Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые способы регуляции биосинтетической функции клеток женьшеня в культуре IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Некоторые способы регуляции биосинтетической функции клеток женьшеня в культуре IN VITRO"

Гч

«Т.

х S

^ .На правах рукописи

сг

0 ? «

1

ХОДАКОВСКАЯ МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

НЕКОТОРЫЕ СПОСОБЫ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ КЛЕТОК ЖЕНЬШЕНЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандитата биологических наук

Владивосток - 1997 г.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения РАН

Научные руководители - член- корреспондент РАН,

профессор Ю.Н. Журавлёв, доктор биологических наук В.П. Булгаков

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор В.А. Кунах кандидат биологических наук, С.А. Федореев

Ведущее учреждение: Государственный научный центр по

вирусологии и биотехнологии "Вектор", НИИ Культур клеток

Зашита диссертации состоится ш-о-НА- 199_? года в

часов на заседании диссертационного совета К ^003.97.01 по физиологии растений в Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан "/£_" иАОЛ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Л.А. Варфоломеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск путей регуляции биосинтетической функции клеток женьшеня Panax ginseng С. А. Меу. в культуре in vitro является актуальной задачей как с точки зрения понимания процессов синтеза вторичных соединений, так и для практических целей. Получение клеточных штаммов, синтезирующих набор основных вторичных метаболитов в количествах и соотношениях, близких к на-тивному растению, позволяет решить проблему ограниченности природных ресурсов женьшеня.

В работе рассмотрены различные методы регуляции биосинтетической функции клеток женьшеня в культуре ткани и дана сравнительная оценка их эффективности. Основное внимание уделено новому и перспективному методу регуляции синтеза вторичных метаболитов -агробактериальной трансформации. Метод позволяет преодолеть одно из основных затруднений при использовании клеток растений в качестве продуцентов вторичных метаболитов, которое ярко выражено у клеточных культур женьшеня - нестабильность синтеза целевых веществ и снижение биосинтетической активности клеток при их продолжительном культивировании.

Цель работы заключалась в исследовании факторов и условий, обеспечивающих стабильный и высокий уровень синтеза гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня. Поставленная цель достигалась посредством изучения свойств интактных и трансформированных клеточных культур.

Задачи исследования:

1. Изучить условия и факторы, обеспечивающие стабильный синтез гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня.

2. Выявить наиболее эффективные способы регуляции биосинтетической функции клеток женьшеня и скорости их роста в условиях культуры in vitro.

3. Получить длительно пассируемые трансгенные культуры женьшеня.

4. Изучить влияние отдельных онкогенов из состава Т-ДНК Ag-robacterium rhizogenes на синтез гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня.

з

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение эффективности различных путей регуляции синтеза гинзенозидов. Разработана схема комбинированной регуляции синтеза гинзенозидов путем изменения условий культивирования и состава сред в сочетании с генетической трансформацией.

Впервые получены трансгенные культуры женьшеня, содержащие ген rolB. Впервые отмечено, что ген го 1С способен индуцировать образование стеблей в культуре клеток in vitro.

Изучено содержание гинзенозидов в клетках женьшеня, содержащих индивидуальные онкогены из Agrobacterium rhizogenes; дана сравнительная характеристика продуктивности ряда линий в течение долговременного культивирования.

Практическая ценность работы. Получены высокопродуктивные культуры женьшеня, обладающие способностью к стабильному синтезу целевых веществ в течение продолжительного культивирования. Показано, что состав и соотношения гинзенозидов в этих культурах приближены к показателям природных корней, что делает полученные культуры перспективным источником, для выработки лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XV Международном ботаническом конгрессе (Токио, . 1993), 45-й Арктической международной научной конференции (Владивосток-Анкоридж, 1994), Второй Российской конференции "Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока" (Красноярск, 1996), конференции молодых ученых, посвященной 35-летию БПИ (Владивосток, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, изложения полученных экспериментальных данных и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит .t3 таблицы и Л& рисунков. В списке литературы работ, из них38 отечественных и ¿¿¿зарубежных авторов.

Принятые сокращения и обозначения.

а-НУК - а-нафтилуксусная кислота; ПУК - индолилуксусная кислота; ИМК - индолилмасляная кислота; 4-СРА - 4-хлорфеноксиуксус-ная кислота; 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусиая кислота; 2,4,5-Т -трихорфеноксиуксусная кислота; МВК - мевалоновая кислота.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили каллусные линии женьшеня, полученные в 1988-89 году из корней дикорастущего женьшеня, собранных в Чугуевском и Уссурийском районах Приморского края, а также из семян различных сортов и популяций женьшеня, полученных с Приморской зональной опытной станции НПО "ВИЛАР".

Агробактерии Agrobacterium tumefaciens, штамм С58, получены в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Agrobacterium rhizogenes A4 и 15834 в Институте физиологии растений РАН. A. tumefaciens 6V3101 (PMP90RK), Е. coli Tg2 - в Филиале института биоорганической химии РАН.

Образцы плазмидной ДНК pPCV002, pPCV002-rolC-35S, pPCV002-rolB-35S и pPCV002-rolA получены из Института Макса Планка (ФРГ).

Методы культуры ткани

Каллусы культивировали на среде, содержащей солевые компоненты по прописи Мурасиге и Скуга (Murashige and Skoog, 1962) с модификацией, заключающейся в уменьшении содержания нитрата аммония до 400 мг/л и дополнительном введении в состав среды следующих компонентов, мг/л: тиамина гидрохлорида 0,2, пиридоксина гидрохлорида 0,5, никотиновой кислоты 0,5, мезо-инозита 100, пептона P/CLB 100, сахарозы 25000-30000, агара 6000, а также различных фитогормонов. pH сред до автоклавирования составляла 5,6-5,8.

Каллусы выращивали в пробирках 200 х 20 мм, содержащих 20 мл питательной среды, либо в колбах Эрленмейера объемом 100 мл (30 мл среды), 250 мл (60 мл среды) в основном в темноте, при температуре 25° С и относительной влажности воздуха 50-70%. Если каллусы выращивали в условиях освещения, то использовали фотопериод: 16 ч день/8 ч ночь, 2500 лк.

Суспензионные культуры выращивали на орбитных или стационарных встряхивателях. Скорость вращения составляла 60-100 об/мин, амплитуда 20-30 мм.

Продолжительность выращивания для каллусных культур составляла 30 суток, для суспензионных культур 14 сут. Корни выращивали обычно в течение 21 сут. Масса инокулюма, если не указано иначе, была 90-100 мг. Ростовые характеристики представлены как средние значения из 10-20 повторностей. Ошибки рассчитаны как среднеквад-ратические ошибки среднего арифметического. Достоверность полу-

ценных результатов оценивалась с помощью критерия Стьюдента.

Трансформация культуры 1с бинарными векторами, содержащими онкогены. Активно растущую суспензионную культуру 1с, взятую в логарифмической фазе роста, отстаивали в стерильной пробирке в течение 5 мин. Крупные агрегаты отбрасывали, а взвесь клеток использовали для трансформации. Наливали мелкоагрегированную суспензию в чашки Петри и выращивали при 110 об/мин до появления видимых агрегатов. Бактерии переносили в пробирки с жидкой средой LB и выращивали в течение ночи. Для трансформации использовали суспензию бактерий, разведенную в жидкой среде W4CPA. Помещали чашки с клетками и бактериями на встряхиватель на трое суток при 24°, затем добавляли цефотаксим до концентрации 250 мг/л. Через неделю в эти же чашки добавили канамицин до концентрации 50 мг/л. Культивировали так до появления агрегатов 2-3 мм в диаметре, затем агрегаты перенесли в чашки Петри с агаризованной средой W4CPA. содержащей канамицин в дозе 100 мг/л. Трансформированные каллусы и регенирированные из них корни первые шесть месяцев выращивали на среде с канамицином. Контрольная ткань (1с) в присутствии канамицина прекращала рост в первом пассаже и погибала в течение 2-3 пассажа.

Выделение и анализ ДНК

Плазмидную ДНК из Е. coll выделяли методом щелочного лизиса (Дрейпер и др., 1991), а также методом Клейна (Бергквист и др., 1990). Тотальные препараты нуклеиновых кислот из агробактерий получали при помощи саркозила и проназы (Дрейпер и др., 1991). ДНК из растительных клеток и каллусов выделяли либо при помощи SDS, либо протеиназы К (Дрейпер и др., 1991).

Мечение зондов. Использовали реакцию ник-трансляции для ме-чения зонда сс-СТР (32Р), либо а-АТР (33Р) с помощью набора "Pro-mega" Nick Translation System, либо использовали праймерную реакцию (Prime-a-gene Labeling System, "Promega"), в соответствии с рекомендациями фирм.

Перенос ДНК на фильтры и гибридизация по Саузерну проводилась в соответствии с методикой, описанной в лабораторном руководстве (Маниатис и др., 1984).

Химический анализ вторичных метаболитов

Выделение суммарной гликозидной фракции. Один грамм измельченной лиофильно высушенной ткани экстрагировали трижды 85% вод-

ным метанолом при перемешивании. Объединенный раствор упаривали досуха при 50° на роторном испарителе. Остаток после испарения экстрагировали пентаном (5 мл х 2) и насыщенным водой н-бутанолом (5 мл х 3). Промытый 5 мл воды бутанольный экстракт при тех же условиях упаривали до сухого остатка, который и составил суммарную гликозидную фракцию (СГФ).

Количественное определение суммы гинзенозидов методом спект-рофотометрии. К полученной СГФ добавляли 0,5 мл этанола, 0,5 мл 8%-ного раствора ванилина в этаноле, охлаждали и прибавляли 5 мл 72%-ного раствора серной кислоты. Смесь нагревали при температуре 60° С в течение 10 мин и после охлаждения измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 544 нм против контрольного раствора. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора хлористого кобальта против 0,02 М раствора хлористоводородной кислоты. Содержание суммы гликозидов в вычисляли по формуле, предложенной Глебко с соавт. (Глебко и др.,1991)

Анализ ВЗЖХ. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии анализировали раствор СГФ концентрацией 10-30 мг/мл. Разделение проводили на хроматографе "Милихром" (НПО "Научприбор, г. Орел) со стальной колонкой 64x2 мм, заполненной сорбентом Сепарон Cíe . На колонку наносили 10-15 мкл раствора СГФ. Элюцию осуществляли градиентом смеси ацетонитрил - вода в соотношени от 20:80 до 60:40 объемных процентов. Детектирование элюата осуществляли при 204 нм. Время разделения составляло 20 мин при скорости подачи растворителя 100 мкл/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности биосинтеза гинзенозидов в каллусиых культурах

женьшеня

В работе использовано 19 каллусных линий женьшеня, полученных в 1988-89 году (Булгаков и др., 1991) из различных органов растений женьшеня. Часть из этих линий была получена в результате трансформации стеблевых клеток женьшеня дикими штаммами Agrobac-terium rhizogenes и Agrobacterium tumefaclens. Установлено, что количество гинзенозидов в каллусах, происходящих от различных органов растения, варьирует в широких пределах, при этом преоблада-

ния гинзенозидов в каком-либо типе ткани не отмечено.

Все культуры продуцируют гликозиды ИЬ- и Ид-групп. В каллусах преобладают три гинзенозида - , Ие, ИЬа. Гликозиды ИГ, Ргг. N(3^, Иэг, содержатся в меньших количествах, а в от-

дельных линиях некоторые из них отсутствуют. Соотношения гинзенозидов в каллусах отличаются от соотношений этих веществ в корнях женьшеня. Так, доля Сб-гсг гинзенозидов в клеточных культурах увеличена, а доля гинзенозидов Из-группы - понижена.

Гинзенозиды синтезируются в близких пропорциях во всех каллусах, вне зависимости от сорта, популяции или органа растений женьшеня, из которого были получены каллусы.

В течение двухлетнего периода наблюдений линия 1с, полученная из побегов женьшеня сорта Мимаки, имела стабильные и высокие биосинтетические показатели при высокой скорости роста. Каллусы линии 1с продуцирует гинзенозиды в количествах, сравнимых с плантационными корнями женьшеня (табл. 1).

Таблица 1

Содержание гинзенозидов в образцах культуры 1с и природного корня.

NN образцов Содержание гинзенозидов, мг/ сухой массы

Rgi Re Rf NG-Ri Rg2 Rbi Rc Rb2 Rd сумма

Штамм 1 2,6 3,6 0,25 0,22 0,5 0,55 0,15 0,06 0,И 8,04 lc 2 1,9 3,2 0,31 0,25 0,45 0,56 0,09 0,22 0,15 7,13

3 2,9 4,2 0,26 0,12 0,55 0,78 0,12 0,12 0,21 9,26

Плантационные 1 0,6 1,9 0,21 0,19 - 2,01 1,58 1,35 0,56 8,47 корни 2 1,4 1,2 0,52 - - 1,82 1,2 0,7 0,3 7,10 женьшеня

Клеточная линия 1с был выбрана нами для изучения регуляции биосинтетической функции клеток женьшеня в культуре In vitro.

Регуляция ростовых и продукционных характеристик клеточных культур женьшеня путем изменения условий культивирования, состава сред и селекции

Экзогенные фитогормоны как важный регулирующий фактор биосинтетической функции клеток женьшеня.

Среди многообразных факторов, влияющих на способность клеточных культур растений синтезировать вторичные метаболиты, важная роль принадлежит фитогормонам. Установлено, что многие широко используемые регуляторы роста либо препятствуют синтезу гинзено-зидов в каллусах женьшеня, либо не поддерживают рост ткани. Все испытанные культуры каллусов женьшеня цитокинин-независимы при использовании в качестве регулятора роста призводных феноксиук-сусной кислоты (табл. 2).

Найден оптимальный для культур женьшеня регулятор роста -4-хлорфеноксиуксусная кислота, которая обеспечивает максимальный выход гинзенозидов в расчете на культуральный сосуд.

Таблица 2

Влияние ауксинов на накопление биомассы и гинзенозидов каллусами женьшеня

Ауксин и его кон- Масса каллусов, мг Содержание гинзе-центрация (мг/л) нозидов, мг

сырых сухих в 1 г в одном куль-

сухой туральном биомассы сосуде

1 2 3 4 5

Отсутствие фито-гормонов (контроль) 205 + 13 14 1.5 0,02

а-нафтилуксусная кислота (2) 440 + 50 31 7,2 0,22

4-хлорфенокси-уксусная кислота (0,4) 1060 + 80 71 5,35 0.38

продолжение табл. 2

{__2_3__4__5_

2,4-дихлорфе- 1280 ± 110 79 3,20 0,25

ноксиуксусная

кислота (0,4)

2,4,5-трихлор- 1680 ± 80 96 0,35 0,03

феноксиуксуснач

кислота (0,4)

2-метил-4-хлор- 1370 ± 170 71 1,30 0,09

феноксиуксусная

кислота (0,4)

Влияние метаболитов изопреноидного пути на ростовые и продукционные характеристики клеточных культур женьшеня.

Регуляция синтеза вторичных соединений предшественниками целевого продукта является эффективным способом улучшения продукционных характеристик клеточных культур.

Изучали влияние метаболитов изопреноидного пути - мевалоно-вой кислоты, фарнезола и сквалена на синтез гинзенозидов. При внесении предшественников в начале пассажа, мевалоновая кислота не активировала синтез гинзенозидов, фарнезол увеличивал синтез на 45-120 сквален на 20-60 в зависимости от используемой дозы (рис. 1).

Существенная прибавка в содержании гинзенозидов может достигаться за счет увеличения скорости роста культуры (рис. 1а,б).

Содержание гинзенозидов под воздействием МВК в отдельном опыте удалось увеличить на 30-36 %. при внесении этого вещества в культуры, находящиеся на стадии логарифмического роста.

Однако, эффект активации синтеза гинзенозидов под влиянием предшественников не воспроизводился в каждом опыте, т.е. не являлся стабильным. Так, в серии опытов, проведенных в течение шести последовательных пассажей, предшественники активировали синтез

Масса каллусов, г Гинзенозиды, иг/г сух. веса

Концентрация фарнезола. М

В Сьгра« бноыагса Г\\\\< Гннэе ноэиди

Масса каллусоа, г Гинзенозиды, иг/г сух. 8еса

Рис. 1. Зависимость ростовых и биосинтетических характеристик каллусов женьшеня 1с от различных концентраций МВК (а), фарнезола (б) и сквалена (в). * - Показатели в опыте достоверно отличаются от контроля (Р < 0,05).

гинзенозидов лишь в половине опытов. Можно предположить, что причиной этого являются различия в физиологическом состоянии клеток.

Получение и характеристика устойчивых к цефазолину клеток женьшеня.

Новая возможность увеличения продуктивности клеток была показана при получении устойчивых к антибиотику цефалоспоринового ряда (цефазолину) клеток женьшеня. Содержание гинзенозидов увеличилось в устойчивой к цефазолину линии (1сСерЬ) в 2,3 раза по сравнению с исходной культурой. Способность селекционной линии к повышенному синтезу гинзенозидов сохранялась в течении долговременного культивирования (рис. 2).

'Содержание гинзенозидов, X от сукой массы

2.00 -1

0.00 .......... I I I . I I I I I I I , I I , I . I I I

14 18 22 26 Пассажи

Рис. 2. Содержание гинзенозидов 1^1, Ие и в культурах 1с (1) и 1сСерЬ (2) в течение 10 пассажей (сентябрь 1992 - июнь 1993 г.), % от сухой массы клеток.

Однако, устойчивая к цефазолину культура клеток по скорости роста стабильно уступает исходной. Так в 18-м, 22-м и 23-м пассажах прирост сырой биомассы составил 56 %, 62 %, и 72 % от прироста каллусов линии 1с.

Биосинтез гинзенозидов каллусами женьшеня в условиях

освещения

Выращивание каллусов в условиях освещения приводит к активации биосинтеза гинзенозидов. При культивированиии каллусов в условиях освещения суммарное содержание гинзенозидов возрастает в среднем на 46% по сравнению с культурами, выращиваемыми в темноте. Удалось подобрать такой режим культивирования каллусов, при котором увеличение синтеза гинзенозидов не сопровождается угнетением роста культуры (выращивание культуры в течение 3 недель при отсутствии освещения и 2 недель - в условиях фотопериода). При длительном выращивании на свету каллусы становятся более твердыми, что препятствовало использования светового режима в промышленных условиях.

Таким образом, рассмотренные в данной главе способы регуляции биосинтеза вторичных соединений, связанные с оптимизацией питательной среды и условий культивирования, достаточно эффективны для обеспечения высокой продуктивности клеточных культур женьшеня.

Следует отметить, что все использованные нами на этом этапе способы регуляции биосинтеза гинзенозидов имеют ряд ограничений. К их числу можно отнести: нестабильность стимулирующего эффекта метаболитов изопреноидного пути, снижение скорости роста цефазо-лин-устойчивых клеточных культур, изменение морфологических характеристик каллусов, выращиваемых на свету. Кроме того, в кал-лусных культурах женьшеня распределение гинзенозидов отличается от их распределения в природных корнях. Описанными способами изменить такое соотношение в каллусах женьшеня нам не удалось.

Качественно новые результаты были получены при использовании метода генетической трансформации. Этот метод позволил, не снижая скорости роста, существенно повысить уровень биосинтеза гинзенозидов и приблизить их соотношения до соотношений, наблюдаемых в природных корнях женьшеня.

Ниже описано получение трансгенных культур женьшеня, содержащих индивидуальные гены rol и приведены их характеристики.

Морфологические и продукционные особенности трансформированных клеточных культур женьшеня

Агробактериальная трансформация женьшеня: интеграция Т-ДНК PRÍA4 и отдельных генов из состава TL-pRl А4 ДНК.

В опытах использовали бактерии Agrobacterium tumefaciens GV3101, содержащие индивидуальные гены rolA, rolB, rolC, а также бактерии A. rhlzogenes А4, содержащие плазмиду дикого типа. На рис. 3 представлена схема локализации генов rol в составе плазми-ды дикого типа pRiA4.

pRi А4

TL TR

rolA rolC

ORF —---_ auxl.

rolB aux2 age

2 kb

Рис. 3. Локализация генов го1 в составе плазмиды дикого типа р/?2 А4 Agrobacteгium rhizogenes (Брела а1., 1982).

Для трансформации был использован каллусный штамм женьшеня 1с, который являтся наиболее активным и стабильным продуцентом гинзенозидов из всех исследованных. На этом этапе работы опытным путем были подобраны условия трансформации для каждого гена и плазмиды дикого типа (табл. 3).

Важными факторами трансформации оказались: соотношение клеток и бактерий, время их совместного кокультивирования, температура. Установлено, что интесивность роста полученных клеточных агрегатов различна и зависит от используемого гена.

В результате были получены каллусы, способные расти на среде, содержащей 100 мг/л канамицина. Исходная культура 1с прекращала рост при концентрации канамицина 50 мг/л и погибала в тече-

Таблица 3

Оптимальные параметры трансформации каллусов женьшеня (штамм 1с) рекомбинантными онкогенами ТЬ-рМ ДНК и плазмидой А4

Ген Соотно- Время кокульти- Время прошедшее Рост

или шение вирования клеток от трансформации клеточных

плаз- бактерий с агробактериями до появления кл. агрегатов

мида и клеток ( сутки) агрегатов (сутки)

A4 1:10 7 30 ++

rolABC 1:20 5 97 +

rolA 1:10 5 135 +

rolB 1:10 5 72 +++

rolC 1:20 2 118 +++

Примечание: - очень слабый рост + слабый рост ++ умеренный рост +++ интенсивный рост

ние 2-3 пассажей. От разных трансформационных событий получено 2 линии го1В-каллусов, 4 линии го1С-каллусов (rolC-I; rolC-II; rolC-III; role-IV) и каллусы, содержащие плазмиду дикого типа (линия 1с-А4). Каллусы rolA и rolABC оставались жизнеспособными в присутствии канамицина в течении 12 пассажей. Однако, эти каллусы росли очень медленно, поэтому не удалось получить на их основе соответствующие трансгенные линии.

Индукция необычных фенотипических эффектов в клеточных культурах женьшеня под влиянием гена role.

Через 2 месяца после трансформации в каллусах 1с-А4 и rolC наблюдали формирование корней, чего не отмечалось в нетрансформи-

рованных клеточных культурах. В дальнейшем из образовавшихся корней была получен культура hairy roots (1с-А4) и 4 культуры го1С-корней (rolC-1, rolC-II, rolC-III и rolC-IV).

В культурах го1С-корней наблюдалось вторичное каллусообразо-вание. Посредством отбора дедифференцированных агрегатов была получена трансгенная суспензионная культура (rolC-II сусп.).

Примерно через год после получения первых трансгенных корней женьшеня наблюдали закладку морфогенных зон в каллусной культуре rolC. Из этих зон удалось получить морфогенный каллус, который при культивировании на свету формировал обильные побеги, цветки и корни.

Таким образом, в результате интеграции гена rolC в ДНК каллусной культуры женьшеня штамма 1с, получены трансформированные канамицин-резистентные культуры корней и побегов женьшеня. Ризо-генный эффект гена rolC описан в литературе, а способность гена индуцировать образование стеблей показана впервые." Интересно, что в отличие от процесса неоплазии у млекопитающих, вызываемого онкогенами и приводящего к дедифференциации клеток, ген rolC вызвал увеличение степени дифференциации каллусных клеток женьшеня.

Содержание гинзенозидов в трансформированных и трансгенных кулътурах женьшеня.

Суммарное содержание гинзенозидов. С целью изучения влияния генов rol и плазмиды дикого типа на синтез гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня, определяли суммарное содержание гинзенозидов в полученных трансгенных культурах и в исходной культуре 1с. Ниже представлены результаты исследований за год наблюдений:

Каллусная культура 1с Корневая культура 1с-А4 Каллусы rolА

Каллусная культура rolB-II Корневая культура rolC-II

7,09 ± 0,53 13,00 ± 2,69 отсутствие гинзенозидов 1,23 ± 0,14 17,33 ± 1,96

Эти данные свидетельствуют, что интеграция в геном клеток женьшеня полной вставки Т-ДНК приводит к увеличению содержания гинзенозидов. В то же время, в го1А-каллусах женьшеня гинзенозиды

отсутствуют полностью, в культуре го1В содержание гинзенозидов понижено, а в культуре role увеличено по сравнению с исходной линией. Таким образом установлено, что отдельные гены из состава Т-ДНК агробактерий могут иметь влияние на синтез вторичных метаболитов. По-видимому, увеличение синтезов вторичных метаболитов в культурах hairy roots растений обусловлено геном role.

Синтез гинзенозидов в rolC-культурах жекьшеня.

Как было установлено до экспериментов по трансформации, основное отличие биосинтеза гинзенозидов в клетках штамма 1с от природного корня заключается в увеличенном образовании гликозидов группы протопанаксатриола (Re, Rgi, Rgz, Rf) по отношению к гли-козидам протопанаксадиола (Rbi, Rb2, Re, Rd). Такое соотношение гликозидов характерно для надземных частей женьшеня и представлялось естественным для штамма 1с, поскольку он происходит из клеток стеблевого происхождения. Ниже показано, как ген гоЮ модифицирует синтез гинзенозидов в трансгенных культурах.

Состав гинзенозидов. Установили, что трансгенные корни содержат те же гинзенозиды, которые были обнаружены ранее в каллусах штамма 1с и корнях женьшеня.

Полученные линии трансгенных корней, содержащих ген rolC, различаются по способности синтезировать гинзенозиды. Среди этих линий можно выделить более продуктивные (rolC-II, rolC-III) и менее продуктивные (rolC-I, rolC-IV). Различия стабильны в пассажах (рис. 4).

В литературе очень мало сведений о содержании вторичных метаболитов в нескольких параллельно выращиваемых трансгенных линиях. Различие в содержании гинзенозидов может указывать на различный уровень экспрессии rolC-тепа. в различных линиях. Ослабление экспрессии трансгенов связывают с позиционным эффектом, направ-леннным на ослабление экспрессии гена, т.е. такого положения Т-ДНК в растительной хромосоме, при котором активность промотора гена rolC угнетается регуляторными элементами клеток хозяина (Su-gaya et al., 1989).

■ШгоЮЧ ЩЗш1СН| СЗгоЮ-Ш Е22го1СНУ

Рис. 4. Содержание гинзенозидов в пассируемых культурах го1С-корней на протяжении одного года культивирования. По оси абсцисс - порядковый номер месяца По оси ординат - содержание гинзенозидов, мг/г сухой ткани

Трансгенные корни не уступали исходной культуре по накоплению сырой биомассы и превосходили ее по накоплению сухой биомассы (табл. 4).

Таблица 4

Ростовые характеристики каллусов 1с и корней го1С-П

Культура Биомасса в конце культурального периода

г/л среды

сырая сухая

1с 223 ± 32 9,1 ± 0,9

го1С-П-корни 214 ± 27 14,4 ± 1,7

Пропорции биосинтеза отдельных гинзенозидов. Промышленная ценность клеточных культур женьшеня зависит не только от их способности к активному и стабильному синтезу гинзенозидов, но и от пропорции индивидуальных гинзенозидов.

В сравнении с каллусной тканью 1с, соотношения гинзенозидов в трансгенных каллусах го1С-П существенно изменились. Так, доля гинзенозида Йэа увеличилась, а гинзенозидов 1^1, Ие и снизилась. В результате соотношение гинзенозидов в трансгенных корнях и корнях природных растений женьшеня стало похожим (рис. 5).

Однако следует отметить особенности в накоплении гинзенозидов в го1С-корнях. Во всех линиях трансгенных го1С-корней понижено удельное содержание гинзенозидов га>2 и 1?с, а гинзенозид синтезируется в значительно больших количествах, чем в природных корнях женьшеня. Анализ полученных результатов наводит на мысль, что специфический тип биосинтеза гинзенозидов в го1С-корнях обусловлен наложением двух типов биосинтеза - исходного, свойственного каллусам 1с и привнесенного геном, свойственного трансгенным каллусам.

Яд1

!Корни

Р1Ь2 Яс1

¡1с каллус СИ го 1С-I I каллу с ^^ го 1 С- I I корни

Рис. 5. Содержание отдельных гинзенозидов в культивируемых корнях женьшеня, культуре 1с, трансгенных каллусах го1С-П и в культуре корней го1С-II.

По оси ординат - содержание гинзенозидов, мг/г сухой ткани

При изучении содержания отдельных гинзенозидов в побегах, полученных из го1С-культур, выяснилось, что в них наблюдаются такие соотношения гинзенозидов, которые характерны для надземной части природных растений женьшеня (табл. 5). Для надземных частей женьшеня часто отмечается увеличенное накопление гинзенозида Нс1 и преобладание гликозида Ие среди других гликозидов.

Таблица 5

Содержание гинзенозидов в побегах и листьях нативного растения женьшеня и морфогенной ткани го1С-П

Ткань Содержание гинзенозидов, мг/г сухого веса

Rgi Re Rg2 Rbi Rc Rb2 Rd Общее

Побеги с

листьями 2,53 16,12 0,13 0,28 0,17 0,06 1,94 21,23 rolC-ткани

Листья

Приморской 3,08 8,1 - 0,8 3,34 1,94 6,58 23,84 популяции*

* по данным Малиновской и др., 1991

Таким образом, во всех типах трансгенных тканей изменены соотношения индивидуальных гликозидов женьшеня по сравнению с исходной культурой. Особенно ценно увеличение пропорций гликозидов протопанаксадиола в трансгенных культурах корней, поскольку они по распределению гинзенозидов приблизились к корням природных растений.

Влияние степени дифференциации трансформированных клеток женьшеня на биосинтез гинзенозидов. Считается, что модификация биосинтеза вторичных метаболитов, а также увеличение биосинтетической способности культур hairy roots растений связано с ризоге-незом под влиянием онкогенов (Kamada et al., 1986). Однако су-

ществуют сведения, которые указывают, что влияние генов Т-ДНК на вторичный метаболизм может быть не связано с ризогенезом (Thron et al., 1989).

Изучали содержание гинзенозидов в тканях различной степени дифференциации: культуре трансгенных корней и полученной из них недифференцированной культуре, состоящей из каллусных агрегатов (rolC-II сусп.). Опыты проводились в течение шести пассажей (рис. 6). Мы не обнаружили зависимости между количеством гинзенозидов в трансгенных клетках женьшеня и степенью их дифференциации. По-видимому, биосинтетический потенциал клеток в большей степени определяется свойствами индивидуальных трансгенных линий, а не степенью дифференциации клеток.

Содержание гинэеноэипоп. иг/г

Пассажи

ЕЯ Г01С-11 корни Иго1С-11 суспензия

Рис. 6. Содержание гинзенозидов в трансгенных культурах го1С-П различной степени дифференциации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

В настоящей работе предпринято комплексное изучение различных факторов и условий, влияющих на синтез гинзенозидов в культивируемых клетках женьшеня. Исследования проведены в основном с использованием штамма 1с, который, как показали предварительные

исследования, является наиболее продуктивным среди 19 клеточных культур женьшеня. При использовании метода генетической трансформации не только преодолены трудности культивирования клеток женьшеня - продуцентов биологически активных веществ, но и получены новые сведения о синтезе вторичных метаболитов в клетках, подвергающихся неопластической трансформации.

В итоге применения различных методов регуляции синтеза гин-зенозидов удалось получить ряд высокопродуктивных культур, обладающих способностью к стабильному синтезу целевых веществ в течение продолжительного культивирования.

ВЫВОДЫ

1) Установлено, что в присутствии хлор-производных фенокси-уксусных кислот каллусы женьшеня прототрофны по цитокининам. Найден оптимальный для культур женьшеня регулятор роста ауксинового типа - 4-хлорфеноксиуксусная кислота.

2) Мевалоновая кислота и ее метаболиты активируют или угнетают накопление биомассы и содержание гинзенозидов в клеточной культуре женьшеня в зависимости от концентрации и особенностей физиологического состояния клеток.

3) В устойчивой к цефазолину культуре клеток женьшеня содержание гинзенозидов увеличилось в 2,3 раза по сравнению с контрольной линией 1с.

4) Выращивание каллусов в условиях освещения приводит к увеличению содержания гинзенозидов на 50-55 Z. Подобран режим культивирования, при котором увеличение синтеза гинзенозидов не сопровождается угнетением роста культуры.

5) Разработана схема трансформации клеток женьшеня агробак-териями, несущими бинарный вектор и получены трансгенные культуры женьшеня, содержащие гены rolB и role, а также каллусы женьшеня, трансформированные геном го1А.

6) Установлено, что отдельные онкогены могут влиять на синтез вторичных метаболитов в клеточных культурах растений. Так, ген rolA полностью подавляет накопление гинзенозидов в каллусах женьшеня, ген rolB уменьшает их содержание в 5,7 раза, а ген rolC, напротив увеличивает в 2,4 раза по сравнению с исходной культурой.

7) В клетках, трансформированных геном го1С, наблюдается дифференциация. Впервые показано, что ген rolC вызывает образование побегов и листьев в длительно пассируемой каллусной культуре женьшеня.

8) Увеличение содержания гинзенозидов в rolC-культурах женьшеня может не коррелировать с повышением степени дифференциации клеток в процессе неопластической трансформации.

9) Культуры трансгенных корней женьшеня, содержащих ген rolC, являются активными и стабильными продуцентами гинзенозидов, имеют приближенные к природному корню соотношения гинзенозидов, что делает их ценным источником биологически активных веществ.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1.Khodakovskaya М.V., Bulgakov V.Р., Strigina L.I. Influence of sodium salt of caulosid С and caulosid D obtained from Caulop-hyllum robustum and polygonathoside С obtained from Polygonatum stenophyllum on growth of cell culture of Panax ginseng // Abstracts of XV International Botanical Congress. Tokyo. 1993. P.531.

З.Стригина Л.И., Ходаковская M.B., Булгаков В.П. Влияние некоторых тритерпеновых и стероидных соединений на рост каллусной культуры Panax ginseng С.А.Меу.//Растит. ресурсы. 1993. Вып.4. С.96-99.

3.Bulgakov V.Р., Kozyrenko М.М., Belozerova 0.L., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Nazarkin D.V., Zhuravlev Yu.N. Gene transference for improvement of Far Eastern medical plants// Abstracts of 45th Arctic Science Conference. Vladivostok. 1994. P. 113.

4.Ходаковская M.B., Булгаков В.П., Маханьков В.В. Влияние фито-гормонов на накопление биомассы и содержание гинзенозидов в каллусных культурах Panax ginseng С.А. Меу.// Биотехнология. 1995. N 9-10. С. 40-45.

5.Булгаков В.П., Ходаковская М.В., Козыренко М.М., Лабецкая Н.В., Журавлев Ю.Н. Синтез вторичных метаболитов в устойчивых к цефа-золину культурах клеток воробейника и женьшеня// Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. N 4. С. 453-457.

6.Ходаковская М.В., Лабецкая Н.В., Чернодед Г.К., Булгаков В.П.// Тез. докл. Второй Российской, конф. "Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока". Красноярск. 1996. С. 360-361.

7.Лабецкая Н.В., Булгаков В.П., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В. Влияние гена role на вторичный метаболизм в клетках женьшеня// Тез. докл. Второй Российской конф."Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока". Красноярск. 1996. С. 334-335.