Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гена rolC aгробактерий на процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточной культуре Panax ginseng C.A. Mey

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гена rolC aгробактерий на процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточной культуре Panax ginseng C.A. Mey"

На правах рукописи

ГОРПЕНЧЕНКО ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ГЕНА rolC АГРОБАКТЕРИЙ НА ПРОЦЕССЫ ОРГАНОГЕНЕЗА И СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ Panax ginseng С.А. Меу.

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2006

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный консультант:

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Корень Ольга Геннадьевна академик РАН Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ст.н.с. Одинцова Нелли Адольфовна, кандидат химических наук, ст.н.с.

Артюков Александр Алексеевич

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится « 12 » сентября 2006 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета К 005.003.01 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159. факс: (4232) 310193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО

РАН.

Автореферат разослан «Ж)» июля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.Н. Музарок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Женьшень настоящий Panax ginseng С.А. Меу. является одним из наиболее важных и известных лекарственных растений. Мировой объем производства и продажи препаратов женьшеня постоянно увеличивается, а проблема источника сырья становится все более актуальной. В основе биотехнологического получения растений, в гом числе и женьшеня, лежат процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Широко распространенные приемы, такие как использование экзогенных фитогормонов и индукция морфогенеза абиотическими факторами, далеко не всегда приводят к получению морфогенных структур или эмбриои-дов, поскольку дифференциация клеток в культуре in vitro зависит не только от внешних стимулов, но во многом определяется генотипом и текущим состоянием клеток экспланта (Бутенко, 1964; Лутова, 1994; Wang, Bhalla, 2004). Поэтому многочисленные исследования направлены па изучение состояния тотипотентности клетки, в котором она может выбирать направление дальнейшей дифференциации. Каскады реакций, запускающие работу генов, контролирующих различные этапы морфогенеза как в интактном растении, так и в культуре ткани, не всегда известны, а процесс развития клеток, тканей и органов трудно изменить (Mordhorst et al., 2002; Grop-Hardt, Laux, 2003). В связи с этим управление морфогенезом с помощью регуляции активности генов пр иобретает особое значение. Важное место в этих исследованиях занимает регуляция морфогенеза с помощью чужеродных генов, введенных в ДНК растений с помощью векторов.

Агробактерии широко используются для генетической трансформации растений. Гены rol содержатся в части плазмидной ДНК агробактерии (Т-ДНК) Agrobac-terium rhizogenes (Spena et al., 1987). При взаимодействии агробактерии с растительной клеткой гены в составе Т-ДНК интегрируются в хромосомы. Трансформация генами семейства rol приводит к неорганизованному росту клеток с изменением программы развития, при этом сохраняется способность клеток к дифференцировке. Отдельные гены семейства rol могут индуцировать образование апикальных меристем побегов. Вероятно, гены rol обладают общим регуляторным действием, которое представляет интерес для биотехнологии. Один из этих генов - ген rolC — индуцировал в клеточном штамме женьшеня образование структур, морфология которых напоминала побеги, эмэриоиды и корни. Это говорит о том, что экспрессии одного встроенного гена оказалось достаточно для придания клеткам трансформированного каллуса состояния тотипотентности и возможности реализовать все имею-

щиеся пути развития, что делает ген rolC весьма перспективным при изучении регуляции морфогенеза.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучение процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточных линиях женьшеня, интактных и трансформированных геном rolC, и создания на этой основе модельной системы для исследования регуляции морфогенеза.

Были поставлены следующие задачи:

1) Изучить особенности формирования и развития зародышей женьшеня в семени интактных растений, описать их морфологию и гистологию до диссеминации.

2) Изучить морфологию и гистологию клеточных линий женьшеня, трансформированных геном rolC.

3) Описать последовательность этапов органогенеза и соматического эмбриогенеза в трансформированной клеточной линии 2сЗ.

4) Провести молекулярный анализ трансгенных линий и оценить влияние экспрессии гена rolC на процессы дифференциации клеток женьшеня.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия гена rolC в трансгенных клеточных линиях женьшеня приводит к изменению программы развития клеток и вызывает разные типы дифференцировки клеток (гистогенез, ризогенез, геммогенез, соматический эмбриогенез).

2. Отдельный ген не растительного происхождения (ген rolC) способен индуцировать соматический эмбриогенез у растений женьшеня; этот процесс не является результатом мутации гена rolC, или следствием инсерционного Т-ДНК мутагенеза.

3. Начальные этапы развития соматического зародыша (эмбриоида) in vitro и полового зародыша in vivo у женьшеня протекают сходно.

4. В трансгенной линии 2сЗ развитие эмбриоидов осложняется процессом вторичного соматического эмбриогенеза и аномалиями развития, свидетельствующими о постоянном присутствии фактора, инициирующего образование новых апикальных меристем и эмбриоидов.

Научная новизна. Впервые изучены некоторые этапы развития зиготического и апомиктичного зародыша женьшеня до диссеминации. Проведено исследование влияния гена rolC на процессы дифференциации в клеточных линиях женьшеня. Впервые изучено формирование эмбриоидов и листьев в трансформированной геном rolC клеточной линии женьшеня, выделены характерные аномалии. Показано,

что уровень экспрессии гена rolC влияет на морфогенетические процессы в клеточных линиях женьшеня. Установлено, что органогенный и эмбриогенный пути развития в трансформированных клеточных линиях женьшеня не являются результатом мутации гена rolC, или следствием инсерционного Т-ДНК мутагенеза.

Практическая значимость. Получена уникальная модельная система для исследования и регуляции морфогенеза в культуре клеток растений. Данная работа может представлять интерес для специалистов, занимающихся процессами морфогенеза как in vivo, так и in vitro. Наличие у женьшеня возможности апомиктичного развития зародыша открывает новые перспективы в разработке технологий его размножения в промышленных условиях.

Полученные данные о репродуктивной биологии женьшеня могут служить основой для мероприятий по сохранению, восстановлению и реинтродукции этого ценного реликтового растения. Результаты работы могут представлять интерес для специалистов в области эволюции семян цветковых растений, т.к. дополняют сведения о природе явления доразвития зародыша, которое свойственно наиболее древним и примитивным формам (видам) цветковых растений.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на первом международном европейском конгрессе по женьшеню "Ginseng in Europe" (г. Мар-бург, Германия, 1998); международной конференции "Растения в муссонном климате" (г. Владивосток, 1999); на международной конференции "Ginseng: Its Sciences and Its Markets" (Гонконг, 1999); на конференциях молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (г. Владивосток, 2000, 2001); на международном Ботаническом конгрессе (г. Вена, Австрия, 2005), на 4" международном симпозиуме "21st- Century СОЕ Program, Promoting Environmental Research in Pan-Japan Sea Area" (г. Каназава, Япония, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 122 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, иллюстрирована 34 рисунками и содержит 10 таблиц. Список литературы содержит 263 наименования, из них 166 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность академику РАН Ю.Н. Журавлеву и к.б.н. О.Г. Корень за руководство при выполнении работы; чл,-корр. РАН Т.Б. Батыгиной (БИН им. Комарова, СПб) за теплый прием в лаборатории эмбриологии растений, всестороннюю помощь и консультации в работе; чл,-

корр. I'ЛII В.П. Булгакову (БПИ ДВО РАН) за рекомендации по подготовке рукописи работы; к.б.н. К.В. Киселеву (БПИ ДВО РАН) за помощь в проведении молеку-лярно-генстических исследований; к.б.н. Т.Н. Музарок, В.Н. Гапонову и Н.П. Гапо-новой за помощь в поддержании коллекции растений женьшеня; к.б.н. А.Б. Холимой, к.б.н. Е.М. Саенко (БПИ ДВО РАН) за рекомендации по подготовке рукописи работы; к.б.н. Е.А. Брагиной, д.б.н. И.И. Шамрову, к.б.н. Е.В. Андроновой, к.б.н. Г.Е. Титовой (БИН им. Комарова, СПб) за консультации в работе и помощь в освоении метода сканирующей электронной микроскопии растений.

Глава 1. Обзор литературы

В работе представлены литературные данные о размножении цветковых растений в естественных условиях и в культуре ткани. Рассмотрены литературные сведения об особенностях размножения P. ginseng in vivo и in vitro. Обобщены данные о факторах индукции и регуляции морфогенеза в культура* клеток и тканей растений.

Глава 2. Материалы и методы

В работе использованы растения Panax ginseng из природных популяций, ин-тродуцированные в питомники с искусственным затенением. Трансгенные линии были получены методом агробактериальной трансформации с использованием агро-бактериального вектора Agrobacterium tumefaciens GV3101. Векторная система GV3101 состояла из двух плазмид, одна из которых была pMP90RK (vír-хелперная плазмида), а вторая выбиралась в зависимости от цели исследования: pPCV002-CaMVC (в составе Т-ДНК ген rolC и маркерный ген nptll, кодирующий неомицин-фосфотрансферазу) или pPCV002 (в составе Т-ДНК находился маркерный ген nptll v. отсутствовал ген rolC) (Булгаков и др., 2000; Bulgakov et al., 1998). Получение и происхождение клеточных линий представлено на рис. 1.

Нетрансформированный штамм le (G), получен в лаборатории биотехнологии в 1990 году из стебля женьшеня (Булгаков и др., 1991) и использован в качестве контроля. Трансформированные клеточные линии были любезно предоставлены чл.-корр. РАН В.П. Булгаковым (гр. биоинженерии БПИ ДВО РАН).

Завязи женьшеня фиксировали на разных стадиях развития, при разных способах опыления в течение 28 суток с интервалом в 12 и 24 часа. Каллусы разных клеточных линий фиксировали одновременно, на 20-й и 30-й дни, культивирования. Пробы каллуса линии 2сЗ фиксировали каждые 3 дня с начала и до конца одного пассажа.

Постоянные препараты изготавливались по классической методике обработки растительных тканей. Для окраски использованы следующие сочетания красителей:

б

Петра нсформированный штамм G

Трансформация (iSS-rolC)

(первичные опухоли)

Трансформированная клеточная линия II (каллус)

С е л е

к Ц

и я

Трансформированные клеточные линии III, IV, V

(каллус)

Селекция

Трансформированная (шюяие Линия СШ клеточная линия III -корни) у (волосатые

(каллус)

Недифференцированные кл еточные агрегаты

Линия СИ

Неддифцренциротитые

клеточные агрегаты ш кончиков корней

(волосатые корни)

корни)

Линии 2с2,2сЗ (наморфогенный и морфогемный каллусы)

Линии R2, R33 (недифференцированные каллусы)

Рис. 1. Схема происхождение трансформированных клеточных линий.

реактив Шиффа по Фелъгииу (Паушева, 1988) с подкрашиванием альциановым синим, гематоксилин с эозином и гематоксилин по Гейденгайну с подкрашиванием альциановым синим (Камелина и др., 1992). Обработка для сканирующей электронной микроскопии проводилась по модифицированной методике, предоставленной лаб. эмбриологии растений БИН им. Комарова, г. Санкт-Петербург.

ДНК выделяли из высушенных каллусов женьшеня по методу Маниатис и др. (1984). Тотальную РНК выделяли при помощи набора «Yellow-Solve» (Clonogen, Санкт-Петербург, Россия) по методике производителя. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК и РНК оценивали спектрофотометрически (RF-1501, Shimadzu, Япония). В экспериментах использовали ДНК и РНК с показателем чистоты (260/280 нм) не менее 1,8-1,9. Доказательство трансгенности и экспрессии перенесенных генов проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и обратно-транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) по методике, описанной ранее (Bulgakov et al., 2005).

Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1 Особенности системы размножения и формирования зародыша женьшеня.

Опыление и завязываемость семян женьшеня. Оценка завязываемости семян изучалась в течение четырех лет при культивировании в оранжерее и в питомниках в разных условиях опыта: искусственное самоопыление, искусственное перекрестное опыление и тесты на апомиксис с изолированием отдельных цветков, из которых предварительно были удалены пыльники. Результаты опытов подтвердили наличие апомиксиса и показали, что завязываемость семян женьшеня без опыления была достаточно высокой в условиях оранжереи (32,7 ± 2,7 %). В естественных условиях завязываемость семян в изолированных цветках была ниже и варьировала в зависимости от года исследования от 0 до 11,8 %. Высокая завязываемость семян женьшеня при самоопылении, сравнимая с завязываемостью семян в естественных условиях, показывает, что у женьшеня отсутствует барьер самонесовместимости.

Изучение качества пыльцы у 20 растений женьшеня с помощью ацетокармино-вош метода показало, что в среднем различные аномалии в пыльце составили 44 %. Корреляционный анализ выявил наличие слабой связи между степенью дефектности пыльцы и процентом завязываемости плодов (15=0,36).

Строение генеративных структур. Завязь женьшеня двухгнездная. В каждом гнезде формируются два семязачатка, верхний и нижний. Верхние семязачатки недоразвитые, обычно в них образуются аномальные зародышевые мешки.. В редких случаях наблюдалось нормальное развитие верхних семязачатков, в которых образовывались полноценные зародышевые мешки. В зависимости от возраста, растения женьшеня могут формировать плоды с 3, 4, 5 и более косточками нормального размера.

Семязачатки женьшеня анатропные, медиокрассинуцелятные, унитегмальные, с фуникулусом, с длинным и узким микропиле. Формируется обтуратор. Зародышевый мешок развивается по Ро1у§опшп-типу. Зрелый зародышевый мешок 7-клеточный, 7-ядерный: состоит из яйцевого аппарата, содержащего яйцеклетку и две синергиды, центральной клетки с вторичным ядром и трех мелких антипод.

Опыление, оплодотворение, развитие зародыша. Двойное оплодотворение у женьшеня соответствует премитотическому типу. Период покоя зиготы варьировал в зависимости от способа опыления: при самоопылении он составил 15-20 суток, при перекрестном опылении — 18-25 суток, без опыления яйцеклетка остается в по-

кое более 23 суток. В это время эндосперм развивался во всех трех случаях по нук-леарному типу.

Зародыш женьшеня развивался по Бо1апа(1-типу развития зародышей. У зародыша хорошо развит суспензор. На стадии глобулярного зародыша в семени начинала формироваться эндоспермальная полость. На момент диссеминации зародыш находился на стадии раннего сердечка. Через 1 месяц после диссеминации у зародыша происходило развитие семядолей. Развитие полового зародыша женьшеня и зародыша, образовавшегося в неопыленных завязях, до диссеминации проходило одинаково. Таким образом можно заключить, что женьшень способен образовывать апомиктичные зародыши.

3.2. Морфология и гистология трансгенных линий женьшеня в зависимости от уровня экспрессии гена го1С.

Как правило, каллусные культуры женьшеня не способны к спонтанному соматическому эмбриогенезу и органогенезу. Каллусный штамм женьшеня в, полученный из проростков женьшеня, в течение продолжительного культивирования (более 15 лет) не проявлял морфогенетических свойств. После трансформации геном го/С каллусы штамма С приобрели способность продуцировать различные морфогенные структуры.

Для выявления эффектов, вызванных переносом гена гоЮ, был проведен морфологический и цитологический и молекулярно-генстический анализ культур представленных на рисунке 1.

Все линии перевивались в течение 10-12 лет и на момент исследования обладали стабильными морфологическими характеристиками. В автореферате приведено описание лишь некоторых трансформированных клеточных линий, обладающих высокой способностью к органогенезу и соматическому эмбриогенезу.

Характеристика нетрансформированного каллуса женьшеня (#. Клеточный штамм был представлен рыхлым каллусом белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. Каллус не менял морфологических и цитологических характеристик при культивировании на свету, увеличении содержания сахарозы в питательной среде, а также при культивировании на средах с различным соотношением цитокииинов и ауксинов. Цитологический анализ показал, что каллусная ткань состояла в основном из крупных тонкостенных клеток (80 %)

Рис. 2. Гистологический срез нетрансформированного клеточного штамма С (100 мкм).

округлой и овальной формы паренхимного типа (105 ± 22 мкм) (рис. 2). В каллусе присутствовали клетки мсристематичсского типа (18 %) округлой формы (48 ± 7 мкм).

Трансформация штамма G векторной плазмидсй не вызывает органогенез. Для подтверждения того, что морфогенетические эффекты в линии 2сЗ вызваны именно геном rolC, провели трансформацию каллуса штамма G агробактериями, в состав бинарного вектора которых входила плазмида pPCV-002. Плазмида pPCV-002 содержала маркерный ген nptll и не содержала ген rolC. Трансгенность полученной «векторной» клеточной линии GV была доказана методом ПЦР. Линия GV фенотипи-чески совпадала с исходным нетрансформированным штаммом G, цитологические данные подтвердили их аналогию. Полученные результаты показали, что ни экспрессия гена nptll, ни процедура агробактериальной трансформации не вызывала соматический эмбриогенез и органогенез в клеточном штамме G.

Органогенные эффекты в трансформированных клеточных линиях не обусловлены мутацией гена rolC. На основании имеющихся в литературе данных известно, что в результате ошибок при переносе Т-ДНК в геном растения, нуклеотид-ные последовательности переносимых генов могут значительно изменяться (Пухна-чева, 2005). Такие ошибки могли стать причиной возникновения эмбриогенного эффекта в трансформированных клеточных линиях. Для проверки данного предположения был секвенирован ПЦР фрагмент гена rolC из всех полученных трансгенных клеточных линий. Сравнение секвенированной последовательности с фрагментом гена rolC, находящимся в A. rhizogenes (GenBank, № К03313), доказывает, что ген rolC в трансформированных клеточных линиях не изменгн. .

Экспрессия гена rolC в трансформированных клеточных линиях. При трансформации чужеродные последовательности могут опознаваться растением и метилироваться (Meza et al., 2002), что влияет на стабильность и уровень экспрессии перенесенных генов (Iglesias et al., 1997). Перенесенный ген может быть встроен в ДНК растения, но не экспрессироваться. Методом ОТ-ПЦР был проведен анализ экспрессии гена rolC во всех исследованных трансген них линиях. Полученные результаты представлены на рисунке 3.

Наблюдаемые в трансформированных линиях морфологические и цитологические эффекты сравнили с уровнем экспрессии гена rolC.

Рис. 3. Экспрессия гена rolC в сравнении с экспрессией гена актина женьшеня в трансгенных клеточных культурах. Nc — негативный контроль (смесь для ПЦР без добавления растительной ДНК); Рс — позитивный контроль (для гена rolC: ПЦР продукт с pPCV002-roLABC; для гена актина: ПЦР продукт с ДНК женьшеня); GV -векторная культура; И, III, IV, V - культуры полученные из опухолей G-rolC в результате независимых трансформаций; 2с2, 2сЗ — линии полученные в результате селекции первичных опухолей II; ризогенные линии CII, СШ соответственно, полученные из линий II и III; R33, R2 - селективные неризогенные вторичные линии II.

Характеристика трансформированных геном го1С клеточных линий.

Линия 2сЗ: Трансфрмированная клеточная линия по структуре неоднородна, обладает светло-желтой окраской. Каллус линии 2сЗ состоит из внутренних слоев вакуолизированных клеток паренхимного типа, покрытых сверху слоями пролифелирующих мелких меристематических клеток (рис. 4). Доля меристематических клеток составляла 82 %, размер 24 ± 5 мкм. В массе меристематических клеток наблюдалось большое количество эмбриоидов, которые находились на начальных стадиях развития. Эмбриоиды на поздних стадиях обнаруживались достаточно редко.

Клеточная линия 2сЗ стабильно продуцировала эмбриоиды как на безгормональной среде (\У0), так и при добавлении синтетического ауксина 4-СРА (У^срд)- При этом добавление 4-СРА не влияло на число эмбриоидов в клеточной линии 2сЗ (табл. 1). Таким образом, процесс формирования эмбриоидов в клеточной линии 2сЗ не зависит от внешних ростовых регуляторов.

Линия 2сЗ характеризуется более высоким уровнем экспрессии гена го1С по сравнению с каллусными линиями (рис. 3). Очевидно, средний уровень экспрессии гена является необходимым фактором для проявления трансформированной линией наблюдаемых морфологических эффектов.

Рис. 4. Гистологический срез трансформированной клеточной линии 2сЗ (100 мкм).

Таблица 1

Количество эмбриоидов и побегов в каллусах штамма в и линии 2сЗ, растущих с добавлением 4-СРА (4-хлорфенолуксосной кислоты) и без добавления горм-

нов после 30 дней культивирования.

Объект и среда культивирования Свежая биомасса, гр Соматический эмбриогенез Органогенез (почки)

Норма Аномалии8 Норма Аномалии0

GW4cpa 2,9 ± 0,3 0 0 0 0

GW0 0,4 ± 0,05 0 0 0 0

2сЗ W4cpa 1,4 ±0,2 6,0 ± 2,0 20,5 ±3,5 34,7 ± 6,8 31,0 ±7,0

2сЗ W0 1,2 ±0,1 6,4 ± 0,6 13,6 ±2,5 38,2 ±5,9 22,0 ± 5,6

Результаты представлены как средние значения ± стандартная ошибка, наблюдаемые в пяти отдельных экспериментах, в 20 повторах проб для каждого эксперимента.

"срастание апикальные меристем, семядолей, или увеличение количества семядолей

6срастание апикальных меристем, побегов и листьев.

Линия трансформированных корней CII: Клеточная линия светлого желто-коричневого цвета, обладает хорошим ростом с образоианием латеральных корней второго и третьего порядков (рис. 5). Ризогенез в данной линии не зависел от действия регуляторов роста. Участки меристематических клеток, из которых происходило образование латеральных корней, располагались вдоль проводящей системы корня не равномерно, при этом происходило формиров:шие апикальной меристемы боковых корней и общей проводящей системы. Это обычный способ формирования боковых корней (Эсау, 1969). В редких случаях, и только на старых корнях, процесс образования корней шел через дедифференциацию клеток. В линии CII наблюдался очень высокий уровень экспрессии гена, практически максимально возможный при используемых нами условиях проведения ОТ-ПЦР (рис. 3).

Линия трансформированных корней CHI: Линия регенерирует корни, отличающиеся по своей морфологии от корней, образующихся в линии CII. Корни CIII крупнее, имеют более темную оранжево-коричневую окраску, с меньшим количеством латеральных корней второго и третьего порядка (ряс. 6). Важно отметить, что образование корней в этой линии происходило двумя путями: в одних случаях фор-

Рис. 5. Внешний вид трансформированной клеточной линии СИ (1 см).

мирование корней происходило как и в линии СИ, в других - молодые корни образовывались путем чередования процессов дифференциации и дедифференциации, через образование вторичных опухолей. Общей проводящей системы между корнями не образовывалось.

Периодически наблюдалось формирование меристем, цитологическое строение которых сходно со строением меристем каллуса линии 2сЗ. В редких случаях на кончиках корней происходило образование почек, морфология которых сходна с морфологией нативных почек на корнях женьшеня в естественных условиях. Однако цитологические

исследования выявили нарушения в организации меристематической ткани, ведущие к дезорганизации клеток почек. Уровень экспрессии гена го1С в корнях СШ ниже, чем к культуре корней СИ (рис. 3), что, по-видимому, обуславливает различия в морфологии и в количестзе морфологических направлений, вызывая одновременно ризогенез и геммогенез.

Линия V: Клеточная линия представляет собой медленно растущий, гетерогенный каллус светло-желтого цвета. Гистологическое исследование показало наличие

Рис. 6. Внешний вид трансформированной клеточной линии CIII (1 см).

большого количества мелких (22 ± 4 мкм) меристематических клеток (77 %). В результате последовательные делений часть этих клеток формировала 4-, 5-, 8- клеточные проэмбрио (рис. 7а). Морфология проэмбрио на ранних стадиях развития имеет большое сходство с начальными стадиями развития эмбриоидов в линии 2сЗ и зиготических зародышей женьшеня. В некоторых эмбриоидах отмечено изменение в закладке первых перегородок, что, по-видимому, приводит к нарушению нормального гистогенеза и появлению аномальных глобулярных эмбриоидов (рис. 76). Впоследствии происходит дезорганизация эмбриоидов и остановка их развития. Эмбриоиды распадаются на отдельные клетки и цикл начинается заново. В данной клеточной линии очаги меристематических клеток и

Рис. 7. Гистологические срезы трансформированной клеточной линии V (а - проэмбрио; б - глобулярный эмбриона с признаками деструкции; 50 мкм).

эмбриовды располагаются равномерно по всему каллусу. В морфогенной линии V наблюдается средний уровень экспрессии гена rolC, аналогичный уровню экспрессии в линии 2сЗ.

Таким образом, клетки недифференцированного штамма G, не способные к морфогенезу при стандартных гормональных воздействиях, после трансформации геном rolC вновь приобрели это свойство. В результате трансформации во всех клеточных линиях, полученных из штамма G, увеличивалось количество тотипотент-ных меристематических клеток. Анализ данных показывает, что уровень экспрессии гена rolC непосредственно связан с эмбриональной компетентностью клеток полученных каллусов. Низкий уровень экспрессии гена rolC не вызывает меристемати-зацию клеток, высокий уровень экспрессии гена приводит к ризогенезу и блокирует образование почек, и только средний уровень экспрессии гена rolC придает клеткам каллусов 2сЗ и V компетентность к соматическому эмбриогенезу.

33 Органогенез и соматический эмбриогенез в трансформированной геном rolC клеточной линии 2сЗ.

Органогенез: Эта клеточная линия обладает большей способностью к геммоге-незу (рис. 8), чем к формированию эмбриоидов. В каллусе присутствовали почки па разных стадиях развития. Для развития листьев в данной клеточной линии необходим свет. Чаще всего на более поздних стадиях развития почек соседние образования срастались между собой. Увеличивались апикальные меристемы, из которых вырастали уплощенные побеги, с 2-3 слившимися примордиями. Во многих случаях наблюдалась многопобеговость. Очень редко на свету в линии 2сЗ происходило образование корней (1,6 ± 0,4 корней на 1 г свежей каллусной массы, исследовано 400 каллусов). Освещение не влияло на количество образующихся эмбриоидов в линии 2сЗ, хотя и приводило к увеличению количества почек и корней.

Соматический эмбриогенез: Клетки эпидермального и субэпидермального слоев каллуса линии 2сЗ чаще формировали эмбриоиды, чем клетки внутренних слоев. Эмбриоиды, формирующиеся внутри массы клеток субэпидермального слоя, подвергались дезорганизации из-за нарушений последовательности делений. Они распадались на отдельные группы меристематических клеток или отдельные клетки, которые либо делились и становились паренхимными клетками во внутренних слоях каллуса, либо вновь, через некоторое количество делений, образовывали эмбриоиды. Эмбриовды, формирующиеся на поверхности, в большинстве случаев достигали поздних стадий развития, в отличие от эмбриоидов, находящихся внутри массы клеток. В своем развитии эмбриоиды проходили стадии глобулы и сердечка (рис. 8). В

каллусе одновременно присутствовали эмбриоиды на разных стадиях развития. Клетки эмбриоидов были слабо вакуолизированны, с плотной цитоплазмой. Несмотря на то, что полученные структуры в своем развитии проходили все начальные стадии, характерные для эмбриоидов в клеточных линиях и зиготических зародышей, практически все они имели аномалии или не могли развиваться дальше из-за инициации на их поверхности новых эмбриоидов. На поверхности эмбриоидов и в основании примордиев листьев образовывались вторичные эмбриоиды и почки. Дальнейшей дифференциации первичных структур не происходило, а отдельные эпидермальные клетки начинали снова делиться, давая начало следующему поколению эмбриоидов и почек. По-видимому, сигнал гена го/С в клетках постоянен и не зависит от стадии развития морфогенных структур. У 55 % эмбриоидов наблюдалось увеличение размеров апикальной меристемы. Около 28 % эмбриоидов сливались между собой в основании и в средней части. У 17 % эмбриоидов наблюдалось увеличение числа семядолей и их срастание.

Из литературных данных следует, что морфогенные клеточные культуры женьшеня нестабильны, что выражается в деградации клеточных структур (1о&Ы, Ти^, 2000; ЬагщИапяоуа е1 а1., 2004). Трансформированный каллус линии 2сЗ при длительном культивировании не проявляет признаков распада и деградации ядер клеток, его способность к соматическому эмбриогенезу остается стабильной в течение многих лет. Таким образом, на основании совокупности приведенных выше данных можно заключить, что экспрессия гена го/С вызывает постоянно возобновляемый незавершенный эмбриогенез. Отсутствие корректной термина-ции начальных стадий эмбриогенеза приводит к нарушению развития эмбриоидов. Это обстоятельство объясняет, почему эмбриоиды в клеточной линии 2сЗ не достигают поздних стадий развития.

Однако, оставался неясен следующий вопрос: не могло ли быть так, что вставка Т-ДНК в результате трансформации нарушила последовательность какого-либо собственного гена женьшеня, связанного с соматическим эмбриогенезом? Интеграция Т-ДНК в геном растения могла привести к разрыву последовательности какого-либо гена, ответственного за эмбриогенез (инсерционный мутагенез), что могло бы вызвать

Рис. 8. Эмбриоиды на разных стадиях своего развития (глобулярной и сердечковидной, СЭМ, 200 мкм).

появление эмбриогенных структур в изучаемых линиях. Мы изучили место встраивания Т-ДНК в геноме линии 2сЗ. TAIL ПЦР позволил идентифицировать сайт слияния Т-ДНК с участком растительной ДНК. Этот участок не имеет заметной гомологии с нуклеотидными последовательностями генов, информгщия о которых находится в Генбанке (NCBI BLAST). То есть, вставка не нарушила какой-либо известный ген, ответственный за эмбриогенез. Известно также, что для того, чтобы инактивировать какой-либо целевой ген в геноме арабидопсиса случайным образом, необходимо выполнить не менее 280 тысяч Т-ДНК инсерций (Rrysan et al., 1999). Поскольку в трансгенных культурах женьшеня возникновение апикальных меристем наблюдалось в трех независимо трансформированных культурах, вероятность того, что этот эффект вызван Т-ДНК инсерционным мутагенезом очень мала (-1/2800003). Поэтому мы считаем, что именно ген rolC явился причиной соматического эмбриогенеза и органогенеза в культурах клеток женьшеня. Описываемый нами случай является первым примером инициации процесса соматического эмбриогенеза отдельным онкогеном. Это также первый известный пример, когда ген не растительного происхождения инициировал соматический эмбриогенез.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показано в работе, клеточный штамм G в течение долговременного культивирования не проявлял признаков дифференцировки, в гом числе при стандартных воздействиях, используемых в биотехнологии для получения морфогенного ответа. Трансформация геном rolC клеток этого штамма привела к появлению клеточных линий, в которых наблюдались различные морфогенетические процессы, такие как ризогенез, геммогенез и соматический эмбриогенез.

Эмбриоиды, полученные в результате трансформации клеточного штамма G, в течение развития проходили все начальные стадии, характерные для эмбриоидов в нетрансформированных клеточных культурах растений. При этом трансформированные геном rolC эмбриоиды имели биполярное строение и оформленные корневые апексы. Способностью к образованию эмбриоидов обладали клетки эпидер-мальнош и субэпидермального слоев эмбриовдов, примордиев листьев и плотног-лобулярного трансформированного каллуса линии 2сЗ. Клетки трансформированного каллуса 2сЗ при одинаковых условиях культивирования способны формировать почки и эмбриоиды. Сходство начальных стадий образования эмбриоидов в трансформированных клеточных линиях и зародышей в растениях женьшеня, установленное нами в результате этой работы, подтверждает адекватность полученной модели для изучения процессов эмбриогенеза женьшеня.

16

Экспрессия гена rolC под контролем сильного промотора в трансформированной клеточной линии 2сЗ вызывает инициацию эмбриоидов из соматических клеток посредством прямого соматического эмбриогенеза и препятствует завершению их развития путем постоянно возобновляемой инициации новых эмбриоидов. Эго наблюдение свидетельствует а пользу предположения, что действие гена ro/С в клетках трансформированного каллуса постоянно и не зависит от стадии развивающихся эмбриоидов. На протяжении многих лет эмбриогенная способность трансформированной клеточной линии 2оЗ остается стабильной, что позволяет направленно изучать инициацию соматического эмбриогенеза как постоянный и независимый процесс.

Наблюдаемые нами эффекты очень сходны с эффектами, вызываемыми конститутивной экспрессией гомеобокс-содержащих генов WUSCHEL (WUS) и CLAVATA (CLV), определяющих возникновение и поддержание идентичности стволовых клеток у растений. При нарушении работы генов CL V наблюдаются нарушения в развитии апикальных меристем: увеличенные или уплощенные апикальные меристемы (Clark et al., 1993; Clark et al., 1996). Показано, что нарушения баланса соотношения экспрессии генов WUS и CLV в сторону увеличения экспрессии гена WUS или уменьшения активности генов CLV, приводили к повышению эмбриогенного потенциала каллуса и образованию увеличенных и слившихся меристем (Brand et al., 2000; Schoof et al., 2000). Важно отметить, что экспрессия гена WUS с конститутивного промотора приводила к образованию постоянно возобновляемых вторичных соматических зародышей и апикальных меристем побега (Zuo et al., 2002). Таким образом, наличие постоянной инициации прямого соматического эмбриогенеза, срастание и увеличение апикальных меристем в трансформированной линии 2сЗ может свидетельствовать о нарушении баланса экспрессии генов WUSICLV и связать действие онкогена с известными на сегодняшний день механизмами образования и поддержания идентичности стволовых клеток растений.

ВЫВОДЫ

1. Растения женьшеня способны образовывать апомиктичные семена. Количество апомиктичных семян in vivo меняется в разные годы, максимальное количество образовавшихся апомиктичных семян составило в среднем 32,7 %. Процессы развития полового и апомиктического зародышей женьшеня осуществляются сходно.

2. Доля стерильной пыльцы варьирует у растений женьшеня от 0 до 100 %, в среднем она составляет 44 %. В строении гинецея аномалий не обнаружено.

3. Транформация онкогеном агробактерий rolC меняет программу развития клеток женьшеня. В трансформированных клеточных линиях осуществляются различные сценарии дифференцировки: гистогенез в клеточных линиях III, IV, 2с2, R2, R33; ризогенез в линиях СП, СНГ, геммогенез и соматический эмбриогенез в линиях V, 2сЗ. Процесс соматического эмбриогенеза в трансформированной геном rolC клеточной линии 2сЗ сопровождается процессами геммогенеза и в редких случаях — ризогенеза. Введение гена rolC в ДНК клеток женьшеня обуславливает увеличение количества меристематических клеток в каллусах.

4. Образование эмбриоидов в трансформированной клеточной линии 2сЗ осуществляется через прямой соматический эмбриогенез. Эмбриоиды не завершают развития из-за инициации на их поверхности вторичных эмбриоидов и дополнительных апикальных меристем, которые развиваются в листья. Клетки эпидермального и су-бэпвдермальных слоев эмбриоцдов обладают высоким морфогенным потенциалом.

5. Начальные этапы развития эмбриоидов женьшеня в трансформированных клеточных линиях 2сЗ и V имеют сходство с этапами развития полового зародыша. Деление клеток отдельных эмбриоидов на начальных стадиях развития происходит с нарушениями, которые сохраняются впоследствии. В трансформированной клеточной линии V это приводит к нарушению гистогенеза и гибели эмбриоидов.

6. В трансформированных клеточных линиях уровень экспрессии гена rolC различен. Низкий уровень экспрессии не вызывает морфогенетического эффекта. Средний уровень обеспечивает постоянно возобновляющиеся процессы соматического эмбриогенеза и геммогенеза. Высокий уровень обеспечивает процесс ризогенеза и блокирует геммогенез. При этом все морфогенетические эффекты в клеточных линиях женьшеня не являются следствием мутации гена rolC или инсерционно-го Т-ДНК мутагенеза,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Корень О.Г., Крылач Т.Ю. (Горпенченко), Журавлев Ю.Н. Изучение системы размножения Panax ginseng С.А. Mey. // Растения в муссонном климате (Материалы межд. конфер., посвящ. 50-летию Ботанического сада-института ДВО РАН). Владивосток: Дальнаука, 1998. С. 100-103.

2. Koren O.G., Krylach T.Yu. (Gorpenchenko), Zaytseva Yu.A., Zhuravlev Yu.N. Floral biology and embryology of Panax ginseng C.A. Meyer // Ginseng of Europe (Weber H.Chr., Zeuske D., Imhof S., eds.). Proceedings of the First European Ginseng Congress. Philipps-Universitat, Marburg, Germany, 1998. P. 221-231.

3. Koren O.G., Krylach T.Yu. (Gorpenchenko), Zhuravlev Yu.N. Evidence of partial apomixis among cultivated Panax ginseng plants detected by the autosegregation of genetic markers II Proceedings of the Int. Ginseng Confer.'99: "Ginseng: Its Sciences and Its Markets", 8-11 July, Honk Kong, 1999. P. 76.

4. Zhuravlev Yu.N., Koren O.G., Kozyrenko M.M., Reunova G.D., Artyukova E.V., Krylach T.Yu. (Gorpenchenko), Muzarok T.I. Use of molecular markers to design the reintroduction strategy for Panax ginseng II Biodiversity and allelopathy: from organisms to ecosystems in the Pacific (Chou C.H., Waller G.R., Reinhardt C., eds.). Academia Sinica, Taipei, 1999. P. 183-192.

5. Горпенченко Т.Ю., Корень О.Г. Оплодотворение и апомиксис Panax ginseng С.А. Mey. II Тез. VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 2000. С. 222.

6. Горпенченко Т.Ю., Корень О.Г., Журавлев Ю.Н. Биология размножения Panax ginseng С.А. Mey. II Растения муссонного климата (Труды П-ой международной научной конференции). Владивосток: Дальнаука, 2000. С. 57-58.

7. Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Tchemoded G.K., Bragina E.A., Khodakovskaya M.V., Koren O.G., Batygina T.B., Zhuravlev Yu.N. Somatic embryogenesis in transformed cell culture of Panax ginseng И XVII International Botanical Congress (Abstracts). Vienna, Austria, 2005. P. 648.

8. Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Bragina E.A., Khodakovskaya M.V., Koren O.G., Batygina T.B., Zhuravlev Yu.N. The Agrobacte-rium rhizogenes ro/C-gene-induced somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Panax ginseng transformed calluses II Planta. 2006. V. 223. P. 457-467.

9. Gorpenchenko T.Y., Koren O.G., Zhuravlev Yu.N. Sexual and asexual breeding in Panax ginseng C.A. Meyer // 4th International Symposium of the Kanazawa University: 21S1-Century СОЕ Program, Promoting Environmental Research in Pan-Japan Sea Area, Young Researchers' Network (Abstracts). Japan, 2006. P. 58-59.

ГОРПЕНЧЕНКО ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

Автореферат диссертации

ВЛИЯНИЕ ГЕНА rolC АГРОБАКТЕРИЙ НА ПРОЦЕССЫ ОРГАНОГЕНЕЗА И СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ Panax ginseng СЛ. Меу.

Подписано в печать 14.06.2006 г. Формат 60x90/16. 1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ Ш 18.

Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» ч Г. Владивосток, ул. Западная, 10