Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов кукумариозида A2-2 и фрондозида A

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов кукумариозида A2-2 и фрондозида A"

На правах рукописи

Мепчиискап Екатерина Сергеевна

Молекулярпые мехаппзмы противоопухолевого действия трптерпеповых гликозпдов кукумарпозпда А2-2 п фропдозида А

03.01.04 — биохимия

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О НОЯ 2014

005555270

Владивосток — 2014

005555270

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Amuuiiii Дмитрий Львович

Официальные оппоненты:

Попов Сергей Владимирович

доктор биологических наук, доцент, заведующий отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН

Верещагина Юлия Витальевна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория

биоинженерии Биолого-почвенного института ДВОРАН

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ, г. Черноголовка

Защита состоится « 25 » декабря 2014 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д.005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс:(423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.gi

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «/» Л014 г.

Ученый секретарь Черников О. В.

диссертационного совета, к.б.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания в настоящее время, безусловно, являются одной из наиболее значимых причин смертности населения земного шара независимо от пола, возраста и качества жизни человека. Для терапии разных типов опухолевых заболеваний выработано множество подходов, в которых используются современные достижения в области молекулярной и клеточной биологии, молекулярной генетики и иммунологии. Особое внимание уделяется разработке таких способов, как избирательная доставка цитостатиков и антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза (включая наносомальные системы доставки), поиск подходов к целенаправленному ингибированию опухолевого ангиогенеза, применение индукторов апоптоза, избирательная активация иммунного ответа, в том числе и разработка методологий, основанных на использовании дендритных клеток, обладающих уникальной способностью представлять опухолеспецифические антигены наивным Т-клеткам и вызывать их дифференцировку в цитотоксические лимфоциты (Северин, Родина, 2006). В то же время проблема терапии рака и повышения эффективности действия противоопухолевых препаратов в отношении резистентных к химиотерапии опухолевых клеток является по-прежнему крайне острой, а поиск природных и синтетических соединений, обладающих противоопухолевой активностью, и создание на их основе новых перспективных лекарственных средств представляет значительный интерес для предупреждения развития и лечения злокачественных новообразований.

Известно, что ряд тритерпеновых гликозидов голотурий обладает цитотоксическими, проапоптотичскими и иммуномодулирукяцими свойствами, а на основе одного из них -кукумариозида Кг-2, выделенного из голотурии Cucumaria japónica, в ТИБОХ ДВО РАН создан иммуномодулирующий препарат кумазид, проявляющий противоопухолевый эффект (Стоник и др., 2004; Aminin et al., 2010). В настоящее время тритерпеновые гликозиды голотурий привлекают внимание онкологов в качестве потенциальных противоопухолевых соединений. Результаты научных исследований, проводимых научно-исследовательскими группами США, Южной Кореи и Китая, демонстрируют высокий потенциал некоторых тритерпеновых гликозидов голотурий как природных соединений, обладающих не только цитотоксическим и антипролиферативным действием по отношению к опухолевым клеткам in vitro, но и вызывающим в них апоптоз, ингибирование формирования тубул, адгезии, миграции и инвазии опухолевых клеток и ингибирование ангиогенеза.

Однако, несмотря на большое количество работ, связанных с изучением физиологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, механизм их противоопухолевого действия на клеточном и субклеточном уровне недостаточно изучен. Имеющиеся в литературе данные о противоопухолевой активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления этого эффекта, и о внутриклеточных мишенях действия гликозидов, а также об их способности преодолевать множественную лекарственную устойчивость.

Целью исследования являлось установление и изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов, кукумариозида Аг-2 и фрондозида А, выделенных из голотурий Cucumaria japónica и Cucumaria frondosa соответственно.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение и установление концентрационных диапазонов цитотоксической активности тритерпеновых гликозидов кукумариозида Аг-2 и фрондозида A in vitro в отношении опухолевых клеток мыши и человека, включая устойчивые к цитостатикам клетки;

2. Провести сравнительное изучение влияния этих соединений на индукцию апоптоза, фазы клеточного цикла, активность белка р53 и биосинтез ДНК опухолевых клеток мыши;

3. Исследовать влияние тритерпеновых гликозидов на пролиферацию, колониеобразование, фазы клеточного цикла и индукцию апоптоза в опухолевых клетках репродуктивной системы человека;

-44. Изучить влияние тритерпеновых гликозидов на протеом клеток рака простаты человека линии РСЗ и выявить белки-мишени, экспрессия которых регулируется под действием гликозидов;

5. Изучить влияние тритерпеновых гликозидов на множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток мыши. Оценить способность гликозидов блокировать МЛУ и изменять скорость накопления в клетках и выброса из клеток цитостатика доксорубицина;

6. Исследовать противоопухолевую активность тритерпеновых гликозидов in vivo на моделях асцитной карциномы Эрлиха мышей, соответствующих различным стадиям заболевания, в том числе при комбинированном действии с доксорубицином.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Взаимодействие кукумариозида Аг-2 и фрондозида А с различными типами опухолевых клеток, включая устойчивые к цисплатину клетки, приводит к индукции в них апоптоза по каспазо-зависимому пути.

2. Действие гликозидов на опухолевые клетки сопровождается арестом клеточного цикла, ингибированием биосинтеза ДНК и подавлением формирования и роста колоний опухолевых клеток человека, свидетельствующим о способности гликозидов тормозить процессы пролиферации и метастазирования.

3. В клетках опухоли простаты человека линии РСЗ выявлены белки-мишени, экспрессия которых изменяется под воздействием кукумариозида Аг-2 и фрондозида А. Эти белки относятся к регуляторам метаболизма белков и углеводов, к белкам цитоскелета, участвующим в клеточной подвижности и делении, принимают участие в иммунном ответе, в ответе на стресс, в мРНК процессинге, а также в структурно-функциональной организации ядра клеток.

4. Кукумариозид Аз-2 и фрондозид А достоверно блокируют множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках карциномы Эрлиха мышей, что приводит к усилению накопления в опухолевых клетках противоопухолевого цитостатика доксорубицина и увеличению времени его задерживания в клетках.

5. Кукумариозид Аг-2 вызывает in vivo достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных с инокулированной асцитной карциномой Эрлиха при моделировании ранних стадий заболевания и при проведении комбинированной терапии с доксорубицином.

Научная новизна и практическая значимость. В ходе данной работы было проведено сравнительное изучение взаимодействия тритерпеновых гликозидов кукумариозида Аг-2 и фрондозида А с опухолевыми клетками репродуктивной системы человека и опухолевыми клетками мыши. Получены новые ценные данные о способности тритерпеновых гликозидов вызывать индукцию апоптоза и блокировать клеточный цикл, а также ингибировать колониеобразование опухолевых клеток. Показано, что восприимчивость устойчивых к цисплатину опухолевых клеток человека к действию гликозидов сопоставима с чувствительностью не резистентных к цисплатину опухолевых клеток. Впервые с помощью методов протеомики, основанных на двумерном электрофорезе с последующим масс-спектрометрическим анализом дифференциально регулируемых белков, в опухолевых клетках человека линии РСЗ были выявлены белки, экспрессия которых существенно меняется при воздействии гликозидов на клетки. Эти молекулярные мишени играют ключевую роль в функционировании опухолевых клеток и принимают активное участие в механизмах развития и регулирования митоза и пролиферации опухолевых клеток, миграции клеток и инвазии опухолей, и контролируют процессы программируемой гибели опухолевых клеток. Впервые были получены данные о способности гликозидов блокировать множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках. Обнаруженный эффект ингибирования резистентности опухолевых клеток к цитостатикам вызывает увеличение накопления в клетках противоопухолевых соединений и, как следствие, усиление противоопухолевого действия этих соединений.

Полученные результаты вносят значимый вклад в понимание молекулярных механизмов противоопухолевого действия кукумариозида Аз-2 и фрондозида А и углубляют существующие представления о влиянии низкомолекулярных биорегуляторов на опухолевые клетки животных и человека. Фундаментальные знания, полученные в ходе выполнения диссертационной работы,

создают методологическую основу для изучения механизма действия новых лекарственных средств, созданных на основе тритерпеновых гликозидов голотурий.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине» (Владивосток, 2011), 9* 1ST Asia pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Владивосток, 2011), XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, МЭС ТИБОХ, 2011, 2012), VIII Дальневосточном региональном Конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2011), 2nd Bi-Annual International Practical Cytometry Workshop (Москва, 2011), 2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam (Ханой, Вьетнам, 2013), 38th FEBS Congress «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 2013), FEBS EMBO 2014 Conference (Париж, Франция, 2014), Annual Meeting of the German, Austrian and Swiss Associations for Hematology and Medical Oncology (Гамбург, Германия, 2014).

Личный вклад автора. Автором самостоятельно были проведены исследования цитотоксической активности кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на различных типах опухолевых клеток, изучено влияние гликозидов на индукцию апоптоза, проведена оценка каспазы-3, -9 и расщепленного PARP-1 с помощью метода Вестерн-блоттинг, исследование клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии, включение 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток методами радиоизотопного анализа, изучение колониеобразования опухолевых клеток человека, исследование множественной лекарственной устойчивости и динамики накопления и выброса доксорубицина в опухолевых клетках методами спектрофлуориметрии и конфокальной микроскопии, и проведение противоопухолевой терапии in vivo.

Исследование влияния кукумариозида А2-2 и фрондозида А на протеом опухолевых клеток рака простаты методом 20-элеюрофореза с последующим MALDI-MS/MS анализом выполнено совместно с к.х.н. Дышловым С.А. (Лаборатория химии морских природных соединений, ТИБОХ ДВО РАН), Т. Рульфинг (Лаборатория экспериментальной онкологии, Университетская клиника Гамбург-Эппендорф, Германия) и С. Венц (Департамент медицинской биохимии и молекулярной биологии, институт генетики и функциональной геномики, Университет Грайсфалъда, Германия). Изучение влияние на активацию мышинного р53 с использование двухгибридной дрожжевой тест-системы проведено совместно с к.б.н. Ковальчук С.Н. (Лаборатория морской биохимии, ТИБОХ ДВО РАН). Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии проведено вместе с д.б.н Реуновым A.A. и д.б.н. Реуновым А.В (Лаборатория клеточной дифференциации, ИБМ ДВО РАН и группа фитоиммунитета, ТИБОХ ДВО РАН соответственно). Исследования с помощью конфокальной микроскопии проводили в ЦКП «Биотехнология и генетическая инженерия» БПИ ДВО РАН (к.б.н. Горпенченко Т.Ю.).

Работа с клетками карциномы Эрлиха мыши выполнена в Лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН при финансовой поддержке гранта РФФИ (№ 11-04-01084-а), гранта Дальневосточного отделения РАН( № 14-III-B-05-098), гранта Дальневосточного и Уральского отделений РАН (№ 09-П-У0-05-002), гранта Дальневосточного отделения РАН и Национального научного совета Тайваня (№ 12-ННС-006), программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ-546.1012.4. Исследование противоопухолевой активности в отношении опухолевых клеток репродуктивной системы человека и влияния на протеом клеток рака простаты выполнено в Лаборатории экспериментальной онкологии при Университетской клинике Гамбург-Эппендорф (Германия) при финансовой поддержке грантов Eppendorfer Krebs- und Leukämiehilfe и DAAD-А/11/85854.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 патент и 11 тезисов докладов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 186 публикаций. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 39 рисунков.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю к.б.н. Дмитрию Львовичу Аминину. Автор выражает признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО

РАН: к.х.н. Александре Сергеевне Сильченко и д.х.н. Сергею Анатольевичу Авилову за любезное предоставление кукумариозида А2-2 и фрондозида А, к.х.н. Виктории Николаевне Давыдовой за помощь при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии, к.б.н. Светлане Николаевне Ковальчук за работу с двухгибридной дрожжевой тест-системой, д.б.н Аркадию Анатольевичу Реунову и д.б.н. Анатолию Васильевичу Реунову за помощь при проведении фазово-контрастной и электронной микроскопии. Автор выражает глубокую признательность к.х.н. Сергею Анатольевичу Дышловому за неоценимую помощь в организации и проведении исследований протеома опухолевых клеток человека, а также ценные консультации. Автор также выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Гамбург-Эппендорф (Германия), и в частности, доктору Фридману Хонекеру, доктору Гунхильд фон Амсберг, доктору Кристин Якобсен и профессору Карстену Букамаеру, а также всем сотрудникам Лаборатории биоиспытаний и механизма действия БАВ ТИБОХ ДВО РАН.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования 1.1. Исследуемые соединения. Кукумариозид Аг-2 из кукумарии Cucumaria japónica и фрондозид А из кукумарии Cucumaria frondosa были получены и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН д.х.н., в.н.с. Авиловым С.А. и к.х.н., н.с. Сильчено A.C. Структуры кукумариозида А3-2 и фрондозида А представлены на рисунке 1.

Рис. 1 - Химические структуры кукумариозида А3-2 (А) и фрондозида А (Б).

1.2. Животные. Мыши линии CD-I весом 18-20 г были приобретены в питомнике РАМН «Столбовая» (Московская область, Россия) и в дальнейшем содержались в виварии ТИБОХ ДВО РАН при свободном доступе к воде и пище. Все эксперименты были проведены с соблюдением правил, этических норм и международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.).

1.3. Получение и культивирование опухолевых клеток. В экспериментах использовали музейный тетраплоидный штамм клеток асцитной карциномы Эрлиха мыши (АКЭ), полученный из Всесоюзного онкологического центра РАМН (г. Москва). Для эксперимента клетки отбирали на 7-8 день после инокуляции опухоли. После чего клетки трижды отмывали от экссудата центрифугированием в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) и хранили на льду до экспериментов.

Клетки опухоли репродуктивной системы человека линий РСЗ, NT2, NT2-R, 2102ЕР и 2102EP-R выращивали при стандартных условиях (37°С, 5% СОг) в среде DMEM или RPMI-1640 содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.

1.4. Определение жизнеспособности клеток. Цитотоксическое действие исследуемых веществ определяли при помощи прижизненного красителя трипановый синий. Для эксперимента к суспензии клеток АКЭ добавляли различные концентрации исследуемых веществ, после чего планшеты с клетками инкубировали в термостате 1 ч при 37°С. Затем оценивали жизнеспособность клеток с помощью микроскопа. Подсчет количества живых (неокрашенных) клеток и погибших (окрашенных трипановым синим) клеток производили при помощи программы

Image Tool Version 3.00 (UTHSCSA, США). Цитотоксическую активность вещества выражали как концентрацию ЕС50, при которой количество погибших клеток равна 50%.

1.5. Измерение активности неспецифической эстеразы. Активность неспецифической эстеразы определяли с помощью флуоресцентного зонда флуоресцеин диацетат (Fluorescein diacetate, FDA) на клетках АКЭ. Суспензию клеток с веществами инкубировали в термостате в течение 24 ч при 37°С. Затем добавляли зонд FDA (200 мкг/мл), инкубировали при 37°С в течение 15 минут и измеряли флуоресценцию при Хех - 485 нм, Я.ет = 518 нм с помощью спектрофлуориметра планшетного формата Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия). Цитотоксическую активность вещества выражали как концентрацию ЕС50, при которой активность фермента эстераза клеток ингибируется на 50%.

1.6. Определение цитотоксической активности (МТТ тест). Цитотоксическую активность исследуемых соединений определяли методом МТТ. После инкубирования клеток с веществами в течение 24 ч или 48 ч удаляли супернатант и добавляли чистую среду. Затем добавляли раствор МТТ в каждую лунку и инкубировали 4 ч, после чего добавляли раствор SDS-НС1 и инкубировали при 37°С на протяжении 4—18 ч. Поглощение измеряли при длине волны 570 нм с помощью спектрофорометра Wallac 1420 Victor (PercinElmer, США) или Multiskan FC (Thermo Scientific, Канада). Цитотоксическую активность вещества выражали как концентрацию ЕС50, при которой метаболическая активность клеток ингибируется на 50% .

1.7. Изучение инверсии фосфатидилсерина (ФС). Суспензию клеток АКЭ кукумариозидом Аг-2 или фрондозидом А в СОг-инкубаторе при 37 С в течение 1-24 ч. Для измерения ФС на поверхности клеток использовали стандартные тест-наборы (ApoTarget™ Annexin-V FITC Apoptosis Kit, Molecular Probes, США). Процедура измерения проводилась согласно протоколу производителя. Анализ клеток, вступивших в апоптоз, проводили методом проточной флуоресцентной цитометрии на лазерном клеточном анализаторе FACS Calibur (Becton Dickinson, США), используя программное обеспечение BD CellQuest Pro. Процентное содержание апоптотических клеток определяли по двумерному графику (дот-плот) с использованием программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter), рассчитывая количество клеток с увеличенным содержанием ФС на поверхности мембран, интенсивно окрашиваемых зондом Annexin V-FITC (ранний апоптоз) и клеток, одновременно интенсивно окрашиваемых зондами Annexin V-FITC и PI (поздний апоптоз/некроз).

1.8. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью флуоресцентных зондов PI и Hoechst 33342. Клетки АКЭ инкубировали с веществами в микропланшетах. Далее к клеткам добавляли раствор Hoechst 33342 и PI. Затем отбирали суспензию клеток в камеру для анализа изображения и анализировали флуоресценцию с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия), объектив Fluar 40х/1.30 Oil, с использованием системы регистрации флуоресценции клеток (Cairn Research Ltd., Англия). Флуоресценцию зондов Hoechst 33342 и PI в клетках вызывали облучением при Хех = 352 нм и Хех = 536 нм соответственно. С помощью программного обеспечения AQM Advance 6 software (Kinetic Imaging Ltd., Англия) и Imaging Tools 3.00 (UTHSCSA, США) рассчитывали количество клеток, у которых наблюдалась конденсация и фрагментация хроматина в ядрах (интенсивная синяя флуоресценция), и количество некротических клеток с ядрами, интенсивно флуоресцирующими в красной области. Для расчета во внимание принимали флуоресценцию порядка 100 случайно выбранных клеток (Belloc et al.,1994).

1.9. Определение каспазы-3, -9 и PARP-1. Для измерения концентрации каспазы-3 в цитоплазме клеток АКЭ после инкубирования с гликозидами использовали стандартные тест-наборы (EnzChek. Caspase-3 Assay Kit #1, Molecular Probes, США). Процедура измерения проводилась согласно протоколу производителя при параметрах Хсх = 355 нм и Хп = 460 нм с использованием флуоресцентного фотометра планшетного формата Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия)

Определение каспазы-3,-9, и PARP-1 проводили методом вестерн-блоттинга. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лаэммли (Laemmli, 1970). Зоны интересующих белков определяли с использованием первичных поликлональных и моноклональных антител: поликлональные кроличьи антитела против PARP-1, титр 1:1000; моноклональные кроличьи антитела против каспазы-3, титр 1:1000; моноклональные мышинные

антитела против каспазы-9, титр 1:1000 были от фирмы Cell signaling (США); поликлональные кроличьи антитела против GAPDH, вторичные козьи антитела, меченные пероксидазой хрена, против кролика, титр 1:5000 и вторичные кроличьи антитела против мыши, титр 1:10000 были от фирмы Abeam (США).

1.10. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии. Клетки фиксировали в 2,5%-ом глютаральдегиде на 0,1 М какодилатном буфере. Исследование методом фазово-контрастной микроскопии проводили с помощью микроскопа Axiovert 200М Apotome (Zeiss, Германия). Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии подготовленные образцы клеток напыляли углеродом и анализировали с помощью микроскопа EVO 40 (Zeiss, Германия). Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии клетки дополнительно фиксировали в 2%-ом растворе OsOí на 0,1 М какодилатном буфере, обезвоживали, заключали в Аралдит и получали ультратонкие срезы. Проводили окрашивание срезов растворами уранилацетата и цитрата свинца и исследовали с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Zeiss, Германия).

1.11. Исследование влияния на активность белка р53. Двугибридную дрожжевую тест-систему MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 конструировали согласно протоколу фирмы Югонтек (Ciontech, США). Для конструирования системы использовали штамм Saccharomyces cerevisiae Y187 (ШТа, ura3-52, his3-200, ade2-101, trpl-901, leu2-3, 112, ga!4A, met-, galSOA, MELI, URA3:GALIuas -GALItata-IcicZ) и плазмиды pGBKT7-53 и pGADT7-T, экспрессирующие мышиный p53 и SV40 large T-antigen, соответственно. Трансформацию дрожжевых клеток плазмидами и оценку активности /?-галактозидазы проводили согласно опубликованной работе (Kovalchuk et al., 2006).

1.12. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии. Клетки инкубировали с веществами в стандартных условиях, после чего к ним добавляли 10 мкл пропидиум иодида (PI). Клеточную суспензию хранили в темноте при 4°С. Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии проводили согласно протоколу фирмы Cytometry Research, LLC (США) на проточном цитометре FACScalibur (Becton Dickinson, США) при возбуждении 488 нм в канале FL2. Оценку гистограмм проводили с помощью программы WinMDI 2.9 Ink (США).

1.13. Определение включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток. В клетки асцитной карциномы Эрлиха за 2—4 ч до окончания инкубирования с веществами вносили 20 мкл раствора метил-3Н-тимидина в конечной концентрации 2 мкКи/мл. По окончании инкубирования добавляли по 200 мкл холодного раствора 50%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и клетки оставляли на холоду для преципитации в течение 30 мин. Далее суспензию фильтровали через стекловолоконные фильтры MGB (Munkteil Filter AB, Швеция), фильтры последовательно промывали раствором ледяной 5%-ной ТХУ, дистиллированной водой и 96%-ным этиловым спиртом, высушивали и переносили в сцинциляционные флаконы с сцинциляционной жидкостью Ultima Gold AB (PerkinElmer, США). Подсчет включения радиоактивной метки производили с помощью сцинтилляционного счетчика Tri-Carb 2800 TR liquid scintillation counter (PerkinElmer/Packard, США). Результаты экспериментов подсчитывали в импульсах в минуту (ерт) и выражали как процент от контрольного уровня включения радиоактивно-меченого тимидина в ДНК (Адаме, 1983; Вильсон, 1989).

1.14. Исследование колониеобразования опухолевых клеток. Опухолевые клетки репродуктивной системы человека высевали на чашки Петри d35 мм. После инкубирования с веществами в течение 48 ч живые клетки в количестве 100 штук на лунку переносили в 6-луночные планшеты. После 10 дней культивирования отбирали среду, фиксировали клетки 1 мл метанола в течение 25 мин, промывали ФСБР, высушивали и добавляли 1 мл раствора Гимза (Merck, Германия), инкубировали 25 мин при комнатной температуре и промывали dH20. Затем клетки высушивали на воздухе и считали количество колоний. Результаты выражали в количестве выросших колоний на лунку.

1.15. Определение множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM. Клетки АКЭ в концентрации 5x105 кл/мл по 100 мкл добавляли в каждую лунку 96-луночной планшеты, содержащей различные концентрации исследуемых веществ и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Затем добавляли по 50 мкл

зонда Calcein AM (Molecular Probes, США) и инкубировали 15 мин при 37 С. После чего планшеты центрифугировали по 5 мин при 4°С, 1500 об/мин 3 раза, каждый раз сливая супернатант и добавляя по 200 мкл культуральной среды в каждую лунку. Флуоресценцию измеряли с помощью спектрофлуориметра планшетного формата Fluoroscan Accent (Thermo Labsystems, Финляндия) при Хсх = 494 нм, >.„„ = 517 нм.

1.16. Изучение динамики накопления доксорубицина. В эксперименте использовались клетки АКЭ, полученные на 7 день после инокуляции. К клеткам добавляли кукумариозид Ai-2 и инкубировали при 37°С на 30 мин. Затем клетки переносили в камеру для регистрации изображений, добавляли раствор доксорубицина (Фармахеми Б.В., Нидерланды) и измеряли динамику изменения флюоресценции клеток в течение 2-х часов с помощью конфокального микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) в режиме реального времени. Клетки облучали светом с длиной волны = 470 нм, флуоресценцию регистрировали при Х«т = 590 нм.

1.17. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток. Клетки АКЭ ресуспендировали в среде RPMI-1640 и переносили в 24-луночную планшету. В каждую лунку добавляли различные концентрации кукумариозида Аг-2 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин для блокирования МЛУ. Затем вносили доксорубицин и инкубировали еще 2 ч при 37°С для накопления доксорубицина в клетках. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты по 100 мкл суспензии клеток в эппендорфы, осаждали центрифугированием и отмывали дважды холодным ФСБР. Далее переносили суспензию клеток по 100 мкл в черную планшету и измеряли флуоресценцию доксорубицина с помощью спектрофлуориметра планшетного формата Fluoroscan Accent (Thermo Labsystems, Финляндия) при A« = 485 нм и Хет = 620 нм.

1.18. Протеомный анализ РСЗ клеток (2D-PAGE). Эксперименты по анализу экспрессии белков с помощью протеомного подхода были проведены на клетках линии РСЗ методом двумерного электрофореза (2D-PAGE) и последующего анализа структуры белков методом масс-спектрометрии. Для этого аликвоты объемом 450 мкл с 1 мг белков были нанесены на стрипы для изоэлектрофокусирования (Immobiline Dry Strip pH 4-7, 24 см, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Швеция) на ночь для регидратации при комнатной температуре. Далее было проведено первое разделение с помощью прибора для изоэлектрофокусирования Protean IEF cell (Bio-Rad, Hercules, CA, США). Затем стрипы были уравновешены в растворе 1% DTT в течение 15 мин, и алкилированы с помощью 4,8%-ного раствора йодацетамида в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее стрипы были перенесены в 15% SDS-PAGE гель и покрыты раствором 0,6% агарозы содержащей 0,001% (w/v) бромфенолового синего в качестве красителя. Второе электрофоретическое разделение было проведено в SDS-буферном растворе при 20°С в течение 14 ч. Гели были зафиксированы и окрашены раствором Coomassie Brilliant Blue G 250 (400 мл/гель). Гели были отсканированы с помощью сканера GS-800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad, США). Оптическую плотность сигналов белковых пятен на гелях анализировали с помощью программного обеспечения Delta 2D 4.0 (Decodon, Германия). Пятна белков, количественное содержание которых менялось в экспериментальных гелях по отношению к контрольным в два и более раза, вырезали из гелей и отправляли для установления структуры белков методом MALDI-TOF-MS/MS в аналитическую лабораторию протеомики (Department of Medical Biochemistry and Molecular Biology, University of Greifswald, г. Грайсфальд, Германия).

1.19. Верификация белков методом двумерного вестерн-блоттинга. Аликвоты белковых экстрактов, содержащие по 30 мкг белка, разбавляли с помощью 20-РАСЕ-лизисного буферного раствора до объёма 125 мкл, а затем загружали на стрипы для изоэлектрофокусирования (Immobiline Dry Strip pH 4-7,7 см, GE Healthcare Bio-sciences, Швеция) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре для регидратации. Далее стрипы подвергали изоэлектрическому фокусированию (IEF) с использованием прибора Protean IEF (BioRad, Германия). После первого разделения стрипы уравновешивали в растворе 1% DTT в течение 15 мин, затем алкилировали с помощью 4,8%-ного раствора йодацетамида в течение 15 мин при комнатной температуре и загружали на SDS-полиакриламидные гели, содержащие 15% акриламида без концентрирующего геля. Стрипы заливали раствором 0,6% агарозы в dHîO, содержащей 0,001% (w/v) бромфенолового синего в качестве красителя. Разделение белков проводили в камере для электрофореза Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad, США), после чего переносили белки на мембрану, блокировали мембрану, и инкубировали с первичными и вторичными

антителами. Полиакриламидные гели после стадии переноса окрашивали раствором Coomassie Brilliant Blue G 250, с последующей отмывкой dHjO. После отмывки гели сканировали с помощью сканера GS-800 Calibrated Densitometer (Bio-Rad, США). Цифровые изображения гелей использовали в качестве контроля загрузки одинакового количества белка для метода 2D-BeCTepH-блоттинга. Относительную оптическую плотность сигналов белковых пятен количественно анализировали с помощью программы Bio ID 15.01 (Vilber Lourmat, Франция).

1.20. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2 in vivo. В эксперименте использовали мышей линии CD-I весом 20-22 г, по 6—7 мышей в группе. Мышам внутрибрюшинно вводили клетки асцитной карциномы Эрлиха в количестве 20x106 или 2x106 кл/мышь, после чего начинали вводить раствор кукумариозида А2-2 (0,2 мкг/мышь) или физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными продолжали на протяжении 30-40 дней.

Влияние кукумариозида Аг-2 на противоопухолевую активность доксорубицина проводили используя метод Доненко с соавторами (Donenko et al., 1991) с небольшими модификациями. Клетки АКЭ инокулиловали в количестве 2x106 клеток на животное внутрибрюшинно мышам линии CD-I. На следующий день мышам вводили водный раствор кукумариозида А2-2 внутрибрюшинно ежедневно на протяжении 5 дней в объеме 0,5 мл в дозе 0,2 мкг/мышь (10 мкг/кг). Контрольная группа мышей получала такой же объем физиологического раствора. Через 7 дней мышей умертвляли, выделяли опухолевые клетки и после подсчета концентрации клеток и определения их жизнеспособности инокулировали клетки последующим группам мышей внутрибрюшинно в количестве 2х106 клеток на животное. Через 24 ч начинали противоопухолевую терапию доксорубицином в дозе 2 мг/кг, через день всего три раза. Наблюдение за животными продолжали на протяжении 70 дней.

Противоопухолевый эффект оценивали по числу мышей с отсутствием опухоли (оценка на 10-ые сутки визуально), по средней продолжительности жизни (СПЖ, сутки) и по увеличению средней продолжительности жизни (УПЖ, %).

1.21. Статистический анализ. Статистическая обработка данных, расчет средних значений, стандартной ошибки, стандартного отклонения и коэффициента Стьюдента, а также построение графиков во всех экспериментах были выполнены с помощью статистического и графического пакета SigmaPlot 3.02 (Jandel Scientific, США). Уровень статистической значимости различий принят равным 0,05. Все эксперименты выполнены в трех повторностях.

2. Результаты исследования и их обсуждение

2.1. Цитотоксическая активность гликозидов и влияние на колониеобразование опухолевых клеток. При окрашивании клеток АКЭ мышей трипановым синим и последующим подсчетом процента их жизнеспособности было обнаружено, что инкубирование клеток с кукумариозидом Аг-2 уже при концентрации порядка 2,5 мкМ гликозида приводит к гибели практически 50% клеток (ECso-2,7 мкМ, Рис. 2 А). Фрондозид А проявляет схожую цитотоксическую активность ЕС5о=2,5 мкМ (Таблица 1). Было установлено, что при инкубировании клеток АКЭ мышей с кукумариозидом Аг-2 или с фрондозидом А, применяемых в микромолярном диапазоне концентраций, происходит ингибирование активности неспецифической эстеразы, оцененное при помощи молекулярного флуоресцентного зонда флюоресцеин диацетат (FDA), что свидетельствует об угнетении жизнеспособности опухолевых клеток. ЕС;о для кукумариозида Аз-2 составила 2,1 мкМ (Таблица 1, Рис 2 Б). Полумаксимальная эффективная концентрация цитотоксического действия кукумариозида Аз-2, полученная с помощью метода МТТ, составляет 2,7 мкМ (Рис. 2 В), а для фрондозида А - 1,9 мкМ.

Рис. 2 Цитотоксичекая активность кукумариозида Ао-2 в отношении клеток асцитной карциномы

Эрлиха.

Установлено, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А проявляют сопоставимую цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам мыши и опухолевым клеткам репродуктивной системы человека. Более того, оба тритерпеновых гликозида проявляют практически одинаковое цитотоксическое действие по отношению к различным опухолевым клеткам человека, как чувствительным к эффективному цитостатику цисплатин (линии ЫТ2 и 2102ЕР), так и резистентных к действию этого противоопухолевого препарата (линии ЫТ2-Я и 2102ЕР-Я) (Таблица 1).

Таблица 1. Влияние кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на жизнеспособность клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей и опухолевых клеток репродуктивной системы человека. Указаны полумаксимальные эффективные концентрации (ЕС50).

Вещество ЕС50, МКМ

АКЭ РСЗ 1ЧТ2 1ЧТ2-К 2102ЕР 2102ЕР-К

Кукумариозид Л;-2 11*' 1 1 **' 2 7*** 2,0*** 1 4*** 1 5*** 1,0*** 2,05***

Фрондозид А 2 5*' 2 4**' 1 9*** 2,2*** 2 2*** 2 7*** 1 2 1***

* окрашивание трипановым синим; *' оценка активности неспецифической эстеразы; *** МТТ метод

Было проведено исследование влияния кукумариозида Аз-2 и фрондозида А на процесс формирования колоний на различных типах опухолевых клеток человека, включая линии 1МТ2, РСЗ и 2102ЕР, и клеток, устойчивых к цисплатину КГС-Я и 2102ЕР-Я (Рис. 3 А). Установлено, что тритерпеновый гликозид кукумариозид Аг-2 в концентрации 1 мкМ эффективно блокирует рост опухолевых колоний. Наблюдалось ингибирование порядка 30% от контроля для всех исследуемых клеточных линий.

А

ИТ2 (т-н

Г "Т — щ

Ж ~ 'к

С? -----

Рис. 3 Влияние тритерпеновых гликозидов на образование и рост колоний клеток линий ЫТ2, №Г2-Я (А) и 2102ЕР (Б). * р < 0,05

Тритерпеновый гликозид фрондозид А также проявил выраженное ингибирующее действие

на колониеобразование опухолевых клеток. Так, величина ингибирования роста колоний были сопоставимы с данными по кукумариозиду А2-2 и составили приблизительно 40% от контроля в отношении опухолевых клеток линии NT2 (Рис. 3 А). Максимальное торможение колониеобразования было выявлено при инкубировании клеток линии 2102ЕР в течение 48 ч, и оно составило 70% (Рис. 3 Б).

В результате экспериментов было установлено, что тритерпеновые гликозиды голотурий кукумариозид Аг-2 и фрондозид А способны блокировать рост колоний опухолевых клеток во всех исследуемых клеточных линиях, включая клеточные линии, устойчивые к цитостатику цисплатин.

2.2. Изучение индукции апоптоза. Исследование индукции апоптоза в клетках АКЭ под действием тритерпеновых гликозидов и количественное определение выхода на поверхность цитоплазматической мембраны фосфатидилсерина (ФС) проводилась с помощью флуоресцентного зонда Anexin V-FITC. Выход ФС на внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны характеризуется появлением яркой зеленой флуоресценции в виде ободка, являющейся следствием связывания Anexin V-FITC с ФС. На рисунке 4 А представлена дотограмма контрольных клеток где наблюдается слабая флуоресценция обоих зондов.

10° 10' 101 10' 10"

Ю- ib1 ю

Annexin V-FITC

» Г -

а*

Ь

5

Е> 1

Я 1

Рис. 4 Дотограммы контрольных клеток (А) и клеток, инкубированных с

кукумариозидом Аг2 в концентрации 0,001 мкМ (Б) и зависимость его влияния на инверсию фосфатидилсерина в клетках АКЭ от времени инкубирования. Окрашивание Annexin V-FITC и PI. Черным цветом обозначен ранний апоптоз, серым цветом поздний аноптоз/некроз. Концентрация кукумариозида 0,001 мкМ (В) и 1,0 мкМ (Г).

Было установлено, что инверсия ФС на внешний монослой плазматической мембраны опухолевых клеток зависит от времени инкубирования клеток с гликозидом. Кукумариозид Аз-2 индуцировал инверсию ФС в первые 6 ч инкубирования с максимальным эффектом за 3 ч; самый выраженный эффект наблюдался при концентрации 0,001 мкМ (Рис. 4 Б), однако процент клеток, вступающих в ранний апоптоз, не превышал 10% от общего количества клеток. Для всех исследуемых концентраций кукумариозида A2-2 наблюдалось постепенное значительное уменьшение числа апоптотических клеток, инкубированных с гликозидом в течение 12 и 24 ч. В тоже время при увеличении времени инкубирования клеток с кукумариозидом А2-2 до 12—24 ч наблюдалось увеличение количества клеток, которые одновременно красятся PI и Annexin V-FITC (Рис. 4 В, Г). Это свидетельствует в пользу того, что с увеличением времени инкубирования возрастает количество клеток, вступивших в стадию позднего апоптоза, или некроза. Вероятно, что увеличение некротических клеток происходит вследствие того, что ранее индуцированные апоптотические клетки со временем теряют жизнеспособность, барьерная функция их биомембран нарушается, и такие клетки становятся доступнее для их окрашивания двумя зондами. При концентрации кукумариозида 1 мкМ динамика изменения количества клеток, вступивших в

ранний апоптоз, и количества клеток в позднем апоптозе (или некрозе) была практически одинакова. Максимальный эффект гликозида наблюдался в интервале 3-6 ч инкубирования.

Конденсация хроматина и его фрагментация является одной из стадий (и маркеров) апоптоза. Принцип измерения конденсации хроматина заключается в окрашивании клеток с помощью двух флуоресцентных зондов Hoechst 33342 и PI. Показано, что при инкубировании опухолевых клеток АКЭ с кукумариозидом Кг-2 происходит индукция конденсации хроматина в первые 6 часов, с максимальным эффектом, развиваемым за 1 ч. Наиболее выраженный эффект наблюдался при концентрации 0,001 мкМ; он составил порядка 40% от общего количества клеток (Рис. 5 А). В то же время при увеличении времени инкубирования клеток с кукумариозидом Аг-2 наблюдалось увеличение числа клеток, окрашенных PI, что свидетельствует о некрозе клеток. Наиболее четко этот эффект проявлялся при максимальной концентрации гликозида 1 мкМ и 6 ч инкубирования (Рис. 5 Б).

Рис. 5 Зависимость влияния кукумариозида Аг2 на конденсацию и фрагментацию хроматина в клетках асцитной карциномы Эрлиха от времени инкубирования. Окрашивание Hoechst 33342 и PI. Концентрация кукумариозида Аз-2 0,001 мкМ (А) и 1,0 мкМ (Б)

Влияние фрондозида А на конденсацию хроматина в клетках АКЭ несколько отличается от действия кукумариозида Аг-2. Так, при инкубировании этого гликозида с опухолевыми клетками максимальное число клеток с конденсированным хроматином в ядрах наблюдалось при концентрации 0,001 мкМ в первый час инкубирования и составило около 60% от общего числа клеток.

Измерение количества вышедшей в цитоплазму активированной каспазы-3 определялось спектрофлуориметрически путем регистрации расщепления субстрата Х-ЭЕУО-АМС, который специфически расщепляется каспазой-3 с образованием конечного флуоресцентного продукта. Было установлено, что кукумариозид Аг-2 наиболее эффективно индуцирует выход активированной каспазы-3 в минимальной исследуемой концентрации 0,001 мкМ в первые 1-3 ч; выход каспазы-3 в цитоплазму составлял порядка 20-25% от контроля. В случае инкубирования опухолевых клеток АКЭ с фрондозидом А максимальный выход каспазы-3 происходил также при концентрации 0,001 мкМ после 1-3 ч инкубирования и превышал уровень содержания каспазы-3 в цитоплазме интактных клеток на 30%. Инкубирование клеток с фрондозидом А в концентрации 1 мкМ приводило к выраженному увеличению уровня каспазы-3 уже в первый час инкубирования (Рис. 6 А).

В

Кагпна ) (1~. 19 кДя)

Кягпиа 9(3$. 3"кД*>

CJAPDH (Г кД»)

Рис. 6 Выход каспазы-3 в цитоплазму клеток асцитной карциномы Эрлиха после индукции апоптоза фрондозидом А (А); влияние фрондозида А на расщепление белка РА11Р-1 в клетках N72 (Б); влияние кукумариозида А3-2 и фрондозида А на активацию каспазы-3 и -9 в клетках РСЗ (В). *р < 0,05

Методом электрофореза и иммуноблоттинга оценено влияние исследуемых соединений на расщепление белка РАЯР-1, а также активацию каспаз-3 и -9. На рисунке 6 Б показано, что при

инкубировании опухолевых терминальных клеток линии МТ2, чувствительной к цисплатину, с фрондозидом А в течение 48 ч наблюдается индукция аполтоза в клетках, выражающаяся в расщеплении белка РАЯР-1. Был установлен дозозависмый эффект влияния исследуемых соединений на появление фрагмента расщепленного белка РАЯР-1 (89 кДа) в опухолевых клетках линии 1МТ2. Максимальную эффективность исследуемые гликозиды проявляли при концентрации 2 мкМ, наименьшую - 0,1 мкМ. Кукумариозид Аг-2 оказался менее эффективным по отношению к устойчивым типам опухолевых клеток. Он вызывал расщепление РАЯР-1 только в клетках линии Ь1Т2 за 24 и 48 ч инкубирования и был не эффективен в отношении остальных исследуемых опухолевых клеток человека Г\!Т2-К и РСЗ.

Методом иммуноблоттинга с применением специфических антител было установлено, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А активируют каспазу-3 и каспазу-9 в концентрациях 2 и 1 мкМ после 48 ч инкубирования с опухолевыми клетками репродуктивной системы человека линии РСЗ. На рисунке 6 В стрелками показана увеличенная экспрессия интересующих белков (каспаза-3 и каспаза-9) по сравнению с контролем, что свидетельствует об индукции этих ферментов под воздействием тритерпеновых гликозидов.

При исследовании клеточной деструкции в клетках АКЭ при их инкубировании с кукумариозидом Аг-2 (0,1 мкМ) и последующем применении фазово-контрастной микроскопии, а также трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии, было установлено, что в эксперименте встречаются клетки, разрушающиеся двумя способами, апоптозом и некрозом. В первом случае для разрушающихся клеток характерны такие морфологические особенности, как прогрессирующее сморщивание, фрагментация хроматина, выраженный "блеббинг" клеточной поверхности, происходящий вследствие формирования апоптотических телец, и, наконец, разъединение этих телец. Данный способ деструкции соответствует критериям апоптоза.

Для выяснения участия р53-зависимого сегмента в индукции апоптоза под действием гликозидов, использовали трансгенную двугибридную систему на основе дрожжевых клеток, в которые были встроены ген р53 мыши и ген репортерного белка /?-галактозидазы. В результате анализа было выяснено, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А в диапазоне концентраций 0,0010,1 мкМ фактически не оказывали никакого достоверного влияния на активацию белка р53 в клетках по сравнению с контролем.

2.3. Исследование клеточного цикла и влияние на пролиферацию. Было установлено, что субцитотоксические концентрации гликозидов вызывают резкое увеличение количества клеток в фазе ЗиЬСо, что соответствует анэуплоидным клеткам и, следовательно, выраженной индукции апоптоза в этих клетках. На рисунке 7 А показана гистограмма контрольных клеток АКЭ, и клеток инкубированных в течение 24 ч с кукумариозидом Кг-2 в концентрации 1 мкМ, у которых существенно увеличивается процент клеток в фазе ЭиЬОо и наблюдается блокировка (увеличение процента клеток) в фазе Б (Рис. 7 Б).

Рис. 7 Влияние тритерпеновых гликозидов на клеточный цикл опухолевых клеток. Гистограмма клеток АКЭ в контроле (А) и под влиянием кукумариозида Аз-2 в концентрации ] мкМ (Б). Гистограмма контрольных клеток линии РСЗ (В) и клеток инкубированных с фрондозидом А в концентрации 2 мкМ (Г).

А

Б

- Sub GO Г

apoptotic cells S

Si"'

i GD/G1

■ Ljl._____

0 FL3 1023

Инкубирование клеток АКЭ с фрондозидом А в диапазоне концентраций 0,01-0,1 мкМ также приводило к понижению количества клеток в фазах С2/М и ОоЛ31 и увеличивал количество клеток в фазе Э при инкубировании в течение 24 ч. Было установлено, что инкубирование опухолевых клеток линии РСЗ с тритерпеновыми гликозидами кукумариозидом Аг-2 и фрондозидом А также приводит к увеличению количества клеток в фазе ЭиЬОо, что соответствует появлению анэуплоидных клеток и индукции апоптоза (Таблица 2, Рис. 7 В, Г).

Кроме того, было выявлено выраженное накопление клеток в фазе митоза (Оч/М), что свидетельствует о блокировании клеточного цикла в данной фазе. В качестве положительного контроля для визуализации апоптоза и выявления анэуплоидных клеток были использованы клетки РСЗ, инкубированные с анизомицином в концентрации 1 мкМ в течение 48 ч.

Таблица 2. Влияние кукумариозида А2-2, фрондозида А и анизомицина на клеточный цикл клеток линии РСЗ, инкубированных с веществами в течение 48 ч.

Вещество, мкМ Фазы клеточного цикла

виЬСо О^/С, 8 с2/м

Контроль 2,59±0,08 63,54±1,01 9,85±2,05 15,22±1,71

Кукумариозид А:-2 (2мкМ) 16,92+1,10* 29,19+3,11* 9,43±0,20 32,56+2,72*

Кукумариозид А2-2 (1мкМ) 8,78±0,23* 36,87±1,53* 9,22±0,04 32,14±0,30*

Фрондозид А (2мкМ) 34,33±4,11* 23,75±2,42* 8,26±1,33 23,84±1,11 *

Фрондозид А (1мкМ) 9,11±1,12* 37,17+1,41* 8,24±0,70 34,35±0,12*

Анизомицин 12,71 ±4,32* 39,63±4,34* 9,81 ±1,09 29,62±9,04

*р < 0,05

Таким образом, тритерпеновые гликозиды кукумариозид Аг-2 и фрондозид А, достоверно увеличивают число апоптотических (анеуплоидных) клеток в фазе ЭиЬОо, а также блокируют клеточный цикл в фазе митоза (02/М) в опухолевых клетках человека линии РСЗ и в синтетической фазе Э в опухолевых клетках мыши.

На рисунке 8 показан комбинированный график по цитотоксической активности кукумариозида Аг-2 и его влиянию на включение Н-тимидина в клетки АКЭ. На графике показано, что цитотоксическая активность гликозида, оцененная по включению в клетки красителя трипановый синий, практически мало меняется в диапазоне концентраций 0,001-1,0 мкМ, в то же время гликозид вызывает довольно существенное ингибирование биосинтеза ДНК. Максимальный ингибирующий эффект (наименьшее включение 3Н-тимидина) наблюдался для обоих гликозидов при концентрации 0,01 мкМ и составил 50,17% для кукумариозида А2-2 и

Рис. 8 Цитотоксический и цитостатический эффект кукумариозида Аг-2 в отношении клеток асцитной карциномы Эрлиха, инкубированных с гликозидом в течение 24 ч.

Таким образом, было показано, что исследуемые соединения в нецитотоксическом диапазоне концентраций обладают

выраженным цитостатическим эффектом, они блокируют включение 3Н-тимидина в опухолевые клетки, что отражает ингибирование биосинтеза ДНК, блокирование клеточного цикла и торможение клеточной пролиферации.

2.4. Исследование влияния на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Известно, что важнейшим следствием МЛУ опухолевых клеток является

53,19% для фрондозида А соответственно.

цитотоксический эффект

Н-Г|к1 включение

0001 001 0 1 Концентрация, мкМ

пониженное накопление препаратов в клетке, обусловленное их активным выведением во внеклеточную среду посредством Р-гликопротеина, локализованного в плазматической мембране, за счет энергии гидролиза АТФ. На первом этапе было проведено изучение влияния тритерпеновых гликозидов кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость клеток АКЭ с помощью флуоресцентного зонда Са1сет АМ и спектрофлуориметрии. Установлено, что в клетках с МЛУ наблюдается усиленная экспрессия Р-гликопротеина, благодаря активности которого Са1сет АМ быстро удаляется из клеток и не накапливается в цитоплазме. Было показано, что исследуемые тритерпеновые гликозиды эффективно блокировали активность Р-гликопротеина в исследуемом диапазоне концентраций 0,001-0,1 мкМ, вследствие чего увеличивалось количество зонда Са1сет в цитоплазме (Рис. 9 А). Оба гликозида примерно в равной степени блокировали МЛУ в клетках АКЭ, и увеличение интенсивности флуоресценции накопленного в цитоплазме зонда Са1сет составило порядка 56% по отношению к контролю.

Изучение транспорта противоопухолевого антибиотика доксорубицина в опухолевых клетках проводили с помощью метода конфокальной микроскопии. Установлено, что доксорубицин способен накапливаться в клетках АКЭ, локализуясь преимущественно в ядрах при практически полном его отсутствии в цитоплазме (Рис. 9 Б). Было выявлено, что инкубирование клеток АКЭ с кукумариозидом Аг-2 в диапазоне концентраций 0,001-0,1 мкМ в течение 2 ч приводит к заметному усилению динамики входа доксорубицина и его накоплению в ядрах опухолевых клеток (Рис. 9 В, Г). Через 2 ч от начала эксперимента конечная концентрация накопленного в ядрах доксорубицина существенно выше в клетках, обработанных кукумариозидом Аг-2 по сравнению с контрольными. Отмечена обратно пропорциональная зависимость ингибирующего МЛУ эффекта от концентрации гликозида. Было показано, что предварительное инкубирование клеток с кукумариозидом Аг-2 в концентрации 0,001 мкМ приводило к максимальному накоплению доксорубицина в ядрах клеток АКЭ (Рис. 10 А).

Рис. 9 Влияние кукумариозида А2-2 (А) на множественную лекарственную устойчивость клеток АКЭ, совмещенное (проходящий свет + флуоресценция) конфокальное изображение клеток АКЭ, нагруженных доксорубицином в течение 2-х часов (Б). Влияние кукумариозида А3-2 (0,01 мкМ) на динамику накопления доксорубина в ядрах клеток асцитной карциномы Эрлиха. Контрольные клетки (В) и клетки, предварительно инкубированные с кукумариозидом А2-2 (Г). Показаны записи изменения флуоресценции ядер индивидуальных клеток в монослое. Стрелками указано время введения доксорубицина

Было установлено, что в нецитотоксических концентрациях кукумариозид А2-2 способен задерживать выход доксорубицина из цитоплазмы опухолевых клеток после его первоначального накопления в ядрах. Заметный эффект ингибирования наблюдался при концентрации гликозида 0,001 и 0,1 мкМ после предварительного инкубирования клеток с гликозидом и последующего накопления доксорубицина в клетках АКЭ в течение 2 ч.

Наибольший эффект задержки выхода флуоресцентного противоопухолевого антибиотика наблюдался через 1 ч после отмывки клеток при концентрации гликозида 0,001 мкМ (Рис. 10 Б).

1«

Ж

>1 икМ 0.001 икм

Рис. 10 Влияние кукумариозида А3-2 на накопление и выброс доксорубицина. Показано содержание доксорубицина в ядрах опухолевых клеток АКЭ после его накопления в течение 2 ч (А) и его остаточное содержание в ядрах через 1 ч после отмывки клеток (Б). * р < 0,05

Таким образом, было установлено, что кукумариозид А2-2 блокирует множественную лекарственную устойчивость, что приводит к увеличению как накопления противоопухолевого цитостатика доксорубицина в опухолевых клетках, так и к увеличению времени его задерживания в клетках. Такое блокирование множественной лекарственной устойчивости может вызывать повышение чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам за счет их накопления в клетках и проявлению синергизма при сочетанной противоопухолевой терапии с помощью гликозидов и известных цитостатиков, как это ранее было продемонстрировано для препарата кумазид и 5-фторурацила (Аппшп « а1., 2010).

2.5. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов на протеом опухолевых клеток человека. Были проведены исследования по протеомному анализу белков, экспрессия которых регулируется после инкубирования клеток рака простаты человека линии РСЗ с кукумариозидом А2-2 или фрондозидом А. С этой целью опухолевые клетки инкубировали с изучаемыми соединениями в течение 48 ч, после чего из клеток выделяли белки и проводили их разделение методом двумерного электрофореза. На рисунке 11 А представлено изображение отсканированного геля после проведенного 20-элекрофореза белков из клеток обработанных фрондозидом А. На геле цифрами отмечены белки, экспрессия которых увеличивалась в результате инкубирования с гликозидом (ап-регуляция).

С помощью дифференциального анализа изображений 20-гелей белков, выделенных из контрольных и инкубированных с гликозидами опухолевых клеток, было обнаружено, что общее число белковых пятен, полученных на гелях из экстрактов клеточных культур, равнялось 946. В клеточных культурах, инкубированных с кукумариозидом А2-2, было обнаружено 20 пятен дифференциально экспрессированных белков, экспрессия которых изменялась относительно контроля более чем в два раза. Из них 13 белков было сверхэкспресеировано, а экспрессия 7 белков была блокирована (даун-регулирована) в два и более раз. При обработке результатов в случае с опухолевыми клетками линии РСЗ, инкубированных с фрондозидом А, было выявлено порядка 30 пятен белков, экспрессия которых менялась в два и более раза, причем экспрессия 12 белков была ап-регулирована, а экспрессия 18 белков была даун-регулирована.

Под воздействием кукумариозида А2-2 увеличивалась экспрессия следующих белков: протеин дисульфат-изомераза; 78 кДа глюкозу-регулирующий протеин; кератин тип II, цитоскелетный 1; кератин тип II, кутикулярный НЫ; кальдесмон; кинезин-1 тяжелая цепь; интерлейкин-1р; гетерогенный ядерный и-подобный рибонуклеопротеин 2; нуклеофозмин; несприн-1.

Рис. 11 Изображения 20-геля клеток линии РСЗ после инкубирования в течение 48 ч с фрондозидом А (А). На геле А отмечены пятна с ап-регуляцией. Увеличенные изображения пятен на 20-геле, соответствующие регулируемым белкам-мишеням, под действием фрондозида А (время инкубирования клеток с веществом -48 ч). Знаком «+» на рисунке обозначены пятна, соответствующие белкам, экспрессия которых менялась под действием фрондозида А. Знаком «-» обозначены белки-мишени контрольных клеток (Б).

Даун-регулируемыми под влиянием кукумариозида Аг-2 оказались такие белки как: катепсин В; фосфогликолат фосфотаза; статмин; гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин А/В; белок N01101; ламин В1; белок 2, связывающий клеточную ретиноевую кислоту.

В перечень ап-регулируемых фрондозидом А белков вошли: интерлейкин-1 бета; триозофосфат изомераза; гипоксия ап-регулируемый белок 1; кофилин-1; кератин тип II, кутикулярный НЫ; митохондриальный дегидролипоиллизин-остаток ацетилтрансферазного компонента пируват дегидрогеназного комплекса; митохондриальная субъединица Иевке комплекса цитохром Ь-с1; посредник клатрина 1; гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин С1/С2; сгк II; нуклеофозмин. В результате инкубирования клеток линии РСЗ с фрондозидом снижалась экспрессия таких белков как: убиквитин-коньюгат фермент Е2 вариант1; триозофосфат изомераза; птерин-4-альфа-карбиноламин дегидратаза; катепсин В; дипептидил дипептидаза 1; О-3-фосфоглицерат дегидрогеназа; белок теплового шока НЭР 90-бета; эндоплазмин; кератин тип И, цитоскелетный 1; кератин тип I, цитоскелетный 10; кератин тип I, цитоскелетный 9; посредник транскрипционного фактора 1-бета; гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин А/В; субъединица 2 комплекса активатора протеасом; гетерогенный ядерный и -подобный рибонуклеопротеин 2; 01^1А.1 гомолог суперсемейства С участник 3.

В результате сравнительного анализа полученных данных был дополнительно установлен целый ряд белков, одинаковым образом экспрессирущихся в опухолевых клетках после их инкубирования с тритерпеновыми гликозидами. Это белки, кодируемые генами 1ЫВ, КЛТ81 и СЯК II (ап-регулируемые в культуре опухолевых клеток линии РСЗ), так же как и белки, кодируемые генами САТВ и ЯОАА (даун-регулируемые в опухолевых клетках линии РСЗ).

Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшее количество белков, регулируемых кукумариозидом Аг-2, относится к группе белков, вовлеченных в структурную организацию цитоскелета и принимающих участие в движении клеток и клеточной пролиферации (32%), и, кроме того, играющих важную роль в функционировании клеточного ядра (21%) (Рис. 12 А). Такая же тенденция по распределению по функциям наблюдается и для белков, регулируемых фрондозидом А. Регулируемые им белки можно также распределить по группам белков, принимающих участие в регуляции и функционировании клеточного ядра (28%) и в клеточной пролиферации и подвижности (24%). По сравнению с действием кукумариозида Аг-2 для фрондозида А увеличилось количество белков, обладающих ферментативной активностью, и белков, принимающим участие в метаболизме ряда клеточных белков (до 28%) и ответе на стресс (до 17%) (Рис. 12 Б). Одной из отличительных особенностей влияния фрондозида А на протеом опухолевых клеток РСЗ в сравнении с действием кукумариозида Аг-2, является регулирование (преимущественно даун-регулирование) экспрессии ряда шаперонов, принимающих участие в

сборке белков и являющихся одним из элементов защитного механизма клетки в условиях стресса и неблагоприятных воздействий.

Кукумариозид А2-2

■ Метаболизм белков

■ Метаболизм углеводов

■ Организация цитоскепета. плетенная подвижность и деление

■ Иммунный ответ

■ мРНК процессинг

■ Ответ на стресс

■ Структурно-функциональная организация ядра

«РОНД01НДА

Метаболизм белков | Метаболизм углеводов

Организация цитоскепета клеточная подвижность и деление : Иммунный ответ | мРНК процессинг | Ответ на стресс

Структурно-функциональная организация ядра

Рис. 12 Распределение белков, регулируемых тритерпеновыми гликозидами голотурий, по их функциям в опухолевых клетках линии РСЗ.

В результате проведенных работ по анализу регулируемых белков, мы отобрали 4 белка для их верификации методом вестерн-блоттинга и 20-вестерн-блоттинга кератин-81, катепсин В, интерлейкин-1р и Сгк II, экспрессия которых одинаково регулируется как кукумариозидом Аг-2, так и фрондозидом А.

Эксперименты по верификации белков методом иммуноблоттинга показали, что кукумариозид Аг-2 достоверно увеличивает экспрессию обеих изоформ интерлейкина-1р, но в то же время экспрессия белка кератин 81 находится на уровне контроля. Для подтверждения ап-регуляции кератина 81 был проведен 20-вестерн-блоттинг. Этот эксперимент показал достоверное увеличение экспрессии данного белка по сравнению с контролем. Методом 2В-электрофореза и последующего МАЫЛ-МБ было установлено, что экспрессия белка катепсин В снижается после инкубирования опухолевых клеток человека линии РСЗ с гликозидом в течение 48 ч. Эти данные были подтверждены только после выполнения верификации при помощи метода 20-вестерн-блоттинг, так как при использовании одномерного иммуноблоттинга достоверных различий между контрольными клетками и клетками, инкубированными с кукумариозидом А2-2 обнаружено не было. Вероятнее всего это связано с тем, что при одномерном иммуноблоттинге не удается разделить изоформы интересующего белка по их изоэлектрическим точкам. Экспрессия белка СЯК II увеличивалась при инкубировании клеток с кукумариозидом А2-2.

фрондошд А 1мкМ 2мкМ

50 кДа Альф а- тубулин

40 кДа Сгк П

Рис. 13 Результаты анализа методом вестерн-блоттинг изменений в экспрессии СгкП (А) под влиянием фрондозида А на клетки линии РСЗ в течение 48 ч. Результаты анализа методом 20-вестерн-блоттинг изменений в экспрессии катепсина В (Б- контроль и В- фрондозид А) в клетках РСЗ под влиянием фрондозида А (2 мкМ) в течение 48 ч. Стрелками на гелях указаны пятна, соответствующие исследуемым белкам.

С помощью специфических антител методом вестерн-блоттинг был проведен анализ и верификация белков, экспрессия которых увеличивается или снижается под воздействием фрондозида А. Помимо этого, для белков кератин 81 и катепсин В была сделана верификация при помощи 20-вестерн-блоттинга. Экспрессия интерлейкина-ip значительно повышается при инкубировании клеток РСЗ с тритерпеновым гликозидом фрондозидом А. В тоже время при использовании одномерного иммуноблотинга не заметна разница в экспрессии белка кератин 81. Ап-регуляция данного протеина подтверждена двумерным вестерн-блоттингом. На рисунке 13 А отчетливо видна ап-регуляция для белка CRK II после инкубирования опухолевых клеток человека линии РСЗ с фрондозидом А в течение 48 ч. Даун-регуляция активной изоформы катепсина В была подтверждена как одномерным, так и двумерным вестерн-блоттингом (Рис. 13 Б, В).

Таким образом, впервые был зарегистрирован ответ опухолевых клеток на воздействие тритерпеновых гликозидов на молекулярном уровне с использованием методических подходов, применяемых в протеомике. Было показано, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А вызывают изменение экспрессии ряда белков, играющих ключевую роль в процессах функционирования опухолевых клеток. Эти молекулярные/субмолекулярные процессы участвуют в механизмах развития и деления опухолевых клеток, инвазии опухолей и контролируют процессы программируемой гибели опухолевых клеток. Следовательно, результаты, полученные с помощью методов протеомики, хорошо согласуются с предположениями, что фармакологические принципы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов связаны со способностью гликозидов тормозить пролиферацию опухолевых клеток, блокировать клеточный цикл и индуцировать апоптоз опухолевых клеток.

2.6. Противоопухолевая активность in vivo. Для исследования противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2 было проведено два типа экспериментов, в которых были смоделированы поздняя и ранняя стадии заболевания мышей асцитной формой карциномы Эрлиха. Кукумариозид Аг-2 мы вводили в виде комплекса с холестерином в дозе 0,2 мкг/мышь для того, чтобы уменьшить цитотоксическую активность этого тритерпенового гликозида. В первом типе экспериментов по моделированию поздней стадии заболевания мышам внутрибрюшинно инокулировали опухолевые клетки в количестве 20 млн клеток на мышь. Схема эксперимента и результаты по подсчету средней продолжительности жизни (СПЖ) представлены в таблице 3.

В следующей серии экспериментов проводили оценку противоопухолевого эффекта кукумариозида Аг-2, применяемого по комбинированной схеме на животных, которым прививали 2 млн клеток на мышь (Рис. 14 А). Анализ результатов проведенного исследования влияния препарата на развитие опухоли у мышей показал, что препарат в дозе 0,2 мкг/мышь тормозит развитие опухоли в течение первых 10-и суток после инокуляции опухоли. Примерно в 25-30% случаев развитие опухоли визуально не выявлялось, в то время как в контрольной группе животных развитие опухоли констатировалась в 100% случаев. Тем не менее, к 20 дню развитие опухоли наблюдалось уже во всех группах мышей. СПЖ для контрольной группы составило 24,67 дня, в то время как при применении препарата наблюдалось статистически достоверное (р < 0,05) увеличение продолжительности жизни до 29 дней. В этом случае УПЖ составило 17,33% по отношению к контрольным животным (Таблица 3).

Таблица 3. Зависимость влияния кукумариозида Аз-2 на среднюю продолжительность жизни мышей с асцитной формой карциномы Эрлиха от количества инокулированных опухолевых клеток.

20Х106кл/МР.ГШЬ

СПЖ, сутки УПЖ, % СПЖ, сутки УПЖ, %

Контроль 16,0±0,89 - 24,6±2,08 -

Кукумариозид А2-2 15,33±0,52 - 29,0*±1,7 17,3±7,5

*р < 0,05

Таким образом, в экспериментах с инокуляцией опухолевых клеток в количестве 2 млн клеток на одно животное, что соответствует ранним стадиям заболевания, кукумариозид Аг-2 показал достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных. Противоопухолевый эффект препарата может быть связан как с иммуномодулирутощими

свойствами тритерпенового гликозида, так и со способностью препарата индуцировать в опухолевых клетках апоптоз, ингибировать в них биосинтез ДНК и блокировать клеточный цикл и пролиферацию.

В экспериментах по исследованию влияния кукумариозида Аг-2 на множественную лекарственную устойчивость клеток АКЭ in vivo мы использовали методический протокол, предложенный Доненко с соавторами (Donenko et al., 1991). На первом этапе исследований животным, которым предварительно была инокулирована АКЭ, на протяжении недели ежедневно внутрибрюшинно вводился раствор кукумариозида Ai-2 для блокирования МЛУ опухолевых клеток. Контрольные животные получали физиологический раствор. Затем опухолевые клетки извлекали и инокулировали их следующей группе животных, которым в дальнейшем проводили противоопухолевую терапию доксорубицином.

Рис. 14 Выживаемость мышей с асцитной карциномой Эрлиха 2 млн клеток на животное (А) в контрольной группе и в группе, получавшей кукумариозид Аг-2. Влияние предобработки кукумариозидом А3-2 на противоопухолевую активность доксорубицина на модели асцитной карциномы Эрлиха мышей in vivo. Кук - кукумариозид А2-2, Доке - доксорубицин (Б).

В результате исследований было показано, что в контрольной группе мышей, с инокулированными опухолевыми клетками от мышей, получавших только физиологический раствор, отмечалась минимальная средняя продолжительность жизни, составляющая 21,5 день. Во второй группе контрольных животных, получавших только физиологический раствор, но у которых введенные опухолевые клетки подвергались m vivo предварительному воздействию кукумариозида Аг-2 на протяжении 5 дней, наблюдалось увеличение продолжительности жизни мышей по сравнению с контрольной группой. Так, последнее животное в этой группе погибло на 36-й день, в то время как в контрольной группе на 23-й день эксперимента. Средняя продолжительность жизни мышей в этой группе составила 29,8 дней (Таблица 4, Рис. 14 Б).

Таблица 4. Влияние кукумариозида Аг-2 и доксорубицина на выживаемость мышей с асцитной формой карциномы Эрлиха (2,0х106 клеток на животное). Кук - кукумариозид Аа-2, Доке -доксорубицин.

Группа Кукумариозид А3-2, мкг/мышь Доксорубицин, мкг/мышь СПЖ, сутки Выживаемость, живые/общее количество Выживаемость, %

Контроль - - 21,5 0/5 0

Контроль (Кук) 0,2 - 29,8 0/5 0

Доке - 40 60,8 3/5 60

Доке (Кук) 0,2 40 70 5/5 100

При применении доксорубицина в дозе 40 мкг/мышь (2 мг/кг) наблюдалось значительное увеличение продолжительности жизни. Первая мышь в данной группе погибла только на 42-й

день после инокулирования опухоли, вторая мышь пала на 52-й день, а оставшиеся в группе животные оставались живы вплоть до 70-го дня наблюдений. СПЖ в этой группе составила 60,8 дней, а выживаемость к 70 дню составила 60%. В группе животных, опухолевые клетки которых предварительно подвергались воздействию кукумариозида Аг-2, а впоследствии обрабатывались доксорубицином, выживаемость составила 100% за весь период наблюдений в 70 дней (Таблица 4, Рис. 14 Б).

Было установлено, что предварительная обработка опухолевых клеток in vivo тритерпеновым гликозидом кукумариозидом Аг-2 и последующая терапия мышей доксорубицином приводит к существенному усилению противоопухолевого эффекта доксорубицина. Это усиление может быть обусловлено подавлением МЛУ в клетках АКЭ, накоплению доксорубицина и усилению его цитостатического эффекта в отношении опухолевых клеток. Кроме того, нельзя исключать, что кукумариозид Аг-2 может индуцировать в клетках АКЭ апоптоз и вызывать блокировку клеточного цикла и митоза (как это было показано нами в предыдущих главах), что может также приводить к усилению противоопухолевого эффекта доксорубицина.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А проявляют практически одинаковую цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам мыши и опухолевым клеткам репродуктивной системы человека, как чувствительных, так и устойчивых к цисплатину. Гликозиды подавляют формирование и рост колоний опухолевых клеток человека, в том числе устойчивых к действию цисплатина, что свидетельствует об их способности тормозить процесс метастазирования.

2. Установлено, что прямое взаимодействие кукумариозида Аг-2 и фрондозида А с различными типами опухолевых клеток, включая устойчивые к цисплатину клетки, приводит к индукции в них апоптоза, что выражается в инверсии фосфатидилсерина на внешнюю поверхность биомембран, конденсации и фрагментации хроматина в ядрах, появлении апоптотических телец, появлении в цитоплазме каспазы-3, -9 и расщепленного PARP-1, увеличении количества анеуплоидных (апоптотических) клеток в фазе клеточного цикла SubGo. Показано, что в опухолевых клетках мышей апоптоз протекает по каспазозависимому пути, минуя активацию р53-зависимой стадии.

3. Обнаружено, что действие гликозидов на опухолевые клетки сопровождается арестом клеточного цикла в синтетической фазе S или фазе митоза G2/M в зависимости от типа опухолевых клеток и блокированием встраивания 3Н-тимидина в опухолевые клетки, свидетельствующим об ингибировании биосинтеза ДНК.

4. В клетках опухоли простаты человека линии РСЗ выявлено 20 белков-мишеней, экспрессия которых изменяется в 2 и более раза при инкубировании клеток с кукумариозидом Аг-2, а также 30 белков-мишеней, экспрессия которых изменяется под воздействием фрондозида А. Эти белки относящиеся к регуляторам метаболизма белков и углеводов, к белкам цитоскелета, участвующим в клеточной подвижности и делении, принимают участие в иммунном ответе, в ответе на стресс, в мРНК процессинге, а также в структурно-функциональной организации ядра клеток. Причем экспрессия 5 белков менялась под воздействием обоих гликозидов одинаковым образом.

5. Показано, что кукумариозид А2-2 и фрондозид А в нецитотоксическом диапазоне концентраций достоверно блокируют множественную лекарственную устойчивость в опухолевых клетках карциномы Эрлиха мышей. Такое блокирование приводит к усилению накопления в ядрах опухолевых клеток противоопухолевого цитостатика доксорубицина и увеличению времени его задерживания в клетках.

6. Установлено, что применение кукумариозида А2-2 in vivo вызывает достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных с инокулированной асцитной карциномой Эрлиха, что проявлялось только при моделировании ранних стадий заболевания. При проведении комбинированной терапии отмечено выраженное усиление противоопухолевого эффекта доксорубицина после предварительной обработки кукумариозидом Аг-2 мышей с асцитной карциномой Эрлиха.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях

1. Menchinskava E.S.. Pislyagin Е.А., Kovakhyk S.N., Davydova V.N., Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Aminin D.L. Antitumor activity of cucumarioside A2-2 // Chemotherapy. 2013. No. 59. P. 181-191.

2. Menchinskava E.S. Aminin D.L., Avilov S.A., Silchenko A.S., Andryjashchenko P.V., Kalinin V.I., Stonik V.A. Inhibition of tumor cells multidrug resistance by cucumarioside A2-2, frondoside A and their complexes with a cholesterol // Natural Product Communication. 2013. V.8, No. 10. P.1377-1380.

3. Aminin D.L., Pislyagin E.A., Menchinskava E.S.. Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I. Immunomodulatory and anticancer activity of sea cucumber triterpene glycosides // Studies in natural products chemistry, Ed. Atta-ur-Rahman. Amsterdam. Elsevier Science Publisher. 2014. V. 41. P. 75-94.

Патент

1. Менчинская E.C.. Аминин Д.Л., Сильченко А.С., Андриященко П.В., Авилов С.А., Калинин В.И., Стоник В.А. Средство, ингибирутощее множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток // Патент РФ № 2494742 от 10.10.13. Бюл. № 28. С. 9.

Тезисы конференций

1. Менчинская Е.С.. Аминин Д.Л. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий и их комплексов с холестерином // XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток, 2010. С. 44.

2. Пислягин Е.А., Менчинская Е.С.. Аминин Д.Л. Новое иммуномодулирующее лекарственное средство Кумазид // Материалы VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука — медицине». Владивосток, 2011. С. 11-12.

3. Пислягин Е.А., Менчинская Е.С. Новое иммуномодулирующее лекарственное средство Кумазид. Молекулярные механизмы противоопухолевого действия // Человек и лекарство: материалы VIII Дальневосточного регионального конгресса с международным участием. Тихоокеанский медицинский журнал. Владивосток: медицина ДВ. № 3. 2011. С. 117-118.

4. Менчинская Е.С.. Аминин Д.Л. Исследование влияния кукумариозида А2-2 на мультилекарственную устойчивость опухолевых клеток // XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток, 2012.

5. Pislyagin Е.А., Menchinskava E.S.. Davidova V.N., Kovalchuk S.N., Avilov S.A., Aminin D.L. Molecular mechanisms of cucumarioside A2-2 antitumor action // 9th 1ST Asia pacific meeting on animal, plant and microbial toxins. September 4—8. Vladivostok, Russia. 2011. P 56.

6. Pislyagin E.A., Menchinskava E.S.. Davydova V.N., Aminin D.L. Cucumarioside A2-2 arrests cell cycle and induces apoptosis in Ehrlich carcinoma cells / Abstracts of 2nd Bi-Annual International Practical Cytometry Workshop, Cytometry Part В // Clinical Cytometry. 2012. V. 82B. P. 10-11.

7. Aminin D.L., Pislyagin E.A., Menchinskava E.S.. Astashev M.E., Sokolov P.A., Yurchenko E.A., Stonik V.A. New anticancer and immunomodulatory compounds from sea cucumbers // The 2nd international workshop on marine bioresources of Vietnam. June 5-6. Hanoi, Vietnam.2013. P. 5359.

8. Menchinskaia E.S.. Gorpenchenko T.Y., Honecker F., Aminin D.L. Influence of cucumarioside A2-2 upon multi-drug resistance of cancer cells // Abstracts of FEBS Symposium "Mechanisms in Biology". Jule 6-11, St-Peterburg, Russia, 2013. FEBS Journal 280 (Suppl. 1), 2013. P. 505.

9. Menchinskaia E.S.. Dyshlovoy S.A., Jacobsen C., Venz S., Aminin D.L., Honecker F., Amsberg G. v. Effect of holothurians triterpene glycosides, cucumariosideA2-2 and frondoside A, on human prostate cancer // Abstracts of FEBS-EMBO 2014 Conference. 29 August-4 September, Paris, France, 2014. FEBS Journal 281(Suppl. 1), 2014. P. 485.

10. Aminin D.L., Menchinskaya E.S.. Pislyagin E.A., Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Stonik V.A. New anticancer compounds from sea cucumbers. Molecular mechanisms of action // Abstracts of FEBS-EMBO 2014 Conference. 29 August -4 September, Paris, France, 2014. FEBS Journal 281(Suppl. 1), 2014. P. 488.

11. Dyshlovoy S.A, Menchinskaya E.S. Rast S., Venz S., Hauschild J., Jacobsen C., Kalinin V.I, Silchenko A.S, Avilov S.A, Bokemeyer C., Schumacher U., Stonik V.A, Aminin D.L, Honecker F., von Amsberg G. Marine triterpene glycoside Frondoside A exhibits high in vitro and in vivo activity in prostate cancer II Annual Meeting of the German, Austrian and Swiss Associations for Hematology and Medical Oncology. 10-14 October. Hamburg, Germany, 2014.

Менчинская Екатерина Сергеевна

Молекулярные механизмы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов кукумариозида Аг-2 и фрондозида А

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 21.10.2014. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 497

Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10