Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика роста культуры клеток женьшеня настоящего P. ginseng C. A. Mey и биосинтеза гинзенозидов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаталова, Марина Алексеевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК. 581.198

ШАТАЛОВА МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА РОСТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО Р. GINSENG (С.А. МЕУ) И БИОСИНТЕЗА ГИНЗЕНОЗИДОВ

(03. 00. 12. - физиология растений) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., профессор А.М. НОСОВ

МОСКВА-1999 г.

Содержание

ВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Общая харктеристика ростовых процессов.................................................10

1.2. Различные методы и подходы определения роста (параметры,

расчетные характеристики).............................................................................15

1.2.1. Динамика клеточных популяций растений в реэкгше периодического культивирования..................................................................................................20

1.3. физиолого-биохимические особенности фаз роста культивируемых in vitro клеток растений......................................................................................21

1.4. Особенности строения, классификации и биосинтеза тритерпеноидов....

1.4.1. Классификация тритерпеноидов..............................................................36

1.4.2. Биосинтез тритерпеновых гликозидов.....................................................39

1.4.3. Тетрациклические тритерпеноиды даммаранового ряда.......................42

1.5. Распространение тритерпеновых гликозидов в природе.........................44

1.6. Тригерпеновые гликозиды даммаранового ряда в интактном растении и культуре клеток женьшеня..............................................................................50

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА И МАТЕРИАЛЫ

2.1. Материалы исследования.........................................................................57

2.2. Методы химического анализа гинзенозидов..........................................59

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ РОСТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖЕНЬШЕНЯ PANAX GINSENG

3.1. Влияние углеводного питания на рост клеток штамма ИФР Ж-1..........60

3.2. Анализ кривых роста штамма ИФР Ж-1 в различных условиях культивирования.............................................................................................61

3.3. Количественный анализ роста культуры клеток женьшеня P. ginseng ... 69 3.3.1. Анализ алгоритма для расчета параметров кривой Гомпертца и Ферхюлъста клеточной популяции женьшеня P. ginseng.................................79

3.4. Особенности динамики процессов деления и растяжения клеток в разных условиях культивирования................................................................82

ГЛАВА 4. ГИНЗЕНОЗИДЫ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК PANAX GINSENG

4.1. Качественный состав гинзенозидов........................................................90

4.2. Количественное содержание гинзенозидов.............................................91

4.3. Изменение качественного состава и количественного содержания гинзенозидов в стандартных условиях в ходе цикла культивирования.......92

4.4. Индивидуальные гинзенозиды в стандартных условиях культивирования.............................................................................................98

4.5. Изменение качественного состава и количественного содержания гинзенозидов в условиях разного углеводного питания............................106

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПОВЫШЕНИЯ ВЫХОДА ГИНЗЕНОЗИДОВ ПРИ ДВУХСТАДИЙНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММА ИФР Ж-1..............................................................................................119

ВЫВОДЫ.................................................................................................................143

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 145

ПРИЛОЖЕНИЕ......................................................................................................174

При широкомасштабном развитии биотехнологии на основе культур клеток высших растений особое значение приобретает теоретическое обоснование сохранения биосинтетических свойств длительно культивируемых штаммов-продуцентов. Интерес к этой проблеме обусловлен тем, что во многих случаях культуры растительных клеток представляют интересные возможности для изучения физиологических закономерностей синтеза вторичных веществ в клетках высших растений.

Особое место среди культивируемых клеток растений занимает женьшень настоящий Р. ginseng (С, А, Меу). Культура клеток женьшеня (штамм ИФРЖ4), впервые в мире получена в 1960 г. из дикорастущего корня Р. ginseng РХ Бутенко,

Многолетние биохимические и фармакологические исследования культуры клеток женьшеня Panax ginseng показали перспективность использования ее в качестве источника ценных биологически активных веществ, которыми являются гинзенозиды (панаксозиды) - тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда (Брехман, 1957; Еляков, Стригина, 1964; Shibata, Fumja 1984,1987).

К началу исследования культура клеток женьшеня (ИФР Ж-1) находилась в состоянии субкультивирований более 30 лет, являясь уникальным объектом, позволяющим изучать закономерности биосинтеза вторичных метаболитов в популяциях клеток длительно пассируемых в условиях in vitro.

На ранних стадиях получения штамма ИФР Ж-1 было проведено только качественное подтверждение присутствия шнзенозидов. При более позднем исследовании анализ тритерпеновых гликозидов показал, что их содержание на 1=2 порядка ниже, по сравнению, с корнями интактных растений женьшеня.

В то же время ряд относительно молодых культур женьшеня (растущих 1 =2 года), полученные различными исследователями, являются активными продуцентами даммарановых гликозидов. Следовательно, синтез гинзенозидов в клетках in vitro может находиться определенное время на достаточно высоком уровне.

Исходя из этого, принципиально важно установить, является ли содержание гинзенозидов в длительно культивируемом штамме закономерным

или случайным фактом. Крайне важное значение, при этом, имеет выяснение возможности повышения их накопления.

Наряду с этим расширению наших знаний о популяциях растительных клеток могут способствовать нетривиальные подходы к анализу интегральных характеристик популяции, что позволяет ставить некоторые специфические задачи для интенсификации биотехнологических процессов с использованием клеточных культур. В частности, представляет значение использование математического аппарата.

Щель шеелеёттмшт - изучение физиологической регуляции процессов роста культуры и накопления в ней гинзенозидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие зшдшчш шсслеётштшш.

1. Изучение количественных параметров роста и определение состава гинзенозидов в популяции клеток штамма ИФР Ж-1 в стандартных условиях.

2. Изучение влияния типа углеводного питания на рост и содержание индивидуальных гинзенозидов. Применение дом анализа ростовых процессов математических подходов, в частности, разностных функций Ферхгольста и Гомпертца.

3. Изучение влияния различных факторов культивирования (изменение состава фитогормонов, применение двухстадийного выращивания) на качественное и количественное содержание выделяемых соединений.

4. Анализ изменчивости качественного и количественного содержания гинзенозидов в длительно еубкультивируемой популяции женьшеня в разных условиях выращивания.

Итущшшж штшзшш работы. Впервые проведено изучение закономерностей роста клеточной популяции Р„§1шеп§ с использованием разностных функций Ферхкшьста и Гомпертца. Анализ характера кривых роста и сопоставление их между собой позволяет предложить физиологическую интерпретацию роста, основанную на своеобразных закономерностях изменения скорости и ускорения роста, длительности фаз роста, а также запуска и соотношения процессов деления и растяжения жлеток.

Изучен качественный и количественный состав гинзенозидов в суспензионной культуре клеток женьшеня и выявлен уровень их накопления в зависимости от природы углеводного и гормонального факторов в среде. Впервые проведено двухфазное культивирование культуры для изучения возможности повышения содержания индивидуальных гинзенозидов. Впервые проведен анализ изменчивости длительно пассируемой культуры женьшеня по признаку содержания тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда. Это можно рассматривать, как не изученный ранее уровень адаптации культур клеток к условиям среды.

Шршюжшческая щетштсжъ ртб&жЫо В результате проведенных исследований получены новые данные о наличии и закономерностях синтеза гинзенозидов

Структура ш объем ршё&ты. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, глав экспериментальной части, выводов и списка литературы.

Обз©1р лшитфатгурм

II Общшш хтршктершапшшш ¡ржшмых мрщеееш

Известные множественные определения роста можно разделить на две

главные группы» Одни исследователи, к которым относится основоположник

учения о росте растений Сакс (1887), Робертсон (1908, 1923) и др„ считают /

возможным определить рост как всякое увеличение линейных размеров, объема

или веса. Многие другие исследователи (Морган, 1937; Шмальгаузен 1935, 1961)

1 „ При преобладании ассимиляции над диссимиляцией происходит накопление массы цитоплазмы или ассимиляционный рост. Многие исследователи принимают этот вид роста за настоящий рост.

2. Может происходить простое поглощение воды растущим организмом, гидратация цитоплазмы клеток и ее вакуолизация. Наиболее демонстративен в этом отношении рост растений, где ассимиляционный рост совершенно нельзя отделить от роста, обусловливаемого поглощением воды и где последний доминирует над первым; видимый рост растительного организма, в значительной мере, вызывается не только увеличением числа клеток и количества цитоплазмы, но и вакуолизацией клеток, объем которых увеличивается за счет поступления воды.

3. В организме во время роста происходит не только увеличение количества цитоплазмы, но развиваются, особенно на поздних стадиях, внутриклеточные и межклеточные вещества различного характера. (Шмальгаузен, 1935).

Таким образом, рост представляет собой сложное, комплексное явление, которое состоит из разнородных компонентов. В этом, видимо, и состоит трудность определения роста.

Закономерный ход развития представлений о росте и научный поиск в этот в этом направлении позволил Д.А. Сабинину (1957, 1963) сделать вывод, что рост - это необратимое увеличение размеров, массы и объема клетки,

(Ждан-Пушкина, 1983), Шлегель (1972) называет ростом - необратимое увеличение количества живого вещества, чаще всего сопровождающееся увеличением размеров клеток и последующим их делением» Стейниер (1979) предлагает определение роста, по существу аналогичное тому, которое было предложено Роузом. Он считает, что в любой биологической системе рост может быть определен как согласованное увеличение количества всех компонентов.

Развивая далее физиолош-биохимические основы роста и учитывая достижения молекулярной биологии К. М. Сытник (1966) предложил рассматривать рост «как процесс создания из неупорядоченной системы малых молекул сложных макромолекул, биополимеров и построение из них надмолекулярных структур». Это определение роста ориентирует на поиск цитофизиолошческих механизмов, обусловливающих деление и рост клеток и клеточных структур.

В отечественной литературе известны определения роста растений, данные Ф.Э. Реймерсом (1957), Н.Г. Холодным (1935), В.Н. Любименко (1938), М.Х. Чайлахяном (1958), СО. Гребинским (1961), П X. Молотковским (1961).

Обобщая данные литературы, можно отметить, что все разногласия по поводу многочисленных определений роста основываются по преимуществу на том, что увеличение размеров или массы организма могут происходить в результате различных процессов:

организма, связанное с новообразованием элементов структуры организма, к которым он относил не только клетки, но и части клеток, субмикроскопические компоненты, протоплазматические структуры, макромолекулы включительно. Это определение в настоящее время стало общепринятым в биологии, и объясняло многочисленные и широко известные в науке факты так называемого «скрытого» роста, когда не наблюдается увеличение массы и размеров, но и идут дифференциация и накопление элементов структуры (Шевелуха, 1992).

Любопытно, что закономерное уменьшение размеров организма, следует считать отрицательным ростом (Светлов, 1978). Это замечание правильно, но тогда для закономерных изменений размеров в процессе роста необходимо избрать иной термин, так как со словом рост связано понятие об увеличении чего-нибудь.

В современной биологической литературе, когда речь идет о культурах клеток (растений или микроорганизмов), наряду с термином «рост» нередко используется термин «развитие».

Определение, в котором считается возможным отнести к росту явление, сопровождающееся увеличением числа клеток или биомассы, не только биологически содержательно, но и полностью приложим© к процессу роста клеточной популяции. Вместе с тем, наблюдения за культурами растительных клеток или микроорганизмов, свидетельствуют о том, что нередко увеличение числа клеток (размножение) или биомассы сопровождается изменением свойств

Таким образом, возможность количественного выражения динамики роста биологически многозначна: она дает основание думать, что изменение размеров и массы организма во время развития - есть результат координации множества факторов, т.е. рост представляет собой одну из функций системы как целого.

lo Jo Ршзлшчшые мемаиды и модх^ды жределетшм ржмт (тшршметры5

Б[есмотря на сложность и многосторонность процессов в клеточных популяциях, имеется единая основа подходов при их описании. Эту основу составляют динамические закономерности роста и развития клеточных культур, так как именно динамика изменения во времени является наиболее важной характеристикой всего живого и, прежде всего роста и развития популяций (Печуркин, 1978).

Основные закономерности наблюдаемых явлений могут быть выражены количественно,с помощью математических подходов. Смысл математического подхода заключается в выявлении общих закономерностей, но не подмены

экспериментального исследования (Печуркин, 1978,1974, 1975; Швытов, 1976).

Первая, после Мальтуса, по времени количественная теория роста принадлежала бельгийскому математику Л„ Кетле (1835). Он предпринял попытку найти объяснение тому, как действуют различные факторы, ограничивающие размеры популяций, и предположил, что сопротивление

N (t) - количество клеток в популяции в момент времени t

Учитывая далее вторую часть гипотезы Ферхгольста, приходим к так называемому «логистическому» уравнению (Швитра, 1988; Швьпгов, 1971, Печуркин, 1978).

N(t) = rx(1-®)xN(t)s (0=2)

к

где, к - максимальная численность популяции, возможная при данных условиях.

График, который отображает решение уравнения (0-2), называется логистическим законом развития популяции. Так возникла полезная гипотеза, с помощью которой можно математически описывать популяции. Эта гипотеза не была проверена имеющимися экспериментальными данными и повторно использована в 1920 г. американцем Р.Пирлом и Л.Ридом. Они показали, что изменение численности многих популяций в ограниченной среде действительно следует логистическому закону. Потому логистическое дифференциальное уравнение часто называют уравнением Ферхгольста-Пирла (Pearl, Reed, 1920).

Наряду с этим существует так называемая химическая теория роста, которая особенно подробно была развита Т. В. Робертсоном (1908). Он предложил описывать динамику роста популяций уравнением автокаталитических реакций. В силу этого кривая, которая свойственна реакции автокатализа, также имеет S-образнуго форму. Кривая в математическом смысле закономерна. Ей соответствует уравнение вида:

!д ——— = к х (| — !1) А-х 1

где, и - время достижения половины окончательного размера;

Существует несколько способов записи формулы Робертсона, например,

к

1 + ег

где: а и Ъ - константы;

' 1 + Юа+Ьх 5 где, А - рассто

х - время, прошедшее с начала роста;

а и Ъ - константы, определяющие наклон, изгиб и точку перегиба

В таком виде формулы соответствуют функции так называемой логистической кривой (Шмидт, 1978,1984). Как будет показано далее, на базе

и его

т.е. не вскрывают внутренних (локальных) механизмов, действующие в популяциях,

1о2о1о Дшншшшшт меточипыж тмужщшй р&етшшш ж р@жшм© тфшзедштеепшг©

культшштршашишшо

Культура растительных клеток, являясь самостоятельно функционирующей единицей, обладает свойствами, которые не вытекают непосредственно из свойств отдельных клеток (хота и зависят от них).

Прежде всего, к ним относятся количественные параметры, характеризующие популяцию как единое целое: величина или размер популяции, ее плотность. Плотность популяции определяется как число клеток в единице объема; либо суммарным весом (биомассой) (Перт, 1978; ПечуркинД 975).

' В условиях, благоприятных дом роста и развития популяций растительных клеток, число клеток находится в постоянной динамике. Динамика популяции складывается в результате баланса двух процессов: прироста числа клеток в результате размножения и их элиминации вследствие гибели. Прирост численности популяции можно охарактеризовать удельной скоростью роста, которая определяется как отношение прироста численности популяции к величине численности: <М

^ ~ N ~ ей

Обручева, 1975, 1976,1979), популяций (Печ�