Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax"

На правах рукописи

П)

.i-LUUj

СМИРНОВА Юлия Николаевна

Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 О КТ 2008

Москва-2008

003448932

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Смоленская Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Лобанова Елена Сергеевна Загоскина Наталья Викторовна

доктор биологических наук

Ведущая организация: Российский Государственный Аграрный Университет -Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

Защита состоится 21 октября 2008г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. КА. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан « сентября 2008 г.

Ученый сйфетарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

Актуальное гь. Целебные свойства растений рода Panax известны около 6000 лет и обусловлены уникальной композицией биологически активных веществ, центральное место среди которых принадлежит тритерпеновым гликозидам даммарапового ряда - пшзенозидам Гинзенозиды обладают иммуностимулирующей и антиоксиданнюй активностями, нормализуют кровяное давление, стимулируют синтез РНК и ДНК, обладают противодиабетическим действием. По структуре агликона тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда делят на две группы. 20(S)-протопанаксадиол (Rb-группа - Rbb Rbj, Re, Rd- гинзенозиды) и 20(S)-протопанаксатриол (Rg-фупна - Rf, Rgi, Re-гинзенозиды). Биологическое действие соединений обеих групп различно, в частности, гликозиды Rb-группы подавляют активность ЦНС, понюкают артериальное давление, а гликозиды Rg-группы увеличивают активность ЦНС и повышают артериальное давление. Поэтому, эффективность применения в лечебных целях препаратов женьшеня, в большей степени, зависит от композиции гинзенозидов, что подтверждается обоснованностью дифференцированного применения отдельных частей корня Р. ginseng С.А. Meyer в традиционной китайской медицине.

В связи с тем, что количество растений рода Panax в природе крайне ограничено, широко исследуется возможность получения гинзенозидов биотехнологическим путем, используя культуру in vitro. Большинство из полученных линий клеток женьшеня отличаются от натуральных корней меньшим количеством и ограниченным составом гинзенозидов (Ходаковская и др., 1995; Langhansova et al, 2005). В настоящее время активио проводятся работы по получению высокопродуктивных штаммов представителей рода Panax, а также по исследованию их роста и биосинтеза гинзенозидов. При этом большое внимание уделяется оптимизации условий выращивания клеток, прежде всего составу питательных сред (Wu, Zhong, 1999) Хорошо известно, что регуляторы роста и их соотношение -важнейшие факторы, определяющие возможность существования популяций изолированных клеток. Они оказывают влияние, как на рост и дифференцировку клеток, так и на их метаболизм Эффект определяется не только спецификой самого

фитогормона, но также зависит от природы вторичных соединений, а подчас от вида растения и даже от штамма культивируемых клеток.

Изучение в сравнительном аспекте цитофизиологических характеристик суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens С.А. Meyer и Р ginseng С.А. Meyer, а также их способности к синтезу вторичных метаболитов, дает возможность установить особенности их существования, как самостоятельных биологических систем. Кроме того, влияние регуляторов роста на биосинтез гинзенозидов у разных видов женьшеня в условиях in vitro до сих пор окончательно не выяснено.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния типа синтетического ауксина на процессы роста, цитофизиологическне и цитогенетические характеристики, биосинтез гинзенозидов в культуре клеток растений двух видов рода Panax: Р japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.А. Meyer.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ростовые, цитофизиологическне и цитогенетические характеристики суспензионных культур клеток двух видов женыненей

2. Определить накопление гинзенозидов в отдельных циклах субкультивирования суспензионных культур клеток Р japonicus var. repens и Р. ginseng.

3. Изучить влияние типа синтетического ауксина на ростовые и цитофизиологическне характеристики суспензионных культур клеток женьшеней.

4. Изучить влияние типа синтетического ауксина на накопление гинзенозидов в суспензионных культурах Р japonicus var. repens и P. ginseng.

5. Рассмотреть возможную связь между ростовыми, цитофизиологическими характеристиками и синтезом тритерпеновых гликозидов в суспензионных культурах клеток P. japonicus var. repens и Р ginseng.

Научная новизна работы. Проведено сравнительное изучение длительно культивируемых суспензионных культур клеток двух видов женьшеня. Установлены

различия ростовых, цитофизиологичсских и биосшпетичсских показателей суспензионных культур P. japonicus var. repens и Р ginseng.

Показано, что основное влияние на накопление биомассы, агрегированность, эидоредупликацию ядерной ДНК, содержание и качественный состав гинзенозидов исследуемых культур оказывает химическая природа синтетического ауксина У обеих суспензионных культур женьшеня НУК вызывает цитодифференцировку, проявляющуюся в увеличении доли крупных многоклеточных агрегатов, увеличении объема клеток, возрастании числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК, а также приводит к повышению синтеза гинзенозидов.

Установлено, что между уровнем синтеза гинзенозидов и цитофизиологическими характеристиками суспензий клеток существует зависимость - повышение синтеза гинзенозидов связано с процессами цитодифференцировки.

Впервые экспериментально показано, что в случае активного биосинтеза соотношение индивидуальных пшзенозидов, следовательно, и соотношение содержания гинзенозидов Rg и Rb групп достаточно стабильно.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований, получены данные о гормональной регуляции роста и накопления тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда в суспензиях клеток двух видов Panax. Охарактеризованы высокопродуктивные штаммы суспензионных культур Р japonicus var. repens и Р ginseng, которые могут быть рекомендованы для биотехнологического производства гинзенозидов. Результаты исследований дополняют данные о взаимосвязи цитодифференцировки клеток и уровня синтеза гинзенозидов в условиях in vitro.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на VIII Международной конференции "Биология клеток растений т vitro и биотехнология" (Саратов, 2003); V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); VI съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007),

IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология"(Звенигород, 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 194 наименования, из них 133 на иностранных языках.

Принятые сокращения и обозначения: ВККК BP - Всероссийская коллекция культивируемых клеток высших растений; 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; НУК - а-нафтилуксусная кислота; БАП - 6-бензиламшюпурин, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, CV-коэффициент вариации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследования были использованы суспензионные культуры клеток двух видов Panax: женьшеня японского P. japonicus var repens С.А. Meyer и женьшеня настоящего Р ginseng С.А. Meyer. Каллусные ткани обеих культур были получены в 1996-1997 годах, а в 1998 году их начали культивировать как суспензии. Первичный каллус P. japonicus var. repens инициирован из двухлетнего корпя интактного растения (Приморский край Дальнего Востока) в Институте пищевой химии и технологии HAH Украины Л.В. Желтоножской и А.Л. Чайко (Чайко и др., 1999). Каллусная культура Р. ginseng получена из бокового корня шестилетнего плантационного растения (Ginseng & Tobacco Company, Южная Корея) в Отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН НД Черняк и A.B. Орешниковым. Культуры клеток Р. japonicus var. repens и P. ginseng депонированы в ВККК BP под номерами № 62 и № 66 соответственно.

Обе суспензии клеток выращивали на питательной среде Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением витаминов по Уайту. Кроме того,

стандартные питательные среды для суспензии Р. ginseng содержали сахарозу (30 г/л), БАП (0,5 мг/л), 2,4-Д (2 мг/л); а для суспензии Р japonicus var. repens - сахарозу (25 г/л), кинетин (1 мг/л), НУК (2 мг/л), гидролизат казеина (500 мг/л). Суспензии культивировали в 0,5-литровых круглых плоскодонных колбах на качалке (90-100 об./мин) при 24-26°С в темноте. Продолжительность каждого пассажа - 21 сутки. Соотношение среды и инокулята для суспензий клеток Р japonicus var. repens и P. ginseng составило 6:1 и 5:1 соответственно.

Рост оценивали по приросту сырой и сухой биомассы и выражали индексом роста, который рассчитывали по формуле: I = Хтах/Х0, где Хшх и Хо - максимальное и начальное значения показателя роста. Сухую биомассу определяли после высушивания ткани при 60°С в течение суток.

Жизнеспособность оценивали по числу неокрашенных 0,1%-ным раствором эозина клеток, при просмотре не менее 300 клеток.

Агрегированностъ определяли как соотношение числа разных типов агрегатов, выраженное в процентах. Просчитывали не менее 200 культивируемых единиц на 1 препарат в 3-х повторностях.

Митотический индекс определяли ежесуточно на давленых препаратах, предварительно фиксированных смесью этиловый спирт: уксусная кислота (3: 1), окраска карболовым фуксином (Gould, 1986). На каждом препарате анализировали по 1000 клеток, просчитывали 3 препарата на каждую точку фиксации

Определение количества ядерной ДНК проводили с помощью цитофотометрии и микроспектрофлуорометрии. Усовершенствование этих методов, также как и разработка алгоритмов анализа результатов проведено ведущим научным сотрудником Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН A.B. Носовым.

Цитофотометрический анализ выполняли на давленых препаратах после окрашивания их по Фельгену, используя модификацию (Filkuka, Kleinwachter 1981). Материал фиксировали смесью этиловый спирт-уксусная кислота (3:1) в течение одних суток, а затем хранили в 70° этаноле. Отмытую от этанола суспензию клеток подвергали гидролизу 5N HCl в течение 35 мин при 20°С. Окрашивали реактивом

Шиффа. Измерение количества ДНК производили на цитофотометре ("Reichert-Jung", Австрия) двухволновым методом при ),i = 550 и Х2 = 500 нм. В качестве стандарта содержания ДНК (4С = 2,1 пг) использовали клетки апикальной меристемы корня проростков Vigna radiata cv. Berken в различных фазах митоза. Было проанализировано 50 интерфазных ядер произвольно выбранных с 2-х препаратов

Для микроспектрофлуорометрического измерения количества ДНК к клеткам добавляли 2 мл холодного (2°С) буфера (20 мМ Mes, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, pH 6,0), детергент IGEPAL СА-630 ("Sigma") до концентрации 0,5% и DIPI (1 мкг/мл) [4',6-бис (2'-имидазолинил-4Н,5Н)-2-фенилиндол] ("Serva"), краситель, количественно связывающийся с ДНК (Schnedl et al., 1977) Для освобождения ядер из крупных агрегатов суспензию гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поггера. Измеряли интенсивность флуоресценции (в относительных единицах) при X = 470 нм визуально целых ядер в составе клеток или лежащих отдельно с помощью микроскопа Univar с цитофотометром ("Reichert-Jung", Австрия), используя объектив 40* и круглый измерительный зонд чуть большего диаметра, чем максимальный диаметр анализируемых ядер. Освещали препарат через объектив возбуждающим светом с к = 365 нм, который отсекали барьерным фильтром с X = 420 нм.

Анализ количества и состава гинзенозидов методом БЭЖХ. Пробы сырой биомассы весом 2-Зг (точная навеска) дважды экстрагировали метанолом при постоянном перемешивании. Время первой экстракции - 3 часа, второй - 1 час. Экстракты объединяли, упаривали под вакуумом на роторном испарителе при температуре 45-50°С. Высушенный метанольный экстракт, растворяли в воде, очищали на патронах Sep-Pak ("Tessek", Чехия) с объемом сорбента Separan SGX Cl8 (60 мкм) 1 мл. Патрон с нанесенной пробой последовательно промывали водой, 20 %-ным этанолом и 80 %-ным этанолом. Сухой остаток последней фракции растворяли в смеси ацетонитрил-вода (35' 65, по объему), пропускали через тефлоновые микрофильтры ("Tessek", Чехия) с порами 0,2 мкм и использовали для ВЭЖХ-анализа Разделение гинзенозидов проводили на приборе фирмы «LKB» (Швеция), используя стальную колонку (4x250 мм), заполненную Lichrosorb RP-18 с размером

частиц 5 мкм («LKB», Швеция). Для анализа использовали два различных изократических режима при скорости потока 0,5 мл/мин: для гинзенозидов Rf, Rb], Re, Rb3, Rd - ацетонитрил : вода в объемном соотношении 35 : 65; для гинзенозидов Rgi, Re- ацетонитрил : вода в объемном соотношении 22 : 78. Детектирование проводили при длине волны 203 нм. Для количественного определения использовали метод абсолютной калибровки относительно индивидуальных гинзенозидов фирмы «Sigma» (США). Пересчет индивидуального и суммарного содержания гинзенозидов проводили на абсолютно сухой вес. Влажность образцов определяли по методике Государственной Фармакопеи СССР (Государственная Фармакопея СССР XI изд, 1987). Минимально определяемое количество каждого индивидуального гинзепозида было равно 20 мкг/г абсолютно сухой биомассы. Идентификация агликонов проведена ранее (Butenko et al., 1993) методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии. Анализ проводили совместно со старшим научным сотрудником Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН О.В. Решетняк.

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам (Рокицкий, 1973). На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения и стандартные отклонения из 3 биологических повторностей (3 колбы) для каждого срока, пассажа и варианта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионных культур клеток Р. japonicus var. repetís и Р. ginseng, культивируемых на стандартных питательных средах

Определение ростовых и цитофизиологических параметров проводили в 70-м,

100-м и 150-м субкультивированиях P. japonicus var. repens и в 150-м цикле

субкультивирования Р ginseng на стандартных питательных средах. Результаты

накопления биомассы, представленные в таб. 1, указывают на активный рост

суспензии клеток женьшеня японского. Необходимо отметить, что прирост биомассы

суспензии Р. japonicus был в 2 раза выше, чем в других культурах клеток рода Panax

(Zhong, Wang 1996; Liu et al ., 1998; Kunach et al., 2003; Wang et al ., 2005). Индекс

9

роста биомассы Р. japónicas var. repens в 1,5-1,8 раза выше, чем у Р. ginseng. Пик митотической активности обоих видов женьшеня совпадал по времени и приходился на 5-6 сутки. Количество жизнеспособных клеток у обеих культур находилось на одном уровне.

Таблица 1

Характеристики роста суспензий клеток Р. japonicus var. repens и Р. ginseng

Показатели Р. japonicus Р. ginseng

Индекс роста I:

сухая биомасса 6,1 ± 1,1 3,8 ±0,5

сырая биомасса 6,0 ± 1,2 3,3 ±1,3

Максимальный МИ, % 3,5 ± 1,3 2,3 ± 0,4

Жизнеспособность, % 86,8 ± 0,5 90,6 ± 1,7

Суспензия Р. ]'аротси5 уаг. герет среднеагрегированна (рис. 1А) и состояла из агрегатов размером 10-50 клеток; на начальные сутки роста их составляли клетки меристемоподобного и паренхимоподобного типов (рис. 2А), а к концу субкультивирования в два раза возрастало число паренхимоподобных, появлялись вытянутые клетки.

Рис. 1. Процентное содержание агрегатов с разным числом клеток в суспензионных культурах Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б), культивируемых на стандартных питательных средах.

0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Время культивирования, сутки

I-10 клеток

II-20 клеток 21-50 клеток

> 50 клеток

ÜZ3

Суспензия P. ginseng мелкоагрегированна (рис. 1Б) и на протяжении всего периода культивирования соотношение меристемоподобных и паренхимоподобных клеток не изменялось (рис. 2Б). Следует отметить, что в популяции женьшеня настоящего преобладали мелкие меристсмоподобные клетки, а клетки паренхимоподобного и удлиненного типов присутствовали в незначительном количестве.

I 100 -

о

| 80 -я

| 60" о

= 40 -й н

g 20 -о св

СГ о -

Рис. 2. Процентное содержание клеток разного типа в популяциях суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б), культивируемых на стандартных питательных средах.

Таким образом, суспензии клеток двух видов Panax значительно различались по приросту биомассы, агрегироваиности и составу клеточной популяции, а жизнеспособность обеих культур находилась на одном уровне.

2. Биосинтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng

Количество и состав тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда

определяли в течение 70, 100 и 150-го циклов субкультивирования суспензии

P. japonicus var. repens и 150-го и 175-го циклов субкультивирования суспензии

клеток P. ginseng. В течение всего периода наблюдения отмечалось увеличение

содержания гинзенозидов в суспензии клеток P. japonicus, а среднее накопление

гинзенозидов в 70, 100 и 150-м субкультивированиях составило 1,67, 1,53 и 3,1%

соответственно (рис. ЗА). В противоположность этому, при культивировании

11

суспензии клеток Р. ginseng на стандартной среде были определены лишь их следовые количества (рис. ЗБ).

70 100 150 150 175

Циклы субкультивирования

Рис. 3. Содержание гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б), культивируемых на стандартных питательных средах (% от сухой биомассы).

Поскольку фармакологическое действие соединений Rb- и Rg-rpyrm различно (Shibata S. et al., 1985), то для характеристики биологической активности женьшеня важным фактором является также соотношение гинзенозидов. Анализ суспензии Р. japonicus var. repens показал присутствие в биомассе всех семи основных гинзенозидов (рис. 4А). К 150-му субкультивированию наблюдалось уменьшение Rf- и увеличение долей Rgr и Re-гинзенозидов, которые являлись мажорными. Отношение соединений Rg/Rb-групп в биомассе суспензии женьшеня японского с 70-го по 150-й пассаж в среднем находилось в пределе 5,5-6,8 (рис. 5А).

В отличие от Р. japonicus var. repens, во всех проведенных определениях в биомассе женьшеня настоящего в основном присутствовала Rg-группа (рис. 4Б), а гинзенозиды Rb-группы в различных опытах то отсутствовали, то появлялись в незначительных количествах. В связи с этим, отношение Rg/Rb-групп гинзенозидов было не устойчиво (рис. 5Б). Так к концу 150-го субкультивирования суспензии Р. ginseng этот показатель был равен 12,7, а из-за отсутствия синтеза соединений с агликоном 20(8)-протопанаксадиол в 175-м цикле - не возможно было определить.

Рис. 4. Процентное содержание индивидуальных гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б), культивируемых на стандартных питательных средах (% от суммы гинзенозидов).

70 100 150 150

Циклы субкультивирования

12 -

á 10

"Вь

U 8

к г

1 4 0)

ffl 2

0

6

А

' - . • - : ттШ'-í- т^тш gggggg ШШ' FBtffg ' S , S

Б : . - ;: - -

¡¡¡¡¡|g

I

*

150

175

70 100 150

Циклы субкультивирования Рис. 5. Отношение содержания Rg/Rb групп гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б), культивируемых на

стандартных питательных средах; Rb=0.

отношение не определено, значение группы

Итак, на основании полученных данных, можно сделать следующее заключение: при культивировании на стандартных питательных средах биосинтетическая активность суспензий клеток Р. japonicus и Р. ginseng существенно различалась по количеству гинзенозидов и их составу. В обоих случаях доминирующими были соединения Rg-группы с преобладанием Re-гинзенозида. В процессе длительного культивирования суспензии женьшеня японского накопление

13

пшзенозидов имело высокий уровень, а их состав не менялся. В культуре клеток женьшеня настоящего гинзенозиды синтезировались в следовых количествах и были представлены только соединениями Rg-группы.

Следует отметить, что стандартные питательные среды обеих суспензий имеют отличия, как по качественному, так и по количественному содержанию ауксинов; кроме того, стандартная (контрольная) среда для Р japonicus var repens содержит гидролизат казеина (табл 2) В связи с этим, задачей нашей дальнейшей работы было определить, каким образом изменение состава фитогормонов повлияет на ростовые, цитофизиологические параметры и специализированный метаболизм суспензионных культур клеток Р japonicus var. repens и Р. ginseng. В течение 6-ти последовательных субкультивирований обе культуры выращивали на средах (табл. 2), отличающихся сочетаниями ауксинов и цитокининов, при этом их концентрации были выравнены в молярном отношении.

Таблица 2

Варианты сочетаний фитогормонов

Цитокинин (4,6x10" Ауксин (1,1 *10"5М) Гидролизат казеина Сокращение

6М) (500 мг/л)

БАП НУК - БН

БАП НУК + БНгк

кинетин НУК - КН

кинетин НУК + КНгк

кинетин 2,4-Д - КД

кинетин 2,4-Д + КДгк

БАП 2,4-Д - БД

БАП 2,4-Д + БДгк

Контроль: Р japonicus - кинетин (4,6 х 10"6М) -НУК(1,1хЮ"5М), копт

гидролизат казеина

Р ginseng - БАП (2,3 х 10"6М) - 2,4-Д (0,9х ЮЛМ)

В весовом соотношении концентрации регуляторов роста составили: НУК -2мг/л, 2,4-Д - 2,37мг/л, БАП - 1,04мг/л и кинетин - 1мг/л. Также изучали совместное действие гидролизата казеина и вышеуказанных регуляторов роста.

3. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионных культур клеток Р. japonicus var. repens и Р. ginseng

Определение индекса роста сырой биомассы исследуемых суснензий проводили в 4-м и 6-м циклах субкультивирования на модифицированных средах. Из результатов, представленных на рис. 6, видно, что интенсивность роста максимальна в вариантах, где химическая природа ауксина соответствовала стандартной среде каждой культуры, т.е у Р. japonicus - в вариантах с НУК, а у Р. ginseng-в вариантах с 2,4-Д.

200

к

§ 150 р. 5

° 100 н о

^ 50 0

^^^ Варианты сред

Щ 4-й цикл

ИИ 6-й цикл

Рис. 6. Изменение индексов роста биомассы суспензионных культур клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б) в 4-м и 6-м циклах культивирования на средах с различными сочетаниями ауксинов и цитокининов.

Суспензия женьшеня японского на средах с НУК прирастала в 2-2,5 раза больше, чем при добавлении 2,4-Д (рис. 6А). Биомасса суспензии женьшеня настоящего на экспериментальных средах с 2.4-Д прирастала в 2-2,8 раза больше, чем на НУК (рис. 6Б). Некоторая стабилизация роста обеих культур наблюдалась к 6-му пассажу и проявлялась в увеличении прироста биомассы суспензий на всех исследуемых фитогормонах приблизительно в 1,5 раза.

конт БН БНгк КН КД КДгк БДгк конт БН БНгк КН КНпс КД КДгк БД БДгк

Жизнеспособность клеток обеих культур на различных сочетаниях ауксинов и дитокининов мало изменялась. В вариантах с добавлением НУК или 2,4-Д количество живых клеток Р. japonicus var. repens находилось на уровне контроля (рис. 7А), а в суспензии Р. ginseng - в пределах от 72% до 92% (рис. 7Б).

100

S

S 80

ю § 60 И

8 40

в §

й 20

0....... J

конт БН БНгк КН КД КДгкБДгк конт БН БНгк КН КНгкКДгк БД БДгк Варианты сред

Рис. 7. Жизнеспособность суспензионных культур клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б) при выращивании на средах с различным сочетанием ауксинов и цитокининов.

А1регированность исследуемых суспензий на различных сочетаниях ауксинов и цитокининов существенно отличалась (рис. 8). В клеточной популяции Р. japonicus var. repens количество крупных агрегатов (размером более 50 клеток) в вариантах с добавлением НУК было в 1,6 раза выше, чем в случае замены ауксина на 2,4-Д; а кластеры размером до 10 клеток, 10-20 и 20-50 клеток представлены в равных долях (рис. 8А). При использовании в качестве ауксина 2,4-Д агрегаты разного размера в суспензии женьшеня японского распределялись равномерно. Синтетический ауксин НУК также вызывал укрупнение агрегатов в суспензии женьшеня настоящего - в популяции в 22 раза увеличивалось количество крупных агрегатов размером более 50 клеток (рис. 8Б). На средах с 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами суспензия Р. ginseng была мелкоагрегирована и не отличалась от контроля.

конт БН БНгк КН КД КДгкБДгк конт БН БНгк КН КНгк КД КДгк БД БДгк

1-10 клеток Варианты сред

^^ 11-20 клеток ¡Щ 21-50 клеток ВШ >50 клеток

Рис. 8. Процентное содержание агрегатов с разным числом клеток в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б) при выращивании на средах с различным сочетанием ауксинов и цитокининов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что на интенсивность роста и агрегированность суспензионных культур клеток Р. japonicus var. repens и Р. ginseng в большей степени оказывал влияние вид используемого ауксина, чем цитокинина. Наибольшая интенсивность роста определена в вариантах, где химическая природа ауксина соответствовала стандартной среде каждой культуры. Добавление НУК вызывало укрупнение агрегатов обеих суспензий. Гидролизат казеина несколько снижал жизнеспособность и не оказывал влияния на агрегированность и интенсивность роста суспензионных культур клеток Р. japonicus var. repens и Р. ginseng.

4. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens и Р. ginseng

Определение тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда проводили на 21-е сутки 4-го цикла субкультивирования на модифицированных питательных средах. Из данных, представленных на рис. 9А, видно, что независимо от вида гормональных

добавок накопление гинзенозидов в суспензии клеток Р. japonicus var. repens сохраняло высокий уровень. При культивировании на средах, содержащих НУК, он был немного выше, чем при использовании 2,4-Д. В серии сред с добавлением НУК синтез гинзенозидов в клетках женьшеня японского в среднем составил 2,8% (CV= 16%), а с 2,4-Д- 2,1% (CV= 17%).

В суспензии Р. ginseng накопление гинзенозидов зависело от вида используемого ауксина (рис. 9Б). В серии сред с 2,4-Д накопление гинзенозидов в биомассе суспензии женьшеня настоящего не отличалось от контроля, тогда как в вариантах с добавлением НУК их содержание в среднем составило 4% (CV=36%), что в 17,2 раза выше, чем на средах с 2,4-Д. Следует отметить, что гидролизат казеина не оказывает существенного влияния на синтез гинзенозидов в суспензиях клеток Р. japonicus var. repens и Р. ginseng.

конт БН БНгк КН КД КДпсБДгк конт БН БНгк КН КНгк КД КДгк БД БДгк Варианты сред

контроль НУК 2,4-Д

Рис. 9. Содержание гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japónicas var. repens (А) и Р. ginseng (Б) при выращивании на средах с различным сочетанием ауксинов и цитокининов (% от сухой биомассы).

Качественный анализ гинзенозидов (рис. 10) показал, что на всех модифицированных средах суспензия клеток женьшеня японского способна к синтезу всех 7-ми основных гинзенозидов, обнаруженных в котроле (рис.ЮА). Следует отметить, что при замене НУК на 2,4-Д увеличилась доля Ле гинзенозида в 1,34 раза,

а доля Rgj гшзенозида уменьшилась в 2,55 раза. Таким образом, в зависимости от вида ауксина изменялось количество отдельных гинзенозидов, и как следствие их соотношение.

При использовании в качестве ауксина 2,4-Д в биомассе суспензии клегок Р. ginseng присутствовали не все гинзенозиды. а их соотношение было не постоянно (рис.1 ОБ). Только в вариантах с добавлением НУК в биомассе женьшеня настоящего состав гинзенозидов был представлен полностью - семь гинзенозидов (рис. 10Б), при этом соотношение индивидуальных гинзенозидов оказалось одинаковым.

контБНБНгкКН КДКДгкБДгк конт БН БНгк КН КНгк КД КДгк БД БДгк

Варианты сред

Рис. 10. Процентное содержание индивидуальных гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б) при выращивании на средах с различным сочетанием ауксинов и цитокининов (% от суммы гинзенозидов).

В суспензии Р. japonicus var. repens (рис. 11 А) не выявлено влияние вида синтетического ауксина на отношение соединений Rg/Rb групп: на всех сочетаниях ауксинов и цитокининов, за исключением варианта БН, данный показатель находился в диапазоне 4,2-4,5. В суспензии Р. ginseng (рис. 11Б) отношение Rg/Rb групп гинзенозидов изменялось в зависимости от используемого ауксина: во всех вариантах с НУК эти значения находились в пределах 6,1-7,6, а при использовании 2,4-Д - колебались, в связи с нестабильным синтезом индивидуальных гинзенозидов.

Представленные результаты также свидетельствуют о том, что в тех случаях, когда отмечается активный биосинтез гинзенозидов, то их состав, доля каждого гинзенозида, а также соотношение соединений Я^Ь групп стабильны.

конт БН БНгк КН КД КДгкБДгк БН БНгк КН КНгк КД КДгк БД БДгк Вариангы сред

Рис. 11. Отношение содержания Rg/Rb групп гинзенозидов в суспензионных культурах клеток Р. japonicus var. repens (А) и Р. ginseng (Б) при выращивании на средах с различным сочетанием ауксинов и цитокининов; * - отношение не определено, значение группы Rb=0.

Таким образом, в суспензии Р. ginseng, в отличие от Р. japonicus, синтез тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда на средах с 2,4-Д не стабилен. Для процесса биосинтеза гинзенозидов суспензиями обоих видов женьшеня более благоприятно присутствие в питательной среде НУК, о чем свидетельствует не только повышение общей суммы гликозидов, но одинаковое отношение групп гинзенозидов - Rg/Rb.

Для исследования влияния НУК на рост и вторичный метаболизм, мы определяли накопление сырой биомассы и содержание гинзенозидов в течение 7-ми циклов субкультивирования суспензии Р. ginseng в варианте кинетин-НУК (рис. 12). В первые циклы культивирования прирост биомассы снижался и лишь к 6-му пассажу наблюдалось незначительное его увеличение. Накопление гинзенозидов с 0,25% в контроле увеличилось до 5% и 11% к 4-му и 7-му пассажу соответственно. Уже с 1-го субкультивирования активизировался синтез обеих групп соединений и к концу 2-го пассажа состав гинзенозидов был представлен полностью (табл. 3).

I о ' ■H^V.j—,—■,-'----j о

К конт 1 2 3 4 6 7 Циклы субкультивирования

Рис. 12. Содержание гинзенозидов (кривая линия) при последовательных субкультивированиях суспензионной культуры клеток Р. ginseng па среде кинетин-НУК; диаграмма - сырая биомасса.

Таблица 3

Накопление гинзенозидов в течение 7-ми циклов субкультивирования суспензионной культуры Р. ginseng на среде кинетин-НУК

№ пассажа Сумма, % Состав гинзенозидов

1 0,54:1:0,19 Rb,; Rc;Rb2; Rf;Rg,:Re

2 1,95±0,14 Rb,; Rc;Rb2;Rd; Rf;Rg,;Re

3 3,43±0,59 Rb,; Rc;Rb2;Rd; Rf;Rg,;Re

4 5,02±0,04 Rbi; Rc;Rb2;Rd; Rf;Rg,;Re

6 6,71± 1,10 Rb,; Rc;Rb2;Rd; Rf;Rg,;Re

7 11,2±0,27 Rb,; Rc;Rb2;Rd; Rf;Rgr,Re

Контроль (0,5 мл/лБАП-2,4-Д) 0,04 Rb2 Rf; Rgi;Re

Известно, что в корнях интактных растений основная масса гинзенозидов локализуется в паренхимных клетках между флоэмой и перидермой (Kubo et al., 1980; Samukawa et al., 1995: Smith et al., 1996). Основываясь на этих данных, можно предположить, что в суспензионных культурах накопление метаболитов также происходит в паренхимоподобных клетках. Число последних значительно возрастало к концу пассажа суспензии P. japonicus var. repens и одновременно с этим в части культивируемых клеток удваивалось количество ядерной ДНК. Число клеток с

удвоенным количеством ядерной ДНК в суспензии женьшеня японского на среде с добавлением НУК составляло около 20% (рис. 13). В отличие от Р. japonicus, на протяжении всего цикла роста в контроле (с добавлением 2,4-Д) суспензия Р. ginseng в основном была представлена мелкими меристемоподобными клетками, а клеток с удвоенной ядерной ДНК было лишь 4%. При замене 2,4-Д на НУК в клетках женьшеня настоящего до 25% увеличивалось число ядер с удвоенным количеством ДНК (рис. 13); одновременно с этим возрастало число паренхимоподобных клеток (см. стр. 10).

25 -

яря

20 -

«

15 Ире шш

10

5 - tiltil ЯиМйи

á Wy'ií^ |р«в| шш

Рис. 13. Число клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК в конце пассажа в суспензионных культурах Panax: 1 -суспензия клеток P. japonicus var. repens на среде с НУК; 2 - суспензия клеток P. ginseng на среде с 2,4-Д; 3 - суспензия клеток Р. ginseng на среде с НУК.

I 2 3

Размер клеток, как правило, коррелирует с количеством ядерной ДНК и

увеличение обоих параметров часто сопровождает дифференцировку клеток и тканей

(Melaragno et al., 1993; Sugimoto-Shirasu, Roberts, 2003). Вероятно, что под влиянием

НУК в суспензионной культуре P. ginseng происходит замедление деления клеток, но

усиливается их растяжение. Рассчитанный на основании данных по числу клеток и

сырой массе, средний объём клеток суспензии женьшеня настоящего до 10-х суток

субкультивирования был равен 10,8 х 104 мкм3 (CV = 26%) и 13,2 х 104 мкм3

(СК= 8%) на средах с 2,4-Д и НУК соответственно. При этом следует отметить, что с

14 до 21 суток субкультивирования средний обьём на средах с 2,4-Д не претерпевал

больших изменений, в то время как культивирование суспензии с НУК приводило к

увеличению объёма клеток до 36,3 * 104 мкм3 (CV = 39%). При этом растяжение

клеток, вероятно, сопровождается эидоредупликацией ядерной ДНК. Очевидно, что

два синтетических ауксина 2,4-Д и НУК противоположным образом действуют на

деление и растяжение клеток суспензионной культуры P. ginseng, и как следствие, -

22

на синтез пшзенозидов. В недавней работе Campanoni и Nick (Campanoni, Nick, 2005) на культуре клеток табака было убедительно показано, что НУК стимулировал растяжение клеток в концентрации на порядок ниже той, которая требовалась для стимуляции делений, а 2,4-Д совсем не влияла па растяжение клеток и поддерживала только их деления. Авторы предполагают, что два ауксина активируют разные сигнальные пути, контролирующие деление и растяжение клеток Причем в проведении сигнала от предполагаемого рецептора 2,4-Д принимают участие гетеротримерные G-белки. О вероятном существовании двух ауксиновых рецепторов, для ИУК и 2,4-Д, было сказано и в работе Kavvano с соавторами (Kawano et al., 2003) и продемонстрировано, что 2,4-Д вызывает неконкурентное ингибирование эпинастического роста полосок листьев табака, под действием ИУК.

Таким образом, повышение синтеза гинзенозидов в клетках обеих культур связано с процессами цитодифференцировки, вызванными НУК. Вероятно, под влиянием НУК в суспензионной культуре женьшеня настоящего происходит замедление деления клеток, но усиливается их растяжение. Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что изменение цитофизиологичсских показателей, состава и количества трнтерпеновых гликозидов даммаранового ряда в суспензионных культурах Р ginseng и P. japonicus var. repens определяется главным образом видом синтетического ауксина.

Выводы

1. Установлены различия в росте и составе клеточной популяции суспензионных культур клеток Р japonicus var. repens и P. ginseng

2. Показано, что обе суспензии отличаются по способности к синтезу гинзенозидов. В суспензии клеток Р japonicus var. repens высокий уровень синтеза всех семи гинзенозидов. В суспензии клеток Р ginseng синтез гинзенозидов не стабилен -определяются только следовые количества, а их состав представлен не полностью. У обеих культур доминируют соединения Rg-группы с преобладанием Re-гинзенозида.

3. Установлено, что замена ауксина в среде культивирования уменьшает прирост биомассы обеих суспензий. Наибольшая интенсивность роста отмечается в вариантах, где химическая природа ауксина соответствует стандартной среде каждой культуры. Показано, что НУК вызывает укрупнение агрегатов в суспензиях P. japonicus var. repens и Р ginseng

4. Показано, что вид ауксина не оказывает существенного влияния на изменение жизнеспособности суспензионных культур клеток Р japonicus var. repens и Р ginseng.

5. Установлено, что в суспензии клеток P. japonicus var. repens накопление гинзенозидов на всех сочетаниях фитогормонов сохраняет высокий уровень.

6. Показано, что в суспензионной культуре клеток P. ginseng НУК вызывает значительное увеличение синтеза гинзенозидов всех групп, в результате состав гинзенозидов представлен полностью.

7. Установлено, что при активном биосинтезе суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng состав гинзенозидов и отношение соединений Rg/Rb групп - одинаковы.

8 Показано, что повышение синтеза гинзенозидов в обеих культурах связано с процессами цитодифференцировки, вызванными НУК: увеличение доли крупных многоклеточных агрегатов, объёма клеток и возрастание числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Решетняк О.В., Черняк Н.Д., Смирнова Ю.Н., Штратникова В.Ю., Орешников A.B. (2003) Изменение качественного и количественного состава гинзенозидов в процессе выращивания новых штаммов Panax ginseng. Тез. докл VIII международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология", Саратов, с. 270.

2. Решетняк О.В., Смоленская И.Н., Смирнова Ю.Н., Чайко AJL, Носов A.B., Носов A.M. (2003) Рост суспензионной культуры клеток Panax japonicus и

биосинтез гинзенозидов. Тез докл VIII международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология ", Саратов, с. 288.

3. Решетняк О.В., Смоленская И.Н., Смирнова Ю.Н., Черняк Н.Д, Кривохарченко А.С., Носов А.М. (2003) Суспензионная культура клеток Panax japonicus и изменение ее агрегированпости для криосохранения. Тез докл V съезда общества физиологов растений России и Международной конференции "Физиология растений - основа фитобиотехнологии", Пенза, с. 530.

4. Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Смирнова Ю.Н., Носов А.В., Чайко А.Л., Носов A.M. (2005) Суспензионная кулыура клеток Panax japonicus var. repens

1. Параметры роста и цитогенетические характеристики. Биотехнология, 5, 21-28.

5. Решетняк О.В., Смоленская И.Н., Смирнова Ю.Н., Чайко А.Л., Носов А.В., Носов A.M. (2005) Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens

2. Качественный и количественный состав гинзенозидов в клетках при культивировании in vitro Биотехнология, 6, 20-26.

6. Смоленская И.Н., Решетняк О.В., Смирнова Ю.Н, Черняк Н.Д., Глоба Е.Б., Носов A.M., Носов А.В. (2007) Противоположное влияние синтетических ауксинов - 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 1-нафтилуксусной кислот на рост культуры клеток женьшеня настоящего и синтез гинзенозидов. Физиология растений, 54, 243-252.

7 Смоленская И.Н., Решетняк О.В., Носов А.В., Смирнова Ю.Н., Носов A.M. (2007) Оптимизация условий роста и биосинтеза гинзенозидов в суспензионной культуре клеток женьшеня настоящего. Тез докл VI съезда общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений'от молекул до экосистем» Сыктывкар, Часть 3, с 202-203.

8. Smolenskaya I.N., Reshetnyak O.V., Nosov A.V., Zoriniants S.E., Chaiko A.L., Smirnova Y.N., Nosov A.M. (2007) Ginsenoside production, growth and cytogenetic characteristics of sustained Panax japonicus var. repens cell suspension culture. Biologia plantarum, 51, 235-241.

9. Решетник О.В., Черняк Н.Д., Смоленская И.Н., Орешников A.B., Смирнова Ю.Н., Носов А.М. (2008) Сравнительный анализ гинзенозидов в разных частях корней и в культивируемых клетках женьшеня настоящего. Хим фарм журн., 42, 34-39.

¡0. Смирнова Ю.Н., Решетняк О.В., Смоленская И.Н., Носов A.B. (2008) Влияние ауксинов на синтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток женьшеня настоящего. Тез докл. IX международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология", Звенигород, с. 350.

1,5 печ. л.

Тир. 100 экз.

Зак. 459.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: 977-00-12, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Юлия Николаевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Ареал распространения рода Panax, биология видов P. japonicus и

P. ginseng.

1.2 Ценность растений рода Panax для медицины.

1.3 Гинзенозиды: химическая принадлежность, структурные формулы.

1.4 Биологическая активность индивидуальных гинзенозидов.

1.5 Биосинтез гинзенозидов: ключевые ферменты, предшественники.

1.6 Накопление гинзенозидов в растениях видов P. japonicus и P. ginseng.

1.7 Накопление гинзенозидов в культуре клеток растений рода Panax.

1.8 Влияние условий культивирования на рост биомассы и синтез гинзенозидов в культурах клеток растений рода Panax.

1.9 Связь роста, дифференцировки и биосинтеза гинзенозидов в культурах клеток растений рода Panax.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Объекты исследования.

2.2 Условия культивирования.

2.3 Определение ростовых и цитофизиологических параметров суспензионных культур клеток женьшеня.

2.4 Измерение количества ДНК.

2.5 Анализ количества и состава гинзенозидов методом ВЭЖХ.

2.6 Статистическая обработка материала.

Результаты исследований

Глава 3. Характеристика роста и биосинтеза гинзенозидов суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng, культивируемых на стандартных питательных средах

3.1 Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток P. japonicus var. repens.

3.2 Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. japonicus var. repens.

3.3 Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток P. ginseng.

3.4 Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. ginseng.

Глава 4. Цитофизиологические параметры и биосинтез гинзенозидов при длительном выращивании суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng на средах с различными сочетаниями регуляторов роста

4.1. Влияние сочетаний синтетических ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионной культуры

P. japonicus var. repens.".

4.2. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. japonicus var. repens.

4.3. Влияние сочетаний синтетических ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионной культуры

P. ginseng.

4.4. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. ginseng.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax"

Целебные свойства растений рода Panax известны около 6000 лет и обусловлены уникальной композицией биологически активных веществ, центральное место среди которых принадлежит тритерпеновым гликозидам даммаранового ряда - гинзенозидам. Гинзенозиды обладают иммуностимулирующей и антиоксидантной активностями, нормализуют кровяное давление, стимулируют синтез РНК и ДНК, обладают противодиабетическим действием. По структуре агликона тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда делят на две группы: 20(8)-протопанаксадиол (Rb-группа - Rbi, Rb2, Rc, Rd гинзенозиды) и 20(8)-протопанаксатриол (Rg-группа - Rf, Rgb Re гинзенозиды). Биологическое действие соединений обеих групп различно, в частности, гликозиды Rb-группы подавляют активность ЦНС, понижают артериальное давление, а гликозиды Rg-группы увеличивают активность ЦНС и повышают артериальное давление. Поэтому, эффективность применения в лечебных целях препаратов женьшеня, в большей степени, зависит от композиции гинзенозидов, что подтверждается обоснованностью дифференцированного применения отдельных частей корня P. ginseng С.А. Meyer в традиционной китайской медицине.

В связи с тем, что количество растений рода Panax в природе крайне ограничено, широко исследуется возможность получения гинзенозидов биотехнологическим путем, используя культуру in vitro. Большинство из полученных линий клеток женьшеня отличаются от натуральных корней меньшим количеством и ограниченным составом гинзенозидов (Ходаковская и др., 1995; Langhansova et al., 2005). В настоящее время активно проводятся работы по получению высокопродуктивных штаммов представителей рода Panax, а таюке по исследованию их роста и биосинтеза гинзенозидов. При этом большое внимание уделяется оптимизации условий выращивания клеток, прежде всего составу питательных сред (Wu, Zhong, 1999). Хорошо известно, что регуляторы роста и их соотношение — важнейшие факторы, определяющие возможность существования популяций изолированных клеток. Они оказывают влияние, как на рост и дифференцировку клеток, так и на их метаболизм. Эффект определяется не только спецификой самого фитогормона, но также зависит от природы вторичных соединений, а подчас от вида растения и даже от штамма культивируемых клеток.

Изучение в сравнительном аспекте цитофизиологических характеристик суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.A. Meyer, а также их способности к синтезу вторичных метаболитов, дает возможность установить особенности их существования, как самостоятельных биологических систем. Кроме того, влияние регуляторов роста на биосинтез гинзенозидов у разных видов женьшеня в условиях in vitro до сих пор окончательно не выяснено.

Цель работы состояла в изучении влияния типа синтетического ауксина на процессы роста, цитофизиологические и цитогенетические характеристики, биосинтез гинзенозидов в культуре клеток растений двух видов рода Panax: P. japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.А. Meyer.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ростовые, цитофизиологические и цитогенетические характеристики суспензионных культур клеток двух видов женьшеней. ;;

2. Определить накопление гинзенозидов в отдельных циклах субкультивирования суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

3. Изучить влияние типа синтетического ауксина на ростовые и цитофизиологические характеристики суспензионных культур клеток женьшеней.

4. Изучить влияние типа синтетического ауксина на накопление гинзенозидов в суспензионных культурах P. japonicus var. repens и P. ginseng.

5. Рассмотреть возможную связь между ростовыми, цитофизиологическими характеристиками и синтезом тритерпеновых гликозидов в суспензионных культурах клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

Научная новизна работы. Проведено сравнительное изучение длительно культивируемых суспензионных культур клеток двух видов женьшеня.

Установлены различия ростовых, цитофизиологических и биосинтетических показателей суспензионных культур P. japonicus var. repens и P. ginseng.

Показано, что основное влияние на накопление биомассы, агрегированность, эндоредупликацию ядерной ДНК, содержание и качественный состав гинзенозидов исследуемых культур оказывает химическая природа синтетического ауксина. У обеих суспензионных культур женьшеня НУК вызывает цитодифференцировку, проявляющуюся в увеличении доли крупных многоклеточных агрегатов, увеличении объёма клеток, возрастании числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК, а также приводит к повышению синтеза гинзенозидов.

Установлено, что между уровнем синтеза гинзенозидов и цитофизиологическими характеристиками суспензий клеток существует зависимость - повышение синтеза гинзенозидов связано с процессами цитодифференцировки.

Впервые экспериментально показано, что в случае активного биосинтеза соотношение индивидуальных гинзенозидов, - следовательно, и соотношение содержания гинзенозидов Rg и Rb групп - достаточно стабильно.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований, получены данные по гормональной регуляции роста и накопления тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда в суспензиях клеток двух видов Panax. Охарактеризованы высокопродуктивные штаммы суспензионных культур P. japonicus var. repens и P. ginseng, которые могут быть рекомендованы для биотехнологического производства гинзенозидов. Результаты исследований дополняют данные о взаимосвязи цитодифференцировки клеток и уровня синтеза гинзенозидов в условиях in vitro.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Смирнова, Юлия Николаевна

выводы

1. Установлены различия в росте и составе клеточной популяции суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

2. Показано, что обе суспензии отличаются по способности к синтезу гинзенозидов. В суспензии клеток P. japonicus var. repens высокий уровень синтеза всех семи гинзенозидов. В суспензии клеток P. ginseng синтез гинзенозидов не стабилен - определяются только следовые количества, а их состав представлен не полностью. У обеих культур доминируют соединения Rg-группы с преобладанием Яе-гинзенозида.

3. Установлено, что замена ауксина в среде культивирования уменьшает прирост биомассы обеих суспензий. Наибольшая интенсивность роста отмечается в вариантах, где химическая природа ауксина соответствует стандартной среде каждой культуры. Показано, что НУК вызывает укрупнение агрегатов в суспензиях P. japonicus var. repens и P. ginseng.

4. Показано, что вид ауксина не оказывает существенного влияния на изменение жизнеспособности суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

5. Установлено, что в суспензии клеток P. japonicus var. repens накопление гинзенозидов на всех сочетаниях фитогормонов сохраняет высокий уровень.

6. Показано, что в суспензионной культуре клеток P. ginseng НУК вызывает значительное увеличение синтеза гинзенозидов всех групп, в результате состав гинзенозидов представлен полностью.

7. Установлено, что при активном биосинтезе суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng состав гинзенозидов и отношение соединений Rg/Rb групп - одинаковы.

8. Показано, что повышение синтеза гинзенозидов в обеих культурах связано с процессами цитодифференцировки, вызванными НУК: увеличение доли крупных многоклеточных агрегатов, объёма клеток и возрастание числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Юлия Николаевна, Москва

1. Александрова И.В., Данилина А.Н., Груздев Л.Г., Стрелец Н.И., Пастушенко Т.М. (1979) Культура ткани женьшеня перспективное растительное сырье. Растительные ресурсы, 15(3), 361-367.

2. Белая Г.А. (1994) Флора сосудистых растений Еврейской автономной области. Аннотированный список. Владивосток: Дальнаука, 108 с.

3. Брехман И.И. (1957) Женьшень. JL: Медгиз, 181с.

4. Брехман И.И., Гриневич М.А. (1959) Метод биологической стандартизации препаратов корня женьшеня. Аптечное дело, 8(6), 34-40.

5. Брехман И.И., Дардымов И.В., Добряков Ю.И. (1966) К фармакологии индивидуальных гликозидов из корней женьшеня (Panax ginseng). Фармакология и токсикология, 2, 167-170.

6. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Бабкина Э. Н.,'г Уварова Н.И., Маханьков В.В. (1991) Содержание даммарановых гликозидов в различных каллусных линиях Panax ginseng С.А. Меу.,- ., Растительные ресурсы, 27(3), 94-100.

7. Булгаков В.П., Лауве Л.С., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев,. Ю.Н. (2000) Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированного растительным онкогеном rolC. Генетика, 36, 209-216.

8. Бутенко Р.Г. (1964) Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 162 с.

9. Бутенко Р.Г., Грушвицкий И.В., Слепян Л.И. (1968) Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре ткани женьшеня и других представителей рода Панакс. Ботанический журнал, 53(7), 906-912.

10. Бутенко Р.Г. (1975) Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.:Наука, 51с.

11. Бутенко Р.Г., Слепян Л.И., Хретонова Т.И., Михайлова Н.В., Высоцкая Р.И. (1979) Изучение некоторых штаммов культур тканей трех видов

12. Panax L. как возможных источников стимулирующих препаратов. Растительные ресурсы, 15(2), 265-270.

13. Государственная Фармакопея СССР (1987) 11-е изд., М.: Медицина, 400 с.

14. Грушвицкий И.В. (1961) Женьшень. Вопросы биологии. JL: Наука, 344 с.

15. Губарь С.И., Гулько Т.П., Кунах В.А. (1997) Рост и накопление гликозидов в каллусной культуре тканей женьшеня при длительном воздействии экзогенных фитогормонов. Физиология растений, 44(1), 97-103.

16. Долгих Ю.И. (1986) Генетическая изменчивость по признаку температурочувствительности в культуре клеток женьшеня: Автореф. канд.биол. наук, Москва, 42 с.

17. Журавлев Ю.Н., Коляда А.С. (1996) Araliaceae: женьшень и другие Владивосток: Дальнаука, 280 с.

18. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В., Стрекова В.Ю., Морозова Г.А. (1979) Образование фенольных соединений и процесс дифференциации в каллусной культуре чайного растения. Физиология растений, 26 (3), 485-491.

19. Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В. (1986) Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения. Физиология растений, 33 (2), 356-364.

20. Бляков Г.Б., Стригина Л.И., Хорлин А.Я., Кочетков Н.К. (1962) Гликозиды из корня женьшеня (Panax ginseng С.А. Meyer). Изв. АН СССР. Отд. хим. наук, 2, 2054.

21. Еляков Г.Б., Стригина Л.И., Кочетков Н.К. (1965) Гликозиды из корней женьшеня. VI. Строение углеводной цепи панаксозида А. Химия природных соединений, Ъ, 149-152.

22. Еляков Г.Б., Дзизенко А.К., Шапкина Э.В. (1967) Структура продуктов кислотного гидролиза панаксозидов Д, Е, F. Химия природных соединений, 3, 165-169.

23. Еляков Г.Б., Оводов Ю.С. (1972) Гликозиды аралиевых. Химия природных соединений, 6, 697-709.

24. Еляков Г.Б., Уварова Н.И., Прокопенко Г.И., Маханьков В.В., Слабко М.Г., Фаустов B.C., Константинова Н.А., Новиков Е.В., Подгорбунская Н.В. (1989) Химическое исследование суспензионной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 5(4), 420-426.

25. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев Ю.Н. (1997) Геномный полиморфизм в культивируемых клетках Panax ginseng С.А. Меу. Биотехнология, 5, 10-14.

26. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве Л.С., Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д. (2001) Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня Panax ginseng. Биотехнология, 1, 19—26.

27. Константинова Н.А., Зайцева Г.В., Фаустов B.C., Маханьков В.В., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. (1989) Исследование ростовых и биосинтетических способностей длительно пассируемой суспензионной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 5(5), 517-575.

28. Константинова Н.А., Маханьков В.В., Уварова Н.И., Самошина Н.Ф., Сова В.В., Михайлова О.М. (1995) Исследование динамики биосинтезагинзенозидов в цикле роста каллусной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 9-10, 35-39.

29. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Губарь С.И. (2001) Особенности получения и продуктивность суспензионных культур и клеточных клонов раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth. in vitro. Биотехнология, 4, 9-21.

30. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Адонин В.И., Губарь С.И. (2003) Продуктивность и генетическая структура популяции клеток Panax ginseng С.А. Меу. при культивировании in vitro. Биотехнология, 3, 25-35.

31. Легостева А.Б., Грушвицкий И.В., Минина С.А. (1986) Возрастная и сезонная динамика содержания панаксозидов в листьях культивируемого Panax ginseng С.А. Меу. Растительные ресурсы, 22(4), 523-526.

32. Лобакова Е.С., Корженевская Т.Г., Гусев М.В., Бутенко Р.Г. (1984) Образование биологически активных веществ клетками женьшеня в ассоциации с цианобактерией Chlorogloea fritschii. Докл. АН СССР, 276(4), 1017-1018.

33. Малышев А.А. (1991) Женьшень. М.: Агропромиздат, 145 с.

34. Маханьков В.В., Самошина Н.Ф., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. (1993) Анализ нейтральных гинзенозидов диких и плантационных корней Panax ginseng, произрастающих в Приморье. Химия природных соединений, 2, 237-242.

35. Маханьков В.В. (2001) Сравнительное исследование качественного состава и количественного содержания тритерпеновых гликозидов, продуцированных дикорастущим и плантационным женьшенем P. ginseng

36. C.M. Meyer и клеточной культурой на его основе. Дисс. канд. хим. наук, Владивосток, 187с.

37. Никитина И.В. (1982) Физиолого-биохимическая характеристика каллусных тканей некоторых видов рода Panax L. Растительные ресурсы, 18(2), 234-238.

38. Носов A.M. (1999) Культура высших растений уникальная система, модель, инструмент. Физиология растений, 46(6), 837-844.

39. Пасешниченко В. А. (1985) Регуляция биосинтеза терпеноидов и стероидов у растений и животных. Успехи биологической химии, 26, 246-268.

40. Пасешниченко В. А. (1987) Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов. Итоги науки и техники. Сер. Биолог, химия, 26. М.: ВИНИТИ, 196 с.

41. Писецкая Н.Ф. (1970) К вопросу о подборе питательной среды для культуры ткани женьшеня. Растительные ресурсы, 6(4), 517-520.

42. Репка Ф., Юрчак С. (1989) Опыт выращивания женьшеня в условиях ЧССР. Лекарственное растениеводство, 4, 22-23.

43. Решетняк О.В., Черняк Н.Д., Смоленская И.Н., Орешников А.В., Смирнова Ю.Н., Носов А.М. (2008) Сравнительный анализ гинзенозидов в разных частях корней и в культивируемых клетках женьшеня настоящего. Хим. фарм. журн., 42(1), 34-39.

44. Рокицкий П.Ф. (1964) Биологическая статистика. Минск: Высшая школа, 328 с.

45. Сапожникова Т.Г. (1994) Распространение и охрана редких видов сосудистых растений Хабаровского края и Еврейской автономной области. Владивосток; Хабаровск: Дальнаука, 126с.

46. Скуратова Е.В., Гольд В.М., Юшкова Е.В., (2004) Влияние фитогормонов на накопление и выделение берберина в каллусной культуре василистника малого. Биотехнология, 4, 24-30.

47. Стригина Л.И., Шапкина Э.В., Еляков Г.Б. (1962) О генинах гликозидов женьшеня. Симпозиум по элеутерококку и женьшеню, Владивосток, ДВО АН СССР, с. 74 75.

48. Тулупова Е.С., Остроженкова Е.Г., Слепян., Саканян Е.И. (2002) Влияние различных цитокининов на рост селективных штаммов Panax ginseng С.А.Меу и Panax quinquefolius L. с герматраном Lx 5 и содержание в них гликозидов. Биотехнология, 3, 30-36.

49. Уварова Н.И., Горшкова Р.П., Еляков Г.Б. (1962) Новый способ получения суммарного гликозидного препарата из женьшеня с применением сефадекса. Симпозиум по элеутерококку и женьшеню, Владивосток, ДВО АН СССР, с. 75 76.

50. Уварова Н.И., Горшкова Р.П., Стригина Л.И., Еляков Г.Б., Кочетков Н.К. (1965) Выделение новых гликозидов из женьшеня. Химия природных соединений, 2, 82-86.

51. Уварова Н.И., Маханьков В.В., Самошина Н.Ф. (2000) Химическая характеристика и биологическая активность тритерпеновых гликозидов приморской популяции Panax ginseng С.А. Meyer. Хим. фарм. экурн., 34(3), 19-25.

52. Федоров А.А. (1969) Хромосомные числа цветковых растений. JL: Наука, 914 с.

53. Филиппова И.Н., Зоринянц С.Э., Володина С.О., Смоленская И.Н. (2003) Культуры клеток экдистероидсодержащих растений Ajuga reptans и Serratula coronata. Физиология растений, 50, 501—508.

54. Ходаковская М.В., Булгаков В.П., Маханьков В.В. (1995) Влияние фитогормонов на накопление биомассы и содержание гинзенозидов в каллусных культурах Panax ginseng С.А.Меу. Биотехнология, 9-10, 40—45.

55. Чайко A.JL, Решетняк О.В., Куличенко И.Е. (1999) Культура клеток женьшеня японского Panax japonicus (var. repens): получение каллусной и суспензионной культуры, оптимизация роста и анализ панаксозидов Биотехнология, 6, 51-55.

56. Чой К.Т., Ан И.О., Парк Д.Ч. (1994а) Образование гинзенозидов в культуре тканей женьшеня (Panax ginseng С.А. Meyer). Физиология растений, 41(6), 891-895.

57. Цой К.Т., Ахн И.О., Парк Д.С. (19946) Продуцирование гинзенозидов культурой клеток женьшеня (Panax ginseng C.A.Meyer). Физиология растений, 41(6), 784 788.

58. Шлотгауэр С. Д. (1993) Антропогенная динамика растительности Хабаровского края. Вест. ДВО РАН, 6, 84-90.

59. Abe I., Rohmer М., Prestwich G.D. (1993) Enzymatic cyclization of squalene and oxidosqualene to sterols and triterpenes. Chem. Rev., 93, 2189-2206.

60. Akashi Т., Furuno Т., Takahashi Т., Ayabe S. (1994) Biosynthesis of triterpenoids in cultured cells and regenerated and wild plants organs of Taraxacum officinale. Phytochemistry, 36, 303-308.

61. Benishin C.G, Lee R, Wang L., Liu H.J. (1991) Effects of ginsenoside Rbl on central cholinergic metabolism. Pharmacology, 42, 223-229.

62. Benishin C.G. (1992) Actions of ginsenoside Rbl on choline uptake in central cholinergic nerve endings. Neurochem. Int., 21, 1-5.

63. Bonfill M., Cusido R.M., Palazon J., Pinol M., Morales C. (2002) Influence of auxins on organogenesis and ginsenosides production in Panax ginseng calluses. Plantcell, Tissue and organ culture, 68, 73-78.

64. Byun В. H., Shin I. Yoon Y.S., Kim S.I., Joe C.O. (1997). Modulation of protein kinase С activity in NIH 3T3 cells by plant glycosides from Panax ginseng. Planta Medica, 63(5), 389-392.

65. Campanoni P., Nick P. (2005) Auxin-Dependent cell division and cell elongation. 1-Naphthaleneacetic acid and 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid activate different pathways. Plant Physiol., 137, 939-948.

66. Chen F.D., Wu M.C., Wang H.E., Hwang J.J., Hong C.Y., Huang Y.T., Yen S.H., Ou Y.H. (2001) Sensitization of a tumor, but not normal tissue, to the cytotoxic effect of ionizing radiation using Panax notoginseng extract. Am J. Chin. Med., 29, 517-524.

67. Cho S.W., Cho E.H., Choi S.Y. (1995) Ginsenosides activate DNA polymerase from bovine placenta. Life Sci., 57, 1359-1365.

68. Choi K.T., Ют M.W., Shin H.S. (1982) Root and shoot formation from callus and leaflets of Ginseng {Panax ginseng C.A.Mey). Proc. 5th Int.Cong. Plant Tissue and Cell Culture, Tokyo, Japan, pp. 171.

69. Choi K.-T., Yang D.-C., Park J.-C. (1989) Characterization of cell line of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer) transformed by Agrobacterium tumefaciens. In: Lyama, S., Takeds, G. (Eds.), Proc. of the 6th Internatl. Congr. Of SABRAO, Tokyo, pp. 519-522.

70. Choi K.T., Lee C.H., Ahn I.O., Lee J.H., Park J.-C. (1994). Characteristics of the growth and ginsenosides in the suspension-cultured cells of Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer). In: Bailey, W.G., Whitehead, C., Proctor, J.T.A.,

71. Kyle, J.T. (Eds.), Proceedings of the International Ginseng Conference, Vancouver, pp. 259-268.

72. Choi Y.E. (2007) Ginseng. Biotechnology in Agriculture and Foresty, 61, 149-168.

73. Court W.A., Reynolds L.B, Hendel J.G (1996) Influence of root age on the concentration of ginsenosides of American ginseng (Panax quinquefolium). Canadian Journal of Plant Science, 76(4), 853-855.

74. Elyakov G.B., Strigina L.I., Uvarova N.I., Vaskovsky V.E., Dzizenko A.K., Kochetkov N.K. (1964) Glycosides from ginseng roots. Tetrahedron. Lett., 48, 3591-3597.

75. Filkuka J., Kleinwachter V. (1981) Basic staining of cell nuclei. Brno: Purkyne University, Medical Faculty. 158 p.

76. Flores-Sanchez I.J., Ortega-Lopez J., Montes-Horcasitas M.C., Ramos-Valdivia A.C. (2002) Biosynthesis of Sterols and Triterpenes in Cell Suspension Cultures of Uncaria tomentosa. Plant Cell Physiol., 43, 1502-1509.

77. Fujioka N., Kohda H., Yamasaki K., Kasai R., Tanaka O., Shoyama Y., Nishioka I. (1989) Dammarane and oleanane saponins from callus tissue of Panax japonicus. Phytochemistry, 28(7), 1855-1858.

78. Furuya Т., Kojima H., Syono K., Ishii T. Uotani K., Nishio M. (1983) Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull., 21, 98-101

79. Gao H., Wang F., Lien E.J., Trousdale M.D. (1996) Immunostimulating polysaccharides from Panax notoginseng. Pharm. Res. 13, 1196-1200.

80. Garve R., Luckner M., Vogel E., Tewes A., Nover L. (1980) Growth, morphogenesis and cardenolide formation in long-term cultures of Digitalis lanata. Planta Med., 40, 93-103.

81. Han J., Zhong J. J. (2002) High density cell culture of Panax notoginseng for production of ginsengsaponin and polysaccharide in an airlift bioreactor. Biotechnology Letters, 24, 1927-1930.

82. Han J.Y., Kwon Y.S., Yang D.C., Jung Y.R., Choi Y.E. (2006) Expression and RNA interference-induced silencing of the dammarenediol synthase gene in Panax ginseng. Plant Cell Physiol., 47, 1653-1662. v *

83. Haralampidis K., Trojanowska M., Osbourn A.E. (2001) Biosynthesis of triterpenoid saponin in plants. Adv. Biochem. Eng. Biothecnol., 75, 31-49.

84. Heijden R., Threlfall D.R., Verpoorte R., Whitehead I.M. (1989) Regulation and enzymology of pentacyclic triterpenoid phytoalexin biosynthesis in cell suspension cultures of Tabernaemontana divaricata. Phytochemistry, 28, 2981-2988.

85. Ни C., Kitts D.D. (2001) Free radical scavenging capacity as related to antioxidant activity and ginsenoside composition of Asian and North American ginseng extracts. J. of American oil chemists' Society, 78(3), 249-255.

86. Hu W.W., Yao H., Zhong J.J. (2001) Improvement of Panax notoginseng cell culture for production of ginseng saponin and polysaccharide by high densitycultivation in pneumatically agitated bioreactors. Biotechnology progressing, 17(5), 838-846.

87. Inomata, S., Yokoyama, M., Gozu, Y., Shimizu, Т., Yanagi, M. (1993) Growth pattern and ginsenoside production of Agrobacterium-transformed Panax ginseng roots. Plant Cell Rep., 12, 681-686.

88. Iturbe-Ormaetxe I., Haralampidis K., Papadopoulou K., Osbourn A.E. (2003) Molecular cloning and characterization of triterpene synthases from Medicago truncatula and Lotus japonicus. Plant Mo I. Biol., 51, 731-743.

89. Jung J.D., Park H.W., Halm Y., Hur C.G., In D.S., Chung H.J., Liu J.R., Choi D.W. (2003) Discovery of genes for ginsenoside biosynthesis by analysis of ginseng expressed sequence tags. Plant Cell Rep., 22, 224-230.

90. Kang K.S., Kim H.Y., Pyo J.S., Yokozawa T. (2006) Increase in the free radical scavenging activity of ginseng by heat-processing. Biol. Pharm. Bull., 29(4), 750-754.

91. Kawano N., Kawano Т., Lapeyrie F. (2003) Inhibition of the indole-3-acetic acid-induced epinastic curvature in tobacco leaf strips by 2,4— dichlorophenoxyacetic acid. Ann. Bot., 91, 465—471.

92. Ют JY, Germolec DR, Luster MI. (1990) Panax ginseng as a potentialimmunomodulator. Studies on in mice. Immunopharmacol Jmmunotoxicol., 12, 257-76.

93. Kim S., Kim D.S., Lee Y.H., Park J.D., Baek N. (1995) Isolation of novel dammarane-glycoside, ginsenoside Rh 44 0, from Korean red ginseng. Proc.of '95 Korean-Japan Symp. pp. 107-116.

94. Kim Y.K.,Guo Q., Packer L. (2002) Free radical scavenging activity of red ginseng aqueous extracts. Toxicology, 172(2), 149-56.

95. Kim Y.S., Hahn E.J., Murthy H.N., Paek K.Y. (2004) Adventitious root growth and ginsenoside accumulation in Panax ginseng cultures as affected by methyl jasmonate. Biotechnol Lett., 26, 1619-1622

96. Kenarova В., Neychev H., Hadjiivanova C., Petkov V.D. (1990) Immunomodulating activity of ginsenoside Rgl from Panax ginseng. Jpn. J. Pharmacol., 54, 447-54.

97. Keum Y.S., Park K.K., Lee J.M., Chun K.S., Park J.H., Lee S.K., Kwon H., Surh Y.J. (2000) Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng. Cancer Lett., 150(1), 41-48.

98. Ко K.S., Noguchi H., Ebizuka Y., Sankawa U. (1989) Oligoside production by hairy root cultures transformed by Ri plasmids. Chem. Pharm. Bull., 37, 245-248.

99. Konoshima Т., Takasaki M., Tokuda M. (1996) Anti-tumor-promoting activities of the roots of Panax-notoginseng. Natural Medicines, 50(2), 158-162.

100. Konoshima T. (1999) Cancer chemo preventive activities of Panax notoginseng ., and ginsenoside Rgi. Stud. Plant. Sci., 6, 36-42.

101. Kubo M., Tani Т., Katsuki Т., Ishizaki K., Arichi S. (1980) Histochemistry, ginsenosides in ginseng {Panax ginseng C.A.Mey) root. J. of Natural Prodacts, 43(2), 278-284.

102. Kushiro Т., Ohno Y., Shibuya Y., Ebizuka Y. (1997) In vitro conversion of 2,3-oxidosqualene into dammarenediol by Panax ginseng microsomes. Biol. Pharm. Bull., 20, 292-294.

103. Kushiro Т., Shibuya M., Ebizuka Y. (1998) p-Amyrin synthase: cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the formation of the most popular triterpene among higher plants. Eur. J. Biochem., 256, 238-244.

104. Kutchan T.M., Ayabe S., Krueger R.J., Coscia E.M., Coscia C.J. (1983) Cytodifferentiation and alkaloid accumulation in cultured cells of Papaver bracteatum. Plant Cell Reports, 2, 281-284.

105. Kuzuyama Т. (2002) Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of isoprene units. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 1619-1627.

106. Langhansova L., Marsik P., Vanek T. (2005) Production of saponins from Panax ginseng suspension and adventitious root cultures. Biologia plantarum, 49(3), 463-465.

107. Li S.H., Chu Y. (1999) Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax notoginseng. Acta Pharmacol. Sin., 20, 551-554.

108. Lim W., Mudge K.W., Vermeylen F. (2005) Effects of population, age, and cultivation methods on ginsenoside content of wild American Ginseng (Panax quinquefolium). Agric. Food Chem., 53 (22), 8498 -8505.

109. Liu S., Zhong J.J. (1997). Simultaneous production of ginseng saponin and polysaccharide by suspension cultures of Panax ginseng: Nitrogen effects. Enzyme and Microbial Technology, 21(7), 518-524.

110. Liu S., Zhong J.J. (1998) Phosphate effect on production of ginseng saponin and polysaccharide by cell suspension cultures of Panax ginseng and Panax quinquefolium. Process Biochem., 33, 69-74.

111. Liu K., Xu S.X., Che C.T. (2000) Antiproliferative effect of ginseng saponins on human prostate cancer cell line. Life Sci., 67, 1297-1306.

112. Liu K.Z., Li J.B., Lu H.L., Wen J.K., Han M. (2004) Effects of Astragalus and saponins of Panax notoginseng on MMP-9 in patients with type 2 diabetic macroangiopathy. Chin. J. Chin. Mater. Med., 29, 264-266.

113. Lee F. C. (1992) Facts about Ginseng. The elixir of life. Elizabeth, New Jersey: Hollyn International Corporation, 104. pp.

114. Lee M.H., Jeong J.H., Seo J.W., Shin C.G., Ют Y.S., In J.G., Yang D.C., Yi J.S., Choi Y.E. (2004) Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalene synthase gene. Plant Cell Physiol., 45, 976-984.

115. Lu M.B., Wong H.L., Teng W.L. (2001) Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of P. ginseng. Plant cell report, 20, 674-677.

116. Mallol A., Cusidor R.M., Palazon J., Bonfill M., Morales C., Pino M.T. (2001) Ginsenoside production in different phenotypes of Panax ginseng transformed roots. Phytochemistry, 57, 365-371.

117. Mannonen L., Toivonen L., Kauppinen V. (1990). Effects of long-term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Catharanthus roseus cell cultures. Plant Cell Reports, 9(4), 173-177.

118. Mathur A., Shukla Y.N., Paul M., Ahuja P.S., Uniyal G.C. (1994). Saponin production in callus and cell suspension cultures of Panax quinquefolium. Phytochemistry Oxford, 35(5), 1221-1225.

119. Mazza G., Cottrell A.C., Gao L. (1996) Ginsenosides in roots and leaves of American ginseng. J. Agric. Food. Chem., 44, 717-720.

120. Melaragno J.E., Mehrotra В., Coleman A.W. (1993) Relationship between Endopolyploidy and Cell Size in Epidermal Tissue of Arabidopsis. Plant Cell., 5, 1661-1668.

121. Morita Т., Kasai R., Tanaka O., Yang T.R, Shou J. (1982) Saponins of Zu-Tziseng, rhizomes of Panax japonicus C.A. Meyer, var. major Burk, C.Y. Wu et K.M. Feng, collected in Yunnan, China. Chem. Pharm. Bull., 30(12), 4341-4346.

122. Morita Т., Tanaka О., Kohda H. (1985) Saponin composition of rhizomes of Panax japonicus collected in South Kyushu, Japan, and its significance in oriental traditional medicine. Chem. Pharm. Bull., 33(9), 3852-3858.

123. Muhlbach H.P. (1998) Use of plant cell cultures in biotechnology. Biothechnol. Annu. Rev., 4, 113-176.

124. Murashige Т., Skoog F.A. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 473-497.

125. Nagai M., Tanaka O., Shibata S. (1971) Chemical studies on the oriental plant drugs XXVI.Saponins and sapogenins of Ginseng. The absolute configuration of cinenic acid and panaxadiol. Chem. Pharm. Bull., 19 (11), 2349-2353.

126. Odashima S., Ohta Т., Kohno H., Matsuda Т., Kitagawa I., Abe H., Arichi S. (1985) Control of phenotypic expression of cultured В16 melanoma cells by plant glycosides. Cancer Res., 45, 2781-2784.

127. Odnevall A., Bjork L., Berglund T. (1989) Rapid establishment of tissue cultures from seeds of Panax ginseng and Panax pseudoginseng. Biochem. Physiol. Pflazen, 185 (1/2), 131-134.

128. Odnevall A., Bjork L. (1989a) Effects of light on growth, morphogenesis and ginsenoside formation in tissue cultures of Panax ginseng. Biochem. Physiol. Pflanzen, 185 (3/4), 253-259.

129. Odnevall A., Bjork L. (1989b) Differentiated tissue cultures of Panax ginseng and their responses to various carbon sources. Biochem. Physiol. Pflansen, 185 (5/6), 403—413.

130. Pichersky E., Gang D.R. (2000) Genetics and biochemistry of secondary metabolism in plants: an evolutionary perspective. Trend plant scince, 5(10), 439-445.

131. Saito A., Lee Y., Takagi K., Shibata S., Shoji J., • Kondo N. (1977) Pharmacological studies of Panax japonicus rhizoma. Chem. Pharm. Bull., 25 (5), 1017- 1020.

132. Samukawa K., Yamashita H., Matsuda H., Kubo M. (1995) Simultaneous analysis of ginsenosides of varios ginseng radix by HPLC. Chem. Pharm. Bull., 43 (1), 137-141.

133. Schnedl W., Roscher U., van der Ploeg M., Dann O. (1977) Cytofluorometric analysis of nuclei and chromosomes by DIPI staining. Cytobiologie, 15, 357-362.

134. Shibata S., Tanaka O., Nagai M., Ishii T. (1962) The stereochemistry of Panaxadiol. Tetrahedron Lett., 26, 1239-1242.

135. Shibata S., Tanaka O., Sado M., Tsushima S. (1963a) On genuine sapogenin of ginseng. Tetrahedron Lett., 12, 795-800.

136. Shibata S., Fujita M., Itokawa H., Tanaka O., Ishii T. (1963b) Studies on the contituents of japanese and chiness crude drugs XI.Panaxadiol, a sapogenin of ginseng roots (1). Chem. Pharm. Bull., 11(6), 759-761.

137. Shibata S., Tanaka O., Soma K., Iida Y., Ando Т., Nakamura H. (1965) The structure ofpanaxatriol. Tetrahedron Lett., 3, 207-213.

138. Shibata S., Tanaka O., Ando Т., Sado M., Tsushima S., Ohosawa T. (1966) Protopanaxadiol, a genuine sapogenin of ginseng saponins. Chem. Pharm. Bull., 14(6), 595-600.

139. Shibata S. (2001) Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and somerelated triterpenoid compounds. J. Kor. Med. Sci., 16, 28-37.

140. Shibuya M., Hoshino M., Katsube Y., Hayashi H., Kushiro Т., Ebizuka Y. (2006) Identification of beta-amyrin and sophoradiol 24-hydroxylase by expressed sequence tag mining and functional expression assay. FEBS J., 273, 948-959.

141. Sivakumar G., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2005) Optimization .of organic nutriens for ginseng hairy roots production in large — scale bioreactors. Current science, 89 (4), 641-649.

142. Smith R.G., Caswell D., Carriere A., Zielke B. (1996) Variation in the ginsenoside content of American ginseng, Panax quinquefolius L., roots. Can. J. Bot., 74(10), 1616-1620.

143. Soldati F., Sticher O. (1980) HPLC separation and quantitative determination of ginsenosides from Panax ginseng, Panax quinquefolium and from ginseng drug preparation. 1-nd commun. Planta medica, 38(3), 348-357.

144. Sollorz G. (1985) Qualitatsbeurteilung von Ginsengwurzeln. Dtsch. Apoth. Ztg., 125, 2052-2055.

145. Sonnenborn U., Proppert Y. Ginseng {Panax ginseng C.A. Meyer). (1991) Br. J. Phytother., 2, 3-14.

146. Sugimoto-Shirasu K., Roberts K. (2003) "Big It Up": Endoreduplication and Cell-Size Control in Plants. Curr. Opin. Plant Biol., 6, 544-553.

147. Tanaka О., Nagai M., Shibata S. (1966) Chemical studies on the oriental plant drugs. The steriochemistry of protopanaxadiol, a genuine sapogenin of ginseng. Chem. Pharm. Bull., 14(10), 1150-1156.

148. Tanaka O., Nagai M., Ohsawa Т., Tanaka N., Shibata S. (1967) Stereochemistry of protopanaxadiol: acid catalysed epimerization of C-20 -hydroxyl of betulafolientriol, protopanaxadiol and their derivatives. Tetrahedron Lett., 5, 391-396.

149. Tanaka O., Kasai R. (1984) Saponins of ginseng and related plants. In: Herz, W., Grisebach, H., Kirby, G.W., Tamm, Ch. (Eds.), Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, 46, Springer-Verlag, Berlin, pp. 1-76.

150. Tanaka O. (1990) Recent studies on glycosides from plant drugs of Himalaya and f South-Western China chemogeographical correlation of Panax species. Pureand applied chemistry, 62 (7), 1281-1284.

151. Tansakul P., Shibuya M., Kushiro Т., Ebizuka Y. (2006) Dammarenediol-II synthase, the first dedicated enzyme for ginsenoside biosynthesis, in Panax ginseng. FEBS Letters, 580, 5143-5149.

152. Tohda C., Matsumoto N., Zou K., Meselhy M.R., Komatsu K. (2004). Ab (25-35)-induced memory impairment, axonal atrophy, and synaptic loss are ameliorated by Ml, A metabolite of protopanaxadiol-type saponins. Neuropsychopharmacology, 29, 860-868.

153. Wang Z., Zhong-jan J., Zhu Zi-ging, Yang Chong-ren, Zhou J., Kasai R., Tanaka O. (1985) The triterpenoid saponins of rhizomes of Panax japonicus C.A.Mey var.anqustifolius (Burk.). Acta Botanica sinica, 27(6), 618-624.

154. Wang W., Zhang Z.Y., Zhong J.J. (2005) Enhancement of ginsenoside biosynthesis in high-density cultivation of Panax notoginseng cells by various strategies of methyl jasmonate elicitation. Appl. Microbiol. BiotechnoL, 67, 752-758.

155. White C.M., Fan C., Song J., Tsikouris J.P., Chow M. (2001) An evaluation of the haemostatic effects of hydrophilic, alcohol, and lipophilic extracts of P. notoginseng. Pharmacotherapy, 21, 773-777.

156. Wen J., Zimmer E.A. (1996) Phylogeny and biogeography of Panax L. (the ginseng genus, Araliaceae): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Mol. Phylogenet. Evol., 6, 167-177.

157. Wu J., Zhong J-J. (1999) Production of ginseng and its bioactive components in plant cell culture: Current technological and applied aspects. Journal of Biotechnology, 68, 89-99.

158. Xie J.T., Mehendale S., Yuan C.S. (2005) Ginseng and Diabetes. The-American Journal of Chinese Medicine, 33(3), 397 404.

159. Yahara S., Kasai R., Tanaka O. (1977) New dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A.Meyer (1), chikusetsusaponins -L 45 0,-L 49a 0 and -L 410 0. Chem. Pharm. Bull., 25(8), 2041-2047.

160. Yahara S., Tanaka O., Nishioka I. (1978) Dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A. Meyer. Saponins of the specimens collected in Tottori-ken, Kyoto-shi andNiigata-ken. Chem. Pharm. Bull., 26(10), 3010-3021.

161. Yamahara J., Kubomura Y., Miki K., Fujimura H. (1987) Anti-ulcer action of Panax japonicus rhizome. J. Ethnopharmacol., 19, 95-101.

162. Yamaguchi H., Matsuura H., Kasai R., Tanaka O., Satake M., Kohda H., Izumi H., Nuno M., Katsuki S., Isoda S., Shoji J., Goto K. (1988) Analysis of saponins of wild Panax ginseng. Chem. Pharm. Bull., 36(10), 4177-4181.

163. Yang D.-C., Choi K.T., Yang D.-C. (1991) Patterns of soluble proteiru reducing sugar and ginsenosides in transformed calli of ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer). Korean J. Ginseng Sci., 15, 124-130.

164. Yang D.C., Yang K.J. (2000) Pattern and contents of ginsenoside in normal root parts and hairy root lines of Panax ginseng C.A. Meyer. Kor. J. Plant Tis-^ue Cult., 27, 485-489.

165. Yokozawa Т., Yasui Т., Oura H. (2004) Stimulation of RNA polymerase activity by ginsenoside-Rb2 in diabetic rats. Phytotherapy Research, 7(3), 240 -243.

166. Yoshikawa Т., Furuya T. (1987) Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Rep., 6, -449-453.

167. Yu K.W., Gao W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2002) Jasmonic acid improves ginsenoside accumulation in adventitious root culture of Panax ginseng C.A. Meyer. Biochemical Engineering Journal, 11 (2-3), 211-215.

168. Yu K.W., Murthy H.N., Hahn E.-J., Paek K.-Y. (2005) Ginsenosides production by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality. Biochemical Engineering Journal, 23, 53-56.

169. Yun Т.К., Lee Y.S., Lee Y.H., Ют S.I., Yun H.Y. (2001) Anticarcinogenic effect of Panax ginseng C.A. Meyer and identification of active compounds. J. Korean Med. Sci., 16, 6-18.

170. Zhang Y.H., Zhong J.J., Yu J.T. (1996b) Effect of nitrogen source on cell growth and production of ginseng saponin and polysaccharide in suspension cultures Panax notoginseng. Biotechnol. Prog., 12, 567-571.

171. Zhang Y.H., Zhong J.J., Yu J.Y. (1996c) Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng manipulation of medium sucrose. J. of Biotechnology, 51 (1), 49-56.

172. Zhang Y.H., Zhong J.J. (1997) Hyperproduction of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation of Panax notoginseng cells. Enzyme Microb. Technol., 21, 59-63.

173. Zhong J.J., Zhu Q.X. (1995) Effect of initial phosphate concentration on cell growth and ginsenoside saponin production by suspended cultures of Panax notoginseng. Applied biochemistry and biotechnology, 55 (3), 241-247.

174. Zhong J. J., Bai Y., Wang S.J. (1996) Effects of plant growth regulators on cell-growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. J. Biotechnol., 45, 227-234.

175. Zhong J.J., Wang D.J. (1996a). Improvement of cell growth and production of ginseng saponin and polysaccharide in suspension cultures of Panax notoginseng: Cu2+ effect. J. Biotechnol., 46, 69-72.

176. Zhong J.J., Wang S.J. (1996b) Effects of nitrogen source on the production of ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of Panax quinquefolium. Process Biochemistry, 33, 671-675.

177. Zhou J., Huang W.K., Wu M.Z., Yang C.R., Feng K.M., Wu Z.Y. (1975) Triterpenoids from Panax Linn, and their relationship with taxonomy and geographical distribution. Acta Phytotaxon Sin., 13,29-45.

178. Zhu S., Zou K., Fushimi H., Cai S., Komatsu K. (2004) Comparative study on triterpene saponins of ginseng drugs. Planta Med., 70,666-677.