Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика роста культуры клеток женьшеня PANAX GINSENG C. A. MEY и биосинтеза гинзенозидов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика роста культуры клеток женьшеня PANAX GINSENG C. A. MEY и биосинтеза гинзенозидов"

б од

ц ЦЕН №

На правах рукописи

ШАТАЛОВА

Марина Алексеевна

ХАРАКТЕРИСТИКА РОСТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖЕНЬШЕНЯ PANAX GINSENG С. A. MEY И БИОСИНТЕЗА ГИНЗЕНОЗИДОВ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской Академии наук

Научный руководитель

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, профессор А. М. НОСОВ доктор биологических наук, Н.В. ЗАГОСКИНА кандидат биологических наук, Е.А.КАЛАШНИКОВА

Ведущее учреждение

АООТ «Биохиммаш»

$0

Защита диссертации состоится «ЛУ » декабря 1998 г. в «У^ » часов на заседай! специализированного совета К.053.05.14 в Московском Государственном Университете и: М.В. Ломоносова.

Адрес: 119899, г. Москва, Воробьевы горы , МГУ, Биологический факультет. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А. М. Горько] Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 98 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

№

О.Г. Полесская

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Естественные ресурсы многих ценных видов растений ограничены, что делает актуальным поиск альтернативного источника сырья для медицины, парфюмерии. В настоящее время одним т таких перспективных сырьевых источников г.п.-.гс-ся культура клею:: ::мсшнх растении. Биомассу культуры клеток можно получать промышленным путем, выращивая ее в биореакторах. Это полностью исключает загрязнения как получаемой биомассы поллютантами, так и окружающей среды нитратами, гербицидами. Поэтому производство биомассы культивируемых клеток является экологически чистым.

При широкомасштабном развитии биотехнологии на основе культур клеток высших растений особое значение приобретает исследование и теоретическое обоснование биосинтетических свойств длительно культивируемых штаммов-продуцентов. Интерес к пой проблеме об\словлен также тем, что во многих случаях культуры растительных клеток представляют широкие возможности для изучения физиологических закономерностей регуляции биосинтеза вторичных метаболитов высших растений.

Особое место среди культивируемых клеток растений занимает женьшень настоящий Р.ginseng С.А.Меу. Культура клеток женьшеня (штамм ИФР Ж-1), впервые в мире была получена в 1960 г. из дикорастущего корня P.ginseng Р.Г.Бутенко.

Многолетние биохимические и фармакологические исследования культуры клеток женьшеня Panax ginseng показали перспективность использования ее в качестве источника ценных биологически активных веществ, прежде всего гинзенозидов (панаксозидов) -тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда (Брехман, 1957; Еляков, Стригина, 1964; Shibata, Furuja 1984, 1987, 1996).

К началу исследования к>льтура клеток женьшеня (ИФР Ж-1) находилась в состоянии субкультивирований более 30 лет. являясь уникальным объектом, позволяющим изучать закономерности биосинтеза вторичных метаболитов в популяциях клеток длительно пассируемых в условиях in vitro. На ранних стадиях получения штамма ИФР Ж-1 было проведено только качественное подтверждение присутствия гинзенозидов. При более

позднем исследовании анализ тритерпеновых гликозидоп в этой культуре показал, что их содержание на 1-2 порядка ниже, но сравнению с корнями интактных растений. В то же время ряд относительно молодых культур женьшеня, полученных различными исследователями, являются активными продуцентами даммарановых гликозидов. Следовательно, синтез гинзенозидов в клетках in vitro может находиться некоторое время на достаточно высоком уровне.

Исходя из этого, принципиально важно установить, является ли невысокий уровень содержания пшзенозидов в длительно культивируемом штамме, закономерным или случайным фактом. Важное значение, при этом, имеет выяснение возможности повышения их накопления.

Наряду с этим расширению наших знаний о популяциях растительных клеток могут способствовать нетривиальные подходы к анализу интегральных характеристик популяции. В частности, представляет интерес использование определенного математического аппарата.

Цель исслсловаиил - изучение физиологической регуляции процессов роста культуры клеток P.ginseng и накопления в ней гинзенозидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучение количественных параметров роста и определение состава гинзенозидов в гюпуляцни клеток штамма ПФР Ж-1 в стандартных условиях.

2. Изучение влияния типа углеводного питания на рост культуры и содержание в клетках индивидуальных гинзенозидов. Применение для анализа ростовых процессов математических подходов, в частности, разностных функций Ферхюльста и Гомпертца.

3. Изучение влияния различных факторов культивирования (изменение состава фнтогормоиов. применение двухстаднйного выращивания) на качественное и количественное содержание тритерпеновых соединений.

4. Анализ изменчивости качественного и количественного содержания гинзенозидов в длительно субкультивируемой популяции женьшеня в разных условиях выращивания.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение закономерностей роста клеточной популяции Р.ginseng с использованием разностных функций Ферхюльста и Гомпертца. Анализ характера кривых роста и сопоставление их между собой позволяет предложить физиологическую интерпретацию роста, основанную на своеобразных закономерностях изменения скорости и ускорения роста, длительности фаз роста, а также запуска и соотношения процессов деления и растяжения клеток.

Изучен качественный и количественный состав гинзенозидов в суспензионной культуре клеток женьшеня и выявлен уровень их накопления в зависимости от природы млеводного и гормонального факторов в среде. Впервые проведено двухфазное культивирование культуры для изучения возможности повышения количественного содержания индивидуальных гинзенозидов. Впервые проведен анализ изменчивости длительно пассируемой культуры женьшеня по признаку содержания тритерпеновых i лпкозидов даммараноього ряда.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований получены новые данные о наличии и накоплении гинзенозидов длительно пассируемой культуры, используемой в промышленности для получения биомассы. В работе использован удобный алгоритм и разработана специальная программа для необходимых расчетов основных параметров ростовых процессов исследуемого объекта.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на еже;одных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР и отчетах кафедры физиологии растении Биологического факультета МГУ.

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы n ^ печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований. Работа завершена общими выводами и заключением. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунками и таблицами.

Библиография содержит наименований, из них на иностранных языках.

Объекты и методы исследовании. Объектом исследования служил штамм ИФР Ж-1 культуры клеток женьшеня Panax ginseng. Штамм выращивали методом пересева в режиме периодического выращивания на модифицированной среде Мураснге- Скуга (Писецкая 1970; А.С. 1058281. 1с)84) с добавлением НУК- 2 мг/л; кинетнна -1 мг/л; сахарозы - 30 г/л. Кроме чого. среда содержала тиамин- 0,4 мг/л; шюзит- 80 мг/л и гидролизат казеина -500 мг/л.

Концентрацию сухой и сырой биомассы, числа клеток определяли по общепринятым методикам (Бутеико. 1964; Паушева, 19S8). Жизнеспособность клеток определяли как процентную долю клеток, неокрашенных 0,1%-м водным раствором феносафронина (повюриость 3-5 кратная). По первичным данным рассчитывали удельную скорость роста в экспоненциальной фазе (сутки"1) по различным параметрам, экономический коэффициент по сахарозе, продуктивность по биомассе (г/л за сутки) по стандартной методике (Перт, 1978). Дня построения расчетных кривых роста создана специальная программа. Полученные данные обработаны статистически (Шмидт, 1982; Глотов, 1982). Анализ качественного состава гинзенозидов проводили методом тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) хроматографии. В работе использовали стандартные образцы пшзенозпдов: Rbj. Rf. Re, Rb. Rd, Rg¡, Re фирмы Serva (Германия) и Тибох РАН. Методики определения гинзенозидов разработаны в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН им. К.А. Тимирязева.

Результаты исследований

1. Особенности роста культуры клеток женьшеня Panax ginseng

1.1. Влияние углеводного питания на рост клеток штамма ИФР Ж-1

Первым шагом по изучению углеводного питания было установление влияния

качественного состава углеводов на поддержание роста культуры. При этом были использованы следующие углеводы: глюкоза, галактоза, мальтоза, лактоза, рамноза и сорбит. Начальная концентрация каждого из использованных углеводов в среде составляла 3%. Анализировали число клеток, а также сухую и сырую биомассу. Культура погибала на среде с лактозой, рамнозой, сорбитом. Активное нарастание биомассы наблюдалось на средах с сахарозой и глюкозой в концентрации 3%. Галактоза оказалась способной хорошо поддерживать рост клеток культуры женьшеня, что для клеток высших растений in vitro встречается достаточно редко.

1.2. Изучение динамики poema штамма ИФР Ж-1 при различных условиях углеводного питания

Следующим этапом исследования явилось измерение ростовых характеристик культуры клеток женьшеня на различных типах углеводах, поддерживающих рост. Для исследуемого штамма получена в линейной системе координат S- образная кривая роста по всем изученным параметрам (сухой, сырой биомассе, числу клеток). Обнаружена несбалансированность роста по различным критериям, связанная с растяжением клеток на заключительной стадии ростового цикла и частичной синхронизацией деления клеток, что является характерной особенностью роста культивируемых клеток вообще и штамма ИФР Ж-1. в частности. На рис. 1.2 представлены экспериментальные кривые роста клеточной суспензии, растущей на сахарозе, глюкозе, .мальтозе и гатактозе соответственно в полуло! арифмпческой системе координат.

-Сахароза

•»Галактоза '

!

-Глюкоза

I!

-Мальтоза

Рис. 1. Кривые роста по числу клеток штамма ИФРЖ-1 в условиях разного углеводного питания.

Рис.2. Кривые росту по сухой биомассе штамма ИФР Ж-1 в условиях разного углеводного питания.

Таблица

Ростовые характеристики клеток- штамма ИФР Ж-1 в режиме периодического культивирования

Углеводы М И; Нк У П

Сахароза 3° & 10.0±0,06 0,13±0.001 0,1-4 + 0,001 033 0,43

I .'ПС'КСЛЛ 3"„ Ю.0+ода 0,17 + 0.001 0.13 + 0,001 033 0,44

Галактоза 3" и 9,7 ±0,06 0,13+0.002 0,12±0,002 032 0,42

Малыоча 3" и 53 ±0,03 03) ±0,001 0.12+0.002 0,18 0,17

М гл - концентрация с>.\ои биомассы; ^ - \ ло.'п.ная скорос п> роста по сухой биомассе;

->ле;п>пая скорость роста но количеству клеток Ю(7сут; У-'жопомичсский кок]}фиш1сит; 11 про л) кпшиоегь » 1 'л (по с\\ой биомассе).

Полученные кривые динамики роста достоверно отличаются продолжительностью лаг-1зы. В частности, длительность начальной фазы роста культуры по чис;гу клеток на лактозе составляет 5 суток. На мальтозе по сухой биомассе отмечается увеличение лаг-пы до 6 суток, что может служить признаком адаптационной перестройки культуры к пользованию нового субстрата.

Как видно из таблицы 1, штамм в целом обладает относительно невысокой удельной

оростью роста. Более высокую скорость наблюдали на средах с глюкозой и сахарозой, а

шменьшую на средах с мальтозой и галактозой..Экономический коэффициент максимален

I средах с сахарозой, глюкозой и галактозой и минимален на среде с мальтозой.

родуктнвность по биомассе на сахарозе, глюкозе, галактозе превышает максимальную

юдуктивность но биомассе на мальтозе и составляет в среднем 0.43. Отсюда следует, что

пьтоза является менее эффективным источником углеводного питания.

S. Количественный анализ роста штамма ПФР Ж-1 в разных условиях углеводного питания

Закономерности физиологии роста растительных клеток in vitro исследованы ещё ¡достаточно. Выявление новых закономерностей данного процесса возможно при швлечении различного математического аппарата. В настоящее время существует класс упкций. пригодный для описания интегральных характеристик роста- это логистическая ункпия Ферхюльста и функция Гомпертца (Шмидг. 1984).

Одновременное использование обоих функций дает наиболее полную картину шамики роста клеточной популяции, а также возможность по экспериментальным данным тределить подходящий тип расчетной кривой и вычислить основные параметры роста.

Полученные нами по экспериментальным данным (сухой биомассе и числу клеток) ючетныс кривые роста культуры на среде с глюкозой несимметричны, поэтому изучаемые 1ми критические почки Tt.T2.T3 располагаются в разном временном порядке. Отсюда ¡сд_\ет. что рост клеточной популяции на глюкозе проявляется в быстром увеличении сухой юмассы клеток, в отличии от оценки растущей популяции по числу клеток. Анализ

Рис 3 Расчетные (тсорс!пчсскнс) крпиые роста клльтуры клеток женьшеня по сухоП биомассе (а) и по числу клеток (б) в условиях выращивания на сахарозе, характера расчетных кривых роста по сухой биомассе на среде с глюкозой, показал, что культура достигает Т?- точки перегиба и 50% уровня сухой биомассы раньше, чем при нснолыовашш и качестве критерия роста числа клеток.

Иная количественная зависимость получена при использовании сахарозы (стандартные условия; рис. 3). В этих условиях в экспоненциальной фазе устанавливается определенная временная «согласованность» между процессами роста клеток и их размножением. Почти одновременное достижение клетками Тз-критичсского состояния

соответствует более высокой продуктивности клеточной популяции в стандартных условиях. Подобный эффект, по-видимому, обусловлен оптимальным соотношением процессов деления и роста биомассы клеток.

1.4. Особенности динамики процессов деления и растяжения меток в разных условиях м л ыпивироеаиия

Очевидно, что культура клеток женьшеня в условиях периодического режима выращивания, обладает ограниченным периодом роста. Представляет интерес изучение закономерностей размножения клеток и их роста растяжением, как двух основных процессов, обуславливающих рост популяции клеток.

Для характеристики роста популяции клеток нами использованы данные о положении критических точек T1.T2.T3, в ходе накопления числа клеток и сырой биомассы, т.е. соотношения процессов деления н растяжения. В разных условиях культивирования получены данные, которые позволяют считать, что в популяции деление клеток и их растяжение начинаются не одновременно. Проведенный анализ показал, что если суспензня растет на среде содержащей глюкозу или мальтозу, то рост такой популяции регулируется за счет перехода к растяжению образовавшихся клеток. Медленный рост сырой биомассы на глюкозе пли мальтозе объясняется необходимостью подготовки н запуска деления, т.е. появления в популяции новых, интенсивно делящихся клеток. В противоположность этому, начало растяжения клеток на среде с сахарозой или галактозой не зависит от образования новых клеток или прекращения деления клеток в популяции. Это подтверждает хорошо известный факт независимого сочетания во времени двух исследуемых процессов (Иванов, 1974).

Таким образом, проведенный сравнительный анализ позволил установить специфику отдельных процессов роста суспензионной культуры женьшеня. В результате показано, что |ч'1»I. ¡л.11.^1 ел!ь;\ iwTcn.ii. ь слот:*Ьа/'гпфииан!!*; ^ч.лсьод^иго

ьчаава среды пролиферация, растяжение и биохимическая дифференциация клеток могут ш>-ра;ном_\ сочетаться во времени.

2. Гшисжмнды в кулыурс клеток женьшеня Ранах ginseng

Химический состав физиологически активных соединений женьшеня Ранах ginseng корпя весьма сложен. В нем обнаружены необычные жирные кислоты, олш опеишды. полисахариды, стероиды и др. По основными и уникальными бнолошчеекп акпшпымн соединениями являются тршернсповые 1лпкозиды даммаранового ряда - гинзенозпды (паиаксознды). Они разделяются на две группы: гликозиды с аглнконом протопанаксаднолом (пнпенозиды Rb-групиы) и пшкозиды с апшкопом ирогоиаиакеатриолом (пшзенозиды Rg-групны).

2.1 Качественный и количественный состав гиюснозидов

Идентификация типзсиозпдов была проведена О.В. Решетник с использованием

хромаю- масс-спектроскоппн апшкопов после гидролиза. Было проведено исследование

качественною н количественною состава лшзепозндов в более чем 50 образцах биомассы

культуры клеток женьшеня, выращенных как в стандартных, так и в контрастных условиях.

В inore было никашно наличие во всех анализируемых пробах гппзенозндов Rbi, Rgi и Re. О

отельных обра щах присутствовали пшзенозиды: Re, Rbj, Ri" и Rd. На основании

качественного анализа iиизенозидов можно сделать вывод, что в биомассе обязательно

ирисуictbviot, как минимум три-четыре пшзсиознда, тогда как иекоюрые из гинзенозндов

могут отсутствовав или находиться в следовых количествах. Таким образом, качественный

состав гинзенозндов штамма ПФР Ж-1 беднее, чем в ингактном корне. Однако в ряде

случаев оп может быть идентичным корню, т.е. показано наличие всех 7 анализируемых

соединений.

Количественное содержание гинзенозндов составляет в среднем от 0,01% до 0,18% к сухой

массе клеюк. что па 1-2 порядка ниже, чем для натурального корня.

2.2. Изменение качественного и количественного содержания гшиснозидов в цикле «ы-ращшмшш в стандартных условиях

На рис.4 представлены кривые изменения общего содержания гинзенозндов и трех последовали,них субкульт ииироваппях на стандартом среде, а также кривые накопления i ни (стендов Rb н Kg-i рупп.

eco | - - - - ------- - ........r i»

nx me

—

9C Ffcfpyma

- • - 'brpjrna ¡ ; 70 ■ ■

£0

0 -------------------1 30

0 6 В ^^ 10 U 22

Рис,4. Изменение содержания общего количества гинзенозидов и Rb и Rg групп в трех циклах

Из приведенных результатов следует, что существует определенная специфическая закономерной ь в изменении количественною содержания гинзенозидов в культуре клеток женьшеня в цикле выращивания. Эта закономерность проявляется в достаточно четко выраженном чередовании локальных максимумов и минимумов общего количества гинзенозидов

обнаруженная в каждом из трех циклов субкультивнрования культуры. Причем эти колебания часто происходят синхронно с общим накоплением гинзенозидов. Характерно увеличение общего содержания гинзенозидов на заключительных фазах роста культуры клеток -женьшеня. Изменения количественного содержания Юз и гликозидов происходят подобно характеру изменения суммарного количества гинзенозидов. Тем не менее, общее накопление определяется, прежде всего, изменением гинзенозидов И^-группы. Накопление гликозидов 1\Ь-группы во всех фазах роста отмечалось только в первом цикле культивирования. В остальных циклах выращивания случаи повышения их содержания происходили, в основном, на более поздних фазах роста культуры. Кроме того, содержание гинзенозидов ЛЬ-групиы может варьировать от следовых количеств до значений на 1-2 порядка превышающих их минимальные количества. По-видимому, можно предположить слу чайный характер изменения содержания соединений ЯЬ-группы в стандартных условиях. Тем не менее, в ряде случаев, их уровень может быть достаточно большим. Изменение содержания гинзенозидов ЯЬ-группы иллюстрирует факт зависимости их биосинтеза от некоторых внешних факторов в условиях перподичес; ого режима выращивания. Однако следует отметить, что полученные в ходе анализа данные о закономерностях изменения гинзенозидов ЯЬ-группы в цикле выращивания нельзя считать полностью доказанными.

2.3. Индивидуальные гипзенозиды штамма ПФР Ж-1 в стандартных условиях выра-¡циаатш

Основными гинзепозидамн штамма ИФР Ж-1 в стандартных условиях являются глпкознды группы протопанаксатриола н Ие, присутствующие на протяжении всего цикла выращивания, и гликозид Кс группы протопанаксадиола. Редко встречающимися соединениями исследуемого спектра являются Ш^ДЬъДс!, ЛТ. На долю гликозида приходится наибольшее абсолютное количество всего набора гинзенозидов. В меньших количествах встречается гликозид Яс группы протопанаксадиола. В цикле культивировании ею количественное содержание не подвержено существенным колебаниям. Исключение

составляет высокий «всплеск» содержания метаболита (до 0,06%) на завершающих этапах роста культуры во втором субкультивировашш. В целом, характер изменения индивидуальных веществ в культуре женьшеня сходен с закономерным изменением общего содержания гинзенозидов со сдвигом в сторону накопления лшзенозидов Ид-группы.

При анализе содержания гинзенозидов ицтактного растения часто используется соотношение ЯЬ^Яд групп соединений. При этом высокое соотношение характерно для листьев, а низкое для корней (Журавлев, Булгаков, 1991).

Изучение индексов соотношений важнейших гинзенозидов в штамме ИФР Ж-1 и в органах

питанных растений показало, что суспензионной культуре реализуется тип биосинтеза

характерный как для подземных, так и надземных органов растения женьшеня. В делом,

можно предположить существование сложной зависимости между процессами накопления

индивидуальных гликозидов 11Ь и Яц групп в стандартных условиях.

2.4. Изменения качественного и количественного содержания гинзенозидов в условиях разного углеводного питания

На рис. 5 представлены кривые накопления культурой клеток женьшеня гинзенозидов КЬ и Яу групп, а также общего их количества, в ходе выращивания на галактозе. По результатам анализа видно, что на галактозе имеются, в основном, три максимума в содержании исследуемых соединений (на 7, 14, 26 сутки). Причем подъемы уровня происходят, главным образом, за счет синтеза гликозидов Яц-группы. Индексы соотношения групп по ходу цикла выращивания на галактозе и мальтозе приведены на рис. 6. Соотношение варьирует от 0.01 до 0.29, что свидетельствует об увеличении накопления доли панаксадполов при выращивании культуры на галактозе. Высокие значения этого показателя наблюдаются на 5 и 10 сутки роста культуры, предшествуя периодам повышения общего содержания гинзенозидов за счет гликозидов ¡^-группы. Повышение накопления соединений КЬ-группы приходится также и на поздние фазы цикла выращивания с 14 по 26 сутки. Следовательно, у штамма ИФР Ж-1, присутствие галактозы в среде вместо

традиционной сахарозы, не приводит к существенным изменениям в характере накопления гинзенозидов обеих групп.

На мальтозе первоначально происходит спад в содержании общего количества пшзенозидов в 2-3 раза но сравнению с начальным их содержанием. Однако, на более поздних этапах содержание пшзенозидов практически восстанавливается. Количественные соотношения Г'.ЬЛчи групп глшчозидов отражают накопления в сухой биомассе клеток соединений группы протопанаксадиола по ходу культивирования, подтверждая тем самым установленную ранее закономерность (рис. 6).

КЬ-группа |

Сумма

гинзенозидов

Вд-группа

Рис.5. Изменение содержания сшшего количества гинзенозидов и КЪ и Я£ групп на галактозе

0.35 ; 03 | 0.25 • 0.2 •

0.1 ■ (I 005 : Ц

Галактоза ч Е Индексы

0 3 5 7 10 12 14 19 26 Сутки

0.5 ----

- ■ ¡"1

1- -

1

, --

ЕЛ-- 11 И_

Мальтоза

С. Индексы Г<ьЯд'

0 3 6 9 12 14 19 Сутки

рнс.о. Индексы соотношении КЬ'Я£. гр\пп на мальтозе и галактозе. Таким же образом был проведен анализ данных по содержанию н соотношению гнизешпнлоп в штамме культивируемом в течение трех последовательных пассажей на глюкозе. Суммируя данные по трем циклам выращивания на глюкозе можно отметить

следующее: первый локальный максимум наблюдается на ранних фазах (5 сутки) роста

штамма; имеется промежуточный подъем на 10 сутки и очередное и более «стабильное» увеличение уровня биосинтеза на 14 сутки в двух независимых культивированиях. Имеющиеся факты подтверждают неоднократно наблюдаемую во всей серии экспериментов специфическую закономерность.

Таким образом, изменение углеводного питания среды оказывает определенное влияние на количество и соотношение гинзенозидов штамма ИФР Ж-1. При этом установлена общая закономерность - наличие локальных минимумов и максимумов содержания гинзенозидов. Изменение углеводного питания не позволило существенно повысить продуктивность культуры по гинзенозидам.

3. Изучение возможности повышения выхода гинзенозидов при двухстаднйном ку льтивировании

Перспективным для биотехнологии этапом нашей работы явилось изучение возможности повышения выхода гинзенозидов в суспензии женьшеня штамма ИФР Ж-1 при двухстаднйном культивировании. В качестве ростовой среды использовалась среда М-С в модификации Писецкой. Длительность цикла культивирования на ростовой среде сокращена до 8 суток, для того чтобы иметь для второй стадии активно растущие клетки. На второй (продукционной) стадии вносили в питательную среду синтетические регуляторы роста (2,4 Д; БАП; НУК; кинетин) в разных концентрациях; для АБК была взята минимальная концентрация (0,26 мг/л), средняя (2,6 мг/л) и максимальная (26 мг/л); длительность второй стадии составляла 8 суток. В отбираемых после смены среды на 2 и 6 сутки образцах, определяли качественный состав и количественное содержание гликозндов даммаранового ряда методом ВЭЖХ: 1^1, Ле, ЯГ (группа протопанаксатриола) и ЛЬ], Лс, ЛЬ:, Лс1 (группа протопанаксадиола).

Важным изменяемым фактором продукционной среды было также выбрано повышение концентрации сахарозы до 5%. Как следует из полученных данных (рис. 7), повышение содержания в стандартной среде сахарозы до 5% заметно увеличивает

Рис.7. Изменение содержания КЬ и Кд групп штамма ИФР Ж-1 в ходе двухфазного культивирования, накопление искомых метаболитов за счет обоих групп гинзенозидов в условиях совместного использования экзогенных гормонов. Изучение действия синтетических аналогов ауксина ПУК и 2. 4 Д в концентрациях 2 мг/л при полном исключении из среды кинетина показало отсутствие какой-либо корреляции между содержанием в среде ауксинов и выходом гинзенозидов. Влияние экзогенных цитокинииов путем введения в среду БАП в концентрации 1 мг/л при исключении ауксинов показано на рис.8.

11а фоне стандартных и особенно повышенных доз Сахаров отмечается повышение уровня пппенозплои. по сравнению с таковым же уровнем на среде без ауксинов. В такой среде культура характеризуется также и более богатым спектром гинзенозидов: культивируемые кж-мси содержали 5 индивидуальных соединении.

Анализ данных выращивания —" ИФР Ж-1 на безгормоналыюн сг>еде показал наименьший уровень накопления гинзенозидов. а их спектр содержал не более 2-3 I ликочидои из 7 обнаруженных в клетках женьшеня.

Эсобый интерес представляет также информация о возможности увеличения выхода гннзенозидов при двухфазном культивировании, добавлением экзогенной АБК в среду МУК

mir

Рис 8 Изменение содержания КЬ и Rg групп штамма ИФР Ж-1 в ходе двухфазного культивирования (без ауксинов)

+ кннетпн с разными концентрациями сахарозы. Из рис. 9. видно, что в противовес высоким концентрациям сахарозы экзогенная АБК в целом снижает синтез гликозидов Rg-группы, полому гинзенозиды в основном представлены Rb-группой. При максимальной концентрации АБК (26 мг/л) происходит значительное повышение количественного уровня гликозида Rb| на 2 сутки (до 1В7, 7 мкг/г сухой биомассы клеток). Однако, такое резкое повышение отдельного гликозида является временным и меняется на 6 сутки в сторону преобладания соединения Re представителя Rg-группы.

Таким образом, выход гннзенозидов в режиме двухстадийного выращивания во всех условиях эксперимента оказался не выше, а ниже, чем при одностадийном. Изучение закономерностей накопления гликозидов на второй (продукционной) стадии показало значительную потребность клеток в синтетических регуляторах на фоне повышенных доз сахарозы. Отсюда вытекает вопрос о характере взаимодействия между ними. Можно полагать, что участие ауксинов и тштокшшпов, а также фитоюрмона-ингибитора в

регуляции оиоеинтеза даммарановых гликозидов осуществляется путем их опосредованного влияния на синтез гинзенозидов.

АБК (26 мг/л)

250 200 150

100 50

0

¡ Rb-группа | Rg-группа

ГНп

JZL

Рис. У Изменение содержания гинзенозидов разных групп под влиянием АБК (26 мг/л).

4. Изменчивость культу ры клеток женьшеня Р.«т5еп2 по содержанию гнпзшозндов в различных условиях культивирования

Одним из существенных свойств изученной выше клеточной популяции женьшеня является ее значительная пластичность, которая проявляется в изменчивости качественною и количественного содержания гинзенозидов. Условия культивирования, изменяющие уровень пролиферации или цитоднфференцировки, могут в значительной степени определять как общую продуктивность штамма, так и его биохимическую гетерогенность по данному признаку.

Закономерности проявления гетерогенности культуры по селективному признаку «содержание гинзенозидов» в меняющихся условиях остаются практически не исследованными.

Таблица 2

Содержание глнкозидов Uh к Ug групп в культуре клеток женьшеня Р. ginseng в цикле выращивания на разных углеводах (в мкг/г сухого веса)

Типы \тлевоиов Содержание протопанаксатриолов Содержание протоланаксадиолов

Сахароза П-1 145,3+27,9 148,5+24,5

о 55,7±19.7 49,1 + 17,3

Сахароза П-2 Х„ ±5, 104.6±12,4 _

а 26,8+8,7 -

Сахароза П-3 Х1П ±8, 123,0+27.5 22,0+3,2

а 67.5+19,4 7,8±2,2

Общая средняя Х„ ± 5, 124,3+22.6 85.2+13,8

а 50,0±15,9 28.4±9,8

Галактоза Х„ ±3, 78.3±4,3 20,5±3,9

а 13,0±3.0 11.9±2,8

Глюкоза П-1 Х1Г ±5, 59,6±9,0 40.7+10,0

а 22.1 ±6.3 24,8+7,1

Глюкоза П-2 Х„ ±5, 80.0+22.2 23.8±2,4

о 49,Ш5,7 5.5+1,7

Глюкоза П-3 Хс„ ±6Ч 80.5±5.8 33.6+6,7

а 16,5+4,1 19,6±4,7

Общая средняя Хп, ±5Ч 73.4+12,3 32,7+6.3

а 29,5±8.7 16,6±4.5

Мальтоза Хс„ ±5, 48.2+5.9 25,2+6,4

ст 15.7+4,3 17,1±4,5

Для оценки уровня признака и его изменчивости использовали стандартные параметры

статистического анализа- Х±5х и величину дисперсии ст, а также учитывали характер относительной изменчивости по коэффициенту вариации (Глотов, 1982).

Анализ таблицы 2 показывает, что в стандартных условиях культивирования изменчивость популяции клеток женьшеня по признаку содержания глнкозидов Я^-группы выше (дисперсия признака =50.0). чем по признаку содержания глнкозидов ЯЬ-группы (дисперсия признака 28,4). При изменении стандартных условий (субкультивирование на ииокозе. галактозе и мальтозе) степень изменчивости содержания обеих групп соединений

снижается (дисперсия для Rg - группы 29,5; 13,0; 15,7 и для Rb - группы 16,6; 11,9; 17.1 соответственно).

Анализ содержания гинзенозидов в вариантах на галактозе и мальтозе, в сравнении с сахарозой, показывает, что общее содержание Rg соединений снижается в этих вариантах, в среднем, на меньшую величину (на~46 %), чем соединений Rb - группы ( на -73 %). Снижение величины дисперсии средних значений гинзенозидов в вариантах на мальтозе и галактозе, наоборот, происходит более значительно в группе Rg - соединений (на 72 % ), чем в группе Rb - соединений (на 46%).

Таким образом, для соединений Rb - группы на этих средах резерв скрытой изменчивости признака у станавливается на более высоком уровне, чем для соединений Rg - группы. Из выше изложенного следует, чго судить однозначно о целесообразности применения тех или иных сред для направленного синтеза этих групп соединений сложно. По-видимому, многое зависит от того, каким путем клеи;и in vitro будут реализовывать свою программу биосинтеза вторичных метаболитов в тех или иных условиях - за счет поддержания синтеза всех известных компонентов данной группы или за счет усиления или ослабления синтеза отдельных соединений. По - видимому для решения биотехнологических задач важно получить все многообразие веществ даммараяового ряда, продуцентом которых является штамм ИФР Ж - 1.

Существенно, что если на сахарозе получено достаточно высокое количество соединения Rgi. то синтез Rbi соединения на сахарозе, по - видимому проблематичен. Это свидетельствует о достаточно высокой гетерогенности культуры клеток женьшеня на этой среде. Исследование качественного состава гинзенозидов, а также содержания этих веществ выявило достаточно широкий днапозон внутршюпуляшюннон изменчивости. Установлено, что наиболее изменчиво содержание гинзенозидов Rgi - группы протопаиаксатриола и Rc -группы протопанаксадиола. Варьирование этих гликозидов вносит определенный вклад в биохимическую i cieporeiiiiocTb штамма ИФР Ж-1. Между тем направленность синтеза

исследуемых гинзенозндов формируется на основе мобилизации разнонаправленной индивидуальной изменчивости соединений даммаранового ряда.

Выводы

1. Изу чены характеристики роста суспензионной культуры клеток женьшеня (штамм ИФР Ж-1) в стандартных условиях и при различном углеводном питании. Показано, что помимо сахарозы, рост культуры клеток поддерживают глюкоза, галактоза и мальтоза. Лучшие ростовые характеристики (удельная скорость роста, продуктивность, экономический коэффициент) отмечены при использовании сахарозы и глюкозы.

2. Проведено моделирование процесса роста культуры клеток на базе логистических функций. На основании математического анализа произведено разделение процессов накопления биомассы н деления клеток в популяции in vitro. Показано, что степень «согласованности» между накоплением биомассы и увеличением числа клеток зависит от углеводного состава питательной среды. Условия способствующие наибольшей «согласованности» между размножением (делением) клеток и биосинтетическими реакциями, обеспечивающими увеличение биомассы на начальных этапах роста культуры клеток, являются наиболее оптимальными для синтеза вторичных соединений (гинзенозндов) па стационарной фазе.

3. Изучен качественный состав тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда (пнпенозидов) культуры клеток женьшеня (штамм ИФР Ж-1) при различных условиях культивирования. Показано, что клетки этого штамма содержат гинзенозпды Rgi, Rd, Re. В зависимости от условий культивирования в клетках могут присутствовать пшзенозиды Rc. Rbi. Rf и Rb].

4. Исследовано количественное содержание гинзенозндов в биомассе штамма ИФР Ж-1 в цикле выращивания на стандартной среде и различном углеводном питании. Установлено, что содержание гинзенозндов в биомассе составляет в среднем от 0,01 до 0,1%, чю па одни - два порядка ниже, чем в ингактном корне. Максимальное содержание

гинзенозидов наблюдаются при выращивании культуры на сахарозе. Использование другие углеводов приводит к значительному (в 3-8 раз ) снижению содержания пшзенозидов. Ii цикле выращивания наблюдаются специфические изменения содержания всех гинзенозидов.

5. Изучены особенности накопления гинзенозидов в ходе двухстадийного способа культивирования при различных вариантах продукционной среды (вариации концентрации сахарозы, состава и концентрации регуляторов роста). Показано, что значимого повышения продуктивности по гинзенозидам при таком способе культивирования не наблюдается. В ряде случаев отмечено значительное изменение количественного содержания отдельных гинзенозидов. В частности, высокие концентрации АБК вызывали резкое увеличение содержания глпкозида Rb|.

6. Установлена высокая степень изменчивости количественного уровня п состава гинзенозидов как в цикле выращивания, так и при различных условиях культивирования. Максимальная изменчивость признака обнаружена в стандартных условиях (на сахарозе).

Список p:iGoT, опубликованных по материалам диссертации

1.Шаталова М.А., Решетняк О.В., Носов A.M. Сопоставление ростовых и биосинтегнческнх характеристик культуры клеток женьшеня шт. ИФР Ж - 1 // Тез. сьезда физиологов растении. - С.П6.-1993.-C.I53.

2. Шаталова М.А.. Решетняк O.D., Hoco» А.М Биосинтез трптерпеновых гликозидов даммэрапового ряда в культивируемых клетках женьшеня Р. ginseng С.А.Мсу // 1 Всероссийская конф. по ботаническому рсарсоведеншо.-С.Пб,- 1996,- С. 212.

3.Шаталова М.А.. Станиславский В.В., Пигулевская Т.К. Закономерности роста культуры клеток женьшеня настоящею/.' I Всероссийская конф. по ботаническому ресурсоведеншо.-С.Пб-1996.-е. 1S6- 187.

•4. Шаталова М.А., Решетняк О.В. Изменчивость культуры клеток Р. ginseng С. А. Меу по содержанию гншенозндов в различных условиях культивирования: Всероссийский популяинонный семинар // Жизнь популяции в 1етерогеннон среде. - Йошкар-Ола. 1998,- С. 257,