Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение метаболизма и физико-химические свойства каталазы из культуры ткани PANAX GINSENG в норме и при тепловом шоке

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение метаболизма и физико-химические свойства каталазы из культуры ткани PANAX GINSENG в норме и при тепловом шоке"

I 2 ,9 0

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ЛЕНИНГРАДСКИЙ ХИМ ИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК. 577.158.7; 581.143.6

ХОН ПХЕ ИЛЬ

ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КАТАЛАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ PANAX GINSENG В НОРМЕ И ПРИ ТЕПЛОВОМ ШОКЕ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.04. — БИОХИМ ИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1990

Работа выполнена на кафедре биологической химии Ленинградского химико-фармацевтического института.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор КОМОВ В. П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, дважды лауреат Государственной премии, профессор БРЕСТКИН А. П. доктор биологических наук, профессор ЗАИКИНА Н. А.

Ведущая организация: I Ленинградский медицинский институт им. академика И. П. Павлова.

Защита состоится « ¿Г» 1990 г. в ^ час. на

заседании специализированного совета К. 098.02.02. при Ленинградском

химико-фармацевтическом институте по адресу: 197022, Ленинград, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат диссертации разослан « » / '^90 г

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук М- КАШКИНА

< ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

! Актуальность темы. В последние годы значительно возрос интерес к методам культивирования ткани и клеток растений. Это связано как°с увеличением роли клеточных культур в фундаментальных иссле-

I в

дованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитоло-. гии растений, так и возможностью практического применения клеточных технологий в медицине, сельском хозяйстве и промышленности. Б связи с возросшим интересом к вопросам, связанным с биотехнологией растений, методы клеточных культур стали широко применять в биологичеазта исследованиях, так как культура тканей является удобным объектом в экспериментальных работах и достаточно адекватной моделью для оценки различных процессов обмена веществ у растений (Бутенко, 1986). В настоящее время культуры растительных клеток успешно используются в качестве источников ферментов и продуктов вторичного метаболизма, а также как модельные системы для изучения дифференциальной экспрессии генов (^л^в}- , 1987; ипЛяефК > ре°та<п. , 1987; Диксон, 1989).

Объектом данного исследования был выбран фермент каталаза. Каталаза всегда присутствует в клетках, где происходят процессы клеточного дыхания с участием цитохромов. Самой характерной функцией каталаз является высокоэффективный катализ разложения перекиси водорода. Несмотря на то, что в настоящее время каталазы хорошо изучены в яивотных, микробных и растительных клетках, до сих пор не проводились какие-либо исследования этого важного для аэробной клетки фермента в культуре растительных тканей. Кроме того каталаза может представлять большой интерес для практической медицины, так как данный фермент входит в состав комплексного лекарственного препарата "Пероксинорм", применяющегося для лечения

ряда заболевали! (petкаи , 1978; M-'cheJson , puget , 1979).

Изучение каталазы проводили на промышленном штамме каллусной культуры ралах ¡¡-nseng в норме и при действии теплового шока. Одним из важнейших, направлений современной фитофизиологии и биохимии является изучение регуляторных механизмов устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Наиболее изучен в этом отношении эффект теплового шока, важной особенностью которого является синтез набора полипелтидов - белков теплового шока (БТШ) или стрессовых белков. Открытие стрессовых белков вызвало большой интерес и стимулировало проведение рада работ ( Nov«- et а|, 1984; bndgusi , 1989).

За последние годы получены существенные результаты в области исследований синтеза белка клетками прокариот и эукариот в условиях стресса. Установлено, что при действии неблагоприятных факторов может происходить не только синтез новых стрессовых белков, но и изменяться содержание некоторых белков, присущих клетке в нормальных для нее условиях. В частности, было выяснено, что понижение температуры индуцирует в клетках пшеницы образование как новых стрессовых белков, так и усиливает синтез некоторых уже имевшихся в клетке полипептидов (Петрова и соавт., IS85; Кобаев и соавт., 1987; Roberts , 1968).

Установлено также, что различные виды экстремальных воздействий вызывают резкое изменение активности и изоферментнсЬо спектра пероксадаэы растительных и микробных клеток (Савич, 1989).

Таким образом, в настоящее время показано, что под воздействием стрессовых факторов в клетках формируется уникальный "стрессовый" набор белков, который образует оптимальное соотношение белков с требуемыми для нормального функционирования клеток свойствами (Войников, 1989; Аётхокин, 1989).

Известно, что ферменты являются ключевыми структурами, влияющими на направленность и интенсивность метаболизма клеток. Их роль особенно возрастает в стрессовых условиях, когда наблюдается дискоординация обменных процессов. Особую роль в адаптации к внешним факторам у растений играют, в частности, такие ферменты как ка-талаза, пероксида'за и супероксидцисмутаза - защищающие клетки от токсичного действия кислорода и перекисных соединений.

В связи с вышеизложенным, а также учитывая тот факт, что анализ синтеза и стабильности каталазы в процессе онтогенеза растительных тканей и, в частности, культуры ткани женьшеня не был предметом специального исследования, изучёние каталазы каллусной культуры pan ах ginseng при экстремальном вЬздействии представляется перспективным и актуальным.

Задачи исследоваЬдя. Целью работы являлась оценка влияния экстремальных воздействий, в частности, теплового шока ва метаболизм каталазы в промышленном штамме каллусной-культуры рапах

ginseng-.

í

Были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать динамику изменения активности, физико-хими-чесвие свойства и молекулярную гетерогенность каталазы в течение роста каллуса.

2. Выделить и очистить каталазу в виде индивидуального белка, а также получить к не! моноспецифические антитела.

3. Расчитать скорости накопления, распада и время "полухизни" каталазы в культивируемых клетках женьшеня.

4. Определить место локализации каталазы в культуре клеток рапах ginseng. .

5. Исследовать влияние теплового шока на содержание и физико-хими-

мические свойства каталазы, ее молекулярную гетерогенность и обмен в клетках культуры ткани.

Научная новизна. Впервые установлено, что каталаза локализована в цитозоле, митохондриях и пероксисомах (глиоксисонах) клеток культуры ткани рапих ддп^&л^ . Показано, что в процессе роста ткани каллуса происходит перераспределение активности каталазы между растворимо! фракцией клеток и ее субклеточными органел-лами [митохондриями и пероксисоыами (глиоксисомамиЗ. В результате проведенных исследований были изучены динамика изменения уровня активности каталазы и содержания белка в течение роста ткани женьшеня, а также молекулярная Гетерогенность каталазы. Разработан ноЕыДчСпоооб выделения и очистки каталазы, изучены некоторые физико-химические и кинетические свойства фермента. Показано, что каталаза из культуры ткани рапа* ^-пгелд по ряду показателей ( оптимум рН, температура, молекулярная масса и др.) имеет сходные характеристики с ранее изученными каталаза:.ш из животных, микробных и растительных клеток.

Впервые изучены скорость синтеза и стабильность каталазы в культуре ткани женьшеня;

В работе оценено влияние теплового шока на состояние каталазы и общего белка в каллусе женьшеня. Установлено, что непосредственно после температурного воздействия в клетках увеличивается скорость спонтанной деградации как каталазы, так и общего бежа.

Показано, что через 24 часа после теплового стресса резкое снижение содержания катала&ы в клетках женьшеня обусловлено достоверным подавлением скорости ее биосинтеза.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют и углубляют наши представления о механизмах биосинтеза, стабильности и функционирования индивидуальных бежов в растительных клетках. Кроме того, данные результаты дополняют ухе тлеющуюся информацию о физиологическом состоянии растительной клетки в экстремальных условиях, в частности, при тепловом шоке и позволяют отнести каталазу, наряду" с пероксидазой, к стрессовым белкам растений.

Выполненная работа является теоретическим исследованием- с перспективным практическим выходом. Во-первых, культура ткани ра.па-< цхпзещ является промышленным штаммом и используется для получения отечественных лекарственных препаратов биоженьшеня и в парфюмерной промышленности для приготовления мазей, лосьонов и др. В связи с этим разнообразные биохимические исследования клеток кеньшеня являются необходимым условием для дальнейшего усовершенствования биотехнологии данной культуры ткани. И, во-вторых, в настоящее время каталаза входит в ряд зарубежных комплексных ле-карстьенных препаратов, содержащих супероксидцисмутазу, которые имеют очень широкий спектр применения в медицине. Культура ткани Ранах может быть использована как дешевый и доступный

продуцент белка каталазы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков, диссертация состоит из введения, обзора литературы, патериалов .и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего наименования, из них на иностранных языках.

- 6 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССВДОВАШЙ

Работу проводила на калдуоной культуре ткани женьшеня, штамм ралах С. А. меу. Т. ф. р^е-1 ВКхр . полученной из корня нативно-

го растения по методюсв Бутеако (1964). Культивирование ткани осуществляли следующим образом: разрыхленную ткань весом 2.5-3.5 г в возрасте 30-35 суток дересаивали на 50 мл агаризованный питательной среды (Писедкая, Бутенко, 1970). Культуру выращивали в темноте при 26°С. Для выделенжя цнтозольной фракции из клеток, навеску биомассы гомогенизировали на холоду с 0.05 М трис-солянокислым" буфером (рН-8.0) в соотношении 0.5 мл буфера на I г сырого веса мани. Полученный гомогенат оставляли на холоду в течение 30 ыинут, а затем центрифугировали при ЮБОООдЗО минут ( Веоктал , США). Осадок отбрасывали, а в супернатанте определяли содержание белка по методу Лоури -{Ломгуу е* а! , 1951) и активность каталааы (Бах, 1937; Комов и соавт., 1975).

Для определения места локализации каталазы в органеляах клетки ткани женьшеня использовали метод Мура и Биверса ( МооЬ^Вее-v*^2t 1975). Активность дитохромоксидази определяли по методу Смита ( £ т;. , 1955). Выделение и очистку каталазы проводили в две стадии: фракционным высаливанием каталазы сульфатом аммония из су-пернатанта (105000 $) с последупцей афс£инной хроматографией обогащенной каталазной фракции на 1ДА-целлюлозе. Гомогенность оделенного фермента определяли методом электрофореза в 7.5 ИААГ. Специфическое окрашивание геле$ на активность каталазы осуществляли по методу Вурбурга (иМЬм^ , 1971).

Определение молекулярной массы каталазы проводили методом электрофореза в 7.5% ГШГ и 10% 11ААГ в денатурируидкх условиях по методу Леммли ( ]_<ммпт[у , 1970). Расчет вели но методу Вебера (^Уег , сеЬоьи , 1969). Антисыворотку к каталазе из культуры

клеток р^пах ¡¡;пз&»1$ цолучали иммунизируя кроликов гомогенным препаратом фермента. Специфичность антител оценивали при помощи двойной радиальной иымунодиффузии в 155 агаре Дифко по методу Ох-терлони ( О^сМ^оп^ , 1949) и диск-электрофорезом преципитатов в 10? ПААГ в присутствии Йа-М» ( Ымчп^у , 1970, а4, 1980).

Параметры кругооборота каталазы и тотального белка оценивали с помощью радиоиммунологических методов анализа, используя ^-лейцин. Радиоизотоп (удельная радиоактивность 157 мкКи/ммоль) вводили в каллус при лоМовд инъекционной жгли в асептических условиях, из расчета 150 мкЕи на 10 г каллуса. Обмен общего белка и каталазы оценивали на 1-5 сугни после введения ^-лейцина. Радиоактивность проб измеряли в системе толуол-РРО-РОРОР "на сцинтшйявдоннам счетчике Мал-к-Я (США). Концентрацию каталазы в клетках расчитывали двумя независимш/и методами: исходя из общей активности фермента в соответствующей фракции и активности I иг гомогенного белка каталазы и методом простой радиальной диффувил в агаре, предложенным Манчини (1963). Скорости синтеза и распада каталазн и общего белка определяли по методу Шимке ( Зелике, 1975), время "полужизни" - по методу Ариаса ( е* а-1 , 1969).

Для изучения влияния теплового шока на активность и обмен каталазы, культуру женьшеня подвергали тепловой обработке в течение 3 часов при 45°С. В первой серии опытов клетки использовались для дальнейшей обработки непосредственно после теплового шока. Во второй - культуру ткани после теплового шока выдерживали сутки при 26°С в темноте.

Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента. Различия считали достоверными'при Р0.05.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование динамики изменешя уровня активности и молекулярной гетерогенности каталазы. В течение 40 дней роста культуры клеток женьшеня каздые пять дней определяли активность каталазы, содержание белка и массу ткани. Как видно из рисунка I, концентрация белка в каллусе женьшеня достигала своего максимума к 15-20 суткам и далее существенно не изменялась в течение всего Бремени культивирования клеток. Наблюдаемое снижение содержания общего белка в культуре ткани к 40 суткам можно объяснить, в частности, истощением питательной среды и старением каллуса, не пересаженного на новую питательную, среду. Каталитическая активность каталазы описывается кривой с двумя максимумами на ¡20 и 35 сутки роста. Характерно, что увеличение активности каталазы практически совпадало с возрастанием митотической активностью клеток и приростом сырой массы культуры ткани (Писецкая, Бутенко, 1971). Повышение каталитической активности в эти сроки культивирования связано, по-видимому, с усилением процессов биологического окисления и интенсификацией дыхания в делящихся клетках (Селихатова, 1980). Методом электрофореза в 7.5& ПААГ выявлено, что в процессе роста клеток на 15-20 сутки наблюдается увеличение чиала изоформ каталазы с 3 до 4-5, а к концу срока культивирования ткаш! число молекулярных форм каталазы равно трем. Данные представлены на рисунке 2.

Ранее молекулярная гетерогенность каталазы была однозначно установлена в работах многих авторов (üauidabos , 1968; pi-jed et al, »970; Masbej-s , 1270). Количественные изменения изоферментно-го спектра и качественное перераспределение активности каталазы между ее отдельными изоформаш, по-видимому могут являться отра-

| 60 >50

1 40

<3

§

8 к 30

л

о

§ 20

а ^ §

а

10

30 20-

иг/т

§20 ч а> ю и

•

« ч 3

•|ю £ аЗ О

о я 1

5

10

15'

20

25

30

35

*Ч I

40

Рис; I Активность каталазы, содержание белка и масса каллус« женьшеня в течение роста.

■ I - активность каталазы, 2 - концентрация белка, 3 - масса каллуса.

<

"Р

I

г \

а в

а в

а в 'с

И

Рис. 2 Молекулярная гетерогенность каталазы в клетках культуры рмах 8-п$еп^, а - 15, в - 25, с - 35 суток.

1 - контроль;

2 - шок (I серия опытов);

3 - шок (2 серия опытов).

жением процессов, происходящих на уровне м-РНК или процессинга каталазы в ходе роста каллусной культуры женьшеня и обусловлены метаболическими потребностями клетки.

Докализагшя каталазы в культуре ткани женьшеня. Установлено, что каталаза присутствует в цитозольной и суммарной митохондрии-альной фракциях клеток женьшеня. Причем в процессе роста и старения ткани происходит количественное перераспределение фермента в этих клеточных органеллах (рисунок 3), Тещ, на 15 сутки роста клеток более 60$ всей активности каталазы локализовано во фракции митохондрии и пероксисом (глиоксисом), что указывает на более интенсивный метаболизм кислорода в данных фракциях клетки. Напротив, в

• ^

стареющей каллусной ткани больше половины суммарной активности . фермента приходится на цитозольную фракцию клеток ткани.

Рис. 3 Распределение активности каталазы в суммарной'.митохонд-риальной (А) и цитозольной (Б) фракциях клеток женьшеня в

процессе их роста.

Было бы весьма интересно сопоставить полученные данные с соответствующими результатами других авторов, однако, подобного рода исследования нами в литературе не обнаружены.

Выделение и очистка каталазы из культуры ткани женьшеня. Для выделения и очистки каталазы был использован новы! метод, основанный на применении дигавдообменно! хроматографии. Разработан и применен двухстадийный способ получения гомогенного фермента с выходом 69?, включающий в себя предварительное фракционирование посредством сульфата аммония и аффинную хроматографию на 1ДА-целлюло-зе. Данные представлены в таблице I и рисунке 4. Известно, что в ФРГ и Швеции был'создан комплексный препарат "Пе-роксинорм", включающий в себя ферменты суперксиддисмутазу и ката-лазу. Эффективность препарата настолько велика, что в ряду противовоспалительных средств он занимает ведущее место. Следует отметить, что выделение и очистку каталазы проводили из промышленного штамма, используемого на заводах ММП СССР для получения спиртовой настойки женьшеня. В связи с этим можно полагать, что разработанный метод может быть внедрен в промышленное производство и катала-за в качестве одного из компонентов препарата "Пероксинорм" может выделяться как из нативной каллусной ткани, так и из отходов производства настойки женьшеня.

Исследование физико-химических свойств каталазы. При определении молекулярной массы фермента диск-электрофорезом в $,5% ПААГ в качестве маркеров были взяты белки с известной массой: пируват-киназа, каталаза, альдолаза, креатинфосфатаза, алкогольдегидроге-наза, сывороточный альбумин. Установлено, что молекулярная масса каталазы составляет 240-250 кДа. Диск-электрофорез в Ю/о ПААГ в денатурирующих условиях выявил одну белковую зону. Таким образом,

Диск-электрофорез в 7,5% ПААГ

I

1—I

V3

16 18

номер фракции

Рис. 4 Очистка каталазы на 1ДА.-цедлюдозе

I - активность каталазы, 2 - выход белка.

Идентификация белковых зон(а) и активности каталазы (б) в геле.

Таблица I

Очистка каталазы из культуры ткани pcuwwt g.-nse-ng,.

Стадия

общ. общ. общ.актив- белок, удел.ак- степень выход объем, белок ' ность, тивность, очистки

(мл) (мг) (мкм/мл мин) (мг/мл) (мкм/мг) (%\

гомогенизация (супернатант)

насыщение 20$ (супернатант)

30

30

63

60

2250

2150

2.1 35.7

1.9 40.1

100

92

высаливание

40%сульфатом

аммония

8 14.4 1910

1.8 132.6

3.7

87

I

аффинная хроматография на ISA -целлюлозе

высаливание сульфатом аммония (4 да)

1.34 1562

1.05 1168

0.33 II65.7 32.6 69.4

0.32 III2.3 33.4 52

исследование очищенной каталазы методом диск-электрофореза в ПААГ в присутствии ¿ds-tia. показало, что фермент, по-видимому, состоит из 4 идентичных полипептидных цепей молекулярной массой 63 кДа, что согласуется с данными литературы для фермента, выделенного из разных ИСТОЧНИКОВ (Summe* , Но.1оч , 1938, ßchhoedes fcta|,I964, Webet- , 1265). Показано, что оптимальная температура для проявления активности каталазы составляв? 20-25°С. При дальнейшем повышении температуры активность постепенно снижалась, достигая при 45°С лишь половины своего максимального значения. Определение зависимости активности каталазы от pH проводили в интервале от 7 до 10. Найдено, что оптимум pH для фермента из ткани женьшеня равен 8.0.

Изучение обмена каталазы и общего белка в культивируемых клетках женьшеня. Скорости синтеза, распада и время "полужизни" общего белка и каталазы определяли, используя иммунохимические и радиоизотопные методы. Экспериментальные кривые, характеризующие скорости включения 14С-лейцина в белки и деградации каталазы и тотального белка в каллусе, представлены на рисунке 5. Выявлено, что включение изотопа в исследуемые белки достигало своего максимума через 4 часа после внесения в каллус. Установлено, что в I г каллусной ткани находится 68 мкг каталазного белка или 2.5$ от общего количества белка в клетке (таблица 2).

Распад старого, выведенного из пула функционирования фермента составил 0.655 сут-^, что соответствует около 3$ общего количества каталазного бежа. Время "полужизни" фермента в 3.3 раза ниже, чем усредненная стабильность белка в клетке. Эти данные указывают на высокую лабильность каталазы из каллуса женьшеня, что совпадает с результатами авторов, работанцих с каталазой из животных'тканей (Комов и соавт., 1984).

15 60

"гад зоб

мин

Рис.5. Включение радиоизотопа С14 -лейцина в общий белок (а) * . и каталазу (б) в каллусе женьшеня.

-17-

Обмен каталазы в каллусе культуры ткани

Таблица 2

Условия ка • * 1/2 • кз • Е

опыта сутГ* сут щг/г сут щг/г

норма тотальный

белок 0.20 3.47 543.00 2720.0

каталаза 0.66 1.06 44.54 ' 68.00

шок I серия тотальный

белок 0.47 1.47 1021.0 2165.0

каталаза 0.79 0.88 43.70 55.25

шок 2 серия тотальный

белок 0.30 2.34 631.00 2132.0

каталаза 0.42 1.65 26.78 63.75

Примечание:

Кд - константа скорости распада, - константа скорости синтеза, Ь^ время функционирования, В - концентрация белка.

- 18 -

Влияние теплового шока на активность, молекулярную гетерогенность и обмен каталазы в процессе роста культуры. Известно, что различные стрессовые ситуации в том числе и тепловой шок, в первую очередь, воздействуют на генную активность, механизмы трансляции и, следовательно, на всю программу белкового метаболизма. Этот факт в полной мере подтверждается в наших экспериментах. Исследуя влияние теплового шока на синтез, стабильность и свойства каталазы, мы сочли целесообразным провести 2е серии опытов, в одной из которых каталазу анализировал* сразу после теплового воздействия, другая же серия предусматривала 24-часовую адаптацию при температуре выращивания каллуса. Таким образом, мы попытались определить не только изменения таких параметров, как скорость накопления нсвосинтезированного фермента, скорость его распада и, следовательно, время функционирования, молекулярную гетерогенность и биологическую активность в условиях теплового шока, но и обратимость данных изменений.

В литературе имеется л™* незначительное число работ, посвященных исследованию стресса не белок-синтезирущие процессы в культивируемых растительных клетках. В частности, было установлено что тепловое воздействие вызывает снижение синтеза рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы ( У-'еи-Ьпд. , Кеу , 1985). В нашей работе также наблюдается уменьшение скорости синтеза каталазы после воздействия высокими температурами на каллусную культуру женьшеня.

Процессы синтеза белка сопряжены с его распадом, что обеспечивает наличие необходимого и достаточного количества молекул функционирующего фермента в соответствующих компартментах клетки. Поэтому процессы биосинтеза белка следует рассматривать с учетом его стабильности и элиминации из пуля функционирующих ;п ума мо-

го

«10 о ч

)2

.20

^ 10

Ю 15 20 25 30 35 40

сутки

10

25

20

25

30

35 ■ 40 сутки

Рис. б Динамика активности каталазы (I) и концентрации белка (2) в каллусе женьшеня

А - I серия опытов, Б - 2 серия опытов

лекул. Такого рода работы были проведены нами, причем установлено, что выявленное выше уменьшение синтеза каталазы сразу же после теплового воздействия имеет место на фоне понижения времени ее функционирования на 35^ (таблица 2).

Можно полагать, что тепловое воздействие приводит к интенсивному образованию перекисных соединений, а увеличение концентрации субстрата (Н2О2), в свою очередь, обусловливает более интенсивное старение каталазы и уменьшение ее стабильности (Комов, Шмелев, 1976) Предложенное объяснение представляется весьма вероятным, хотя нельзя отрицать и иную интерпритацию обнаруженного эффекта. Несколько неожиданным оказалось резкое снижение синтеза каталазы через 24 часа после теплового шока. Это указывает на необратимость некоторых биохимических процессов в послешоковы? период, по крайней мере, в изучаемом временном интервале. Содержание каталазы в растворимой фракции клеток в адаптационный период также снижалось, хотя и не коррелировало с уменьшением скорости синтеза фермента. Это однозначно объяснимо, так как стабильность фермента возрастала и время нахождения его в пуле функционирующих молекул увеличивалось (таблица 2).

Нам представляется наиболее вероятным, что снижение синтеза каталазы через 24 часа после теплового воздействия обусловлено уменьшением содержания перекиси водорода в цитоплазме клеток. Данное соображение соответствует регуляции синтеза белка по принципу обратной связи, имеющим общебиэлогическое значение.

В нашей работе установлено, что общая активность каталазы в клетке не коррелирует с увеличением или уменьшением скорости накопления насцентных полипептидов фермента е том или ином коыпарт-менте, что обусловлено значительной вариабельностью стабильности

каталазного белка, и, как следствие, различной скоростью его старения и деградацией на отдельные аминокислоты.

Уне на начальных этапах культивирования общая активность ка-талазы в клетке при тепловом шоке была на 35% ниже по сравнению с нормой. В процессе клеточного роста динамика изменения активности фермента при температурном воздействии значительно отличалась от нормы (рисунок 6).

Одной из характерных особенностей является снижение активности каталазы почти в 4 раза на 15 сутки культивирования, исчезновение максимума на 20 сутки роста и еыход на максимум, аналогичный норме, через 35 суток.

Можно полагать, что начальное снижение каталазно5 активности обусловлено тепловой инактивацией функционирующего фермента. Однако, и 24 часовая адаптация не приводит к нормализации каталазной активности на различных этапах культивирования. Этот факт можно интерпретировать либо как результат глубоких изменений, происходящих в системе защиты от токсического воздействия кислорода и пе-рекисных соединений, в результате теплового воздействия, либо как индукцию или репрессию гена (генов?), ответственных за синтез каталазы в ответ на изменяющееся количество перекиси водорода в клетке,- подвергнутой тепловому стрессу.

Большой интерес по нашему мнению представляют данные, касающиеся изменения молекулярной гетерогенности каталазы при тепловом шоке. Как видно из рисунка 2, изоферментный спектр каталазы в клетках калдуса, подвергнутых тепловому воздействию, характеризуется появлением дополнительных "стрессовых" изоформ фермента, что по-видимому, обусловлено метаболическими потребностями клетки.

Ранее было установлено, что резкое повишеш1е температуры ок-

ружапцей среды приводит к трансформации пероксидазного состава растений (Овчаренко и соавт., 1965; Олейникова и соавт., 1979; ТЪоглал .Neu.ie.hB , 1973), что цроявлявтся в образовании большого числа новых изоформ пероксидазы. Подобные хе изменения в изофер-ыентном спектре пероксидазы наблюдаатоя и через 48 часов после снятия теплового воздействия (Сарсебаев, Полжмбетов, 1986). Авторы этих работ считают, что при воздействии неблагоприятных факторов на растения и, в частности, теплового шока большое адаптивное значение имеют изменения в периксидазном комплексе и обосновывают возможность применения высокой изменчивости изоперокси-дазного состава в тестировании растений на устойчивость к стрессовым факторам внешней среди (Савич, 1984). Полученные нами результаты по изменению состояния каталазы (уровня активности, молекулярной гетерогенности и др.) при тепловом шоке коррелируют с опубликованными ранее данными по влиянию высоких температур на уровень пероксидазной активности и ее изоферыентный спектр. Выявленная нами гипертермическая индукция "стрессовых" изоформ каталазы позволяет отнести последнюю, наряду с пероксидазой, к стрессовым белкам растений.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения и очистки каталазы из культуры ткани женьшеня. Выделенный фермент состоит из 4-х идентичных субъединиц с молекулярной массой 63 КДа каждая.

2. Установлено наличие двух максимумов каталазной активности на 20 и 35 сутки роста культивируемых клеток; молекулярная гетерогенность фермента при этом варьировала в пределах от 3 до

5 изоформ.

- 23 -

3. В культивируемых метках женьшеня каталаза локализована в пероксисомах, митохондриях и Цитозольной фракции. По мере старения ткани происходит перераспределение качалазной активности между компартментамн клетки.

4. Впервые исследованы биосинтез и стабильность каталазы и общего белка в культуре ткани женьшеня. Установлено, что скорость накопления новоеинтезированного фермента в цитоплазме составляет 44,5 мкг на I г ткани в сутки, а время "полужизни" - 1,1 суток.

5. Впервые изучено влияние теплового шока на синтез, стабильность и условия функционирования каталазы в культивируемой ткани женьшеня.

Установлено:

- значительное снижение (на 41,скорости накопления фермента через 24 часа после снятия теплового шока;

- образование "стрессовых" молекулярных форм каталазы на 20-30 сутки роста культуры клеток женьшеня в ответ на тепловое воздействие;

- снижение стабильности каталазы на '¿0% сразу же после теплового воздействия и увеличение до 36% в результате 24-часовой адаптации культуры клеток.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах: I. В.П.Комов, Н.В.Кириллова, Хон Пхе Иль. Исследование каталазы из каллусной культуры ткани а:еньшеня . Всесоюзн.конф. "Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармации": Тез.докл.-Ленинград, 1989. С.II .

-242. V.P.Komoy, Jf.V.Kirillova, Chon Phe 111, E.}i.Bat igiaa. Study or primary metabolites from callus culture of Panax, //fli'th international Conference on Chemistry and iiiotecnnology of biologically active natural products! v.4. Biotecianology -Varna, Bulgaria.- p.498-502.

J. V.P.Komov, H,V»Kirillova, Chon Phe 111, -L.I.Sxepyan.

Pnarniucjy.utSJ.cax action and mexaooxisin or the cultivated cells of Panax ginseng.// The 1-st International Conference on traditional rehabilitation medicine.- Beijing, Chine, i9o>.-- 2.3,-5.

4. v.r.Komov, IT.V.Kirillova, Chon Phe 111.

The influeoca of heat shock on the biosynthesis and stability of catalase in callus culture Panax ginseng.// VII Internationa congress on Plant Tissue and Cell culture. Abstracts. -- üfisterdam, Hetherland, 1990.- P.299.

Подписано к печати Ц^О- ЗОь . заказ /£. Тираж -{Сл

формат бумаги 60x84 1/16, с/, б печ.л. Бесплатно.

ПО - 3 "Ленуприздата".

191104 Ленинград, Литейный пр., дом № 55.