пиридин-вода (95:5, об/об), контролируя выход вещества как

описано ранее. Полученную фракцию тритерпеновых гликозидов многокр хроматографировали на колонке с силикагелем 40-63 мкм (Merck, Германия) в си хлороформ-этанол-вода (100:100:17, об/об). В результате получали 4 фракции, кот анализировали и разделяли с помощью ВЭЖХ-МС на хроматографе Shimadzu LC-8 квадрупольным масс-спектрометрометром HPLC LCMS-2010EV (Шимадзу, Япония) в ре детектирования отрицательных ионов, при напряжении на источнике ионов 3 кВ в диапа 1000-1700 m/z, с использованием детекции по избранным ионам. Деление производил! обращенно-фазовой колонке Sim-pack PREP-ODS 20 х 250 мм (Шимадзу, Япония); вещ элюировали в градиенте концентраций метанола в воде. Концентрация метанола возрастала до 75% за 20 мин, затем - от 75 до 90% за 20 мин; далее элюцию продолжали 90%-ным метан в течение 40 мин со скоростью 10 мл/мин. Из фракции 1 были выделены кукумариозиды, кот соответствовали пики с m/z 1299 и m/z 1284. Из фракции 3 выделили вещества, соответств) пикам с m/z 1299 и m/z 1284. Подвижность веществ, которым соответствовали пики с m/z 1 была разной. Фракции 2 и 4 содержали сложную смесь, состоящую примерно из 10 компоне которые не разделялись и в дальнейшем использовались как фракции 2 и 4 наря индивидуальными кукумариозидами для модификации ТИ-комплексов. Структуру получе веществ идентифицировали методом 13С-ЯМР спектроскопии.

ТИ-комплексы получали, как описано (Kostetsky et al., 2011). ТИ-комплексы на основе Ф ФЭ получали аналогично, но вместо раствора МГДГ использовали раствор ФХ или соответственно.

Исследование и фотографирование образцов ТИ-комплексов проводили на просвечива электронном микроскопе Libral20 (Zeiss, Германия) как описано (Kostetsky et al., 2011).

В качестве антигенов ТИ-комплексов использовали тримерный порин YOmpF и pseudotuberculosis (штамм 598, 1В серовар), любезно предоставленный сотрудниками лаборат Молекулярных основ противобактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН, рекомбинан нерасщепленный мономер гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 (A/California/04/2009) Biological Inc., Китай) и человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) (Sigma, США), исследования адъювантного эффекта ТИ-комплекса КД-Хол-МГДГ/ФХ/ФЭ в вес соотношении 6:2:4 антиген в чистом виде и в составе ТИ-комплекса вводили мышам линии В или СВА весом 18-21 г, любезно предоставленных виварием ТИБОХ ДВО РАН. Дозы КД и составляли 1 мкг/мышь. Дозы порина и гемагглютинина — 0.1 мкг/мышь. В ка экспериментальную группу входило по 10 животных, которых иммунизировали двукратно (в 14-й день). Забор крови животных проводили на 21-й день. Биологические испытания прово на базе вивария ТИБОХ ДВО РАН. Эффективность включения белка в ТИ-комплекс оцени после центрифугирования суспензии при 120000 g при 4 °С в течение 2-х ч на ультрацентри Optima L-90 (Beckman Coulter Inc., USA). Количество невключившегося белка определя супернатанте. Гемагглютинин и порин включались на 95%, ЧСА не включался. Для определ содержания специфических антител и цитокинов в сыворотке крови подопытных живо использовали метод ELISA. Для определения цитокинов использовали наборы OptEIA™ ELISA SET (BD, USA).

Исследование термоденатурации порина и гемагглютинина в индивидуальном состояни комплексе с липидами проводили с помощью дифференциальной сканирующей калориметр микрокалориметре Scal-1 (СКБ БП РАН, Пущино). Температурные зависимости моля теплоемкости денатурации белка были проанализированы с использованием програ разработанной Кургановым Б.И. и др. (Kurganov et al., 1997) и программного пакета OR (MicroCal, США).

Спектрофлуориметрическое исследование гемагглютинина и порина в индивидуал состоянии и в комплексе с липидами или кукумариозидами проводили методом собстве флуоресценции белка на спектрофлуориметре PCI (ISS, США). Длина волны возбуждаю света - 296 нм. Деконволюцию полученных спектров осуществляли с помощью прогр ORIGIN (MicroCal, США). Спектры кругового дихроизма были сняты на спектрополяри Jasko J-500A (Jasko, США) при 25 °С. Спектральная полоса пропускания - 2 нм, длина п\

- 1 мм в дальнем УФ диапазоне (195-250 нм). Расчет элементов вторичной структуры был ен по методу Провенчера-Глокнера (Provencher, Glockner, 1981) и программы CDPro a et al„ 2000).

Статистическую обработку результатов, а также построение графиков проводили с ью Microsoft Excel 2010. Данные анализировали с использованием i-критсрия Стьюдента. ия между средними арифметическими считали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

того чтобы понять роль химической структуры полярных липидов и тритерпеновых 1дов в регуляции эффективности вакцин на основе ТИ-комплексов, нами было исследовано е этих соединений, выделенных из разных видов морских макрофитов и беспозвоночных на мацию и иммуногенность модельных белковых антигенов — порина YOmpF, ггинина вируса гриппа и ЧСА. На первом этапе исследования из разных морских штов были выделены МГДГ, изучен состав их жирных кислот и микровязкость, остав жирных кислот МГДГ из морских макрофитов

видно из таблицы 1, МГДГ, выделенные из 5 видов морских макрофитов, значительно ются, что согласуется с ранее полученными результатами (Sanina et al., 2004, 2008).

а 1. Общие показатели состава жирных кислот МГДГ из морских макрофитов_

е кислоты A. tobuchiensis L. japonica_S. pallidum_U. fenestrata Z. marina

щ./Насыщ. ПНЖК

347 6.7 0.97

387 7.7 1.55

248 3.8 0.64

357 75.9 38.75

258 12.0 7.5

индекс ненасыщенности жирных кислот, Ненасыщ./Насыщ. - отношение суммы щенных к сумме насыщенных жирных кислот, n-З/ п-6 - соотношение между суммами п-3 линенасыщенных жирных кислот (ПНЖК).

икровязкость МГДГ из морских макрофитов

'ольшие значения Ie/Im и, следовательно, наибольшая текучесть (самая низкая язкость) были зарегистрированы для МГДГ из A. tobuchiensis и L. japonica, а наиболее оказался МГДГ из Z. marina. МГДГ из U. fenestrata и S. pallidum характеризовались ми значениями микровязкости (табл. 2).

а 2. Коэффициент эксимеризации пирена (Ie/Im) в образцах МГДГ, выделенных из разных орских макрофитов

A. tobuchiensis

L. japonica

U.fenestrata

S. pallidum

Z. marina

еднее ение ± дартная ибка

0.619 ± 0.002

0.576 ± 0.002

0.519 ± 0.009

0.542 ± 0.003

0.365 ± 0.009

лияние МГДГ из разных видов морских макрофитов на иммуиогенность и мацию порина в составе ТИ-комплексов Выбор антигенной формы порина

экспериментов была выбрана тримерная форма порина, так как эта форма более ивно стимулировала выработку антипориновых антител, чем мономер порина в составе плексов (в 4 и 3 раза по сравнению с соответствующими формами антигена, введенного в виде, соответственно).

Влияние МГДГ из морских макрофитов на образование антипориновых антител

омплексы, содержащие МГДГ из разных морских макрофитов, отличались по их нтному эффекту (рис. 1). Наибольший иммуностимулирующий эффект (повышение уровня риновых антител в 4 раза по сравнению с индивидуальным порином) наблюдался при

использовании в составе ТИ-комплексов МГДГ из зеленой водоросли U. fenestrata и б водоросли S. pallidum. Жирнокислотный состав МГДГ из этих таксономически различ водорослей существенно различался (табл. 1). Несмотря на это, микровязкость МГДГ и: fenestrata и S. pallidum была схожей и характеризовалась средними значениями по сравненг МГДГ из других макрофитов (табл. 2).

Рис. 1. Содержание антипориновых антите сыворотке крови мышей, иммунизированных пор: в составе ТИ-комплексов на основе МГДГ из ра' видов морских макрофитов. По оси абсци экспериментальные группы живо!

иммунизированных индивидуальным триме]: порином (ТП) или ТП в составе ТИ-компле содержащих МГДГ из L. japónica / A. tobuchiensi, marina / S. pallidum / U. fenestrata (ТП+ТИ (L.j.) (A.t.) / ТИ (Z.m.) / ТИ (S.p.) соответственно). Кош - интакгные животные. По оси ординат - содерж антител, выраженное в единицах оптич-: плотности при длине волны 450 нм (А Представлены значения средних арифметическ доверительный интервал.

Влияние других МГДГ на адъювантный эффект ТИ-комплексов было слабее (в 1.3-2.8 ра: уменьшалось в ряду Z marinan A. tobuchiensis^L. japónica соответственно. Таким обра физическое состояние МГДГ является более важным для проявления адъювантной актив» ТИ-комплексов, чем состав жирных кислот сам по себе. Умеренная микровязкость липид' окружения, вероятно, необходима для оптимального представления антигенных детерми! белка.

3.3. Влияние МГДГ из разных морских макрофитов на цитокиновый профиль

В регуляции иммунного ответа существенную роль играют цитокины, которые служат одни сигналов, предопределяющих тип Т-клеточного иммунного ответа — Th 1 или Th2 (Sjolander е 2001), и, соответственно, эффективность вакцины. Иммунизация животных порином в составе' комплексов приводила к сравнительно небольшим изменениям в содержании большин цитокинов (рис. 2). На этом фоне выделялся Thl-индуцирующий ИЛ-12, уровень которого зам снижался в 1.2-1.7 раза по сравнению с эффектом индивидуального порина. Минимал! изменения уровня ИЛ-12 наблюдались при использовании ТИ-комплекса, содержащего МГД U. fenestrata или S. pallidum. Максимальный эффект оказывал ТИ-комплекс, содержащий МГД L. japónica. Таким образом, в тенденции влияния МГДГ из различных морских макрофито цитокиновый механизм регуляции иммунного ответа и влиянием этого гликолипида на уро антипориновых антител имеется сходство.

Рис. 2. Содеря' цитокинов в сывое крови мы

иммунизирова1 порином в составе комплексов на ос МГДГ из разных и морских макрофитов оси абсцисс — цито.:; содержание кот; было определено! сыворотках 1

экспериментал1 животных. Обозна-как к рис. 1.

0,350

5 0,250 ■j

0,200

0,150 0,100 0,050 0,000

■ Контроль ШТП+ТИ(Щ а ТП+ТИ (Z.m.)

ватп+ти (u.f.)

□ ТП

е тп+ти ¡A.t.) а тп+ти {s.p.

ИЛ-2

ИЛ-4

ИЛ-6

ИЛ-10

ИЛ-12 ИФН-гаммз ГМ-КСФ

I

I

Влияние МГДГ из разных видов морских макрофитов на конформацию порина 1. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

¡даденатурации порина при рН 7.5 соответствовал хорошо выраженный калориметрический 1д, температура максимума теплопоглощения которого (Тт) зависела от скорости ования. Термоденатурация порина при таких экспериментальных условиях была всегда гима. Анализ термоиндуцированных переходов осуществляли на основе модели адийной необратимой денатурации (или модели двух состояний) NiiDj, где Nj и D3 -ый и денатурированный тример порина соответственно, и к - константа скорости рации первого порядка, которая меняется в зависимости от температуры в соответствии с ншем Аррениуса. Избыточную теплоемкость Срех анализировали с помощью нелинейного наименьших квадратов, приближая данные к модели двух стадийной кинетически ¡тированной необратимой денатурации (Kurganov et al, 1997). Результаты приближения ibi на рисунке 3 (сплошная линия) и в таблице 3.

Рис. 3. Температурная зависимость избыточной молярной теплоемкости индивидуального тримерного порина YOmpF (светлые круги) и в комплексе с МГДГ из А. tobuchiensis (темные круги), U. fenestrata (открытые треугольники), Z. marina (темные треугольники), S. pallidum (светлые ромбы) в 0.03 М Трис-HCl буфере, рН 7.5. Скорость сканирования - 60 К h"1. Сплошная линия -наилучшая подгонка к модели двухстадийной кинетически детерминированной

необратимой денатурации (Kurganov et а], 1997).

55 70 75 80 85 90 9s 100 Техчпература, °С

льтаты ДСК, которые позволяют обнаружить интегральные изменения в биологических юлекулах, показали, что термостабильность порина увеличивается под воздействием Это выражалось в увеличении значений Тт и энергии активации процесса денатурации (Ел) , табл. 3). МГДГ со средней микровязкостью умеренно стабилизировали конформацию гпособствуя его максимальной иммуногенности. Так, наиболее вязкий МГДГ из Z. marina в ыпей степени стабилизировал конформацию белка, а эффект наименее вязкого МГДГ из А. ensis был минимальным.

да 3. Значения параметров уравнения Аррениуса для тепловой денатурации порина и его íkcob с МГДГ из морских макрофитов (Ahnfeltia tobuchiensis, Ulva fenestrata, Zostera marina, "um pallidum).___

етры Образцы

Порин Порин + МГДГ Ahnfeltia Порин + МГДГика Порин + МГДГгоЯега Порин + МГДГэащаББит

pal mol"1) 99.3 100.1 104.6 113.9 107.3

360.5 360.8 360.8 361.9 362.2

al mol"1) 72.3 127.4 143.8 206.8 198.9

0.9989 0.9998 0.9994 0.9991 0.9987

Ьазница энтальпий между денатурированным и нативным состояниями белка (энтальпия рации), Т* - температура, при которой константа скорости денатурации (к) равна 1 мин" ; Ел ¡риментальная энергия активации процесса денатурации, г - коэффициент корреляции.

3.4.2. Собственная флуоресценция порина

Интенсивность флуоресценции белка увеличивалась в зависимости от липидного окруже (рис. 4). МГДГ, выделенные из Z marina и A. tobuchiensis, вызывали максимальный эффек эффект МГДГ из S. pallidum и U.fenestrata был минимальным. Деконволюции эксперименталь: спектров порина на элементарные компоненты, соответствующие эмиссии белкового флуороф (триптофана) в зависимости от специфического микроокружения (Пермяков, 2003) (рис. 4, т; 4), показала, что МГДГ из S. pallidum влиял на распределение спектральных форм в наимены степени: содержание формы I не изменялось, а содержание формы II увеличивалось на 4% за i формы S по сравнению с вкладом этих спектральных форм индивидуального порина.

Наоборот, под влиянием МГДГ из U. fenestrata содержание формы S сохранялось, а bi формы I значительно возрастал в связи с исчезновением спектральной формы II. Наибе глубокие конформационные изменения, влияющие на вклад всех спектральных фс происходили в порине под влиянием МГДГ из A. tobuchiensis и Z. marina.

Рис. 4. Спектры собственной флуоресцен (светлые круги) индивидуального порина YOi (а) и YOmpF в комплексе с МГДГ из мора макрофитов: A. tobuchiensis (b), S. pallidum (el

Ч aj

¡5

•e-

¡S

fenestrata (d) и Z marina (e) в 0.03 M Трис-буфере, pH 7.5, и их приближение к теоретиче<

зоо зге а^о зео aso Длина волны, нм

модели дискретных состоянии оста'^ триптофана в белках (сплошная линия, кото является суммой спектральных компонентов ! и II (пунктирные линии)). Концентрация бел 0.05 мг/мл. Длина волны возбуждения - 296 нм1

Вероятно, сохранение вклада одной спектральных форм и более низкое содержу спектральной формы I в общем спе' флуоресценции порина под влиянием МГДГ и fenestrata или S. pallidum по сравнению с МГД A. tobuchiensis и Z marina имело решаю значение для формирования пространственнс антигенной структуры белка, что выразилось г-различной иммуногенности.

Таблица 4. Влияние МГДГ из морских макрофитов на распределение спектральных (J

триптофана в общем спектре флуоресценции порина, %

Образец Спектральные формы триптофана

S I II

Порин 28 53 19

Порин +МГДГ из A. tobuchiensis 23 77

Порин +МГДГ из S. pallidum 24 53 23

Порин +МГДГ из U. fenestrata 28 72

Порин +МГДГ из Z marina 9 77 14

3.4.3. Круговой дихроизм

Все образцы МГДГ оказывали незначительное влияние на вторичную структуру белка (табл

Р-структура р-изгиб Неупорядоченная Таблица 5.

структура Влияние МГДГ

65 32 3 из морских

гМГДГ из A. tobuchiensis 63 33 4 макрофитов на

к- МГДГ из 2. marina 59 37 4 вторичную

И- МГДГ из U. fenestrata 60 34 6 структуру

]+ МГДГ из S. pallidum 57 36 7 порина, %.

3 целом, описанные результаты показали, что одним из путей регуляции иммунного ответа '•я модуляция жирнокислотного состава липидного компонента ТИ-комплексов. При этом ское состояние МГДГ является более важным для проявления адъювантного эффекта, чем кирнокислотный состав. Таким образом, способность МГДГ регулировать (стимулирующий эффект ТИ-комплексов путем варьирования его микровязкости можно гривать как новую функцию этого гликолипида. МГДГ из S. pallidum и U. fenestrata, 1ие среднюю микровязкость, обладали минимальным влиянием на третичную структуру |о чем свидетельствовало сохранение вклада спектральных форм триптофана I или S в де порина (табл. 4). Можно говорить о том, что данные липидные образцы мягко иировали конформацию порина, что, вероятно, способствовало поддержанию антигенной |'ры порина, близкой к нативной. Именно это, скорее всего, обеспечивало максимальную эгенность YOmpF в составе ТИ-комплексов. Обнаруженная нами различная способность из морских макрофитов влиять на конформацию и иммуногенность порина в составе ТИ-ксов побудила исследовать возможность применения этого подхода для регуляции ^генности других белковых антигенов.

Влияние МГДГ из разных видов морских макрофитов на иммуногеннось и >мацию гемагглютинина в составе ТИ-комплексов

. Характеристика рекомбинантного мономера гемагглютинина вируса гриппа 1 (A/California/07/2009)

«стоящей работе мы использовали нерасщепленный рекомбинантный мономер ютинина вируса гриппа A/H1N1 (A/California/04/2009) (НАО) (Sino Biological Inc., Китай), [епленный мономер неинфекционен в отличие от расщепленного и характеризуется венно большей иммуногенностью, что свидетельствует о зависимости иммуногенности от его третичной структуры (Jackson et al., 1978). В состав НАО входят фрагменты, |'ствующие сигнальному пептиду и субъединицам НА1 и НА2. Последовательность с 530 по |инокислотный остаток была заменена полигистидиновым «хвостом». Судя по составу ислотной последовательности, НАО включает все антигенные сайты гемагглютинина: Sa, Ъ, за исключением Са (Hagembe, 2009; Igarashi et al., 2010). При инфицировании ответ ¡ма хозяина главным образом характеризуется индукцией антител, нейтрализующих эти >i (Prabakaran et al., 2010).

. Влияние МГДГ из разных морских макрофитов на образование антител против пютинина

изучения влияния МГДГ, выделенного из морских макрофитов (S. pallidum, U. fenestrata и iná), на иммуногенность НАО были иммунизированы мыши линии СВА. Введение ым индивидуального гемагглютинина НАО, в отличие от индивидуального порина из Г. uberculosis (рис. 1), не выявило его собственной иммуногенности (рис. 5). Введение того тгена в ТИ-комплексы на основе МГДГ из U. fenestrata, S. pallidum или Z. marina приводило атному увеличению содержания анти-НАО антител независимо от источника МГДГ (рис. также не совпадает с соответствующими результатами относительно порина YOmpF (рис. >собность которого стимулировать образование специфических антител существенно а от физико-химических свойств МГДГ, выделенных из разных видов морских итов.

/ i

Рис. 5. Содержание антител против моно; гемагглютинина (НАО) в сыворотке крови мьи иммунизированных НАО в составе ТИ-комплексо основе МГДГ из разных видов морских макроф!: По оси абсцисс — группы живот иммунизированных индивидуальным НАО (НА) НАО в составе ТИ-комплексов, содержащих МГД U. fenestrata / S. pallidum / Z marina (НА+ТИ (I НА+ТИ (S.p.)/ НА+ТИ (Z.m.) соответстве! Контроль — интактные животные. По оси ордин содержание антител, выраженное в един! оптической плотности при длине волны 450 ш» 450). Представлены значения средних арифметиче ± доверительный интервал.

3.5.3. Влияние МГДГ из разных морских макрофитов на цитокиновый профиль

Введение НАО в ТИ-комплексы, включающие различные МГДГ, не влияло на содержа большинства цитокинов (рис. 6). Исключением являлся ГМ-КСФ, уровень которого повышал 1.8-2.3 раза по сравнению с группой, иммунизированной индивидуальным НАО. Эффект комплексов на основе МГДГ из Z. marina был максимальным, а МГДГ из U. fenestra

Рис. 6. Содержание цитокин: сыворотке крови мы; иммунизированных мономер гемагглютинином (НАО) или Н составе ТИ-комплексов на ос МГДГ из разных видов Mop¡ макрофитов. По оси абсцис цитокины, содержание коте было определено

экспериментальных rpyj

животных (обозначения как к 5). По оси ординат — содерж цитокинов, выраженное в един, оптической плотности при д; волны 450 нм (А < Представлены значения сре, арифметических ± доверител! интервал

ГМ-КСФ секретируется различными типами клеток и оказывает разнообразные эффект! иммунную систему, включая стимулирующее влияние на гуморальный и клето| опосредованный ответы, в частности на усиление активности цитотоксических Т-лимфо^ (Kaufman et al., 2014). Так как повышение уровней ГМ-КСФ и анти-НАО антител в резуль иммунизации животных НАО в составе ТИ-комплексов происходило примерно в одинак степени (рис. 5, 6), то можно заключить, что усиление продукции ГМ-КСФ способство адекватному повышению специфического иммунного ответа против НАО в составе исследован; ТИ-комплексов. Возрастание уровня ГМ-КСФ также позволяет предположить стимуля! цитотоксических клеток, что является важной характеристикой вакцинных препаратов.

3.5.4. Влияние МГДГ из различных морских макрофитов на коиформа гемагглютинина

Конформационные изменения в НАО, индуцированные МГДГ из S. pallidum, U. fenestrata marina, были исследованы теми же методами, что и в случае порина: ДСК, а тг

минимальным.

скопическими методами, такими как собственная флюоресценция белка и круговой jsM.

3.1. Дифференциальная сканирующая калориметрия

'лоденатурация НАО при рН 7.4 характеризовалась хорошо выраженным ндуцированным переходом (рис. 7), температура максимума теплопоглощения (Ттах) го зависела от скорости сканирования. Термоденатурация НАО при этих иментальных условиях была всегда калориметрически необратимой. Это свидетельствует о что наблюдаемые термопереходы характеризуют необратимый, кинетически лируемый процесс. Анализ ДСК термограмм и расчет избыточной теплоемкости проводили как для порина (3.4.1.).

ря на одинаковый стимулирующий эффект МГДГ из разных видов морских макрофитов в ТИ-комплексов на выработку анти-НАО антител (рис. 5), термодинамические параметры енатурации белка НАО менялись различно в зависимости от микровязкости МГДГ. Как кз таблицы 6, термостабильность НАО уменьшалась в присутствии МГДГ, что проявлялось ении Еа. Причем МГДГ из Z marina и S. pallidum оказывали максимальный и минимальный шизирующий (разрыхляющий) эффект на НАО соответственно. Энтальпия денатурации АО также изменялась различно под действием МГДГ. Так, ДЯ белка, окруженного МГДГ из Нпа, практически не отличались от ДН индивидуального НАО, тогда как МГДГ из U. ¡ta и S. pallidum повышал и понижал АН по сравнению с таковым индивидуального НАО •ственно. Однако Т* НАО практически не изменялась под влиянием различных МГДГ.

Рис. 7. Температурная зависимость избыточной молярной теплоемкости мономера

гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 (A/CaliforniaJOl/2009) в свободном виде (открытые круги) и в комплексе с МГДГ из U. fenestrata (треугольники), S. pallidum (темные круги) или Z marina (ромбы) в ФСБ, рН 7.4. Скорость сканирования - 60 К h"'. Сплошная линия - наилучшая подгонка к модели двухстадийной кинетически

детерминированной необратимой денатурации (Kurganov et al, 1997).

SO 55 60

Температура, °C

ja 6. Параметры уравнения Аррениуса для тепловой денатурации гемагглютинина (НАО) и

X ДН, (ккалмоль"') (ккалмоль"1) Т*, (К) г

267.9 152.7 332.6 0.9999

1ГДГ из S. pallidum 243.3 147.7 332.4 0.9996

1ГДГ из U. fenestrata 274.6 131.9 332.5 0.9991

МГДГ из Z marina 264.0 128.6 332.6 0.9999

!1ания как для табл.

-лом, данные калориметрического анализа НАО принципиально отличаются от данных, нных для порина из Y. pseudotuberculosis, термостабильность которого наоборот возрастала йствием МГДГ. Возможно, это связано с разными формами сравниваемых белков: рной и олигомерной.

3.5.4.2. Собственная флуоресценция гемагглютиннна

Интенсивность флуоресценции НАО практически не зависела от МГДГ, окружавшего бе Более детальная информация о конформационных изменениях НАО была получена разложении экспериментальных спектров на элементарные компоненты, отвечающие испуска белкового флуорофора - триптофана (табл. 7). В экспериментальном спектре индивидуалы НАО были идентифицированы три спектральные формы (Б, I и II) в соотношении 2:48 Доминирующими спектральными формами в индивидуальном белке были спектральные фор и II, которые в сумме составляли 98% от всех спектральных форм.

Таблица 7. Влияние МГДГ из мор макрофитов на вклад различ спектральных форм триптофан остатков в общий спектр флюоресце гемагглютинина (НАО) вируса гр1 А/НШ1 (А/СаП/огп!а/07/2009), %.

МГДГ из всех трех морских макрофитов существенно влияли на конформацию НАО, повы содержание формы II за счет формы I. Степень влияния увеличивалась в ряду: МГДГ и pallidum —> МГДГ из U. fenestrata —> МГДГ из Z. marina. Доля S формы возрастала под действ наиболее вязкого МГДГ из Z. marina до 8% против 2% в индивидуальном белке, в то время другие образцы МГДГ слабо влияли на содержание этой формы. Следовательно, МГДГ и marina максимально разрыхляет периферические участки белка, одновременно уплотняя « НАО, что согласуется с максимальным снижением экспериментальной энергии актив денатурации белка (Ел) в окружении этого МГДГ (табл. 6). Возможно, наибольшая релакс третичной структуры НАО под влиянием МГДГ из Z. marina способствует «правиль экспозиции антигенных сайтов НАО, которая сопровождается максимальной продукцией цито ГМ-КСФ. Наименьшие изменения в распределении спектральных форм I и II наблюдались действии МГДГ из S. pallidum на конформацию НА, что также совпадает с результат исследования термоденатурации белка.

3.5.4.3. Круговой дихроизм

Согласно полученным спектрам кругового дихроизма, вторичная структура НАО в основ представлена p-структурой, процентное содержание которой не зависело от гликолипид окружения (табл. 8). Это соответствует данным литературы о том, что [i-структура явля главным элементом вторичной структуры тяжелой субъединицы НА1, где фокусир; антигенные сайты гемагглютинина (Hagembe, 2009; Igarashi et al., 2010).

Однако вклад других элементов вторичной структуры изменялся различным образом. МГДГ из S. pallidum и Z. marina снижал и увеличивал вклад р-изгибов на 9% соответстве Наоборот, эти же гликолипидные образцы заметно увеличивали и снижали содержани спиралей соответственно. Наиболее вязкий МГДГ из Z. marina также индуцировал двукра снижение вклада неупорядоченной структуры, тогда как МГДГ из U. fenestrata практическ влиял на содержание элементов вторичной структуры НАО.

Таблица 8. Влияние МГД морских макрофитов вторичную стру

рекомбинантного моно гемагглютинина (НАО) в гриппа Ai

(A/California/07/2009), %

Образец Спектральные формы

триптос >ана

S I II

НАО 2 48 50

HA0+ МГДГ из S. pallidum 1 32 67

НАО+МГДГ из U. fenestrata 3 17 80

HA0+ МГДГ из Z. marina 8 8 84

Образец а- спираль Р- структура Р- изгиб Неупорядоченная структура

НАО 4 60 24 12

НАО+МГДГ из S. pallidum 11 60 15 14

НАО+МГДГ из U. fenestrata 7 57 23 12

НАО+МГДГ из Z. marina 0 62 33 5

im образом, изменения во вторичной структуре белка были, вероятно, существенно связаны одействием гликолипида МГДГ с легкой субъединицей НА2, гидрофобный N-конец "i образует белок слияния гемагглютинина (Bentz, Mittal, 2003), тогда как вторичная ра субъединицы НА1 - главного месторасположения антигенных детерминант тинина и его рекомбинантного мономера НАО, практически не затрагивалась. Вероятно, причине стимулирующий эффект ТИ-комплексов на образование антител против НАО был ов независимо от того, из какого вида морских макрофитов был выделен МГДГ, входящий в ТИ-комплекса. Однако варьирование уровня цитокина ГМ-КСФ под действием разных может быть связано с конформационными изменениями в области НА2 субъединицы белка олученный результат согласуется с известным постулатом о том, что, в отличие от ического, неспецифический иммунный ответ обусловлен не столько конформацией ных детерминант белка, сколько пространственной структурой белкового антигена в

ю отметить, что белок взаимодействовал с липидной матрицей ТИ-комплексов, и эффект аимодействий на конформацию белка повышался с увеличением вязкости МГДГ. Однако личия во влиянии МГДГ на конформацию антигена в составе ТИ-комплекса не отражались е анти-НАО антител, но коррелировали с различным влиянием МГДГ на содержание ГМ-Отсутствие сходного эффекта МГДГ на иммунный ответ против рекомбинантного ра НАО вируса гриппа А и порина из У. pseudotuberculosis согласуется с тем, что иммунный ависит не только от компонентов ТИ-комплекса и их соотношения (Kostetsky et al., 2011), особой структуры антигена в составе этой адъювантной системы доставки. Жпрнокислотный состав, комплексообразующие свойства фосфолипидов из жих и их влияние на нммуногепность ЧСА в составе ТИ-комплексов е нами была показана возможность использования ТИ-комплекса на основе кукумариозида С. japónica, холестерина и МГДГ из морских макрофитов в весовом соотношении 6:2:4 в е адъювантного носителя мембранных, то есть гидрофобных и амфифильных, антигенов, известно, что прототип ТИ-комплексов - ISCOMATRIX* можно использовать не только ювантный носитель мембранных антигенов, но и как адъювант в смеси с гидрофильными ими, что существенно упрощает производство вакцин и расширяет возможности их ения (Pearse, Dräne, 2005; Skene, Sutton, 2006). Для того, чтобы проверить адъювантные а ТИ-комплексов в отношении водорастворимых антигенов, нами был выбран в качестве ного антигена ЧСА. Кроме того, важно было выяснить, насколько принципиален в этом не только состав жирных кислот липидного матрикса ТИ-комплексов, но и полярная липида. Поэтому наряду с МГДГ из морского макрофита (U. fenestrate,г) использовали ипиды из морских беспозвоночных — ФХ и ФЭ из морской звезды D. nippon и морского ntermedius. Была дана характеристика состава жирных кислот фосфолипидов и изучена их юсть формировать ТИ-комплексы.

.6.1. Состав жирных кислот фосфолипидов из морских беспозвоночных

сновными жирными кислотами ФХ и ФЭ, выделенных из иглокожих D. nippon и S. ius, являлись арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты, содержание которых вало от 6.7% до 29.3% и от 10.0% до 37.7% от суммы ЖК соответственно. Сравнительно е содержание этих ПНЖК в основном определяло высокие ИН использованных ипидов (табл. 9.), особенно ФХ и ФЭ из D. nippon (314 и 334 против 254 и 216 в S ius соответственно). Соотношение между суммами ненасыщенных и ненасыщенных ЖК ыло выше в фосфолипидах из D. nippon, чем в фосфолипидах из S. intermedius. Заметным и i для интерпретации иммунологических (Яременко, 2001; Shaikh, Edidin, 2006) и ских свойств (Sanina, Kostetsky, 2002; Sanina et al., 2008) полярных липидов отличием было дание п-3 над п-6 ПНЖК в ФХ или их почти равные количества в ФЭ из D. nippon, тогда оих фосфолипидах из S. intermedius преобладали п-6 ПНЖК.

Таблица 9. Общие показатели жирнокислотного состава ФХ и ФЭ из Distolasterias nipp Strongylocentrotus intermedius (% от суммы жирных кислот)_

Жирные кислоты

НЖК

МНЖК

ПНЖК

Ненасыщ./Насыщ.

n-3/п-бПНЖК

ИН

D. nippon

ФХ 15.7

19.1

65.2 5.3 2.8 314

ФЭ 10.1

9.8 80.1

8.9 1.1 336

S. intermedius

ФХ 18.3 16.8 64.9 4.7 0.7 254

ФЭ 26.8 22.9 50.3 2.7 0.8 216

3.6.2. Комплексообразующие свойства фосфолипидов из морских беспозвоночных

В ТИ-комплексе, состоящем из КД Аг-2, холестерина и МГДГ в весовом соотношении 6 гликолипид МГДГ был заменен на фосфолипид — ФХ или ФЭ из морских беспозвоночных и б исследовано формирование тубулярных частиц. Способность к комплексообразов исследовали методом трансмиссионной электронной микроскопии образующихся частиц комплексов, негативно контрастированых фосфорно-вольфрамовой кислотой.

Замена МГДГ на фосфолипиды приводила к формированию трубчатых частиц, аналогии ТИ-комплексам на основе МГДГ (рис. 11). Морфология частиц, формировавшихся в присут ФХ и ФЭ, была сходной и не зависела от источника получения фосфолипида. Полученные да показывают, что ТИ-комплексы могут быть сформированы не только на основе МГДГ, но и или ФЭ.

3.6.3. Влияние фосфолипидов из морских беспозвоночных на образование антител ир ЧСА

Для исследования адъювантной активности ТИ-комплексов в отношении ЧСА использованы различные по составу ЖК и полярным головкам фосфолипиды из мор беспозвоночных: ФХ и ФЭ из S. intermedius и D. nippon (табл. 9). ТИ-комплекс на основе МГД U. fenestrata использовали в качестве контроля. Для приготовления всех комплексов использо КДА2-2.

Замена МГДГ на ФХ из D. nippon в классическом ТИ-комплексе не приводила к изменени иммуностимулирующей активности (рис. 8). Однако результатом использования др фосфолипидов для модификации классического ТИ-комплекса было снижение адъюван активности как по сравнению с комплексом, содержащим ФХ из D. nippon, так и по сравнен эффектом индивидуального ЧСА. Наиболее сильное супрессирующее влияние оказывал комплекс на основе ФЭ из S. intermedius.

Таким образом, адъювантная активность ТИ-комплекса обусловлена не то иммуностимулирующими свойствами КД Аг-2, но и химической структурой полярного ли входящего в его состав. Судя по полученным данным, фосфолипиды могут эффективно заме МГДГ из U. fenestrata в ТИ-комплексах, обеспечивая близкий уровень их адъюван активности. Но при этом в полярном липиде, по-видимому, должно быть высокое соотношен З/п-6 ПНЖК, чем отличаются МГДГ из U. fenestrata и ФХ из D. nippon от ФЭ из D. nippon и ФЭ из S. intermedius (табл. 1, 9). Известно, что ПНЖК по-разному влияют на иммунную фун организма за счет модификации функциональной активности клеток иммунной системы (Ya 2003; Shaikh, Edidin, 2006) и иммунного ответа в целом. Так, повышенный уровень п-6 Г снижает определенные иммунные функции, включая продукцию иммуноглобулинов и цитокинов, а n-З ПНЖК обладают противоположным эффектом (Harbige, 2003)

17

Рис. 8. Содержание антител против ЧСА в сыворотке крови мышей, иммунизированных ЧСА в смеси с ТИ-комплексами на основе фосфолипидов из иглокожих. По оси абсцисс -экспериментальные группы животных, иммунизированных индивидуальным ЧСА или ЧСА в смеси с ТИ-комплексами, содержащими МГДГ из U. fenestrata / ФХ из D. nippon / ФХ из S. intermedius / ФЭ из D. nippon / ФЭ из S. intermedius (ЧСА+ТИ (МГДГ U.f.) / ЧСА+ТИ (ФХ D.n.) / ЧСА+ТИ (ФХ S.i.) / ЧСА+ТИ (ФЭ D.n.) / ЧСА+ТИ (ФЭ S.i.). Контроль -интактные животные. По оси ординат — содержание антител, выраженное в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (А 450). Представлены значения средних арифметических ± доверительный интервал.

^. Влияние фосфолипидов из морских беспозвоночных на цитокиновый профиль

видно из рисунка 9, содержание цитокинов ИЛ-6, ИЛ-12 и ГМ-КСФ варьирует в

Рис. 9. Содержание цитокинов в сыворотке крови мышей, иммунизированных ЧСА в смеси с ТИ-комплексами на основе фосфолипидов из иглокожих. По оси абсцисс - цитокины, содержание которых было определено в сыворотках крови экспериментальных животных (обозначения как к рис. 8). По оси ординат - содержание цитокинов, выраженное в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (А 450). Представлены значения средних арифметических ± доверительный интервал.

унизации животных ЧСА в смеси с ТИ-комплексами на основе ФХ из D. nippon и S. idius, подобно ТИ-комплексам на основе МГДГ, индуцировало повышение продукции из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации иммунного ответа и ггельной реакции, ИЛ-6, по сравнению с эффектом индивидуального ЧСА. Подобно ИЛ-6, L цитокина ИЛ-12 имел тенденцию к снижению при иммунизации животных чистым ном по сравнению с интактным контролем. Зависимость содержания этого цитокина от 1 ТИ-комплексов имела более сглаженный профиль по сравнению с таковым для ИЛ-6. Тем гее, наблюдалась сходная тенденция: МГДГ из U. fenestrata и ФХ из D. nippon ировали синтез ИЛ-12 в наибольшей степени. ТИ-комплексы на основе фосфолипидов из S. dius наряду с ТИ-комплексом на основе МГДГ стимулировали продукцию ГМ-КСФ. елом, уровень специфического иммунного ответа, а также цитокин-модулирующая эсть растворимого антигена ЧСА в индивидуальном состоянии или в смеси с ТИ-ксами, модифицированными фосфолипидами, существенно отличались от таковых, ируемых мембранным антигеном — порином YOmpF. В частности, стимулирующий эффект шлексов на продукцию антиген-специфических антител по сравнению с чистым антигеном раза выше в отношении к амфифильному антигену порину, чем к водорастворимому ЧСА.

m т ! 1 ■ ■

ьшей степени в зависимости от состава ТИ-комплексов.

■ ПК CJ4CA

ЩЧСА+ ТИ (МГДГ U.f.) 83 ЧСА + ТИ (ФХ D.n.)

□ MCA-fTMiOXS.Î.) ЩЗЧСА + ТИ {ФЭ D.n.) ИЧСА+ ТИ {ФЭ S.i.)

В профиле цитокинов, образующихся под действием порина в составе ТИ-комплексов на oci МГДГ, наблюдалось снижение уровня ИЛ-12 (рис. 2), тогда как ЧСА в смеси с ТИ-комплекс мало влиял на содержание этого цитокина (ТИ-комплексы на основе ФХ из S. intermedius и Ф. S. intermedius и D. nippon) или стимулировал его продукцию (ТИ-комплексы на основе МГД. U. fenestrata и ФХ из D. nippon). Более того, ЧСА в смеси с ТИ-комплексами в основном повы образование ГМ-КСФ и ИЛ-6 (рис. 9).

3.7. Структура, комплексообразующие свойства кукумариозидов и их влияние иммуногенность белковых антигенов ТИ-комплексов

В связи с тем, что на иммуногенность белковых антигенов могут влиять не только физ! химические свойства липидной, но и сапониновой составляющей ТИ-комплексов, были выдел наряду с КД Аг-2 близкие к нему по хроматографическому поведению кукумариозиды - А2-4 охарактеризована их структура и изучен эффект на конформацию порина. В каче! альтернативы индивидуальным кукумариозидам были выделены 2 фракции кукумариози процедура выделения которых более проста по сравнению с таковой для индивидуал! кукумариозидов. Затем исследовали способность к комплексообразованию, а также вли. полученных кукумариозидов и фракций кукумариозидов на иммуногенность порина и ЧСА.

3.7.1. Характеристика структуры кукумариозидов из Cucumaria japónica

В предложенную Авиловым С.А. и Калининым В. И с соавторами (Авилов и др., 1990; Кал^ и др., 1994) методику выделения кукумариозидов нами было введено несколько дополнител;.: этапов, описанных в материалах и методах. В результате было получено три индивидуале соединения, структура которых была исследована методом 13С-ЯМР-спектроскопии. Получек спектры вещества с m/z 1299 и одного из веществ с m/z 1284 были полностью идентичны р опубликованным спектрам кукумариозида Аг-2 и кукумариозида Аг-4 соответственно (Авил др., 1990). Вторым веществом с m/z 1284 являлся ранее неизвестный кукумариозид Е.

3.7.2. Комплексообразующие свойства кукумариозидов Cucumaria japónica

Ранее нами была показана возможность формирования ТИ-комплекса на oci индивидуального КД Аг-2 и показана его адъювантная активность. В настоящей работе исследована возможность получения ТИ-комплексов на основе других тритерпеновых гликоз^ из С. japónica, наиболее близких по структуре и хроматографическому поведению к КД A2-2.¡ этих целей были использованы кукумариозид А2-4, который отличается от кукумариозида отсутвием кетогруппы при С16 агликона, и кукумариозид Е, в углеводной цепи которого втор третьим моносахаридами являются глюкоза и ксилоза вместо соответствующих хиново. глюкозы в гликоне кукумариозида Аг-2 (рис. 10). Также мы исследовали две су тритерпеновых гликозидов, наиболее близких по хроматографическому поведению к КД А; обладающих по сравнению с ним большей (фракция 2) и меньшей (фракция: хроматографической подвижностью.

КД Аг-г йгСйгОН: R}=CHi: %=0

Рис. 10. Химиче структуры индивидуал! кукумариозидов

(Аг-2, А2-4, Е).

исследования способности кукумариозидов Е, А2-4, а также фракций кукумариозидов 2 и 4 ровать ТИ-комплексы, пленки холестерина и МГДГ из U. fenestrata диспергировали в ре соответствующих кукумариозидов под действием ультразвука. Каждую липид-иовую систему исследовали с помощью метода EFTEM, позволяющего получать жонтрастные изображения неокрашенных биологических образцов и обнаруживать слабо вающие электроны частицы аморфного вещества, и метода электронной микроскопии для ования структуры частиц, негативно контрастированных фосфорновольфрамовой кислотой, 'льтате показано, что все препараты представляют собой гомогенную суспензию трубчатых , имеющих одинаковое строение, ровные стенки и четко выраженный канал (рис. 11 А, Б), и ;ржат частиц с иной морфологией или аморфного вещества (рис. 11В).

Рис. 11. Электронные

микрофотографии частиц ТИ-комплексов на основе ФЭ из D. nippon и КД А2-2 (А); на основе МГДГ из U. fenestrata и КД А2-2 (Б, В). А, Б - негативно контрастированные образцы. Масштабная линия - 100 нм. В -EFTEM. Масштабная линия - 400 нм.

довательно, индивидуальный КД А2-2 и структурно близкие ему КД А2-4 и КД Е, а также е по хроматографической подвижности к КД Аг-2 фракции кукумариозидов 2 и 4 не ются друг от друга по способности к формированию ТИ-комплексов. 3. Влияние различных кукумариозидов на иммуногенность и конформацию порина .1. Влияние кукумариозидов на иммуногенность порина

!1ние замены КД Аг-2 в ТИ-комплексах на другие индивидуальные кукумариозиды (КД А2-4 В) и фракции кукумариозидов 2 и 4 на иммуногенность антигена порина YOmpF из Y. Tuberculosis оценивали по содержанию антипориновых антител в сыворотке мышей, |изированных соответствующими препаратами. Для приготовления комплексов |зовали только МГДГ из U. fenestrata. Было установлено, что индивидуальный тримерный гювышает продукцию антител в три раза по сравнению с интактным контролем (рис. 12). |менение ТИ-комплексов позволило усилить способность порина индуцировать выработку я в 1.4-4.1 раза. Максимального эффекта удалось достичь при применении ТИ-комплексов нове кукумариозида Аг-2, тогда как кукумариозид Е стимулировал выработку риновых антител в наименьшей степени. Эффект кукумариозида А2-4 был сравнительно im, но менее выраженным по сравнению с эффектом А2-2 (в 1.3 раза). Фракции риозидов 2 и 4 эффективно повышали выработку специфических антител (в 2.3 и 3.1 раза тнению с индивидульным порином соответственно), но в меньшей степени, чем риозиды А2-2 и А2-4.

im образом, выбор КД А2-2 в качестве наиболее эффективной сапониновой составляющей шлексов является оптимальным.

.2. Влияние различных кукумариозидов на конформацию порина

оценки влияния кукумариозидов на конформационные изменения порина в связи с яой иммуногенностью этого белка в составе ТИ-комплексов, была исследована собственная !сценция порина в комплексе с кукумариозидами А2-2, А2-4 и Е. Из полученных результатов ¡11) следует, что кукумариозиды в значительной степени влияли на третичную структуру j Так, под влиянием кукумариозидов появлялась III спектральная форма триптофана, рвующая в индивидуальном порине, и одновременно сокращался в 2.8-4.6 раза вклад формы рсть кукумариозиды способствовали разворачиванию белка, что согласуется с высокой ностной активностью сапонинов и их способностью солюбилизировать мембранные белки Ustündag, Mazza, 2007).

Рис. 12. Содержание антипоринс антител в сыворотке крови мы: иммунизированных порином в составе комплексов на основе различных К,: фракций КД. По оси абсцисс экспериментальные группы живот1 иммунизированных индивидуал«:

тримерным порином (Порин) или порин составе ТИ-комплексов, содержащих K,i 2/ КД Е/ КД А2-4/ КД фракции 2/ фракции 4 (ТИ (А2-2)/ ТИ (Е)/ ТИ (А ТИ (фр. 2)/ ТИ (фр. 4) соответственно). I интактный контроль. По оси ордин! содержание антител в единицах оптиче плотности при длине волны 450 нм (А Представлены значения сре арифметических ± доверительный интер

Однако исследованные кукумариозиды оказывали разное воздействие на распредели спектральных форм триптофана. Содержание формы I не изменялось только под действием! А2-2. КД Е и КД А2-4 снижали вклад этой формы с 53% до 46% и 32% соответственно. В)' формы II уменьшался под действием всех кукумариозидов, особенно сильно (до 0%) происходило под действием КД Е, и в наименьшей степени — под действием КД А2-4. В формы III увеличивался под воздействием всех кукумариозидов, причем наибольший эф( оказывали КД А2-4 и Е.

Таблица 10. Влияние кукумариозидов из Cucumaia japónica на распределение спектральных (J триптофана в общем спектре флуоресценции порина, %_

Проба ^■тах Спектральные формы триптофана

S I II III

Порин 337.3 28 53 19 j

Порин + кукумариозид А2-2 338 6 52 5 37

Порин + кукумариозид А2-4 335 9 32 16 43

Порин + кукумариозид Е 338.2 10 46 0 44

Следовательно, кукумариозиды проявили различное влияние на конформацию порина, согласуется с литературными данными о зависимости влияния сапонинов на физико-химичесв биологические свойства других белков от химической структуры сапонинов (Ой^й-ШЮт Магга, 2007). Судя по резкому увеличению вклада III формы в спектр флюоресценции пот происходило разворачивание белка и экспонирование его антигенных детерминант. КД который оказывал наибольший иммуностимулирующий эффект на порин, в меньшей сте; способствовал экспонированию триптофановых остатков в водное окружение. Но если К разворачивал белок за счет наиболее резкого снижения спектральной формы II, разворачивающий эффект КД А2-4 оказывал как за счет II, так и I форм. И, вероятно, это 8 мягкое перераспределение вкладов форм может быть причиной существенно большего эфф КД А2-4 на иммуногенность порина по сравнению с КД Е.

3.7.4. Влияние различных кукумариозидов на иммуногенность ЧСА

Эффект модификации ТИ-комплексов индивидуальными кукумариозидами (КД Е, КД А2 фракциями кукумариозидов 2 и 4 на иммуногенность ЧСА оценивали по образованию антиантител в сыворотке мышей, иммунизированных соответствующими комплексами, приготовления комплексов использовали только МГДГ из II. /епе$1га1а. Индивидуальный вызывал 5-кратное увеличение продукции антител против ЧСА по сравнению с интакт контролем (рис. 13). ТИ-комплексы на основе различных кукумариозидов способств | дальнейшей стимуляции выработки антител, уровень которых повышался в 1.4—1.8 раз

3,5 3 2,5 о 2 m «í <1,5 1 0,5 1 i

ov

нию с эффектом индивидуального ЧСА. Наибольшим адъювантным эффектом обладали отлексы на основе кукумариозидов А2-2 и Е. Близкую адьювантную активность также ши ТИ-комплексы на основе фракции кукумариозидов 4.

зкая адъювантная активность ТИ-комплексов на основе индивидуальных кукумариозидов и ¡ш кукумариозидов в отношении ЧСА, вероятно, обусловлена их одинаковой способностью оовать вирусоподобные наночастицы комплекса, которые более эффективно, чем белок сам ре, стимулируют первый этап антигенного распознавания - фагоцитоз. Однако »альный адъювантный эффект ТИ-комплексов, который достигался при использовании двух гриозидов (КД Аг-2 и Е), имеющих идентичный агликон, но различающихся по гликонной демонстрирует превалирующее значение структуры агликона кукумариозидов, в сти, С16-кетогруппы, для проявления этого эффекта.

ав ТИ-комплексов также влиял на содержание цитокинов; в наибольшей степени рвало содержание ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН-гамма и ГМ-КСФ (рис. 14). Введение животным ЧСА и с ТИ-комплексами на основе кукумариозидов фракции 4 не приводило к изменению ИЛ-6 по сравнению с эффектом чистого ЧСА. В остальных группах наблюдалось ение продукции ИЛ-6 в 1.4—2.4 раза по сравнению с его уровнем после иммунизации /дуальным ЧСА. Максимальное повышение было зарегистрировано в группе животных, 1-13ированных ЧСА в смеси с ТИ-комплексом на основе КД Е, минимальное — при зовании ТИ-комплексов на основе кукумариозидов фракции 2.

чО* цел* чО

Рис. 13. Содержание антител против ЧСА в сыворотке крови мышей, иммунизированных ЧСА в составе ТИ-комплексов на основе различных КД и фракций КД. По оси абсцисс - экспериментальные группы животных, иммунизированных индивидуальным ЧСА (ЧСА) или ЧСА в составе ТИ-комплексов, содержащих КД А2-2 / КД Е / КД А2-4 / КД фракции 2 / КД фракции 4 (ЧСА+ТИ(А2-2) / ЧСА+ТИ(Е) / ЧСА+ТИ(А2-4) / ЧСА+ТИ(фр. 2) / ЧСА+ТИ(фр. 4) соответственно). ИК -интактный контроль. По оси ординат — содержание антител в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (А 450). Представлены значения средних

арифметических± доверительный интервал.

14. Содержание ов в сыворотке крови иммунизированных эставе ТИ-комплексов ве различных КД и КД. По оси абсцисс -ы, содержание

[ было определено в ках крови

дентальных животных |ения как к рис. 13). Ьрдинат - содержание эв в единицах рй плотности при >лны 450 нм (А 450). злены значения

арифметических± 'льный интервал

■ ИК

Е2ЧСА+ ТИ {£) Ш ЧСА + ТИ {фр. 4)

О ЧСА

О ЧСА + ТИ (А2-4)

ЭЧСА+ ТИ (А2-2) ЁЭЧСА+ ТИ (фр. 2)

£ 0,80 <

0,60

*** у**

Зависимость содержания ИЛ-12 от состава ТИ-комплексов имела более сглаженный про. по сравнению с таковым для ИЛ-6, тем не менее, наблюдалась сходная тенден индивидуальные кукумариозиды стимулировали синтез ИЛ-12 в наибольшей степ Максимальное увеличение уровня ИЛ-12 (в 1.9 раза) происходило при иммунизации живот ЧСА в смеси с ТИ-комплексами на основе КД А2-2 и КД А2-4.

Синтез ИФН-гамма, как известно, зависит от ИЛ-12 (Newport, 2003). Однако пря пропорциональной зависимости между уровнями этих Thl-индуцирующих цитокинов наблюдалось. Более того, ТИ-комплексы на основе индивидуальных кукумариозидов способствовали повышению продукции ИФН-гамма. Единственным стимулятором его син был ТИ-комплекс, включающий фракцию 2 кукумариозидов. Этот же комплекс наряду с комплексом на основе КД А2-4 в наибольшей степени (в 2.6 раза) повышал продукцию ГМ-К Остальные варианты ТИ-комплексов в меньшей степени стимулировали образование э цитокина (в 1.4—1.8 раза).

Проведенные исследования в целом показали умеренную адъювантную активность комплексов в отношении водорастворимого антигена ЧСА, которую можно регулировать п замены кукумариозидов в составе ТИ-комплекса. Максимальный уровень антител против наблюдался при использовании ТИ-комплексов, в состав которых входили КД А2-2 или 1 Преимущественная стимуляция продукции цитокинов ИЛ-6, ИЛ-12 и ГМ-КСФ под дейст ЧСА в смеси с ТИ-комплексами может свидетельствовать об активации клето опосредованного и гуморального иммунных ответов.

ВЫВОДЫ

1. Иммунизация животных порином YOmpF в составе ТИ-комплексов, модифицирован разными по составу жирных кислот и микровязкости МГДГ, показала, что умере микровязкость МГДГ из U. fenestrata и S. pallidum способствует максимальному увеличению раза) уровня антипориновых антител и минимальному понижению уровня ИЛ-12 по сравнен! эффектом индивидуального белка.

2. Наибольший иммуностимулирующий эффект ТИ-комплексов на основе МГДГ и fenestrata и S. pallidum коррелирует с умеренным повышением энергия актив термоденатурации и сохранением вклада одной из трех спектральных форм триптофан остатков (S или I) в спектре флуоресценции, характеризующих конформацию белка.

3. Установлено, что уровень антител против рекомбинантного мономера гемагглютш вируса гриппа в составе ТИ-комплексов повышался в 2 раза независимо от физико-химиче свойств МГДГ, однако повышению уровня цитокина ГМ-КСФ в 1.8-2.3 раза соответство конформационным изменениям белка. При повышении микровязкости липида в ряду: МГДГ pallidum —■► U. fenestrata —* Z. marina наблюдалось уменьшение термостабильн гемагглютинина и его конформационная релаксация.

4. Показано, что ТИ-комплексы в смеси с водорастворимым антигеном ЧСА способст повышению иммуногенности белка. Содержание антиген-специфических антител увеличив примерно, в два раза по сравнению с таковым при иммунизации индивидуальным белком.

5. Показано, что фосфолипиды ФЭ и ФХ из S. intermedius и D. nippon могут замещать МГ составе ТИ-комплексов без нарушения их трубчатой морфологии, но только ФХ из D. ni отличавшийся от остальных фосфолипидов высоким соотношением п-З/п-6 полиненасыще жирных кислот, способствовал проявлению адъювантных свойств ТИ-комплексов по отнош к ЧСА.

6. Из голотурии С. japónica выделено два известных кукумариозида А2-2, А2-4 и один н кукумариозид Е, а также получены две фракции, содержащие сумму кукумариозидов и пок что все кукумариозиды и фракции кукумариозидов формируют ТИ-комплексы трубч морфологии.

7. Применение ТИ-комплексов на основе кукумариозидов А2-2 или А2-4 и МГДГ и fenestrata способствует увеличению выработки антител к порину в 4.1 и 3.2 раза соответствен

азворачивания белка, сопровождающегося увеличением вклада 111 спектральной формы офанового флуорофора. Показано, что все выделенные кукумариозиды и фракции кукумариозидов в составе ТИ-ексов в смеси с ЧСА вызывают повышение уровня антител против ЧСА в 1.4-1.8 раза, а увеличивают в разной степени продукцию цитокинов ИЛ-6, Ш1-12 и ГМ-КСФ.

Список работ по теме диссертации татьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах: ostetsky E.Y., Sanina N.M., Mazeika A.N., Tsybulsky A.V., Vorobyeva N.S., Shnyrov V.L. ar immunostimulating complex based on cucumarioside A2-2 and monogalactosyldiacylglycerol arine macrophytes // J. Nanobiotechnology. 2011. 9:35.

ina N.M., Kostetsky E.Y., Shnyrov V.L., Tsybulsky A.V., Novikova O.D., Portniagina O.Y., ieva N.S., Mazeika A.N., Bogdanov M.V. The influence of monogalactosyldiacylglycerols from nt marine macrophytes on immunogenicity and conformation of protein antigen of tubular ostimulating complex // Biochimie. 2012. Vol. 94. P. 1048-1056.

хбульский A.B., Тимченко Н.Ф., Костецкий Э.Я., Воробьева Н.С. Изучение иммуногенных и ктивных свойств термостабильного летального токсина Yersinia pseudotuberculosis и его ия на гематологические и цитокиновые параметры крови лабораторных мышей // инская иммунология. 2014. № 3. С. 227-236. orobieva N., Sanina N., Vorontsov V., Kostetsky E., Mazeika A., Tsybulsky A., Kim N., Shnyrov the possibility of lipid-induced regulation of conformation and immunogenicity of influenza A 1/N1 hemagglutinin as antigen ofTI-complexes //J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2014. Vol. 24. P. 09.

атент:

стецкий Э. Я., Санина Н. М., Мазейка А. Н„ Цыбульский А. В., Воробьева Н. С., Новикова Портнягина О. Ю., Шныров В. Л. Иммуностимулирующий комплекс, способ его получения енение // Патент № 2446822 от 10.04.2012.

боты, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных ых конференций и симпозиумах:

азейка А.Н., Костецкий Э.Я., Веланский П.В., Воробьева Н.С., Портнягина О.Ю. Разработка -сапонинового носителя субъединичных антигенов // Сб. трудов XII Всероссийской ежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 7-ября 2009. С. 43.

оробьева Н.С., Мазейка А.Н. Модификация липид-сапониновых наноносителей белковых нов // Сб. тезисов IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных заций Дальнего Востока России по актуальным проблемам экологии, морской биологии и хнологии. Владивосток. 14-17 апреля 2010. С. 50-52.

азейка А.Н., Костецкий Э.Я., Воробьева Н.С., Цыбульский А.В. Иммуностимулирующая ость липид-сапонинового наноносителя антигенов на основе кукумариозида А2-2 // Сб. в XIII Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и гии. Владивосток. 7-14 сентября 2010. С. 39.

азейка А.Н., Костецкий Э.Я., Санина Н.М., Цыбульский А.В., Воробьева Н.С. Носитель иничных антигенов на основе моногалактозилдиацилглицерола из Ulva fenestrata и ариозида А2-2 из Cucumaria japonica II Материалы X региональной конференции студентов, антов вузов и научных организаций Дальнего Востока России по актуальным проблемам гии, морской биологии и биотехнологии. Владивосток. 4-6 мая 2011. С. 156-158. anina N., Kostetsky Е., Tsybulsky A., Novikova О., Portniagina О., Mazeika A., Vorobieva N„ iov M., Shnyrov V. Tubular immunostimulating complex based on lipids from marine hydrobionts tracts from the 52nd International Conference on the Bioscience of Lipids. Warsaw. 30 August - 3 ber 2011. Chem. Phys. Lipids. 2011. V. 164. P. S22-S27.

anina N., Kostetsky E., Shnyrov V., Novikova O., Portniagina O., Tsybulsky A., Bogdanov M., ka A., Vorobyeva N. Influence of monogalactosyldiacyglycerol from marine macrophytes on

A,

immunogenicity and conformation of protein antigen incorporated in tubular immunostimulating comp // Abstract book of The 4th Asian Symposium on Plant Lipids. Hong Kong. 2-4 December 2011. P. 14.

12. Sanina N.. Kostetsky E., Popov A., Shnyrov V., Tsybulsky A., Novikova O., Portniagina Mazeika A., Vorobieva N., Bogdanov M. Tubular immunostimulating complex based on lipids fr marine hydrobionts// Abstract book of The 2nd Annual International Congress of Marine Biotechnol (WCMB-2012 ). Dalian. 20-22 September 2012. P.435.

13. Vorontsov V. N., Davydova L. A., Mazeika A. N., Vorobieva N. S., Tsybulsky A. V., Kostetsky Y., Sanina N. M. Immunogenic features of hemagglutinin of influenza virus A HI A/California/07/2009 in the composition of tubular nanocomplexes // Abstract book of VI Russ Congress of Young Biologist «SymBioS Russia 2013» with international participation. Irkutsk. 19 -August 2013. P. 336-337.

14. Vorontsov V., Sanina N., Kostetsky E., Tsybulsky A., Davydova L., Mazeika A., Vorobieva Kim N., Shnyrov V. On the possibility of lipid-induced regulation of conformation and immunogeni of hemagglutinin from influenza A virus Hl/Nl in the content of TI-complexes // Abstracts from 3 FEBS Congress. Saint Petersburg. 6-11 July 2013. FEBS J. 2013. V. 280. Suppl. 1. P. 113.

15. Vorontsov V., Sanina N., Kostetsky E., Tsybulsky A., Davydova L., Mazeika A., Vorobieva Shnyrov V. Effect of monogalactosyldiacylglycerol from different marine macrophytes on conformât and immunogenicity of hemagglutinin of Influenza A virus Hl/Nl A/California/07/2009 // Abstract b of The 15th International Congress of Immunology. Milan. 22-27 August 2013. P. 982.

16. Sanina N.M., Kostetsky E.Y., Vorobieva N.S., Tsybulsky A.V., Mazeika A.N. Tub immunostimulating complexes as the base of nanovaccines // Materials of the International Conféré «Biotechnology and Quality of Life». Moscow. 18-20 March 2014. P. 32.

Воробьева Наталья Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ИЗ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ НА КОНФОРМАЦИЮ И ИММУНОГЕННОСТЬ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНО ТУБУЛЯРНЫХ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Подписано в печать 26 декабря 2014. Формат 60X80/16. Усл. печ. л. 1.0 Уч. Изд.л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ №25 Отпечатано в типографии Интерфейс. Владивосток, ул. Семеновская, 8.