Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сапонины растений семейства Fabaceae Lindl. европейского северо-востока России

ВАК РФ 03.02.14, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Сапонины растений семейства Fabaceae Lindl. европейского северо-востока России"

На правах рукописи

Шадрин Дмитрий Михайлович

САПОНИНЫ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА FABACEAE LINDL. ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРО-ВОСТОКА РОССИИ

03.02.14 - биологические ресурсы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 MAP 2013

Владивосток 2013

005051040

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Володин Владимир Витальевич

Официальные оппоненты: Калинин Владимир Иванович

Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, старший научный сотрудник.

Зорикова Светлана Петровна Кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Горнотаежная станция ДВО РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Дальневосточный государственный аграрный университет, г. Благовещенск

Защита состоится 14 марта 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, е-mail: komand@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан «¿26» Q>€--6¿¿Z2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук, доцент

Командрова H.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

к

Актуальность темы. Семейство Fabaceae Lindl. является одним из ведущих семейств во флоре европейского северо-востока России и насчитывает 61 вид из 16 родов. Среди бобовых много видов пищевых и кормовых растений, таких как виды рода астрагал (Astragalus L.) - а. альпийский (A al-pinus Boriss. & Schischk.), а. цицер (A. cicer Boriss. & Schischk.), а. датский (A. danicus Retz.), а. холодный {A. frígidas (L.) A. Gray); рода чина (Lathy-rus L.) - ч. Гмелина (L. gmelinii Fritsch), ч. луговая (L. pratensis L.); рода клевер (Trifolium L.) - к. пашенный (Т. arvense L.), к. полевой (Т. campestre L.), к. луговой (Т. pretense L.); рода чечевица (Lens L.) - ч. обыкновенная (L. culinaris Medik.); рода горох (Pisum L.) - г. посевной (Р. sativum L.) и рода фасоль (Phaseolus L.) - ф. обыкновенная (Ph. vulgaris L.). Благодаря высокому содержанию биологически активных веществ различной природы ряд видов этого семейства входит в Фармакопею Российской Федерации (Государственная фармакопея РФ, 2008) и других государств (Государственная фармакопея СССР, 1990), например, солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), с. щетинистая (Glycyrrhiza echinata L.), с. уральская (Glycyrrhiza uralensis L.). Имеются многочисленные сведения о применении растений этого семейства в народной медицине: язвенник обыкновенный (Anthyllis vulneraria L.), копеечник альпийский (Hedysarum alpinum L.), пажитник сенной (Trigonella foenum-graecum L.). Несмотря на то, что в литературе имеются обширные сведения о химическом составе представителей данного семейства, данные о содержании стероидных и тритерпеновых сапонинов являются разрозненными и фрагментарными. Актуальность настоящего исследования заключается в необходимости разработки молекулярно-филогенетических и хемотаксономических подходов для установления закономерностей распространения стероидных и тритерпеновых гликозидов в семействе Fabaceae Lindl. Важным направлением исследований является выявление продуцентов тритерпеновых и стероидных гликозидов. Среди тритерпеновых гликозидов интерес представляют производные олеаноло-вой кислоты, среди стероидных гликозидов - диосцин и протодиосцин (производные диосгенина), которые используют в качестве полупродукта для микробиологического' синтеза кортикостероидов. Протодиосцин применяют в составе антиатеросклеротических лекарственных препаратов (Авакян, 2006).

Цель работы: установление закономерностей распределения тритерпеновых и стероидных гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России, а также определение состава и динамики их содержания в Anthyllis vulneraria и Trigonella foenum-graecum.

Задачи исследования:

1) разработать экспериментальные подходы к скринингу растений семейства Fabaceae на содержание сапонинов;

2) изучить распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России;

3) дать количественную биохимическую оценку перспективных представителей семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России по содержанию тритерпеновых гликозидов;

4) определить содержание производных олеаноловой кислоты в различных органах дикорастущих растений язвенника обыкновенного (Anthyllis vulneraria) на разных фазах развития, установить содержание общего азо-

та, протеиногенных аминокислот и микроэлементов в растениях Anthyllis vulneraria;

5) определить содержание стероидных гликозидов в различных органах культивируемых растений пажитника сенного (Trigonella foenum-graecum), установить содержание общего азота, протеиногенных аминокислот и микроэлементов в растениях Trigonella foenum-graecum.

Научная новизна работы

На основании сравнения последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) рРНК исследуемых видов реконструировано филогенетическое древо семейства Fabaceae. С использованием молеку-лярно-филогенетического и хемотаксономического подходов впервые изучено распределение стероидных и тритерпеновых гликозидов в семействе Fabaceae и установлено, что большинство видов изучаемого семейства содержат тритерпеновые гликозиды. Стероидные гликозиды обнаружены только у представителей триб Trifolieae, Loteae и Thermopsideae.

Впервые определенно количественное содержание суммы тритерпеновых гликозидов (СТГ) у горных видов родов копеечника (Hedysarum), астрагала (Astragalus), остролодочника (Oxytropis) флоры европейского северо-востока России и выявлены виды с наибольшим их содержанием.

Изучена динамика содержания производных олеаноловой кислоты в дикорастущих растениях Anthyllis vulneraria и установлено, что наибольшее количество этих веществ содержат корни и листья в фазу бутонизации (3.20 и 2.60%) и цветения (3.46 и 1.92%), а также семена (2.74%).

Впервые изучена динамика содержания протодиосцина и диосцина у культивируемых растений Trigonella foenum-graecum и установлено, что максимальное количество протодиосцина содержат проростки и семена, а также листья растений в фазе бутонизации. Максимальное содержание диосцина отмечено в листьях в фазе цветения и в семенах.

Практическая значимость работы

Во флоре европейского Северо-Востока выявлены виды растений с высоким содержанием тритерпеновых гликозидов: Hedysarum arcticum. Astragalus subpolaris и A. frigidus.

Anthyllis vulneraria рекомендован для выращивания в Республике Коми в качестве лекарственного и кормового растения.

Для интродукции рекомендован вид Trigonella foenum-graecum, который в подзоне средней тайги Республики Коми за вегетационный период проходит все стадии развития и образует полноценные жизнеспособные семена, применяемые в качестве лекарственного сырья для фармацевтической промышленности.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на XV, XVII и XVIII Всероссийских молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008, 2010, 2011); II ежегодной русско-корейской конференции «Современные проблемы в химии природных соединений и биотехнологии» (2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issues of natural products chemistry and biotechnology») (Новосибирск, 2010); V всероссийской научно-практической конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2010); «Февральских чтениях» Сыктывкарского государственного университета (Сыктывкар, 2011); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Украина, 2011); между-

народной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе три статьи в журналах, входящих в «Перечень российских рецензируемых журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами, включает одно приложение. Список цитируемой литературы включает 162 наименования, в том числе 66 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы представлено многообразие известных групп и структур вторичных метаболитов в царстве растений, возникшее, по мнению ряда исследователей, как результат адаптивной эволюции видов к факторам окружающей среды (Harborne, 1993; Wink, 2003). Рассмотрено распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растительном мире (Dini et al., 2001а; Akhov et al., 1999; Fabricant, Farnsworth, 2001; Муравьева, 1978; The biological action..., 2002), их химическая природа (Гринкевич, 1974; Абубакиров, 1986), характер распределения по частям растений (Иванова и др., 1981; Бенидзе и др., 1983; Harborn, Turner, 1984). Показаны пути биосинтеза стероидных и тритерпеновых гликозидов (Bennett, Heftmann, 1965; The biosynthesis of steroidal..., 1969; Tschesche, 1972; Пасешниченко, Васильева, 1995, 2000), а также широкий спектр биологической активности данных соединений, который зависит от природы агли-кона (Анисимов, Чирва, 1980; Dimoglo et al., 1985; Johnson и др., 1986; Кинтя и др., 1987; Киселева и др., 1991, Hostettman et al., 1996; Hu et al., 1996; Васильева, Пасешниченко, 1995, 2000; Ikeda et al., 2000; Yoshikawa et al., 2001; Mengoni et al., 2002; Myszka, Bednarczyk, 2005; Noguchi et al., 2006; Артюшкова и др., 2008). Обобщены сведения, касающиеся функций и физиологической роли сапонинов в самих растениях (Муравьева, 1978; Barr et al., 1998; Identifcation of a novel..., 1998; Morrissey, Osbourn, 1999; The biological action..., 2002; Кинтя и др., 2005, 2006). Показано, что развитие методов молекулярной биологии в конце XX в. открыло принципиально новые возможности для изучения эволюционных отношений между организмами путем сравнения их нуклеотидных последовательностей. Анализ литературы показал, что хорошим объектом для филогенетических реконструкций являются внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2) рРНК (Baldwin et al., 1995; Hershkovitz, Zimmer, 1996; Hershkovitz, Lewis, 1996; Choi, Kim, 1997; Ким, 2003; Ней, Кумар, 2004; Крюков, 2005; Тюпа, 2005; Носов, 2006; Антонов, 2006).

2. Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Объектами исследования являлись образцы дикорастущих видов растений семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России, собранные в экспедициях на Приполярный и Северный Урал, Средний и Южный Тиман, в Вологодской, Архангельской обла-

стях и окрестностях г. Сыктывкар, SL ТЯКЖ6 образцы растений других географически удаленных флор из коллекции Ботанического института РАН (Санкт-Петербург) и образцы культивируемых растений Trigonella foenutn-graecum, семена которых были предоставлены Всероссийским институтом лекарственных и ароматических растений (г. Москва). Образцы растений рода Hedysarum, рода Astragalus и рода Oxytropis, произрастающие на территории европейского северо-востока России, были отобраны со следующих местообитаний: местообитание 1 - Троицко-Печорский район, Северный Урал, правый берег нижнего течения р. Илыч, 35 км вверх от устья, разнотравный ивняк на скалистом выступе (62°38'31.2" с.ш., 58°47'59.2" в.д.); местообитание 2 - Троицко-Печорский район, Средний Тиман, левый берег р. Цильма, урочище Щепина щелья на каменистом берегу в основании выходов известняков (65°30'54.1" с.ш., 50°4Г35.6" в.д.); местообитание 3 - Интинский район, Приполярный Урал, национальный парк «Югыд ва», левый берег р. Кожим вблизи бывшей базы Таврота, на каменистом берегу в основании выхода коренных пород (65°28'24" с.ш., 60°36'32" в.д.); местообитание 4 - Интинский район, Приполярный Урал, национальный парк «Югыд ва», верхнее течение р. Кожим около устья р. Хасаварка, галечник с разреженной травяно-моховой растительностью, окруженный ивняками и ерником, каменистый берег (65°03'25.2" с.ш., 60°45'59.4" в.д.); местообитание 5 - Интинский район, Приполярный Урал, национальный парк «Югыд ва», переправа через р. Кожим, левый берег, вблизи дороги антропогенно нарушенный участок, ерничково-кустарничково-злаково-мел-котравное моховое сообщество, каменистый берег (65°28'61.7" с.ш., 60°31'82.1" в.д., 300 м); местообитание 6 - Троицко-Печорский район, Средний Тиман, сырая травянистая прибрежная полоса левого берега р. Цильма вблизи устья р. Мутная шириной 1.5 м, длиной около 10 м, опушка леса (65°38'31.6" с.ш., 49°22'21.8" в.д.); местообитание 7 - Троицко-Печор-ский район, Средний Тиман, каменистый берег правого берега р. Цильма, вблизи устья р. Нижняя Сенка в основании выхода коренных пород, ширина - б м, длина около 40 м (65°26'35.1" с.ш., 49°29'44.7" в.д.); местообитание 8 - Троицко-Печорский район, Северный Урал, Печоро-Илычский биосферный заповедник, правый берег р. Илыч, напротив устья р. Большая Ляга, каменистая прибрежная полоса (62°28'25.4" с.ш., 58°57'28.4" в.д.).

Сбор растительного материала производили в течение 2007-2010 гг. Образцы растений фиксировали путем высушивания в бумажных пакетах. Для биохимического анализа отбирали разные части растений (листья, бутоны, цветки, плоды, корни) на разных фазах развития: начала вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения. Определение видов проводили в отделе флоры и растительности Севера Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Родовые названия и видовые эпитеты приведены в соответствии со сводкой С.К. Черепанова (Черепанов, 1995).

Качественное определение сапонинов. Для качественного определения сапонинов в исследуемых образцах растений использовали экспресс-метод на гемолиз эритроцитов, тест на пенообразование и метод тонкослойной хроматографии на пластинках Sorbfil в системах хлороформ:метанол:вода в различных соотношениях - 65:27:4, 65:12:1.5 и 65:35:10. Пластины проявляли реактивом Санье (1%-ный раствор ванилина в концентрированной H2S04) и реактивом Эрлиха (n-диметиламинобензальдегид в концентрированной НС1) для выявления стероидных гликозидов. Для тритерпеновых гликоиздов использовали 20%-ный раствор H2S04.

Определение суммы тритерпеновых сапонинов в растениях. Образцы растений отбирались методом модельных экземпляров. Содержание тритерпеновых сапонинов определяли по опубликованной методике (Киселева и др., 1991). Растительное сырье исчерпывающе экстрагировали 70%-ным этанолом при нагревании на водяной бане. Экстракты испаряли до исчезновения спирта и добавляли семикратный объем ацетона. Образовавшийся хлопьевидный осадок (сырой сапонин) отфильтровывали, сушили до постоянной массы и вычисляли его содержание в процентах от сухой массы навески исследуемого образца.

Спектрофотометрическое определение тритерпеновых сапонинов в растении Anthyllis vulneraria. Метод основан на способности агликона три-терпенового сапонина взаимодействовать с концентрированной серной кислотой. После такого взаимодействия тритерпеноиды протонируются по двойной связи с образованием карбокатиона. При этом наблюдается характерный максимум поглощения при длине волны, равной 310 нм (Писарев и др., 2009). 1.0 г измельченного воздушно-сухого сырья трехкратно экстрагировали 96%-ным этиловым спиртом порциями по 50 мл на кипящей водяной бане в круглодонной колбе на 200 мл с обратным холодильником. Полученные извлечения фильтровали и объединяли в мерную колбу на 250 мл (раствор 1), недостающий объем восполняли элюентом. Из полученного извлечения отбирали аликвоту объемом 10 мл и выпаривали в фарфоровой чашке досуха. Остаток растворяли в 10 мл смеси для гидролиза (ледяная уксусная кислота:хлористоводородная кислота:вода в соотношении 3.5:1.0:5.5), помещали в круглодонную колбу для гидролиза и нагревали на водяной бане в течение 2 ч с момента закипания бани. После кипячения гидролизную смесь разбавляли водой в два раза, выпавший осадок отделяли фильтрованием. Осадок на фильтре промывали водой, растворяли в 25 мл горячего 96%-ного этилового спирта и собирали в мерной колбе на 25 мл (раствор 2). К 1 мл полученного раствора прибавляли 4 мл концентрированной серной кислоты, выдерживали 10 мин и определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-56 в области 220-450 нм, раствор сравнения - концентрированная серная кислота. Параллельно определяли оптическую плотность стандартного раствора олеаноловой кислоты в аналогичных условиях эксперимента. Содержание (%) суммы сапонинов в образцах в пересчете на олеаноловую кислоту расчитывали по формуле:

А m„-250 25-100-100

X' ^ _ u_,

Aq -т1 - 25 - (100- ÍF¡,)

где А0 - оптическая плотность исследуемого раствора; Ах - оптическая плотность концентрированной серной кислоты; ш0 - масса навески олеаноловой кислоты, г; тх - масса сырья, г; W0 - потеря 5 % массы сырья при высушивании.

ВЭЖХ-анализ растений Trigonella foenum-graecum при определение содержания диосцина и протодиосцина. Все растительные пробы высушивали в потоке воздуха при температуре 60 °С в течение 10-15 ч. Высушенные пробы измельчали. Растительный материал экстрагировали 70%-ным этанолом. Работа проводилась на аналитической ВЭЖХ-системе Varían (США) с использованием обращенно-фазовой колонки Microsorb-100A-C18, размеры частиц - 5 мкм. При анализе проб на содержание протодиосцина и диосцина использовали элюент ацетонитрил-вода в соотношении для первого соединения 27:73 v/v, для второго - 80:20 v/v; скорость потока -

1.5 мл/мин.; длина волны - 207 нм. В качестве стандартов использовали протодиосцин и диосцин фирмы ChromoDex (США).

Определение общего азота и протеиногенных аминокислот. Анализ на содержание азота и протеиногенных аминокислот (ПАК) проводили в эко-аналитической лаборатории «Экоаналит» ИБ Коми НЦ УрО РАН. Азот определяли с использованием газовой хроматографии (газ-носитель - гелий) на элементном анализаторе 1110 (CHNS-O) (Методика выполнения измерений..., 2009). Содержание ПАК устанавливали методом количественного химического анализа гидролизатов белков, полученных при гидролизе изучаемых образцов хлороводородной кислотой в запаянных ампулах при температуре 110 °С в течение 24 ч в термостате. Разделение смеси на отдельные компоненты осуществляли на хроматографической колонке, заполненной ионообменной смолой «Ostión». Количество каждой АК определяли фотометрическим методом по поглощению при X = 520 нм окрашенного в желтый цвет соединения, образующегося в результате постколоночной реакции аминокислоты с нингидрином. Хроматографирование АК осуществлялось на анализаторе AAA 339 с использованием буферных растворов с pH 2.90, 4.25 и 7.90. Содержание аминокислотного азота в общем азоте рассчитывали по общепринятой методике (Методика выполнения измерений..., 2010).

Определение содержания макро- и микроэлементов. Анализ содержания макро- и микроэлементов проводили в экоаналитической лаборатории «Экоаналит». Содержание металлов в кислоторастворимой форме определяли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой «Spectro» (ПНД Ф 16.1:2.3.3.11-98) (Методика выполнения измерений..., 2005). Содержание макро- и микроэлементов выражали в мг/кг сухого вещества.

Методы молекулярно-филогенетического анализа. Выделение геномной ДНК проводили по методике Doyle and Doyle (1987) с модификациями. Амплификация участка ITS1 и ITS2 гена 45S рРНК проводили при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Проверку качества и количества выделенной геномной ДНК и продукта ПЦР осуществляли при помощи электрофореза в агарозном геле. Определение последовательностей ДНК (секвенирование) производили на базе Центра коллективного пользования Ботанического института РАН (г. Санкт-Петербург) и на базе Института биологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар). Для реконструкции филогенетического древа исследуемых видов семейства Fabaceae использовали полученные нами и взятые из базы данных GenBank последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2. Последовательности выравнивали вручную и с помощью программы ClustalW (Thompson et al., 1994), входящей в пакет программ MEGA 4 (Tamura et al., 2007). Использованы два метода: метод максимальной парсимонии и метод объединения ближайших соседей. Генетические расстояния рассчитывали исходя из модели Таджимы-Неи (Ней, Кумар, 2004). В качестве внешней группы была взята Rosa blanda.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку Данных проводили по непарному t-критерию Стьюдента (Лакин, 1990).

3. Распространение сапонинов в семействе Fabaceae флоры европейского северо-востока России

3.1. Методология скрининга растений на содержание сапонинов

В основе методологии скрининга растений на содержание сапонинов (стероидных и тритерпеновых гликозидов) были использованы методы хемоси-стематики и молекулярно-филогенетического анализа. Для проведения систематического и ботанико-географического анализа отбирали виды семейства Fabaceae таким образом, чтобы в выборку входили представители как можно большего числа триб и родов этого семейства, произрастающие на территории европейского северо-востока России. Также учитывали, что содержание сапонинов в разных частях растений значительно изменяется в течение вегетационного периода. Проведение скрининговых работ требует массовых анализов, которые затруднительно проводить инструментальными методами, такими как ВЭЖХ-хроматография, масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия, поэтому в работе использовали экспрессные методики, основанные на известных физико-химических свойствах сапонинов и их биологической активности. Для этого использовали тест на гемолиз эритроцитов, тест на пенообразование и метод тонкослойной хроматографии. Тест на гемолиз эритроцитов хотя и является специфичным, но все же допускает получение ложноотрицательного результата, так как известно, что стероидные гликозиды фуростанолового ряда проявляют гемолитическую активность на порядок меньше, чем стероидные гликозиды спиростанолового ряда (Кинтя и др., 1987). Поэтому образцы подвергли дальнейшему исследованию, направленному на установление природы сапогенина, для чего использовали метод, основанный на способности стероидных и тритерпеновых гликозидов к образованию пены в кислой или щелочной среде. Далее для уточнения химической природы сапонинов использовали специфические реагенты для тонкослойной хроматографии. Таким образом, исключалась возможность получения ложноотрицательных результатов.

3.2. Распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России

Семейство Fabaceae - одно из самых обширных семейств цветковых растений, насчитывающее около 550 родов и более 12000 видов, распространенных почти по всему Земному шару. Семейство делится на три подсемейства: Caesalpinioideae, Mimosoidae и Faboideae (Тахтаджян, 1987). Жизненные формы Fabaceae весьма разнообразны. Подсемейства Caesalpinioideae и Mimosoideae представлены в основном древесными, кустарниковыми формами и лианами, травы в них крайне редки (Neptunia, Senna, Chamaecrista и Hoffmanseggia). Среди Faboideae около половины видов относятся к травянистым растениям, многие высокоспециализированные трибы, такие как Vicieae и Trifolieae, практически полностью представлены травянистыми растениями (Яковлев, 1991). В изучаемой флоре встречаются представители только подсемейства Faboideae, представленные травянистыми растениями, за исключением интродуцента Caragana arborensis Lam. (кустарник).

Во многих представителях этого семейства обнаружены сапонины, главным образом, тритерпеновые гликозиды (Sparg et al., 2004). Стероидные гликозиды обнаружены только в растениях рода Trigonella (Т. foenum-graecum и Т. caerulea L.) и у видов Anthyllis macrocephala L. из флоры Средиземноморья и Melilotus tauricus L. из флоры Крыма (Галкин, 1980; Ходаков и др., 1996).

На содержание стероидных и тритерпеновых сапонинов было проанализировано 178 образцов растений 108 видов из 35 родов семейства Fabaceae, из них 32 вида из 13 родов произрастают во флоре европейского северо-востока России. Нами установлено, что практически все исследованные виды изучаемой флоры содержат только тритерпеновые гликозиды (29 видов). По результатам использованных тестов в образцах растений трех видов (Lathyrus sylvestris L., Vicia sepiurn L., Trifolium hybridum L.) сапонины не обнаружены. Мы ожидали обнаружить стероидные гликозиды в образцах видов растений из местной флоры, принадлежащих трибе Trifolieae, к которой относятся известные виды-продуценты из родов Trigonella и Melilotus, и в трибе Loteae, которой принадлежат известные по литературным данным продуценты стероидных гликозидов из родов Anthyllis (А. macrocephala) и Coronilla (С. varia). Однако стероидные гликозиды не были обнаружены ни в одном из образцов видов растений из указанных выше триб Trifolieae и Loteae. В общей выборке образцов (108 видов) стероидные гликозиды были обнаружены в образцах двух степных видов рода Thermopsis трибы Thermopsideae. Тритерпеновые гликозиды были обнаружены у большинства представителей семейства Fabaceae изучаемой флоры. С помощью метода тонкослойной хроматографии были выявлены перспективные виды-продуценты с высоким содержанием данных соединений. Ими оказались виды родов Hedysarum, Astragalus и Oxytropis, а также заносный вид Anthyllis vulneraria.

Для разработки хемотаксономического прогноза обнаружения новых источников сапонинов нами была произведена филогенетическая реконструкция семейства Fabaceae на основании сравнения нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2. Полученное филогенетическое древо включает 50 видов, относящихся к 20 родам и семи трибам, разделенное на пять клад (рис. 1). Кладу I с хорошей поддержкой образуют представители родов Trigonella и Melilotus. Клада II объединяет две субклады, одна из которых с хорошей поддержкой объединяет виды родов трибы Vicieae, а вторая субклада с кладой I образуют трибу Trifolieae. Клада III объединяет виды родов Anthyllis, Coronilla и Lotus, входящих в трибу Loteae. Клада IV состоит из двух субклад с невысокой поддержкой, одну из которых образуют виды, относящиеся к трибе Galegeae, а вторую - виды, относящиеся к трибе Hedysareae. Клада V образует две субклады, одна из которых включает виды родов, относящиеся к трибе Thermopsideae, а вторая - виды родов трибы Genisteae.

Сопоставление результатов биохимического и молекулярно-филогене-тического анализа растений (для чего привлекались образцы растений не только из изучаемой флоры, но и из других географически удаленных флор) позволяет заключить, что на внутрисемейственном уровне виды - продуценты стероидных гликозидов оказались не связаны монофилетическими отношениями на уровне триб, к которым они принадлежат. При этом особый интерес представляют данные распределения стероидных гликозидов в трибе Trifolieae, в которой эти соединения обнаружены в монофилетич-ных родах Trigonella и Melilotus, образующих на молекулярно-филогене-тической кладограмме отдельную обособленную от других представителей этой трибы кладу I с хорошей поддержкой. Этот факт, свидетельствующий об эволюционной близости нуклеотидных последовательностей таксонов, которые образуют данную кладу, отражает современные представления об эволюции вторичного метаболизма как результата адаптивной стратегии растений в отборе определенных структур (в нашем случае — стероидных гликозидов), вероятно в качестве защитных факторов, способствующих выживанию растений в меняющихся условиях среды.

i foenum-graecum*

Trigonelía s Melilotos officinalis* Melilotos albus* Trifolium pratense* Trifolium med и ил* Trifolium arvense* Trifolium hybrid um Trifolium repens* Trifolium monlanuin Trifolien fragitèrurn Trifo iiuro campestre Trifolium aureum

Uuhyrus vcmus I-arltyrus pratcnsis Pisum sativum Vicia sytvatica *

__HJ-vic'a

0_| '-Vicia sepium *

^ i-Vicia cracca *

^-Vicia amurcos»

s,!-lx>tus peczoricus «

1—— Lolus corniculatus " _J I™«««««— Coronilla coronata 191-Anlhyllis vulneraria

ccer * Astragalus glycyphyllos Oxytropis deflexa Oxytropis glabra Hedysarum hedysaroidcs Hedysarum alpinum « Hedysarum membranaceum Hedysarum caucasicum Onobrychis petraea Onobrychis incrmis Thermopsts lanceolate Thermopsis monUrna * Baptisia amtralis * Lupinus potyphyllus * liiictoria germanici

- Gtycyrrtiiza glabra

- Rosa blanda

II

III

IV

V

s

Рис. 1. Филогенетическое древо видов семейства Fabaceae.

Примечание: ■■■■■■ - виды, содержащие стероидные гликозиды;--виды, содержащие тритерпеновые гликозиды; I, II, III, IV и V - клады; * - виды, ITS последовательности которых получены нами, последовательности остальных видов взяты из базы данных национального центра биотехнологической информации США Genbank.

То обстоятельство, что нами не были обнаружены виды с одновременным присутствием и тритерпеновых, и стероидных гликозидов, свидетельствует о том, что наличие стероидных и тритерпеновых гликозидов у растений, по-видимому, является взаимоисключающим. Наличие тритерпеновых гликозидов у подавляющего числа видов наследственных Mimosoideae и большинства триб Faboideae, куда вошли исследованные нами виды, может указывать на генетическую предрасположенность к биосинтезу сапонинов этой группы, что не исключает одновременное присутствие в растениях генов, кодирующих ферменты биосинтеза обеих групп сапонинов.

Для представителей семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России характерны только тритерпеновые гликозиды.

4. Оценка представителей родов Hedysarum, Astragalus и Oxytropis по содержанию тритерпеновых гликозидов

Для количественного анализа тритерпеновых гликозидов нами были отобраны образцы растений родов Hedysarum, Astragalus и Oxytropis из разных местообитаний, которые по результатам ТСХ-хроматографии дали наиболее выраженную реакцию на содержание тритерпеновых гликозидов. Результаты анализа по содержанию суммы тритерпеновых гликозидов («сырой» сапонин) представлены в табл. 1.

Таблица 1

Содержание суммы тритерпеновых гликозидов (СТГ) в фазу цветения в образцах растений видов родов Hedysarum, Astragalus и Oxytropis

Местообитание СТГ («Сырой» сапонин), %

Таксон Вид Надземная Подземная

часть часть

Род Hedysarum L. H. alpinum L. 1 1.5 3.0

Н. alpinum L. 2 1.3 2.8

Н. arcticum В. Fedtsch. 3 1.1 2.5

Н. arcticum В. Fedtsch. 4 2.9 4.0

Н. arcticum В. Fedtsch. 5 2.1 2.5

Н. arcticum В. Fedtsch. 6 1.9 2.0

Н. arcticum В. Fedtsch. 7 0.8 3.3

Род Astragalus L. A. danicus Retz. 8 1.6 3.8

A. danicus Retz. 1 1.2 3.4

A. subpolaris Boriss. & Schischk. 8 2.8 4.9

A. subpolaris Boriss. & Schischk. 5 1.3 2.5

A. subpolaris Boriss. & Schischk. 3 2.0 3.2

A. frigidus (L.) A. Gray 7 3.1 4.4

A. frigidus (L.) A. Gray 8 2.9 2.7

A. frigidus (L.) A. Gray 3 3.0 3.7

A. norvegicus Grauer 3 3.1 4.8

A. norvegicus Grauer 5 1.4 2.9

Род Oxytropis DC. 0. sordida (Willd.) Pers. 3 3.3 4.4

0. sordida (Willd.) Pers. 7 3.0 4.3

0. sordida (Willd.) Pers. 6 1.5 2.2

4.1. Род Hedysarum

На территории европейского северо-востока России род копеечник представлен двумя многолетними травянистыми видами - копеечник альпийский (Н. сйртит) и к. арктический (Н. агсИсчт) (Флора..., 1976).

H. alpinum - евроазиатский лесостепной вид, произрастающий в лесной и лесостепной зонах Сибири и Дальнего Востока. В европейскую часть заходит на Урале, в Предуралье, а также в Архангельской и Мурманской областях. Н. alpinum встречается в хорошо дренированных закустаренных луговых участках в поймах рек и ручьев. Предпочитает влажные и богатые гумусом луговые почвы на склонах коренных берегов. Встречается на сырых галечниковых берегах (Фармакогнозия, 2010).

Высокое содержание суммы тритерпеновых гликозидов (СТГ), определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях

H. alpinum из местообитания 1. В надземной части растений оно составило

I.5%, в подземной - 3.0%. Поскольку вид включен в Красную книгу Республики Коми, его заготовка в природных популяциях запрещена. Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений северо-уральских популяций.

Н. arcticum - арктоальпийский евроазиатский вид. Произрастает на сухих песчаных, каменистых берегах, слабо задернованных берегах, пойменных луговинах уральских рек (Флора..., 1976).

Высокое содержание СТГ, определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях Н. arcticum из местообитания 4. В надземной части растений оно составило 2.9% , в подземной - 4.0% . Вид включен в Красную книгу Республики Коми и его заготовка в природных популяциях запрещена. Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений из популяций Приполярного Урала.

4.2. Род Astragalus

На территории флоры европейского северо-востока России произрастает семь видов рода астрагал: а. датский (A danicus), а. холодный (A. frigidus), а. субарктический (A. subpolaris), а. норвежский (A norvegicus), а. уральский (A. uralensis), а. зонтичный (A. umbellatus) и а. песчаный (A. arenarius) (Флора..., 1976). Нами были выявлены местообитания и отобраны для анализа образцы растений четырех видов изучаемого рода.

A. danicus - лесостепной евроазиатский вид. Обычно встречается на песчаных пойменных злаково-разнотравных лугах и берегах рек. Высокое содержание СТГ, определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях A. danicus из местообитания 8. В надземной части растений оно составило 1.6%, в подземной - 3.8%. Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений из популяций Северного Урала.

A. frigidus - гипоарктический циркумполярный вид. Севернее Полярного круга растет на сухих луговых разнотравных склонах, каменистых речных берегах. В зоне тайги произрастает на каменистых и сырых галечниковых берегах. Более высокое содержание СТГ, определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях A. frigidus из местообитания 7 и в надземной части растений оно составило 3.1%, в подземной — 4.4% . Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений из популяций Среднего Тимана.

A. subpolaris - циркумполярный субарктический вид. Произрастает A subpolaris в горной и равниной тундрах, в лесную зону заходит по берегам рек. Типичными местообитаниями являются долинные и горные луга, берега рек. Высокое содержание СТГ, определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях A. subpolaris из местообита-

ния 8. В надземной части растений оно составило 2.8%, в подземной -4.9%. Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений из популяций Северного Урала.

A. norvegicus - арктоальпийский евроазиатский вид. Встречается на каменистых берегах, гольцах, береговых склонах и на пойменных разнотравных луговинах. Высокое содержание СТГ, определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях A. subpolaris из местообитания 3. В надземной части растений оно составило 3.1%, в подземной - 4.8%. Вид включен в Красную книгу Республики Коми, его заготовка в природных популяциях запрещена. Для получения лекарственного растительного сырья целесообразно его введение в культуру клеток.

4.3. Род Oxytropis

На территории флоры произрастает два вида этого рода: остролодочник Мертенса (О. mertensiana) и о. грязноватый (О. sórdida) (Флора..., 1976). Нами был исследован на содержание тритерпеновых гликозидов только О. sórdida, относящийся по широтно-долготному распределению к арктичес-ко-евроазиатской группе. Более высокое содержание СТГ, определяемое по методике Киселева и др., (1991), было обнаружено в растениях данного вида из местообитания 3. В надземной части растений оно составило 3.3% , в подземной - 4.4%. Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений из популяций Приполярного Урала.

Для получения лекарственного растительного сырья целесообразна интродукция растений Н. alpinum и A. subpolaris из северо-уральских популяций, Н. arcticum и О. sórdida из популяций Приполярного Урала, A. fri-gidusH3 популяций Среднего Тимана, а также введение в культуру клеток растений A. norvegicus.

5. Тритерпеновые гликозиды, аминокислоты и микроэлементы растений Anthyllis vulneraria L.

Язвенник обыкновенный (Anthyllis vulneraria L.) - двулетнее растение, достигающее высоты 35 см, имеет стержневой корень (Флора..., 1976). В Республике Коми A. vulneraria встречается по обочинам дорог и на железнодорожных насыпях, возможно, является заносным. Нами были обнаружены несколько его местообитаний: 1 - в Ухтинском районе Республики Коми на втором километре от поворота с федеральной трассы Сыктывкар-Ухта на пос. Боровской; 2 - в Ухтинском районе Республики Коми вдоль федеральной трассы Сыктывкар-Ухта вблизи моста через р. Ухта; 3 - в окрестностях г. Великий Устюг Вологодской области на берегу р. Сухона; 4 - в окрестностях г. Вельск Архангельской области вдоль федерального шоссе Москва-Архангельск.

Недавними исследованиями показано, что A. vulneraria содержит тритерпеновые гликозиды - производные олеаноловой кислоты, которые, по всей видимости, и обуславливают его целебные свойства (Nartowska et al., 2001). Однако сведения о их количественном содержании в растениях A. vulneraria, произрастающих на европейском северо-востоке России, отсутствуют. Также отсутствуют сведения о его аминокислотном и микроэлементном составе. На содержание суммы тритерпеновых гликозидов (СТГ) были проанализированы образцы растений второго года жизни из местообитания 1. Отбирались листья, стебли и корни на различных фазах развития растений: бутонизации, цветения, плодоношения и отмирания (рис. 2).

4,5

Илист

4 3.5

Ш стебель

Шкорень

И семена

О

бутонизация цветение

плодоношение отмирание

Рис. 2. Содержание суммы тритерпеновых гликозидов по органам и фазам развития растения Anthyllis vulneraria L.

Примечание: звездочками обозначена разница с предыдущей фазой по содержанию суммы тритерпеновых гликозидов, достоверная при * Р<0.001, ** Р<0.002, *** Р<0.05.

Анализ растений на содержание СТГ в пересчете на олеаноловую кислоту (Писарев и др., 2009) показал, что наибольшее их количество содержится в корнях в фазу бутонизации и цветения, составляя 3.20 и 3.46% соответственно. В надземной части растении A. vulneraria наибольшее содержание СТГ обнаружено в листьях в фазу бутонизации и цветения, составляя 2.60 и 1.90% соответственно, что несколько уступает содержанию СТГ в корнях. В семенах содержание СТГ составило 2.74%. Поскольку массовая доля корней в структуре урожая мала, а содержание СТГ максимально, в качестве сырья для получения тритерпеновых гликозидов целесообразно использовать всю биомассу растений.

Качественный анализ белка в растениях A. vulneraria позволил обнаружить наличие 16 протеиногенных аминокислот, девять из которых являются незаменимыми. По содержанию аминокислот растение язвенника обыкновенного не уступает известным кормовым растениям, а по содержанию аланина и лизина превосходит их. Элементный анализ показал, что надземная часть растений особенно богата магнием, железом и марганцем. Содержание алюминия и тяжелых металлов не превышает ПДК.

Язвенник обыкновенный рекомендован для интродукционных и биохимических исследований в качестве источника ценных биологически активных веществ и микроэлементов.

6. Оценка культивируемых растений Trigonella foenum-graecum L. по содержанию стероидных гликозидов, аминокислот и микроэлементов

В настоящее время увеличивается потребность фармацевтической промышленности в растительном сырье, содержащем стероидные гликозиды. Среди представителей семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России мы не обнаружили растений - продуцентов этих соединений и поэтому целесообразно было оценить состав и динамику содержания стероидных гликозидов в известном растении-продуценте данных соединений Trigonella foenum-graecum при культивировании этого вида в условиях Севера.

Пажитник сенной (Т. foenum-graecum) - однолетнее травянистое растение семейства Fabaceae. Родина растения - восточная часть Средиземноморья. В культуре пажитник сенной известен с глубокой древности в качестве ценного кормового, пищевого и лекарственного растения. В настоящее время пажитник культивируется главным образом в Индии, Эфиопии и Китае (Фармокогнозия, 2010). В России имеется опыт по его выращиванию в Московской и Новосибирской областях (Израильсон, 1981).

Опыт по выращиванию пажитника сенного в условиях европейского северо-востока России проводился нами в период 2008-2010 гг. в подзоне средней тайги в окрестностях г. Сыктывкар на территории Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Исходные семена были предоставлены Всероссийским институтом лекарственных и ароматических растений (г. Москва). Наибольшая полевая всхожесть семян была определена на 30-й день после посева. Наблюдение за прохождением основных фенологических фаз позволило установить вегетационный период, который составил в условиях Республики Коми 109, 110 и 101 день соответственно в 2008, 2009 и 2010 гг. За этот период растения успевали пройти полный цикл своего развития и образовать полноценные жизнеспособные семена.

Исследование высоты растений в конце вегетационного периода показало, что растения из семян собственной репродукции оказались выше растений, полученных из семян московской репродукции, на 23% (PcO.OOl). Урожай семян составил 80, 105 и 95 г/м2 соответственно в 2008, 2009 и 2010 гг. Таким образом, урожайность у растений, выращенных из семян собственной репродукции, выше, чем урожайность растений, выращенных из семян московской репродукции. Достоверных различий по высоте растений, полученных из семян собственной репродукции, по годам наблюдений не выявлено.

В растениях пажитника сенного содержатся стероидные гликозиды фу-ростанолового (протодиосцин) и спиростанолового (диосцин) рядов. Содержание данных соединений в семенах урожая разных лет непостоянно. Наибольшее количество протодиосцина (2.47%) содержится в семенах урожая

2009 г., наибольшее количество диосцина (1.27%) - в семенах урожая 2010 г. Достоверно низкое количество протодиосцина и диосцина (соответственно 1.47 и 0.93%) содержится в семенах урожая 2008 г. по сравнению с 2009 и

2010 гг.

Для понимания роли стероидных гликозидов для самих растений, а также для определения сроков заготовки растительного сырья нами был исследован характер распределения протодиосцина и диосцина в различных органах растений Т. foenum-graecum, выращиваемых в условиях Севера. Имеющиеся в литературе сведения по локализации синтеза стероидных гликозидов указывают на то, что данные соединения синтезируются в листьях в виде фуростаноловых производных, которые при повреждении ткани растения взаимодействуют с эндогенным ферментом Р-глюкозидазой и трансформируются в спиростаноловые аналоги, обладающие более высокой мембранолитической активностью по отношению к фитофагам, представляя собой эндогенный фактор защиты растений (The biosynthesis..., 1969; Гиоргадзе, 2006).

В проростках, основную часть которых составляют первые два листа, содержание протодиосцина и диосцина составило 1.37 и 0.62% соответственно.

Таблица 2

Доля протодиосцина и диосцина в сухой массе растений пажитника сенного, %

Часть растения

Фаза

Бутонизация | Начало цветения [ 1-^етение ¡Плодоношение

Лист Протодиосцин

Диосцин Стебель Протодиосцин

Диосцин Корень Протодиосцин

Диосцин Семена Протодиосцин Диосцин

1.16 ± 0.18 0.53 ± 0.05 0.02 ± 0.003 0.42 ± 0.070 0.014±0.003 0.69 ± 0.09

0.40 ± 0.04* 0.51 ± 0.05 0.08 ±0.014* 0.44 ± 0.05 0.0040 ±0.0001* 0.100 ±0.026**

0.76 ± 0.06** 1.27 ±0.10 0.073 ±0.008 0.65 ± 0.08" 0.051 ± 0.006* 0.032 ± 0.005

0.846 ± 0.080 0.15 ±0.02* 0.050 ± 0.002** 0.14± 0.02* 0.08 ±0.01** 0.33 ± 0.06* 1.96 ±0.14 1.12 ±0.08

Примечание: звездочками показана достоверность разницы с предыдущей фазой по содержанию соединения: * при р<0.001; ** при р<0.05.

При изучении динамики содержания протодиосцина и диосцина растений Т. ^оепит^гаесит установлено, что наибольшее количество протодиосцина (1.96%) и диосцина (1.12%) содержится в семенах. В листьях наибольшее количество протодиосцина обнаружено в фазу бутонизации (1.16%), диосцина - в фазу цветения (1.27%) (табл. 2).

При изучении особенностей онтогенеза растений Т. /оепит^гаесит на европейском северо-востоке России и накопления в них стероидных глико-зидов показано, что за вегетационный период пажитник сенной проходит все стадии развития и образует полноценные жизнеспособные семена с высоким содержанием соединений фуростанолового (протодиосцин) и спи-ростанолового (диосцин) рядов. При изучении динамики содержания данных соединений по органам и фазам развития Т. /оепит^гаесит установлено, что наибольшее их количество содержится в семенах, а также в проростках и в листьях в фазах бутонизации и цветения.

Содержание азота в сухом веществе надземной части растений Тпйопе11а /оепитп^гаесит Ь. составило 1.35%, суммарное содержание аминокислот составило 5.77 г в 100 г сухого вещества, содержание магния, железа и марганца составило 2436, 140 и 56 мг/кг соответственно, содержание алюминия и тяжелых металлов не превысило предельно допустимых концентраций.

ВЫВОДЫ

1. Для семейства Fabaceae европейского северо-востока России характерны только тритерпеновые гликозиды, поиск видов - продуцентов стероидных гликозидов следует проводить среди представителей триб Trifolieae, Loteae и Thermopsideae в растениях южных широтных групп.

2. Наиболее перспективными для изучения содержания и состава три-терпеновых гликозидов является Hedysarum arcticum, в образцах которого СТГ составляет в надземной части - 2.9%, подземной - 4.0% от сухой массы образца; Astragalus subpolaris, в образцах которого СТГ составляет в надземной части — 2.8%, подземной - 4.9% от сухой массы образца, и A. frigidus, в образцах которого СТГ составляет в надземной части - 3.1%, подземной — 4.1% от сухой массы образца.

3. Наибольшее количество производных олеаноловой кислоты у дикорастущих растений Anthyllis vulneraria L. содержится в корнях в фазу бутонизации (3.20%) и цветения (3.46%), в листьях.в фазу бутонизации (2.60%) и в семенах (2.74%).

4. Содержание азота в сухом веществе растений Anthyllis vulneraria L. составило 2.1%, суммарное содержание аминокислот составило 10.94 г в 100 г сухого вещества, содержание магния, железа и марганца составило 2830, 210 и 70 мг/кг соответственно, содержание алюминия и тяжелых металлов не превысило предельно допустимых концентраций.

5. В подзоне средней тайги Республики Коми интродуцированные растения Trigonella foenum-graecum L. за вегетационный период проходят все стадии развития, образуют жизнеспособные семена с высоким содержанием стероидных гликозидов; максимальное содержание протодиосцина обнаружено в проростках (1.37%), в листьях в фазу бутонизации (1.65%) и в семенах (1.96%), максимальное содержание диосцина обнаружено в листьях в фазу цветения (1.27%) и в семенах (1.12%). ,

6. Содержание азота в сухом веществе растений Trigonella foenum-grae-ситп L. составило 1.35%, суммарное содержание аминокислот составило 5.77 г в 100 г сухого вещества, содержание магния, железа и марганца составило 2436, 140 и 56 мг/кг соответственно, содержание алюминия и тяжелых металлов не превысило предельно допустимых концентраций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах, входящих в «Перечень российских рецензируемых журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук».

Шадрин Д.М., Пылина Я.И., Родионов А.В., Володина С.О., Ткаченко К.Г., Володин В.В. Закономерности распространения сапонинов и экдисте-роидов в растениях: хемотаксономический и молекулярно-филогенетичес-кий подходы // Известия Самарского научного центра РАН, 2010. Т. 12. № 1(3). С. 857-862.

Шадрин Д.М., Пылина Я.И., Володина С.О., Володин В.В. Химический анализ растений Anthyllis vulneraria L., произрастающих на европейском северо-востоке России // Известия Самарского научного центра РАН, 2011. Т. 13. № 1(4). С. 945-947.

Шадрин Д.М., Володина С.О., Володин В.В., Цицилин А.Н. Динамика содержания диосцина и протодиосцина в Trigonella foenum-graecum (Faba-сеае) в условиях интродукции (Республика Коми) // Растительные ресурсы, 2011. Т. 47. Вып. 4. С. 88-96.

В прочих изданиях

Шадрин Д.М. Методология скрининга растений семейства Fabaceae на содержание сапонинов // Актуальные проблемы биологии и экологии: Материалы докладов XV Всероссийской молодежной научной конференции. Сыктывкар, 2008. С. 327-329.

Шадрин Д.М . Распространение, классификация, методы обнаружения и выделения сапонинов из растительного сырья и их биологическая активность // Вестник Института биологии Коми НЦ УрО РАН, 2010. № 1. С. 15-24.

Шадрин Д.М. , Родионов А.В., Володина С.О., Ткаченко К.Г., Володин В.В. Хемотаксономический и молекулярно-филогенетический подходы в

изучении распространения сапонинов в сем. Fabaceae Lindl. // Труды Института биоресурсов и прикладной экологии. Оренбург, 2010. Вып. 9. С. 154156.

Dmitry М. Shadrin, Alexander V. Rodionov, Svetlana O. Volodina, Kirill G.Tkachenko, Vladimir V. Volodin. Distribution of saponins in Fabaceae // Current issues of natural products chemistry and biotechnology: Abstracts 2nd Annual Russian-Korean Conference. Novosibirsk, 2010. P. 132.

Шадрин Д.М., Пылина Я.И. Хемотаксономический и молекулярно-фи-логенетический подходы в изучении распространения сапонинов и экдис-тероидов в растениях // Актуальные проблемы биологии и экологии: Материалы докладов XVII Всероссийской молодежной научной конференции. Сыктывкар, 2010. С. 259-263.

Шадрин Д.М., Володина С.О., Володин В.В. Ttigonella foenum-graecum L. -продуцент диосцина и протодиосцина в культуре на севере // Тезисы докладов научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». Новый Свет, Крым, 2011. С. 409-410.

Dmitry М. Shadrin, Yana I. Pylina, Svetlana О. Volodina, Vladimir V. Volodin. Triterpenoid glycosides, amino acids and microelements in Anthyllis vulneraria L. growing in the European northeast of Russia // Тезисы докладов Международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина». Санкт-Петербург, 2011. С. 187-188.

Лицензия № 19-32 от 26.11.96 г. КР 0033 от 03.03.97 г.

ЮО Заказ 01(13)

Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шадрин, Дмитрий Михайлович

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вторичные метаболиты растений.

1.2. Сапонины.

1.2.1. Химическая природа сапонинов.

1.2.2. Распределение сапонинов в растениях.

1.2.3. Биосинтез сапонинов.

1.2.4. Роль сапонинов в растениях.

1.2.5. Биологическая активность сапонинов.

1.2.6. Распространение сапонинов в растительном мире.

1.2.7. Распространение сапонинов в семействе Fabaceae.

1.3. Молекулярно-филогенетический анализ в систематике.

1.3.1. Молекулярная филогенетика растений.

1.3.2. Нуклеотидные последовательности, используемые в молекулярно-филогенетическом анализе.

1.3.3. Группы генов ядерной рРНК и их изменчивость в эволюции.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Аналитические методики.

2.2.1. Качественное определение сапонинов в растениях.

2.2.2. Определение суммы тритерпеновых сапонинов в растениях.

2.2.3. Спектрофотометрическое определение тритерпеновых сапонинов в растении Anthyllis vulneraria.

2.2.4. ВЭЖХ-анализ растений Trigonella foenum-graecum при определении содержания диосцина и протодиосцина.

2.2.5. Определение общего азота и протеиногенных аминокислот.

2.2.6. Определение содержания макро- и микроэлементов.

2.3. Методы молекулярно-филогенетического анализа.

Глава 3. РАСПРОСТРАНЕНИЕ САПОНИНОВ В СЕМЕЙСТВЕ FABACEAE

ФЛОРЫ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРО-ВОСТОКА РОССИИ.

3.1. Методология скрининга растений на содержание сапонинов.

3.2. Распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России.

Глава 4. ОЦЕНКА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ HEDYSARUM, ASTRAGALUS И OXYTROPIS ПО СОДЕРЖАНИЮ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ.

4.1. Род Hedysarum.

4.2. Род Astragalus.

4.3. Род Oxytropis.

Глава 5. ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ, АМИНОКИСЛОТЫ И МИКРОЭЛЕМЕНТЫ

РАСТЕНИЙ ANTHYLLIS VULNERARIA L.

5.1. Краткая ботаническая характеристика и практическое использование Anthyllis vulneraria L.

5.2. Химический анализ растений A. vulneraria L.

Глава 6. ОЦЕНКА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТЕНИЙ

TRIGONELLA FOENUM-GRAECUM L. ПО СОДЕРЖАНИЮ СТЕРОИДНЫХ

ГЛИКОЗИДОВ, АМИНОКИСЛОТ И МИКРОЭЛЕМЕНТОВ.

6.1. Краткая ботаническая характеристика растения Trigonellafoenum-graecum L.

6.2. Опыт выращивания Trigonellafoenum-graecum L. в подзоне средней тайги Республики Коми.

6.3. Динамика содержания диосцина и протодиосцина в растении

Trigonellafoenum-graecum L. в культуре на Севере.

6.4. Аминокислотный и микроэлементный состав травы

Trigonellafoenum-graecum L.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сапонины растений семейства Fabaceae Lindl. европейского северо-востока России"

Актуальность темы. Семейство Fabaceae Lindl. является одним из ведущих семейств во флоре европейского северо-востока России и насчитывает 61 вид из 16 родов. Среди бобовых много видов пищевых и кормовых растений, таких как виды рода астрагал (Astragalus L.) - а. альпийский (Л. alpinus L.), а. цицер (A. cicer L.), а. датский (A. danicus Retz.), а. холодный (A. frigidus (L.) A. Gray); рода чина (Lathyrus L.) - ч. Гмелина (L. gmelinii Fritsch), ч. луговая (L. pratensis L.); рода клевер (Trifolium L.) - к. пашенный (Т. arvense L.), к. полевой (Г. campestre Schreb.), к. луговой (Г. pratense L.); рода чечевица (Lens Mili.) - ч. обыкновенная (L. culinaris Medik.); рода горох (Pisum L.) - г. посевной (Р. sativum L.) и рода фасоль (Phaseolus L.) - ф. обыкновенная (Р. vulgaris L.). Благодаря высокому содержанию биологически активных веществ различной природы ряд видов этого семейства входит в Фармакопею Российской Федерации (Государственная фармакопея РФ, 2008) и других государств (Государственная фармакопея СССР, 1990), например, солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.), с. щетинистая (Glycyrrhiza echinata L.), с. уральская (Glycyrrhiza ura-lensis Fisch.). Имеются многочисленные сведения о применении растений этого семейства в народной медицине: язвенник обыкновенный (Anthyllis vulneraria L.), копеечник альпийский (Hedysarum alpinum L.), пажитник сенной (Trigonella foenum-graecum L.). Несмотря на то, что в литературе имеются обширные сведения о химическом составе представителей данного семейства, данные о содержании стероидных и тритерпеновых сапонинов являются разрозненными и фрагментарными. Актуальность настоящего исследования заключается в необходимости разработки молекулярно-филогенетических и хемотаксономических подходов для установления закономерностей распространения стероидных и тритерпеновых гликозидов в семействе Fabaceae. Важным направлением исследований является выявление продуцентов тритерпеновых и стероидных гликозидов. Среди тритерпеновых гликозидов интерес представляют производные олеаноловой кислоты, среди стероидных гликозидов - диосцин и протодиосцин 4 производные диосгенина), которые используют в качестве полупродукта для микробиологического синтеза кортикостероидов. Протодиосцин применяют в составе антиатеросклеротических лекарственных препаратов (Авакян, 2006).

Цель работы: установление закономерностей распределения тритерпе-новых и стероидных гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России, а также определение состава и динамики их содержания в Anthyllis vulneraria и Trigonella foenum-graecum.

Задачи исследования:

1) разработать экспериментальные подходы к скринингу растений семейства Fabaceae на содержание сапонинов;

2) изучить распространение стероидных и тритерпеновых гликозидов в растениях семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России;

3) дать количественную биохимическую оценку перспективных представителей семейства Fabaceae флоры европейского северо-востока России по содержанию тритерпеновых гликозидов;

4) определить содержание производных олеаноловой кислоты в различных органах дикорастущих растений язвенника обыкновенного (Anthyllis vulneraria) на разных фазах развития, установить содержание общего азота, протеиногенных аминокислот и микроэлементов в растениях Anthyllis vulneraria',

5) определить содержание стероидных гликозидов в различных органах культивируемых растений пажитника сенного (Trigonella foenum-graecum), установить содержание общего азота, протеиногенных аминокислот и микроэлементов в растениях Trigonella foenum-graecum.

Научная новизна работы

На основании сравнения последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) рРНК исследуемых видов реконструировано филогенетическое древо семейства Fabaceae. С использованием молекулярно-филогенетического и хемотаксономического подходов впервые изучено распределение стероидных и тритерпеновых гликозидов в семействе Fabaceae и 5 установлено, что большинство видов изучаемого семейства содержат тритерпе-новые гликозиды. Стероидные гликозиды обнаружены только у представителей триб Trifolieae, Loteae и Thermopsideae.

Впервые определенно количественное содержание суммы тритерпено-вых гликозидов (СТГ) у горных видов родов копеечника (Hedysarum), астрагала (Astragalus), остролодочника (Oxytropis) флоры европейского северо-востока России и выявлены виды с наибольшим их содержанием.

Изучена динамика содержания производных олеаноловой кислоты в дикорастущих растениях Anthyllis vulneraria и установлено, что наибольшее количество этих веществ содержат корни и листья в фазу бутонизации (3.20 и 2.60%) и цветения (3.46 и 1.92%), а также семена (2.74%).

Впервые изучена динамика содержания протодиосцина и диосцина у культивируемых растений Trigonella foenum-graecum и установлено, что максимальное количество протодиосцина содержат проростки и семена, а также листья растений в фазе бутонизации. Максимальное содержание диосцина отмечено в листьях в фазе цветения и в семенах.

Практическая значимость работы

Во флоре европейского Северо-Востока выявлены виды растений с высоким содержанием тритерпеновых гликозидов: Hedysarum arcticum, Astragalus subpolaris и A. frigidus.

Anthyllis vulneraria рекомендован для выращивания в Республике Коми в качестве лекарственного и кормового растения.

Для интродукции рекомендован вид Trigonella foenum-graecum, который в подзоне средней тайги Республики Коми за вегетационный период проходит все стадии развития и образует полноценные жизнеспособные семена, применяемые в качестве лекарственного сырья для фармацевтической промышленности.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на XV, XVII и XVIII всероссийских молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008, 2010, 2011); II 6 ежегодной русско-корейской конференции «Современные проблемы в химии природных соединений и биотехнологии» (2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issues of natural products chemistry and biotechnology») (Новосибирск, 2010); V всероссийской научно-практической конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2010); «Февральских чтениях» Сыктывкарского государственного университета (Сыктывкар, 2011); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Украина, 2011); международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе три статьи в журналах входящих в «Перечень российских рецензируемых журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами. Список цитируемой литературы включает 162 наименования, в том числе 66 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биологические ресурсы", Шадрин, Дмитрий Михайлович

выводы

1. Для семейства Fabaceae европейского северо-востока России характерны только тритерпеновые гликозиды, поиск видов - продуцентов стероидных гликозидов следует проводить среди представителей триб Trifolieae, Loteae и Thermopsideae в растениях южных широтных групп.

2. Наиболее перспективными для изучения содержания и состава тритер-пеновых гликозидов является Hedysarum arcticum, в образцах которого СТГ составляет в надземной части - 2.9%, поземной - 4.0% от сухой массы образца; Astragalus subpolaris, в образцах которого СТГ составляет в надземной части -2.8%, поземной - 4.9% от сухой массы образца, и A. frigidus, в образцах которого СТГ составляет в надземной части - 3.1%, поземной - 4.1% от сухой массы образца.

3. Наибольшее количество производных олеаноловой кислоты у дикорастущих растений Anthyllis vulneraria L. содержится в корнях в фазу бутонизации (3.20%) и цветения (3.46%), в листьях в фазу бутонизации (2.60%) и в семенах (2.74%).

4. Содержание азота в сухом веществе растений Anthyllis vulneraria L. составило 2.1%, суммарное содержание аминокислот составило 10.94 г в 100 г сухого вещества, содержание магния, железа и марганца составило 2830, 210 и 70 мг/кг соответственно, содержание алюминия и тяжелых металлов не превысило предельно допустимых концентраций.

5. В подзоне средней тайги Республики Коми интродуцированные растения Trigonella foenum-graecum L. за вегетационный период проходят все стадии развития, образуют жизнеспособные семена с высоким содержанием стероидных гликозидов; максимальное содержание протодиосцина обнаружено в проростках (1.37%), в листьях в фазу бутонизации (1.65%) и в семенах (1.96%), максимальное содержание диосцина обнаружено в листьях в фазу цветения (1.27%) и в семенах (1.12%).

6. Содержание азота в сухом веществе растений ТгщопеИа /оепит-graecumL. составило 1.35%, суммарное содержание аминокислот составило 5.77 г в 100 г сухого вещества, содержание магния, железа и марганца составило 2436, 140 и 56 мг/кг соответственно, содержание алюминия и тяжелых металлов не превысило предельно допустимых концентраций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шадрин, Дмитрий Михайлович, Владивосток

1. Абубакиров Н.К., Горовиц М.Б., Волернер Ю.С. Химия спиростано-лов. М: Наука, 1986. 176 с.

2. Авакян П. Трибестан эффективный фитопрепарат // Вестн. мед. ин-та им. Мергабяна. Ереван, 2006. С. 129-132.

3. Анисимов ММ, Чирва В.Я. О биологической роли тритерпеновых гликозидов // Усп. совр. биол., 1980. Т. 6, № 3. С. 351-364.

4. Антонов A.C. Основы геносистематики высших растений. М.: Наука, 2000. 135 с.

5. Антонов A.C. Геносистематика: от Э. Чаргаффа и А.Н. Белозерского до наших дней // Молекулярная биол., 2005. Т. 39, № 4. С. 581 -589.

6. Антонов А. С. Геносистематика растений. М., 2006. 293 с.

7. Алиев Р.К. К характеристике химического состава и кровоостанавливающего действия травы эспарцета закавказского // Изв. АН Аз ССР, 1947. № 9. С. 85-90.

8. Анели H.A., Махарашвили Е.З., Микеладзе P.M. Лекарственные растения Гудаутского района // Биологически активные вещества флоры Грузии. Тбилиси, 1965. С. 333-350.

9. Белянин M.JI. Биологически активные вещества природного происхождения. Томск, 2010. 144 с.

10. Бенидзе М.М., Пхеидзе Т.А., Кемертелидзе Э.П. Содержание тиго-генина в листьях Yucca aloifolia L. // Растительные ресурсы, 1983. Т. 19, № 4. С. 523-526.

11. Блинова К.Ф., Стуккей K.JI. Качественное фитохимическое исследование некоторых растений тибетской медицины Забайкалья // Вопросы фармакогнозии. Д., 1961. Вып. 1.С. 135-155.

12. Блинова К.Ф., Баланкова Л.Г. К фитохимическому изучению некоторых представителей рода астрагала Astragalus L. // Вопросы фармакогнозии. Л., 1968. Вып. 5. С. 113-123.

13. Богачева Н.Г., Горохова М.М., Коган J1.M. 22-метиловый эфир протодиосцина из семян Trigonella caerulea II Химия природных соединений, 1977. №З.С. 421.

14. Бухаров В.Г., Талан В.А., Карлин В.В. О тритерпеновых гликозидах Patrinia intermedia 11 Химия природных соединений, 1967. № 1. 1967. 74 с.

15. Васильева И.С., Пасешниченко В.А. Стероидные гликозиды растений и культуры клеток диоскореи, их метаболизм и биологическая активность // Усп. биол. хим., 2000. Т. 40. С. 153-204.

16. Галкин М.А., Казаков A.JJ. Дикорастущие полезные растения Северного Кавказа. Ростов-на-Дону, 1980. 128 с.

17. Гладких A.C., Губанов Е.А., Мещеряков A.A. Содержание сапонинов в растениях флоры Туркмении // Изв. АН ТССР. Сер. биол. науки, 1965. № 1. С. 22-35.

18. Гиоргадзе Ц.А. Динамика накопления стероидных гликозидов в листьях юкки славной // Химический журнал Грузии, 2006. Т. 6. (1). С. 62-63.109

19. Головко Т.К., Гармаш Е.В., Куренкова C.B. Рапонтик сафлоровид-ный в культуре на европейском Северо-Востоке (эколого-физиологические исследования). Сыктывкар, 1996. 140 с.

20. Государственная фармакопея СССР. Изд. 11, вып. 2 / Под ред. И.В. Туманова. М.: Медицина, 1990. 399 с.

21. Государственная фармакопея РФ. Изд. 12, ч. 1. М.: «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. 696 с.

22. Грант В. Эволюция организмов. М.: Мир, 1980. 407 с.

23. Гринкевич А.И., Сафронич JI.H. Химический анализ лекарственных растений. М., 1984. 162 с.

24. Гросгейм A.A. Растительные богатства Кавказа. М., 1952. 631 с.

25. Губанов A.C., Либизов Н.И., Гладких A.C. Поиск сапонинсодержа-щих растений во флоре Средней Азии и Южного Казахстана // Фармация, 1970. Т. 19, №3. С. 23-31.

26. Гужва H.H. Биологически активные вещества астрагала эспарцет-ного, произрастающего в Предкавказье // Химия растительного сырья, 2009. №3. С. 123-132.

27. Губанов И.А., Мещеряков A.A. Поиски биологически активных соединений в растениях флоры Туркмении // Изв. АН ТССР. Сер. биол. науки, 1963. №2. С. 35-41.

28. Гуляев Г.В. Генетика. М., 1971. 345 с.

29. Деканосидзе Г.Е., Чирва В.Я., Сергиенко Т.В. Биологическая роль, распространение и химическое строение тритерпеновых гликозидов. Тбилиси: Мицнеереба, 1984. 349 с.

30. Демидова Е.В. Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens при разных условиях выращивания: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2007. 24 с.

31. Еляков Г.Б. Химическое исследование тритерпеновых гликозидов из корней женьшеня {Panax ginseng C.A.Meyer): Автореф. дис. . докт. хим. наук: Новосибирск, 1967. 39 с.

32. Захаров A.M., Боряев К.И. Химическое изучение растений флоры Тянь-Шаня // Аптечное дело, 1965. Т. 14, № 5. С. 44-48.

33. Ибрагимова Н.Х., Кожабекова С. С. Исследование некоторых видов астрагалов, произрастающих в Казахстане // Некоторые проблемы фармацевтической науки и практики. Алма-Ата, 1975. С. 224-227.

34. Иванова Н.С., Горовой П.Г., Стригина Л.И. Динамика содержания тритерпеновых гликозидов в различных органах Caulophyllum robustum Maxim, в течение вегетационного периода // Растительные ресурсы, 1981. Т. 17, № 2. С. 229-232.

35. Израшъсон В. Ф., Киселев В.П. К интродукции пажитника сенного в Новосибирской области // Ресурсы и интродукция полезных растений Сибири. Новосибирск: Наука, 1981. С. 23-29.

36. Кабишев К.Э. Современные подходы к разработке лекарственных средств на основе тибетских прописей // Вестн. ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация, 2005. № 1. С. 181-188.

37. Киселев В.П., Израилъсон В.Ф., Костромина М.М. Биологическиеособенности пажитника сенного в условиях Новосибирской области // Расти111тельные ресурсы южной Сибири и пути их освоения. Новосибирск: Наука,1977. С. 146-152.

38. Киселева A.B., Болконская Т.А., Киселев В.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений Южной Сибири. Новосибирск: Наука, 1991. 136 с.

39. Киселева A.B. Фитохимическое исследование некоторых видов рода Астрагал флоры Хакасии // Вторая республиканская конференция по медицинской ботанике. Киев, 1988. С. 253-254.

40. Ковганко Н.В., Ахрем A.A. Стероиды: экологические функции. Минск: Наука и техника, 1990. 224 с.

41. Коган Л.М., Богачева Н.Г. Новые гликозиды фуростен-5-триола-3ß,22,26 из Trigonella foenum-graecum и Trigonella caerulea II Доклад на пятом советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений. Ереван,1978. С. 39.

42. Куваев КБ., Блинова К.Ф. Предварительная химическая оценка лекарственных растений тибетской медицины, произрастающих в Забайкалье // Вопросы фармакогнозии. JL, 1961. Вып. 1. С. 213-262.

43. Кучеров Е.В., Каримова С.Г. Содержание биологически активных веществ в растениях флоры Башкирского Предуралья // Дикорастущие и интро-дуцируемые полезные растения в Башкирии. Уфа, 1974. Вып. 4. С. 61-88.

44. КимЕ.С. Секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров генов рибосом-ных РНК и гена 5.8S рРНК у представителей рода Avena L.: Автореф. дис. . магистра биологии. СПб., 2003. 23 с.

45. Крюков A.A. Изменения первичной и вторичной структуры ITS последовательностей в ходе дивергенции видов рода Euphorbia: Автореф. дис. . магистра биологии. СПб., 2005. 22 с.

46. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

47. Лебеда А.П. Инвентаризация флоры Украины (Лекарственные растения, содержащие сапонины). Киев, 2007. 140 с.

48. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 256 с.

49. Ляликов С.И. Ракитник австралийский, произрастающий в Молдавской СССР, как источник цитизина: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Кишинев, 1952. 7 с.

50. Методика выполнения измерений содержания металлов в твердых объектах методом спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой. ПНД Ф 16.1:2.3:3.11-98. Издание 2005 г.

51. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск: Наука, 1991.431 с.

52. Муравьева Д. А. Фармакогнозия. М.: Медицина, 1978. 656 с.

53. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Т.П. Фармакогнозия: Учебное пособие. М.: Медицина, 2002. 656 с.

54. Ней М., Кумар С. Молекулярная эволюция и филогенетика. Киев, 2004. 405 с.

55. Носов H.H. Молекулярно-филогенетическое и морфологическое исследование представителей рода Роа L. (Роасеае) северо-запада европейской части России: Автореф. дис. . магистра биологии. СПб., 2006. 22 с.

56. Орловская Т.В., Магомедова З.С. Фитохимическое исследование надземной части пажитника сенного, интродуцированного на Северном Кавказе // Химия в технологии и медицине: Матер, всерос. науч. конф. Махачкала, 2002. С.135-138.

57. Постников Б.А. Маралий корень и основы введения его в культуру. Новосибирск, 1995. 276 с.

58. Пхеизде Т.А., Мадаева O.E. Исследование некоторых сапонинонос-ных растений, произрастающих в Грузии // Биологически активные вещества флоры Грузии. Тбилиси, 1967. С. 223-237.

59. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hydrangeaceae-Haloragaceae. СПб.: Наука, 1987. С. 145-148.

60. Самарин В.П. Итоги обследования флоры сосудистых растений Якутии на содержание сапонинов // Ученые записки Якутского университета. Сер. биол. и хим. наук. Якутск, 1965. Вып. 15. С. 15-38.

61. Семенченко В.Ф., Муравьев И.А. Исследование сапонинов некоторых видов Glycyrrhiza L. секции Pseudoglycyrrhiza Krug. // Растительные ресурсы, 1975. Т. 11, вып. 3. С. 381-384.

62. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: Мир. 1998. Т. 2. 391 с.

63. Стен Г. Молекулярная генетика. М.: Мир, 1974. 532 с.

64. Тахтаджян А.Л. Система магнолиофитов. Л.: Наука, 1987. 439 с.

65. Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. Иркутск, 1985.384 с.

66. Тюпа Н.Б. Кариосистематическое и молекулярно-филогенетическое исследование дикорастущих представителей рода Avena L.: Автореф. дис. . канд. биол. наук. СПб., 2006. 23 с.

67. Тютюнников А.И., Цугкиев Б.Г. Химический состав нетрадиционных кормовых и лекарственных растений. М., 1995. 135 с.

68. Умаров А., Халецкий A.M. Фитохимическое изучение растения кара-гана гривастая // Труды Ленинградского химико-фармацевтического института. Л., 1969. Вып. 28. С. 103-109.

69. Усаков С.И., Бойник В.В., Ковалев В.Н. Сравнительное фитохимическое изучение караганников Украины // Современные изыскания в области фармации. Ярославль, 1996. С. 145-146.

70. Фармакагнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения / Под ред. Г.П. Яковлева. СПб., 2010. 863 с.

71. Флора и растительный покров Печоро-Илычского биосферного заповедника / Под ред. C.B. Дегтевой. Екатеринбург, 1997. 384 с.

72. Флора северо-востока европейской части СССР. В 4-х томах / Под ред. А.И. Толмачева. Т. 3. Семейства Nymphaeaceae-Hyppuridaceae. Л.: Наука, 1977. 293 с.

73. Флоря В.Н. Источники биологически активных веществ в растениях местной флоры // Полезные свойства дикорастущих растений Молдавии. Кишинев, 1973. С. 38-56.

74. Халматов Х.Х., Примухамедов И., Свечникова А.Н. Фитохимическая характеристика некоторых видов астрагала, произрастающих в Узбекистане // Растительные ресурсы, 1979. Т. 15, вып. 3. С. 384-389.

75. Хамидуллина Е.А., Зинченко C.B., Семенов А.А. Качественный состав сапониновой фракции из надземной части Hedysarum alpinum L. // Растительные ресурсы, 2002. Т. 38, вып. 1. С. 78-81.

76. Черепанов С.К Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). М., 1995. 992 с.

77. Шаин С.С., Фонин B.C., Головкина Г.И. Изучение особенности минерального питания пажитника сенного (Trigonella foenum-graecum L.) // Новые культуры в народном хозяйстве и медицине: Матер, науч. конф. Киев: Наукова думка, 1976. С. 14-25.

78. Brown J.W.S., Shaw P.J. Small nuclear RNA and pre-rRNA processing in plants // Plant Cell, 1998. Vol. 10. P. 649-687.

79. Choi B.-H., Kim J.-H. ITS sequences and speciation on Far Eastern Indi-gonifera (Leguminosae) // J. Plant. Res., 1997. Vol. 110. P. 339-346.

80. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull., 1987. Vol. 19. P. 11-15.

81. Harborne J.B. Introduction of ecological biochemistry. L.: Acad. Press, 1993. 318 p.

82. Harborne J.B., Turner B.L. Plant chemosystematics. L.: Acad. Press, 1984. 562 p.

83. Hershkowitz M.A., Lewis L.A. Deep-level diagnostic value of the rDNA-ITS region // Mol. Biol. Evolution, 1996. Vol. 13. P. 1276-1295.

84. Hershkowitz M.A., Zimmer E.A. Conservation patterns in angiosperm rDNA ITS2 sequences // Nucleic Acids Res., 1996. Vol. 24. P. 2857-2867.

85. Hilu K.W., Liang H. The matK gene: sequence variation and application in plant systematics // Amer. J. Bot., 1997. Vol. 84. P. 830-839.

86. Martin P.G., Boulter D., Penny D. Angiosperm phylogeny studied using sequences of five macromolecules // Taxon, 1985. Vol. 35. P. 393-400.

87. Martin W., Gierl A., Saedler H. Molecular evidence for pre-Cretaceous angiosperm origin // Nature, 1989. Vol. 339. P. 46-48.

88. Morrissey J.P., Osbourn A.E. Fungal resistance to plant antibiotics as a mechanism of pathogenesis: Reviews // Microbiol. Mol. Biol., 1999. Vol. 63. P. 708724.

89. Myszka H., Bednarczyk D. Steroidal saponins // Wiadomosci Chem., 2005. Vol. 59. P. 275-303.

90. Nartowska J., Wawer /., Strzelecka H. Triterpenoid sapogenin from An-thyllis vulneraria L. // Acta Poland. Pharm., 2001. Vol. 58, № 4. P. 289-91.

91. Nazar N.R. Ribosomal RNA processing and ribosome biogenesis in Eu-karyotes // IUBMB Life, 2004. Vol. 56. P. 457-465.

92. Nei M., Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics. N.-Y.: Oxford Univ. Press, 2000. 333 p.

93. Walter E.D. Note of saponins and their sapogenins from strawberry clover // J. Amer. Pharm. Ass., Sei. Ed., 1960. Vol. 49, № 11. P. 735-736.

94. Wink M. Evolution of secondary metabolites from an ecological end molecular phylogenetic perspective // Phytochem., 2003. Vol. 64, № 1. P. 3-19.

95. Wink M. Evolution of secondary plant metabolites // Encyclopedia of life sciences, 2008. P. 1-12.

96. Udayama M., Kinjo J., Nohara T. Triterpenoidal saponins from Baptisia australis II Phytochem., 1998. Vol. 48. P. 1233-1235.