Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе

Берлина, Анна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе"

004611990 На правах рукописи

Берлина Анна Николаевна

ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ СОИ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

Специальность 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2010

004611900

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российская экономическая академия им. Г.В. Плеханова»

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Сахаров Иван Юрьевич кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Кузнецов Борис Арсеньевич доктор биологических наук, профессор Мягкова Марина Александровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 28 октября 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан_сентября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Одно из приоритетных направлений в современной биохимии, биотехнологии и аналитической химии - поиск новых детектирующих систем с использованием ферментов для улучшения характеристик аналитических методов. В настоящее время широко применяются методы иммуноферментного анализа (ИФА), в которых в качестве маркера наиболее часто используется катионный изофермент с пероксидазы хрена (ПХ). К сожалению, ПХ не всегда оптимальна для аналитического применения, в частности, при создании высокочувствительных систем со стабильным сигналом.

В последние годы описан ряд новых пероксидаз растений, некоторые из которых (например, пероксидазы сои, табака, картофеля, батата, масличной пальмы) относятся к группе анионных пероксидаз. Наиболее перспективна из них пероксидаза сои (ПС) - пока единственная коммерчески доступная анионная пероксидаза. Важным свойством ПС является ее более высокая стабильность по сравнению с ПХ. Применение в ИФА ПС в сочетании с хемилюминесцентной детекцией ее ферментативной активности может привести к созданию высокочувствительных методов определения различных аналитов. Одна из задач, для которых использование новых ферментных маркеров имеет принципиальное значение, - мониторинг токсичных загрязняющих веществ в потребительской продукции и объектах окружающей среды. В частности, сульфаниламиды широко применяются в ветеринарии как антимикробные препараты и поэтому рассматриваются как значимые контаминанты продуктов питания животного происхождения. Предельно допустимые уровни содержания сульфаниламидов в пищевых продуктах, установленные в разных странах, варьируют от 20 до 100 мкг/кг. В связи с этим разработка высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для определения сульфаниламидов с применением новых ферментных маркеров, таких как ПС, является практически важной задачей.

Цели и задачи исследования. Оценить возможности использования ПС в качестве маркера в ИФА по сравнению с ПХ на примере определения сульфаметоксипиридазина (СМП) - одного из широко применяемых сульфаниламидов.

Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач: • Разработать и оптимизировать твердофазный иммуноферментный анализ СМП с использованием в качестве ферментного маркера ПС,

Сокращения: ИФА - иммуноферментный анализ, ПС - пероксидаза сои, ПХ -пероксидаза хрена, САМ - М-(Ы-сульфанил)-4-аминомасляная кислота, СМП -сульфаметоксипиридазин, СТР - стрептавидин, ФБС-Т - 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М №С1 и 0,05% Тритона Х-100.

• Изучить влияние условий проведения гетерогенной реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой ПС, на интенсивность хемилюминесценции,

• Определить аналитические характеристики ИФА СМП с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией, сравнив ПС и ПХ в качестве маркеров,

• Провести апробацию ИФА СМП в реальных образцах.

Научная новизна работы. Изучено влияние условий проведения реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой сои, на интенсивность хемилюминесценции. Установлены оптимальные условия проведения этой реакции в гетерогенной системе твердофазного ИФА. Показано, что п-йодофенол в данном случае является не усилителем люминесценции, а тушителем неспецифического свечения. Продемонстрированы преимущества анионной ПС в качестве маркера по сравнению с катионной ПХ.

Практическая значимость работы. Показано, что пероксидаза сои может являться эффективной альтернативой пероксидазе хрена в иммуноферментном анализе. Использование коммерчески доступной ПС в ИФА СМП с хемилюминесцентной детекцией позволило существенно улучшить характеристики аналитического метода, что выразилось в формировании стабильного во времени сигнала и снижении предела обнаружения аналита. Перспективность использования ПС показана для контроля содержания практически значимого загрязняющего вещества, СМП, в образцах молока и озерной воды.

Связь работы с государственными программами. Работа была поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 02.740.11.0868 от 28 июня 2010 г.).

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конгрессах «1СА8-2006» (Москва, 2006), «РЕ5РВ-2008» (Тампере, 2008) и «1иРАС-2009» (Глазго, 2009), международных конференциях «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006) и «Биотехнология: Экология больших городов» (Москва, 2010) и молодежной конференции «Биохимическая физика» (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 6 тезисов докладов на конгрессах и конференциях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов исследования,

результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка цитируемой литературы (270 ссылок). Работа изложена на 140 страницах и включает 41 рисунок и 13 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Получение и характеристика иммунореагентов

Для оценки возможности применения в ИФА пероксидазы сои (ПС) вместо традиционно используемого изофермента с пероксидазы хрена (ПХ) были разработаны и охарактеризованы методики определения сульфаметокси-пиридазина (СМП) с применением двух исследуемых ферментов.

СМИ (рис. 1, а) - антимикробный препарат, относящийся к классу сульфаниламидов. Для конъюгирования с белками и получения антител использовался его карбоксилированный структурный аналог, N-(N1-сульфанил)-4-аминомасляная кислота (САМ, см. рис. 1, б). В качестве иммунореагентов были получены и охарактеризованы конъюгат САМ и овальбумина (САМ-ОВА), биотинилированные поликлональные кроличьи антитела против САМ, конъюгаты стрептавидина с пероксидазами сои и хрена (СТР-ПС, СТР-ПХ).

СМП

о б

Рис. 1. Химические структуры СМП (а) и его аналога САМ (б)

СМП является низкомолекулярным веществом, поэтому для его определения была реализована схема непрямого конкурентного твердофазного ИФА (рис. 2). Конъюгат САМ-ОВА использовался в качестве антигена, адсорбируемого в лунках планшета. Для выявления формирующихся в ходе анализа иммунных комплексов применялся модуль биотин - стрептавидин.

00 сРеЛ %1<Р1% I? 1

Ч^л г" V« и/ „У/ Ху" \У>

А^ЙГ

»у./-» * й У.,/а

а- «г.

то-

Антиген

САМ-ОВА

Р-----5

Антитело-биотин

СТР-ПС/ПХ

Рис. 2. Схема проведения непрямого конкурентного ИФА СМП с использованием модуля биотин - стрептавидин

Было показано, что взаимодействие антител против САМ с конъюгатом САМ-ОВА эффективно ингибируют как САМ, так и СМП (рис. 3), что объясняется наличием общих фрагментов в структурах данных соединений.

10 100 1000 [Конкурент], нг/мл

10000

Рис. 3. Ингибирование СМП (□) и САМ (•) связывания кроличьих антител с конъюгатом САМ-ОВА в твердофазном ИФА

Из антисыворотки, содержащей антитела к САМ, выделяли 1д6-фракцию путем осаждения 20% раствором полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000. Биотинилирование 1дС проводили по стандартной методике, в основе которой лежит реакция 1\1-гидроксисукцинимидного эфира биотана с аминогруппами иммуноглобулина. Мольное соотношение 1дС:биотин в полученном конъюгате, определенное методом титрования свободных поверхностных аминогрупп, равнялось 1:8,8.

Влияние биотинилирования на антигенсвязывающую способность антител тестировали в модифицированной схеме ИФА, в которой в качестве проявляющего реагента применяли конъюгат ПС и антител против 1дв кролика. Этот конъюгат синтезировали с использованием перйодатного окисления углеводных фрагментов ПС. Согласно данным, представленным на рис. 4, биотинилирование не влияло на антигенсвязывающую способность специфических антител.

Рд<3|, гжг/мп

Рис. 4. Зависимость сигнала от концентрации 1дв до (о) и после биотинилирования (■) при взаимодействии в системе ИФА с иммобилизованным конъюгатом САМ-ОВА

[СМП], нг/мл

Рис. 5. Выбор рабочей концентрации конъюгата ПС и антител против [дй кролика в ИФА СМП. Концентрации конъюгата (мкг/мл) - 26,8 (1), 13,4 (2), 6,7 (3), 3,4 (4), 1,7 (5), 0,84 (6), 0,42 (7) и 0,21 (8)

Были сопоставлены градуировочные кривые ИФА СМП с колориметрической детекцией (субстрат - диаммониевая соль 2,2-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС)), полученные для разных концентраций конъюгата (рис. 5). Для концентраций конъюгата от 0,84 мкг/мл и ниже предел обнаружения СМП был высоким из-за низких значений сигнала. Увеличение концентрации конъюгата снижает предел

обнаружения СМП, однако для концентраций выше 1,7 мкг/мл рост значения сигнала сопровождается увеличением предела обнаружения СМП. Поэтому концентрация конъюгата, равная 1,7 мкг/мл, была выбрана как рабочая и использовалась в дальнейших экспериментах.

Были получены градуировочные кривые ИФА СМП при использовании разных концентраций биотинилированных 1дв (рис. 6). Как видим, при концентрациях 1 и 2 мкг/мл достоверное определение СМП невозможно, так как оптическая плотность в отсутствие аналита превышает фоновый сигнал всего в полтора раза. Увеличение концентрации биотинилированных антител вызывает снижение предела обнаружения СМП. Однако при этом возрастает и неспецифическая сорбция, о чем свидетельствует увеличение оптической плотности в присутствии СМП в высокой концентрации, например, 1000 нг/мл. Наличие неспецифического связывания было также подтверждено в опыте, в котором вместо конъюгата САМ-ОВА адсорбировали нативный овальбумин (данные не приведены). Исходя из этих соображений, концентрация биотинилированных антител, равная 8,5 мкг/мл, была выбрана как оптимальная и использовалась в дальнейших экспериментах.

[СМП], нг/мл

Рис. 6. Выбор концентрации биотинилированных антител в ИФА СМП. Концентрации антител в лунках микропланшета - 1 (Í), 2 (2), 4,3 (3), 8,5 (4), 17 (5) и 34 (6) мкг/мл

При проведении ИФА для выявления связанных биотинилированных антител применяли их высокоаффинное взаимодействие с конъюгатами стрептавидина (СТР) с ПС и ПХ. Синтез конъюгата СТР-ПС проводили в условиях, описанных ранее (Sakharov I.Y., et al. J. Agrie. Food Chem., 2006, v. 54, № 5, p. 1584-1587) и отличающихся от условий, используемых при

конъюгировании СТР с ПХ. Так, концентрация перйодата натрия для окисления ПХ равнялась 6,8 мМ, тогда как для ПС - 27 мМ.

Были сопоставлены градуировочные кривые ИФА СМП, полученные для разных концентраций конъюгатов СТР-ПС и СТР-ПХ (рис. 7, 8). ИФА проводили в стандартной реакционной среде - 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М №С1 и 0,05% Тритона Х-100 (ФБС-Т). Показано, что предел обнаружения СМП снижается с уменьшением концентраций конъюгатов. Исходя из вычисленных параметров градуировочных кривых, были выбраны как оптимальные концентрации 3,5 мкг/мл для конъюгата СТР-ПС и 1,7 мкг/мл для СТР-ПХ.

[СМП], нг/мл [СМП], нг/мп

Рис. 7. Выбор рабочей концентрации конъюгата СТР-ПС в ИФА СМП. Кривые 1-4 соответствуют концентрациям в лунках микропланшета, равным 13,8, 6,9, 3,5 и 1,7 мкг/мл

Рис. 8. Выбор рабочей концентрации конъюгата СТР-ПХ в ИФА СМП. Кривые 1-4 соответствуют концентрациям в лунках микропланшета, равным 6,9, 3,5, 1,7 и 0,9 мкг/мл

В данных условиях была получена градуировочная кривая ИФА СМП с использованием конъюгата СТР-ПС и колориметрической детекцией (рис. 9). Диапазон определяемых концентраций СМП составил 1,3-63 нг/мл при пределе обнаружения 0,4 нг/мл и 1С50 (концентрации аналита, вызывающей 50%-ное ингибирование связывания) 4,8 нг/мл. В диапазоне 1С2о-1Сео среднее отклонение определяемых концентраций СМП варьировало от 4 до 6% (п=8).

а405

0,6-

0,3-

0,9-

0,0

0,1

100

1000

[СМП], нг/мл

Рис. 9. Градуировочная кривая ИФА с использованием конъюгата СТР-ПС и колориметрической детекцией для определения СМП в ФБС-Т

II. Оптимизация условий твердофазного ИФА с хемилюминесцентной детекцией с использованием ПС в качестве метки

В современной практике ИФА наиболее распространена колориметрическая детекция активности ферментного маркера. В тех же случаях, когда необходимо выявление аналита в предельно низких концентрациях, используется хемилюминесцентная детекция. Однако ПХ является малоактивным катализатором окисления люминола и требует добавления усилителя в субстратную смесь. В отличие от ПХ, ПС способна эффективно окислять люминол даже в отсутствие усилителя. Ранее оптимальные условия для катализа ПС были подобраны в гомогенной среде, т.е. без учета влияния материала микропланшета для ИФА и адсорбированных на нем молекул, а также без добавления усилителя. Поэтому был необходим подбор состава субстратной смеси в условиях, соответствующих проведению твердофазного ИФА.

Было установлено, что наличие в лунках планшета комплекса САМ-ОВА и 1дС-биотин приводит к появлению неспецифического свечения, обусловленного присутствием белковых молекул (рис. 10).

Оптимизацию состава субстратной смеси с добавлением п-йодофенола в гетерогенных условиях проводили в лунках микропланшета, на поверхности которых был сформирован комплекс конъюгатов САМ-ОВА, 1дС-биотин и СТР-ПС. Исследовали субстратные смеси, содержащие 0,5, 1, 1,5, 2 мМ люминола и 0, 1, 2, 3 мМ п-йодофенола в разных сочетаниях в 100 мМ Трис-

буфере, рН 8,6. Фоновое свечение регистрировали в лунках, содержащих либо САМ-ОВА, либо САМ-ОВА + 1дО-биотин.

Как видно из рис. 11, в отсутствие п-йодофенола в составе субстратной смеси варьирование концентрации люминола практически не влияет на интенсивность люминесценции. Добавление п-йодофенола несколько увеличивает специфический сигнал, в отличие от ПХ, для которой п-йодофенол является мощным усилителем. Наибольший хемилюминесцентный сигнал достигается при использовании 1 мМ люминола в сочетании с 1, 2 или 3 мМ п-йодофенола.

Рис. 10. Влияние присутствия белка на интенсивность хемипюминесценции. Черные столбцы - 1 мМ люминола без п-йодофенола; серые - 1 мМ люминола, 1 мМ п-йодофенола

Рис. 11. Зависимость хемилюми-несцентного сигнала от состава субстратной смеси при использовании ПС в качестве маркера в ИФА

Рис. 12. Зависимость фонового сигнала Рис. 13. Зависимость отношения сигнал/ от состава субстратной смеси фон от состава субстратной смеси

Сопоставление неспецифической хемилюминесценции, вызываемой иммобилизованными белковыми комплексами, при разных составах субстратной смеси показало (рис. 12), что увеличение концентрации люминола с 0,5 до 2,0 мМ приводит к росту неспецифического свечения. В противоположность этому, увеличение концентрации п-йодофенола снижает неспецифическое свечение почти в 10 раз; наибольшее значение сигнала наблюдается в отсутствие п-йодофенола.

Для каждой субстратной смеси было рассчитано отношение сигнал/фон. Из рис. 13 видно, что добавление усилителя увеличивает данное отношение, максимум которого достигается для субстратных смесей, содержащих 1 мМ люминола и 2 мМ либо 3 мМ п-йодофенола.

Сопоставление этих двух вариантов показало большую стабильность во времени сигнала для субстратной смеси, содержащей 1 мМ люминола и 2 мМ п-йодофенола (рис. 14), которая и была выбрана для дальнейших опытов.

и-1-■-1-■-1-■-1-■-I->

20 40 60 80

Время, мин

Рис. 14. Кинетика хемилюминесцентного сигнала при гетерогенном катализе с использованием ПС и субстратных смесей, содержащих 1 мМ люминола и 2 мМ (■) либо 3 мМ (о) п-йодофенола

После выбора концентраций субстрата и усилителя необходимо было определить оптимальную концентрацию Н202. Был сопоставлен ряд концентраций Н202 в интервале 1-8 мМ. Критерием выбора, как и в предыдущих экспериментах, был высокий сигнал, стабильный в течение долгого времени.

Как следует из рис. 15, увеличение концентрации Н202 приводит к более быстрому падению сигнала. С другой стороны, при [Н202] < 1 мМ низкое значение сигнала вызывает уменьшение отношения сигнал/фон (данные не приведены). Концентрация Н202, равная 2 мМ, была выбрана как оптимальная.

о-Ц-.-,-,-,-,-,-,-,-

О 20 40 60 80

Время, мин

Рис. 15. Кинетика хемилюминесцентного сигнала при гетерогенном катализе с использованием ПС и разных концентраций Н2О2: 1 - 1 мМ, 2-1,5 мМ, 3-2 мМ, 44 мМ, 5-6 мМ, 6-8 мМ

Таким образом, оптимальный состав субстратной смеси для определения активности ПС в условиях твердофазного ИФА следующий: 1 мМ люминола, 2 мМ п-йодофенола и 2 мМ Н202 в 100 мМ Трис-буфере, рН 8,6.

III. Сравнение аналитических характеристик ИФА СМП с использованием ПХ и ПС в качестве маркеров и хемилюминесцентной детекцией

В выбранных условиях катализа мы сравнили ИФА СМП с использованием пероксидаз сои и хрена, рассматривая данные для разной продолжительности реакции окисления люминола.

Градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПХ и хемилюминесцентной детекцией представлены на рис. 16. При регистрации хемилюминесценции через 20 с после начала реакции предел обнаружения СМП составил 0,3 нг/мл, 1С5о - 12,4 нг/мл, диапазон определяемых концентраций - 1,2-85 нг/мл (Табл. 1). Коэффициент вариации сигнала в рабочем диапазоне изменялся от 3,4 до 8,5%, а среднее отклонение определяемых концентраций СМП не превосходило 12% (п=6).

С увеличением продолжительности реакции окисления люминола значения хемилюминесцентного сигнала снижаются. При этом возрастают величины предела обнаружения и Ю50 (см. Табл. 1), а также коэффициенты вариации результатов измерений (Табл. 2).

[СМП], нг/мл

Рис. 16. Градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПХ и хемилюми-несцентной детекцией. Интенсивность люминесценции измерена через 20 (кривая 1), 160 (2), 300 (3), 440 (4), 580 (5), 1160 (б) и 1740 с (7) после начала реакции окисления люминола

Таблица 1. Зависимость аналитических параметров ИФА СМП с использованием ПХ и хемилюминесцентной детекцией от продолжительности реакции окисления люминола

Продолжительность реакции окисления люминола, с ICso, нг/мл Диапазон определяемых концентраций СМП (IC20-IC80), нг/мл Предел обнаружения СМП (1С10), нг/мл

20 12,4 1,2-85 0,3

160 16,0 2,6-80 0,8

300 22,0 4,0-85 1,6

440 35,0 8,0-125 2,6

Таблица 2. Коэффициенты вариации при определении СМП методом ИФА с использованием ПХ и хемилюминесцентной детекцией

[СМП], нг/мл Продолжительность реакции окисления люминола, с

20 160 | 300 440

Коэффициент вариации (п=6), %

56 8,2 9,7 10,2 11,3

19 8,5 9,4 15,3 19,1

6 3,4 6,9 9,5 11,5

2 4,8 7,7 12,0 НО

НО - не определялся

Далее были получены градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией (рис. 17). При регистрации хемилюминесценции через 20 с после начала реакции предел обнаружения, 1С50 и диапазон определяемых концентраций равнялись 0,02, 0,17 и 0,045-0,63 нг/мл, соответственно (Табл. 3). Таким образом, при замене ПХ (см. Табл. 1) на ПС в ИФА с хемилюминесцентной детекцией предел обнаружения снижается в 15 раз.

С ростом продолжительности окисления люминола, катализируемого ПС, аналитические параметры ИФА практически не изменялись (см. Табл. 3).

[СМП], нг/мл

Рис. 17. Градуировочные кривые ИФА СМП с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией. Интенсивность люминесценции измерена через 20 (кривая 1), 160 (2), 580 (3), 1160 (4) и 1740 с (5) после начала реакции окисления люминола

Таблица 3. Зависимость аналитических параметров ИФА СМП с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией от продолжительности реакции окисления люминола

Продолжительность реакции окисления люминола, с 1СИ, нг/мл Диапазон определяемых концентраций СМП (IC20-IC8o), нг/мл Предел обнаружения СМП (1Сю), нг/мл

20 0,17 0,045-0,63 0,02

160 0,22 0,045-1,1 0,02

300 0,28 0,07-1.0 0,03

440 0,35 0,08-1,5 0,03

580 0,34 0,08-1,2 0,03

1160 0,45 0,08-2,5 0,03

1740 0,45 0,08-2,3 0,03

Коэффициент вариации результатов измерений достоверно не изменялся во времени, составляя не более 11% (Табл. 4). Сравнение коэффициентов вариации для ИФА с использованием ПС и ПХ (см. Табл. 2) свидетельствует о том, что выбор пероксидазы-маркера не влияет на точность анализа.

Таблица 4. Коэффициенты вариации при определении СМП методом ИФА с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией

[СМП], нг/мл Продолжительность реакции окисления люминола, с

20 160 300 440 580 1160 1740

Коэффициент вариации (п=6), %

2,06 НО НО НО НО 12,0 5,8 0,4

0,69 НО 2,0 11,0 9,2 11,0 1,0 7,8

0,23 9,0 5,7 4,5 8,8 4,8 0,7 2,3

0,08 3,0 8,0 4,5 5,0 5,3 4,4 2,8

НО - не определялся

Сопоставление форматов ИФА с двумя способами детекции и двумя маркерами показывает (Табл. 5), что минимальный предел обнаружения СМП достигается для ИФА с хемилюминесцентной детекцией и ПС в качестве маркера.

Таблица 5. Сравнение аналитических параметров ИФА СМП при использовании ПС и ПХ с хемилюминесцентной и колориметрической детекцией

Фермент- Способ Предел 1Сбо, Диапазон Коэффи-

ный детекции обнаруже- нг/мл определяемых циент

маркер ния СМП, нг/мл концентраций СМП, нг/мл вариации, %

ПС Хемилюминес-

центный 0,02 0,17 0,045-0,63 3,0-9,0

Колориметриче-

ский 0,4 4,8 1,3-63 4,1-6,0

ПХ Хемилюминес-

центный 0,3 12,4 1,2-85 3,4-8,5

Колориметриче-

ский 0,4 4,8 1,3-60 1,7-8,0

IV. Применение ИФА с ПС в качестве маркера для определения СМП в пробах молока и озерной воды

4.1. Определение СМП в молоке методом ИФА с колориметрической детекцией

В соответствии с приоритетными объектами, тестируемыми на содержание сульфаниламидов, в задачу нашего исследования входила характеристика пригодности разработанного метода ИФА с использованием ПС для контроля СМП в молоке. При этом принципиальное значение имело определение условий проведения анализа, в которых предотвращается влияние матрикса проб на получаемые результаты.

Поскольку в молоке в высоких концентрациях содержится казеин (в коровьем молоке - до 2,7%), было изучено его влияние на параметры разрабатываемого метода. Для этого были получены градуировочные кривые ИФА СМП с колориметрической детекцией при использовании в качестве реакционной среды ФБС-Т с добавлением 0,015, 0,05 и 0,15% казеина. Анализ кривых показал, что при использовании 0,15% казеина предел обнаружения СМП равен 0,12 нг/мл, диапазон определяемых концентраций - 0,33-15,0 нг/мл, a IC50 - 2,0 нг/мл. Таким образом, введение в рабочий буфер казеина понижает предел обнаружения СМП. Коэффициенты вариации сигнала в рабочем диапазоне метода не превышали 10%.

Для оценки пригодности разрабатываемого ИФА для определения СМП в молоке были приобретены в розничной сети образцы молока с жирностью 3,2%. СМП был введен в исходное и в обезжиренное центрифугированием молоко в концентрациях 50, 150 и 1500 нг/мл, что соответствует 0,5, 1,5 и 15 ПДК. Для предотвращения влияния матрикса пробы разводили ФБС-Т в 50 раз.

Применимость разработанного ИФА для определения СМП количественно оценивали методом «введено - найдено». Концентрации СМП рассчитывали по градуировочным графикам, полученным при использовании в качестве рабочего буферного раствора ФБС-Т либо ФБС-Т с 0,15% казеина. Как следует из Табл. 6, при использовании ФБС-Т ошибка в определении СМП очень высока, что следует объяснить влиянием матрикса молока. При проведении же ИФА в среде, содержащей 0,15% казеина, полнота выявления СМП варьировала в пределах 80-120% (см. Табл. 6). При этом значения найденных концентраций СМП не зависели от того, проводилось ли предварительное удаление жира или нет. Таким образом, 50-кратное разведение проб молока в сочетании с применением 0,15% казеина позволяет исключить влияние матрикса и проводить корректное определение СМП разработанным иммуноферментным методом с колориметрической детекцией и ПС в качестве маркера.

Таблица 6. Характеристика полноты выявления СМП в пробах молока методом ИФА с колориметрической детекцией

Рабочий буферный раствор Проба 1 Проба 2

Введено, нг/мл Полнота выявления, % Введено, нг/мл Полнота выявления, %

ФБС-Т 50 786 50 786

150 567 150 710

1500 522 1500 500

ФБС-Т + 0,15% казеина 50 110 50 120

150 87 150 113

1500 100 1500 80

4.2. Определение СМП в молоке методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией

Образцы молока из розничной сети с жирностью 3,2% после введения СМП в концентрациях 8, 23, 70, 210 нг/мл были охарактеризованы методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией. Для этого варианта анализа, в отличие от колориметрического ИФА, добавление казеина приводит к появлению неспецифического свечения и меняет ход градуировочных кривых. Для устранения влияния матрикса проб молока предложено применение центрифугирования (для обезжиривания) и последующей обработки трихлоруксусной кислотой. Данная пробоподготовка, вызывая денатурацию и осаждение белков, позволяет стандартизировать пробы. В экспериментах «введено - найдено» полнота выявления СМП составила от 71 до 130% (Табл. 7), что свидетельствует об эффективности разработанного метода.

Таблица 7. Характеристика полноты выявления СМП в образцах молока методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией

[СМП] в образце, нг/мл | Полнота выявления, % Коэффициент вариации, %

Проба 1

8 115 6,4

23 94 5,1

70 99 4,5

210 98 2,9

Проба 2

8 113 7,6

23 71 7,0

70 77 9,9

210 84 5,9

Проба 3

8 105 4,7

23 71 5,1

70 78 9,7

210 80 3,1

Проба 4

8 130 6,4

23 86 3,1

70 79 4,5

210 82 0,7

4.3. Определение СМП в озерной воде методом ИФА с хемилюминес-центной детекцией

Одной из важных областей применения разрабатываемых аналитических методов является экологический мониторинг. Используемые в медицине и ветеринарии лекарственные препараты способны накапливаться в окружающей среде. Загрязнение водоема веществами антибактериального действия может повлечь за собой накопление данных соединений и в его обитателях (например, в рыбе и моллюсках). Поэтому необходимо было оценить пригодность разрабатываемых методов для контроля содержания СМП в природных водах.

Для этой работы были использованы пробы озерной воды, взятые из разных точек в Бутовских озерах (Москва). Первоначально, как и для определения СМП в молоке, изучалось влияние матрикса. Сопоставление буферных растворов, отличающихся по молярности, позволило выбрать в качестве оптимальной среды 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Градуировочные кривые, получаемые в этом буфере и в озерной воде, практически совпадают. Пробы воды показали в конкурентном ИФА отсутствие СМП, что позволило применить их при характеристике полноты выявления СМП методом «введено - найдено».

Была получена градуировочная кривая для определения СМП в озерной воде методом ИФА с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией (рис. 18). Предел обнаружения СМП составил 0,14 нг/мл, 1С50 - 1,3 нг/мл, диапазон определяемых концентраций - 0,35-8 нг/мл. Коэффициент вариации сигнала при определении СМП в рабочем диапазоне изменялся от 1,9 до 9,5% (п=3).

см>1 1 10

[СМП], нг/мл

Рис. 18. Градуировочная кривая ИФА СМП в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, с использованием ПС и хемилюминесцентной детекцией. Интенсивность люминесценции была измерена через 440 с после начала реакции окисления люминола.

Данные характеристики, а также значения полноты выявления (от 70 до 116%; см. Табл. 8) свидетельствуют о пригодности разработанного метода ИФА для определения СМП в озерной воде.

Таблица 8. Характеристика полноты выявления СМП в пробах озерной воды методом ИФА с хемилюминесцентной детекцией

[СМП] в образце, нг/мл Полнота выявления, % Коэффициент вариации, %

Проба 1

6 70 8,9

2 90 7,9

0,7 101 1,8

Проба 2

6 82 12

2 70 3,4

0,7 72 3,9

Проба 3

6 89 9,4

2 92 5,0

0,7 116 8,9

выводы

1. Разработан иммуноферментный анализ антибактериального препарата сульфаметоксипиридазина с колориметрической детекцией и использованием пероксидазы сои в качестве ферментного маркера. Предел обнаружения сульфаметоксипиридазина составляет 0,4 нг/мл.

2. Изучено влияние условий проведения реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой сои, на интенсивность хемилюминесценции. Проведена оптимизация условий гетерогенного окисления люминола. Показано, что введение п-йодофенола в реакционную смесь вызывает десятикратное снижение некаталитического окисления люминола.

3. Разработан иммуноферментный анализ сульфаметоксипиридазина с хемилюминесцентной детекцией. Предел обнаружения сульфаметоксипиридазина составляет 0,02 нг/мл. Переход от колориметрической к хемилюминесцентной детекции активности пероксидазы сои приводит к 20-кратному снижению предела обнаружения.

4. Проведено сравнение характеристик разработанного иммунофермент-ного анализа сульфаметоксипиридазина с хемилюминесцентной детекцией пероксидаз сои и хрена в качестве маркеров. Установлено, что пероксидаза сои обладает преимуществами по сравнению с традиционно используемой пероксидазой хрена, заключающимися в снижении предела обнаружения сульфаметоксипиридазина в 15 раз и значительном возрастании стабильности сигнала.

5. Показана возможность иммуноферментного определения сульфаметоксипиридазина в пробах молока и озерной воды с использованием хемилюминесцентной детекции пероксидазы сои.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Берлина А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. Применение пероксидазы сои для иммуноферментного определения сульфаметоксипиридазина в молоке. II Прикладная биохимия и микробиология, 2007, том 43, №5, с. 614-620.

2. Sakharov I.Yu., Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Advantages of soybean peroxidase over horseradish peroxidase as the enzyme label in chemi-luminescent enzyme-linked immunosorbent assay of sulfamethoxypyridazine. // Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, v. 58, № 6, p. 3284-3289.

3. Берлина A.H., Алпеева И.С., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. Иммуноферментный анализ сульфаметоксипиридазина с помощью биотин/стрептавидиновой пары. II Труды Международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, Россия, 14-17 марта 2006 г., с. 247.

4. Alpeeva I.S., Berlina A.N., Zherdev A.V., Efremov E.E., Dzantiev B.B., Sakharov I.Yu. Advantages of application of anionic soybean peroxidase in chemiluminescent ELISA. // Proceedings of International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006), June 25-30, 2006, Moscow, Russia, p. 137-138.

5. Берлина A.H., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. Применение анионной пероксидазы сои в иммуноферментном анализе сульфаметоксипиридазина с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией. // Труды Седьмой ежегодной молодежной конференции ИБХФ РАН - вузы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 12-14 ноября 2007 г., с. 25.

6. Sakharov I.Yu., Alpeeva I.S., Berlina A.N. Anionic plant peroxidases in chemiluminescent ELISA: Perspectives and advantages. II Abstracts of the 8th International Peroxidase Symposium. Satellite symposium of the XVIth Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB-2008). August 20-23, 2008, Tampere, Finland, PX-S11-2.

7. Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Sakharov I.Yu. Ultrasensitive chemiluminescent ELISA of sulfamethoxypyridazine using soybean peroxidase. II Abstracts of the 42nd IUPAC congress: Chemistry Solutions, August 2-7, 2009, Glasgow, UK, S210-004.

8. Берлина A.H., Жердев A.B., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю. тИФА для определения сульфаметоксипиридазина с использованием пероксидазы сои в качестве метки. II Труды Международной конференции «Биотехнология: Экология больших городов», 15-17 марта 2010 г., Москва, Россия, с. 443.

Подписано в печать 23 сентября 2010 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 716 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Берлина, Анна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммунохимические методы анализа.

1.1.1. Понятие и классификация антигенов.

1.1.2. Строение и функции антител.

1.1.3. Классификация иммунохимических методов анализа.

1.1.4. Реакции с использованием меченых антител или антигенов.

1.1.5. Разнообразие методов ИФА.

1.1.5.1. Гомогенные методы иммуноанализа.

1.1.5.2. Гетерогенные методы иммуноанализа.

1.2. Применение реакции авидин-биотин в ИФА.

1.3. Аналитические характеристики иммуноанализа.

1.4. Применение ферментов в ИФА.

1.4.1. Требования к ферментам, используемым в ИФА в качестве меток

1.4.2. Характеристика класса пероксидаз.

1.4.3. Пероксидаза хрена.

1.4.4. Механизм окисления субстратов под действием пероксидаз («пинг -понг» механизм).

1.4.5. Альтернативные пероксидазы. Пероксидаза сои.

1.4.6. Субстраты пероксидаз.

1.4.7. Методы определения каталитической активности пероксидаз в ИФА

1.4.8. Механизм хемилюминесцентной реакции.

1.5. Сульфаниламидные препараты.

1.5.1. Фармакологическая характеристика и механизм действия сульфаниламидов.

1.5.2. Влияние сульфаниламидов при попадании в окружающую среду.

1.5.3. Эффекты сульфаниламидных препаратов при попадании в организм человека и животных.

1.5.4. Методы анализа образцов на наличие сульфаниламидов.

1.5.5. Влияние матрикса биообразцов на определение сульфаниламидных препаратов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки кроликов.

2.2.2. Биотинилирование антител.

Список сокращений

АБТС - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)

Ат — антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

ИФА - иммуноферментный анализ

ИХМ - иммунохимический метод (методы)

ОВА - овальбумин

ПАБК - иора-аминобензойная кислота

ПС - пероксидаза сои

ПХ - пероксидаза хрена

ПЭГ - полиэтиленгликоль

САМ - К-сульфанил-4-аминомасляная кислота

СМП - сульфаметоксипиридазин

СТР - стрептавидин тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ ТМБ - 3,3', 5,5' -гетрам ети л бензидин ТХУ - трихлоруксусная кислота ФБ - фосфатный буфер

ФБС - 50 мМ фосфатный буферный раствор с 0,1 М №С1, рН 7,4 ФБС-Т - ФБС с 0,05% Тритона Х-100, рН 7,4 ХЛ - хемилюминесценция

ХЛ-тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ с хемилюминесцентной детекцией

- иммуноглобулин класса С

2.2.3. Определение авидности антител после их биотинилирования.

2.2.4. Синтез конъюгата (антитела против IgG кролика - пероксидаза сои)

2.2.5. Синтез конъюгатов СТР-ПС и СТР-ПХ.

2.2.6. Измерение пероксидазной активности методом колориметрии.

2.2.7. Оптимизация условий для хемилюминесцентной детекции с использованием пероксидазы сои.

2.2.8. Измерение пероксидазной активности методом хемилюминесценции

2.2.9. Определение термостабильности конъюгатов стрептавидин-пероксидаза (сои, хрена).

2.2.10. Твердофазный ИФА СМП (формат с использованием конъюгатов СТР-ПС или СТР-ПХ).

2.2.11. Твердофазный ИФА СМП (формат с использованием антивидовых меченых антител).

2.2.12. Пробоподготовка образцов молока для тИФА с колориметрической детекцией.

2.2.13. Пробоподготовка образцов молока для тИФА с хемилюминесцентной детекцией.

2.2.14. Пробоподготовка образцов озерной воды для тИФА с хемилюминесцентной детекцией.

2.2.15. Определение состава конъюгатов.

2.2.16. Обсчет данных и получение значений аналитических характеристик метода тИФА.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение и характеристика реагентов для проведения тИФА.

3.2. Оптимизация условий для XJI-тИФА с использованием ПС в качестве метки

3.3. Получение и сравнение основных аналитических характеристик ХЛ-тИФА для определения СМП с использованием ПХ и ПС в качестве меток.

3.4. Определение СМП в молоке методом тИФА с колориметрической детекцией.

3.5. Определение СМП в молоке методом тИФА с хемилюминесцентной детекцией.

3.6. Определение СМП в озерной воде методом ХЛ-тИФА.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе"

Одним из приоритетных направлений в современной биохимии, аналитической химии и смежных науках является разработка новых ферментных систем, пригодных для лекарственного мониторинга, оценки состояния окружающей среды и иных скрининговых исследований. В современной биохимии именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение биологически активных веществ. В связи с этим поиск, получение, характеристика новых ферментов для аналитических целей является актуальной задачей.

Наиболее широко применяемым в аналитических целях ферментом является пероксидаза (КФ 1.1.11.7). Пероксидазы составляют группу ферментов, катализирующих окисление различных субстратов пероксидом водорода. Эти ферменты широко применяются в иммуноферментном анализе и при конструировании ферментных электродов, иммуносенсоров и биосенсоров, что обусловлено чрезвычайно низким пределом обнаружения фермента.

Хотя пероксидазы обнаруживаются в тканях всех растений, в настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Armoracia rusticana). Катионная пероксидаза хрена (ПХ, изофермент с) обладает высокой активностью, в лиофильно высушенном состоянии она способна храниться в течение нескольких лет без потери активности. Более того, в настоящее время активно используются разнообразные методы получения высококачественных коныогатов ИХ с Ат или антигенами. Несмотря на это, с развитием новых биоаналитических методов к ферментам предъявляются новые требования, которым не в полной мере удовлетворяет ПХ. Появление пероксидаз с повышенной стабильностью сигнала и отличной от ПХ субстратной специфичностью могло бы повысить качество фермент-содержащих аналитических наборов и стимулировать разработку новых методов и промышленных процессов. С этой целью активно проводятся исследования пероксидаз из новых источников. К настоящему времени выделено и изучено большое количество пероксидаз из ряда растений: пероксидазы картофеля, пальмы, сои, брюссельской капусты, полыни, табака, огурца, зелёной груши, редиса, шпината, риса, арахиса, томата, клубники и др. [1-34]. В последние годы возрос интерес к пероксидазам грибов[35

37]. Все это связано с открытием новых реакций, катализируемых пероксидазами, и перспективами их использования в биохимии, биотехнологии и индустрии.

Существует несколько способов определения ферментативной активности пероксидаз - колориметрическая, флуориметрическая и хемилюминесцентная и другие (например, электрохимическая) типы детекции. Наиболее перспективна хемилюминесцентная детекция, что объясняется ее высокой чувствительностью. В настоящее время разработан и коммерчески доступен ряд высокочувствительных иммуноферментных тест-систем с хемилюминесцентной детекцией для определения широкого спектра аналитов. Во многих коммерческих наборах в качестве метки используется ПХ. Но ПХ в процессе катализа быстро инактивируется пероксидом водорода и радикальными продуктами, образующимися в процессе окисления ее субстратов. Это обуславливает необходимость поиска более стабильных ферментных меток.

Известно, что анионные пероксидазы, такие как пероксидаза пальмы, батата, картофеля, табака, обладают высокой термо-, рН- стабильностью и стабильностью при хранении [38-41], и благодаря этим свойствам их можно применять в различных целях. Из них только пероксидаза сои (ПС) коммерчески доступна. Она выделяется из шелухи соевых бобов, т.е. как побочный продукт пищевой индустрии. В [42] описано применение ПС в качестве ферментного компонента биосенсора. Это позволяет предположить, что и в ИФА в качестве метки она может обеспечить возможность высокочувствительного анализа. К тому же ПС активна в отношении традиционных субстратов ПХ, в том числе часто используемых в ИФА.

Таким образом, применение анионных пероксидаз, таких, как ПС, может привести к созданию стабильных и чувствительных систем для определения различных веществ. Это очень актуально для мониторинга состояния окружающей среды, в которой контаминанты содержатся в минорных концентрациях. Так, например, сульфаниламиды, являющиеся антимикробными препаратами, широко используются в медицине. В то же время они активно применяются в ветеринарии и опосредованно попадают в биологические ткани животных, которые затем используются человеком в качестве источника питания. В настоящее время для определения сульфаниламидов используются хроматографические методы, которые трудоемки и требуют существенных материальных и временных затрат.

Поэтому разработка новых систем анализа на основе уже известных, с применением новых ферментных меток, таких, как ПС, и типов детекции является актуальной задачей.

Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

• Разработать твердофазный иммуноферментный анализ СМП с использованием в качестве ферментной метки ПС,

• Показать возможность определения СМП в озерной воде и молоке с применением хемилюминесцентной детекции ПС.

Основываясь на отдельных характерных свойствах, все многообразие антигенов можно подразделить на несколько групп [43]:

• По происхождению (экзогенные, эндогенные),

• По химической природе (белки, липополисахариды, нуклеиновые кислоты и др.),

• По молекулярной массе (биополимеры, низкомолекулярные вещества),

• По степени иммуногенности (полноценные и неполноценные антигены, или гаптены),

• По степени чужеродности (ксено-, алло- и изоантигены),

• По направленности активации и обеспеченности иммунного реагирования (иммуногены, толерогены, аллергены).

В данной работе в качестве исследуемого антигена использовался сульфаметоксипиридазин (СМП) - вещество, относящееся к группе неполноценных антигенов. К гаптенам относится широкий круг природных соединений: пептидные и стероидные гормоны, различные лекарственные препараты, антибиотики, витамины, олигосахариды и т.д. Неполноценные антигены или гаптены неспособны при введении в нормальных условиях индуцировать в организме иммунный ответ. Однако свойство антигенности они не утратили, что позволяет им специфически взаимодействовать с уже готовыми факторами иммунитета (Ат, лимфоцитами). Чаще всего гаптенами являются низко молекулярные соединения с молекулярной массой меньше 10 кДа. Для получения антител к гаптену его молекулярную массу искусственно укрупняют, соединяя ковалентной связью с белковой молекулой или другим полимерным носителем. Синтезированный таким образом конъюгат будет обладать всеми свойствами полноценного антигена и вызывать при введении в организм выработку антител или клона лимфоцитов, специфичных к гаптенной части комплекса. При этом специфичность в составе молекулы конъюгата определяется гаптенной частью, а иммуногенность - белком-носителем. Химическая модификация гаптена, как правило, заключается во введении в его структуру карбоксильной или аминогруппы [44, 45]. Очень часто используется введение «ножки» («мостика») между модифицированным гаптеном и белком-носителем. Длина ножки, обеспечивающая пространственную удаленность эпитопа от белковой структуры, обычно составляет от 2 до 5 метиленовых группировок [46-48]. Структура гаптена, строение и длина участка между гаптеном и белком-носителем в конъюгате вносят существенный вклад в процесс иммунного распознавания.

При получении антител к низкомолекулярным веществам в качестве носителя используют разные белки: сывороточные альбумины быка и человека, овальбумин (ОВА), тиреоглобулин, гемоцианин, фетуин, фракции ^О из сывороток другого вида животных и др. [46, 48-50]. В каждом случае выбирается белок-носитель под конкретные задачи.

Получение ковалентных конъюгатов гаптен-носитель подробно описано в [51 -54]. Количество молекул гаптена, приходящихся на одну молекулу белка-носителя, существенно влияет на иммуногенность конъюгата. Этот параметр может быть измерен методами УФ- и ИК-спектроскопии [55], масс-спектрометрии, электрофореза, сравнением числа свободных аминогрупп в конъюгате и исходном белке [56]. Наилучшими иммуногенами являются конъюгаты, содержащие от 15 до 30 молекул гаптена на одну молекулу белка, поскольку данное соотношение обеспечивает высокую поверхностную "плотность" гаптена и, как следствие, хорошие иммуногенные свойства конъюгата [57].

1.1.2. Строение и функции антител

Одной из форм реагирования иммунной системы в ответ на внедрение в организм антигена является биосинтез антител (Ат) - белков, специфически реагирующих с антигенами. Антитела относятся к у-глобулиновой фракции белков сыворотки крови. На долю у-глобулинов приходится 15-25 % белкового содержания сыворотки крови, что составляет 10-20 г/л. Они специфически связываются с антигеном и участвуют во многих иммунологических реакциях [43, 58].

Вследствие высокой специфичности и значимости в формировании гуморального иммунитета, Ат используют для диагностики, профилактики и лечения соматических и инфекционных заболеваний, выделения и очистки биологически активных веществ. Для этого на основе специфических иммуноглобулинов созданы соответствующие иммунобиологические препараты -лечебные и диагностические сыворотки, диагностикумы и пр.

В организме Ат вырабатываются специфическими клетками крови - В-лимфоцитами, каждый из которых имеет на своей поверхности до 100000 рецепторов одинаковой специфичности, способных узнавать любой чужеродный антиген. Антиген, встречаясь в кровотоке с комплементарным ему рецептором, проводит отбор (селекцию) соответствующего В-лимфоцита, который затем, трансформируясь в плазматическую клетку и многократно делясь, образует клон клеток. Каждый клон плазматических клеток секретирует гомогенные по структуре Ат. Однако так как антиген активирует в крови сразу большое количество типов В-лимфоцитов, которые содержат рецепторы разной степени специфичности по отношению к исходному антигену, такой иммунный ответ называется поликлональным. Сыворотку животного, содержащую специфические к данному антигену Ат, называют антисывороткой (например, антисыворотка кролика против эритроцитов человека). Принципиально важным является то, что поликлональные Ат даже против одной антигенной детерминанты гетерогенны как по структуре активного центра, так и по физико-химическим свойствам. Если антиген поливалентен, то в сыворотке крови образуются Ат, направленные против каждой индивидуальной антигенной детерминанты.

Среди известных типов свороточных иммуноглобулинов количественно преобладают, это основные антитела, обеспечивающие вторичный иммунный ответ. Молекула имеет четвертичную структуру и образована двумя тяжелыми (Н) и двумя легкими (Ь) цепями (субъединицами). Целостность четвертичной структуры поддерживается как нековалентными взаимодействиями, так и межсубъединичными дисульфидными связями [58]. В пространственной структуре и легкой, и тяжелой цепей иммуноглобулинов четко прослеживаются домены, отвечающие отрезкам последовательности, которые содержат примерно 110 аминокислотных остатков. Домены сходны по способу укладки полипептидной цепи и могут быть отнесены к типичным р-структурным белкам. Четко выраженная доменная организация молекулы иммуноглобулина делает возможным самостоятельное существование, а в ряде случаев и функционирование отдельных ее фрагментов при условии, что в них сохраняются более или менее сложные ансамбли доменов. Домены иммуноглобулинов, соответственно расположенные в разных цепях, взаимодействуют между собой, как правило, за счет нековалентных связей, что приводит к промежуточным подуровням структурной организации. Например, вариабельные домены Vi, и Уц взаимодействуют весьма тесно, образуя единый центр связывания антигена. Два таких сдвоенных модуля - Vl + Уц и + С„1 - объединяются в общую структуру: Fab - фрагмент (от англ. Fragment antibody-binding - антигенсвязывающий фрагмент) (рис. 1). Fc - фрагмент не участвует непосредственно в связывании антигена, однако ответственен за взаимодействие со специфическими рецепторами иммуноглобулинов на поверхности клеток и необходим для инициирования целого каскада реакций, направленных на элиминирование связанного антителом антигена [58].

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено Ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность комплекса и количество связавшегося антигена с Ат зависят от аффинности/авидности антител и их валентности [43].

1.1.3. Классификация иммунохимических методов анализа

Многообразные диагностические методики, основанные на реакции антиген-антитело (Аг-Ат), можно условно разделить на четыре основные группы [59]:

1. Методы анализа, основанные на взаимодействии Аг-Ат, результаты которого определяются непосредственно (базируются на феноменах агглютинации и преципитации - «склеивание» и выпадение в осадок частиц или цельных клеток, несущих антигены, под действием специфических агглютининов, в роли которых могут выступать Ат, лектины). Реакция агглютинации широко используется для определения групп крови и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний и т.д.

2. Методы, основанные на агглютинации частиц, предварительно закрепленных на пассивных носителях (способы регистрации - визуальный и приборный).

3. Индикаторные методы с использованием специально подготовленных меченых молекул Аг или Ат, являющихся маркерами образовавшихся иммунных комплексов.

Рис. 1. Строение молекулы иммуноглобулина G (по [58]).

Н - тяжелая цепь, L — легкая цепь, Q, и Сн - константные области, Ll и Lh -вариабельные области; 1 - гипервариабельные участки легкой цепи, 2 -гипервариабельные участки тяжелой цепи, 3 - шарнирная область, 4 - участок связывания комплемента, 5 - углеводный фрагмент, 6 - внутрицепьевые дисульфидные связи; Fab - фрагмент, связывающий антиген, Fc -константный фрагмент

4. Методы, основанные на применении иммуносенсоров, являющихся разновидностью биосенсоров - специальных устройств, объединяющих в себе биологически чувствительный материал с системой передачи и трансформации электрического или иного сигнала, сопровождающего реакцию Аг-Ат. Это направление в иммуноанализе уже находит широкое применение в анализе реальных образцов [60, 61].

Рассмотрим подробнее подклассы, на которые могут быть разделены методы, основанные на использовании меченых молекул.

1.1.4 Реакции с использованием меченых антител или антигенов

Радиоиммунологический метод (РИА).

Впервые применение изотопно меченых антител в иммуноанализе описали Miles и Hales в 1968 г. [62]. Они показали, что иммунорадиометрические методы, использующие в качестве меток радиоактивные изотопы, должны обеспечить повышение чувствительности и специфичности. Это положило начало интенсивным исследованиям и последующему широкому применению радиоиммуноанализа (РИА) в лабораторной практике, который используется и сейчас для аналитических целей.

Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, 3Н, 51Сг и др.). После их взаимодействия определяют радиоактивность образовавшегося иммунного комплекса в соответствующем счетчике (бета- или гамма- излучение); интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. РИА применяют для выявления разнообразных антигенов, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях -10~12- 10~15 г/л.

Несмотря на высокую чувствительность и селективность РИА, очевидны и его недостатки. Прежде всего, это радиоактивное излучение и проблема захоронения отходов. Кроме того, в РИЛ усложнена стандартизация, так как срок годности наборов зависит от периода полураспада радиоактивного иода-125 (или других меток). Это объясняет развитие широкого спектра альтернативных методов, не требующих радиоактивных изотопов и использующих различные физические принципы количественного определения метки [43].

Иммуноферментный метод (ИФА).

Miles и Hales [63] описали возможность применения ферментов вместо изотопов в иммунометрическом анализе. В 1971 г. Van Weemen и Schuurs [64], Engvall и Perlmann [65] независимо друг от друга опубликовали первое детальное описание иммуноферментного анализа. Этот метод основан на реакции антиген -антитело с применением в качестве метки фермента, активность которого определяют, добавляя субстрат-хромоген. Субстрат модифицируется в присутствии фермента, в результате чего изменяется цвет субстратной смеси, если детекция колориметрическая, или выделяется свет, если детекция люминесцентная. Интенсивность окраски зависит от количества связавшихся молекул антигена или антител [43].

Наиболее распространен твердофазный ИФА (тИФА), когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках планшетов, изготовленных из полистирола. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в концентрациях до Ю"10 - 10"12 г/л [43, 66]. В 1980 году Hammock и Mumma [67] показали возможность применения данной технологии для анализа пестицидов и, соответственно, использование такого анализа в химических исследованиях окружающей среды. В настоящее время ИФА является одним из распространенных методов, используемым в различных областях сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для охраны окружающей среды [68].

Иммуиоблоттгтг (ИБ).

Это высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг - от англ. Blot - пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. ИБ используют, например, как диагностический метод при ВИЧ инфекции и других заболеваниях [43, 69], для выявления и определения белковых антигенов и антител [70, 71].

Далее мы подробно остановимся лишь на иммуноферментном анализе, вариантах его проведения и основных аналитических характеристиках. 1.1.5. Разнообразие методов ИФА

Из-за разнообразия объектов исследования - от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует очень большое количество вариантов этого метода, что затрудняет его классификацию.

Описание различных форматов иммуноанализа, общие принципы разработки и оптимизации ИФА изложены в ряде обзоров [72-77].

Предлагаются различные подходы к классификации иммуноферментных схем анализа [52, 78, 79]:

• по соотношению концентраций антигена и сайтов связывания антигена;

• по типу определяемого комплекса (детекция образованного иммунного комплекса или свободных паратопов - антигенсвязывающих центров);

• по меченому соединению (антиген или антитело);

• по характеру стадии иммунохимического распознавания (образование иммунного комплекса на твердой фазе или в растворе с последующим его отделением при помощи иммобилизованного реагента);

• по числу реагентов, участвующих в образовании иммунного комплекса (неконкурентные - участвуют антиген и Ат, конкурентные - участвуют антиген, меченый антиген и Ат).

Рассмотрим эти подходы подробнее.

За основу всех методов ИФА следует принять разделение концентрации специфических комплексов анализируемого соединения с центрами связывания -прямое его определение или нахождение по разности общего числа мест связывания и количества оставшихся свободными центров связывания.

Можно также классифицировать методы ИФА по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа [68]. Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические Ат), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в относительном недостатке центры специфического связывания, то метод является конкурентным.

С точки зрения способа выполнения все методы иммуноферментного анализа можно разделить на две группы: протекающие в гомогенной среде {гомогенные) и системы, в которых такое разделение необходимо {гетерогенные). Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения.

В целях удобства классификации целесообразно проводить разделение гетерогенных методов по характеру первой стадии «узнавания», которая является определяющей для всего анализа. Если на первой стадии анализа образование специфических иммунокомплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гетерогенные. Если же на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии, а, следовательно, формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ. solid phase assay). 1.1.5.1. Гомогенные методы иммуноанализа

Гомогенный ИФА был предложен Рубенштейном и соавторами [80] в 1972 году. Данные методы иммуноанализа отличаются от гетерогенных тем, что реакция антиген-антитело проходит в единой гомогенной среде, без разделения компонентов, и идентификация комплекса происходит здесь же (рис. 2). Эти методы в основном базируются на эффекте модуляции Ат активности фермента (или кофактора), используемого в качестве метки. Все известные схемы проведения гомогенного ИФА основаны на том, что регистрируется концентрация не образовавшегося специфического комплекса Аг-Ат, а оставшихся свободных центров специфического связывания [52].

Разнообразие гомогенных вариантов анализа обусловлено возможностью введения метки как в молекулу антигена, так и в молекулу Ат. Наиболее распространенным подходом является введение метки в молекулу антигена. Это конкурентные методы, основанные на одновременном взаимодействии с Ат анализируемого и меченого антигена. Ферментативная активность после проведения иммунохимической реакции пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого липшда. Необходимым условием гомогенных ИФА является изменение наблюдаемой ферментативной активности при взаимодействии меченого антигена с Ат. Это достигается различными способами:

• исключением субстрата из ферментативной реакции вследствие стерического затруднения взаимодействия субстрата с ферментом, возникающего при образовании иммунохимического комплекса антител с меченым антигеном;

• индуцируемым Ат конформационным изменением структуры молекулы фермента-метки, приводящим к изменению ферментативной активности;

• модуляцией Ат способности кофакторов, субстратов, ингибиторов и других соединений участвовать в ферментативной реакции.

Доинством гомогенного метода ИФА является его экспрессность. Однако к его недостаткам можно отнести меньшую по сравнению с гетерогенными методами ИФА чувствительность [52]. Еще одним ограничением является то, что анализ сложных биологических жидкостей затруднен из-за возможного наличия в среде кофактора или эффекторов фермента. Основной областью применения гомогенного ИФА является экспрессный анализ лекарств [81].

1.1.5.2. Гетерогенные методы иммуноанализа

Гетерогенные методы ИФА предполагают использование нерастворимых носителей для разделения анализируемых компонентов. Адсорбция иммунореагентов происходит на поверхности носителя за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей. Наиболее широкое применение получили 96-луночные полистирольные планшеты. Но в настоящее время коммерчески доступны 386-луночные планшеты, которые применяются для скрининговых исследований и позволяют использовать меньшие количества реагентов. Разработаны методики, основанные на применении полистироловых пробирок [82], латексных частиц [83], магнитных частиц [84] и даже с сорбированием на компакт-дисках [77]. Также в настоящее время находят применение методы иммуноанализа с использованием наночастиц [61, 85-87]. Детекцию низкомолекулярных антигенов, к которым относятся все сульфаниламиды, можно реализовать исключительно конкурентными методами. Иммобилизация антител/антигена на твердой фазе производится несколькими способами: ковалентным, ковалентно-адсорбционным, адсорбционным, аффинным, микрокапсулированием [68, 77, 88, 89]. Наиболее часто применяется метод физической адсорбции, главное преимущество которого заключается в простоте его проведения [90].

Многообразие типов гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа (далее тИФА (или ELISA - от англ. Enzyme Linked Immunosorbent Assay)) [91] обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу Ат.

Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов - антиген или антитело, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавшихся реагентов. Существует два вида конкурентного тИФА: прямой и непрямой.

Самый простой - прямой конкурентный, где Ат сорбируются на твердую фазу [90], а меченый и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом (рис. 3).

Одна из схем проведения непрямого конкурентного тИФА предполагает использование использовании меченых антивидовых антител (рис. 4). На поверхности носителя также иммобилизуют конъюгат гаптен-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый гаптен и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена (непрямой анализ).

V о-©

Низкая концентрация определяемого антигена

Низкая ферментативная активность

О О о

Высокая концентрация определяемого антигена

Высокая ферментативная активность

Антитело

Антиген

ОЧ;) Антиген, меченный ферментом

Рис. 2. Принцип гомогенных методов иммуноанализа о О о-О

Оф О

М)

Антитело(сорбировано)

Антиген (аналит)

Антиген, меченный ферментом

Рис. 3. Схема прямого конкурентного тИФА

Сорбированный ф Антиген (аналит) антиген

Специфическое антитело

Конъюгат а нти видовое антитело - фермент

Рис. 4. Схема непрямого конкурентного тИФА

Введение анализируемого образца и меченого реагента на разных стадиях анализа позволяет устранить влияние различных эффекторов, присутствующих в пробе, на каталитические свойства ферментной метки.

Вторая схема проведения твердофазного ИФА предполагает использование иммобилизованного Ат и меченого ферментом антигена. Ат могут быть сорбированы на твердофазном носителе непосредственно или с использованием стафилококкового белка А, который обладает способностью связывать Рс-области антител.

К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Преимуществом данной схемы является небольшое число стадий, а недостатком - сложность и не универсальность методов синтеза ферментных конъюгатов.

К методам с использованием меченых антител и иммобилизованных антител относятся варианты «сэндвич»-метода. К носителю с иммобилизованными Ат добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом Ат. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Он может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты (рис. 5). / /1 о ° О о

О с

Рис. 5. Схема «сэндвич» - формата непрямого конкурентного тИФА

1.2. Применение реакции авидин-биотин вИФЛ

Иммуноглобулины синтезируются в организме позвоночных и способны распознавать и специфически связывать антигены и включать механизм их элиминирования. Однако белки, обладающие свойством избирательно связывать другие молекулы, не редки. Более того, хорошо известны случаи образования белками чрезвычайно прочных комплексов с различными соединениями -лигандами. К ним относятся, например, комплексы авидина или его микробного аналога - стрептавидина - с биотином, комплексы ферментов и их природных белковых ингибиторов (например, барназа - барстар) и т.п. [58, 92, 93]. В некоторых случаях для определения взаимодействия антиген-антитело неудобно вводить метку напрямую. Одним из вариантов непрямого мечения рассматривается взаимодействие авидин - биотин.

Известно, что для обеспечения прочного взаимодействия (KD = 10'15 М) биотина (витамина Н) с гликопротеином яичного белка авидином (М=67 кДа) требуется только часть молекулы (уреидное кольцо витамина). Таким образом, карбоксильная группа может быть модифицирована для получения активных производных [94]. Биотин, связанный с макромолекулой (ферментом, антителом), сохраняет способность связываться с активным центром авидина. Так как молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, то с ней могут быть одновременно связаны остатки биотина как минимум двух различных биотинилированных белков (например, Ат и фермента) [95].

Применение авидина в данной системе ограничивается из-за его основности (pl 10,5) и степени гликозилирования, в связи с чем возрастает уровень неспецифического связывания. Авидин используется после модификации, например, окисления перйодатом натрия [96, 97].

Также появляются сведения о новых белках семейства авидина, например, ксенавидина, выделенного из лягушек Xenopus tropicalis [98]. Как альтернатива авидину, в бактериях Streptomyces avidinii был обнаружен другой биотинсвязывающий белок, названный стрептавидином [99] (М=60 кДа), а в настоящее время получают рекомбинантный стрептавидин. Авидин и стрептавидин сильно различаются по аминокислотному составу, но оба богаты остатками триптофана. В отличие от авидина, он не гликозилирован и имеет нейтральную р1 и широко используется в иммунобиохимии и иммуноцитохимии [100].

Систему, основанную на реакции стрептавидин-биотин в иммуноанализе выгодно использовать по следующим причинам:

• биотинилирование антител и ферментов легко осуществить в мягких условиях с минимальными изменениями ферментативной и иммунологической активности конъюгатов;

• биотинилированные ферменты можно использовать как универсальные реагенты;

• использование авидин-биотинового комплекса обеспечивают повышение чувствительности;

• авидин, стрептавидин, Ы-гидроксисукцинимидные эфиры биотина и большое число их конъюгатов с ферментами и Ат коммерчески доступны.

В литературе встречается множество публикаций по использованию биотин-авидин/стрептавидиновой пары для иммуноанализа как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных соединений [101-116]. 1.3. Аналитические характеристики имму но анализа

Важным вопросом при разработке иммунохимических методов является определение аналитических характеристик метода. Рассмотрим этот вопрос подробнее.

Градуировочная кривая - это графическая зависимость, связывающая концентрацию определяемого вещества с тем параметром, который измеряется в ходе анализа (оптической плотностью, интенсивностью люминесценции, электродным потенциалом и т.д.). Масштаб координатных осей может быть как линейный, так логарифмический.

Аналитические характеристики иммунохимических методов получают непосредственно из параметров градуировочной кривой (рис. 6). Эта кривая для конкурентных методов анализа часто достаточно удовлетворительно описывается четырехпараметрическим уравнением следующего вида:

У=(А1-А2)/[1+(^/А0)ь]+А2, где А] - максимальное значение сигнала, Ь - наклон кривой в точке 1С50, А0 -концентрация, при которой связывание с меткой составляет 50%, А2 — минимальное значение сигнала.

Предел обнаружения (1Сю) определяется как минимально детектируемая концентрация анализируемого вещества. Во многих случаях в конкурентном иммуноанализе эту величину принимают равной концентрации аналита, при которой наблюдается 90% В/В0. С другой стороны, также используют предложенный Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮГТАК) метод "трех сигм", при этом предел обнаружения рассчитывают по формуле:

Впо^Во-З-ББ, где ВПо ~ значение сигнала, соответствующее минимально определяемой концентрации (пределу обнаружения), В0 - усредненное значение сигнала, соответствующее образцам с нулевой концентрацией исследуемого соединения, ББ - стандартное отклонение Во.

Оба указанных метода дают примерно одинаковые результаты и активно применяются при обработке результатов ИФА.

Предел количественного определения — это значение концентрации, выше которой можно проводить количественный анализ с установленной относительной точностью или определенным доверительным интервалом [5].

Точность анализа определяется как различия между повторными измерениями одной и той же пробы. Количественной характеристикой данного параметра является коэффициент вариации:

КВКЯО/А) 100%, где А - среднее арифметическое сигналов в серии повторных измерений.

Сигмоидная форма градуировочной кривой способствует увеличению ошибки на границах диапазона определяемых концентраций: максимальная точность определения будет находиться в области концентраций, близких к точке перегиба (1С50). На величину коэффициента вариации влияют постоянные и случайные ошибки анализа, качество измерительной аппаратуры и квалификация персонала. в/вп, % 100

0,01 0,1 1 10 100 1000

Конкурент], нг/мл

Рис. 6. Типичная градуировочная кривая конкурентного тИФА. ПО - предел обнаружения метода (минимальная детектируемая концентрация), ПКО - предел количественного определения, 1С50 - концентрация, при которой ингибируется 50% максимального сигнала

Специфичность илшуноанализа характеризует взаимодействие антител со структурно близкими аналогами определяемого вещества. Процент перекрестных реакций (ППР) обычно рассчитывают по формуле:

Ю50 специфического антигена

ППР = - х 100%,

ГС50 перекрестнореагирующего гаптена где 1С50 - концентрация аналита, приводящая к 50%-ному ингибированию связывания антител [117].

Воспроизводимость анализа — повторяемость (в пределах установленной погрешности) результатов измерений полученных одним и тем же методом, на идентичных объектах испытаний, в разных лабораториях, разными операторами, с использованием различного оборудования. Она может быть охарактеризована с помощью величины среднеквадратического отклонения.

1.4. Применение ферментов в ИФА

1.4.1. Требования к ферментам, используемым в ИФА в качестве меток

К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд требований [52], прежде всего:

• высокая удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;

• доступность фермента;

• возможность получения чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую каталитическую активность после химической модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами;

• стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;

• простота и чувствительность метода определения активности фермента. Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА из ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза, щелочная фосфатаза, р-£-галактозидаза, глюкозооксидаза [43, 79].

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела. При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислот, при этом часть из них находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобным для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагиновых или глутаминовых остатков, SH-группы цистеина. Модификация не должна затрагивать функциональных групп активного центра, а также влиять на каталитически активную конформацию всей ферментной глобулы. Поэтому, например, в случае конъюгации пероксидаз с белками, в частности, с Ат, используется перйодатный метод [118], в процессе которого происходит окисление углеводной части фермента, но не затрагивается белковая часть.

1.4.2. Характеристика класса пероксидаз

Пероксидазы (КФ 1.11.1.7) составляют группу ферментов, катализирующих окисление различных субстратов перекисью водорода, и играют важную роль в физиологии растений [119, 120], в том числе для удаления токсичных для организма перекисей [121].

Это гем-содержащие гликопротеины с молекулярной массой полипептидной цепи порядка 31-36 кДа. Содержание олигосахаридов в молекуле колеблется от 0 до 25%. Гем-содержащие пероксидазы (КФ 1.11.1 .X, где X определяется природой восстановителя) подразделяются на 2 суперсемейства: пероксидазы растений и пероксидазы животных.

Суперсемейство пероксидаз растений подразделяется на 3 класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей и особенностей посттрансляционной модификации [122]. Класс I включает микробиальные пероксидазы, бактериальные каталазы-пероксидазы (КФ 1.11.1.6), дрожжевую цитохром С пероксидазу (КФ 1.11.1.5) и аскорбатпероксидазы растений (КФ 1.11.1.11). Класс II - это пероксидазы грибов, включающие лигнинпероксидазу, марганецпероксидазу и секреторные пероксидазы растительного типа. Класс III -это классические пероксидазы растений. Пероксидазы двух последних классов (КФ 1.11.1.7) гликозилированы, содержат 4 дисульфидные связи и 2 катиона кальция на молекулу фермента.

Изоферментный спектр пероксидаз растений представлен кислыми (pl 3,55,0), щелочными (pl 7,5-9,5) и суперщелочными (pl >10) изоформами, которые всегда присутствуют во всех тканях растения в той или иной пропорции.

К настоящему времени обнаружено и изучено очень большое количество пероксидаз: пероксидазы хрена, сои, дыни, картофеля, брюссельской капусты, ячменя, брюквы, апельсина, полыни, плодов перца, моркови, табака, люцерны, ростков пшеницы, огурца, зелёной груши, плодов папайя, верблюжьей колючки, редиса, шпината, мякоти кокоса, риса, хлопка, арахиса, томата и клубники [1-34]. Увеличился интерес к пероксидазам грибов [35-37]. Все это связано с открытием новых реакций, катализируемых пероксидазой, и перспективами их использования в биотехнологии, биохимии и индустрии. Пероксидаза в качестве метки находит широкое применение в методах аналитической биохимии и иммунохимии, что обусловлено чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе.

1.4.3. Пероксидаза хрена.

В настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Armoracia rusticana). Молекула пероксидазы хрена представляет собой глобулярный белок диаметром примерно 5 нм, состоящий из апофермента и гемина.

Изофермент С пероксидазы хрена - наиболее широко применяемый для целей анализа и поэтому охарактеризованный подробнее других пероксидаз растений. Изофермент С ПХ имеет рГ=8,8 [123], хотя в корнях хрена встречаются и другие изоферменты этой пероксидазы [124].

Велиндер в 1979 г. определила аминокислотную последовательность ПХ [123], а в 1985 г. предложила структуру молекулы ПХ [122]. Молекулярная масса полипептидной цепи составляет 33899 (308 аминокислотных остатков), в то время как нативный фермент имеет массу, близкую к 44 кДа. Молекула ПХ содержит 4

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Берлина, Анна Николаевна

выводы

1. Разработан иммуноферментный анализ антибактериального препарата сульфаметоксипиридазина с колориметрической детекцией с использованием пероксидазы сои в качестве фермента-маркера. Предел обнаружения сульфаметоксипиридазина составляет 0,4 нг/мл.

3. Разработан иммуноферментный анализ сульфаметоксипиридазина с хемилюминесцентной детекцией. Предел обнаружения сульфаметоксипиридазина составляет 0.02 нг/мл. Переход от колориметрической к хемилюминесцентной детекции активности пероксидазы сои привел к 20-кратному снижению предела обнаружения.

4. Проведено сравнение аналитических характеристик разработанного иммуноферментнош анализа сульфаметоксипиридазина с хемилюминесцентной детекцией пероксидаз сои и хрена в качестве маркеров. Установлено, что пероксидаза сои обладает преимуществами по сравнению с традиционно используемой пероксидазой хрена, заключающимися в снижении предела обнаружения сульфаметоксипиридазина в 15 раз и значительном возрастании стабильности сигнала.

5. Показана возможность иммуноферментного определения сульфаметоксипиридазина в образцах молока и озерной воды с использованием хемилюминесцентной детекции пероксидазы сои.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Берлина, Анна Николаевна, Москва

1. Mirza О., Henriksen A., Ostergaard L., Welinder K.G., Gajhede M., Arabidopsis thaliana peroxidase N: structure of a novel neutral peroxidase. II Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2000. 56(Pt3): p. 372-375.

2. Thongsook Т., Barrett D.M., Purification and Partial Characterization of Broccoli (Brassica oleracea Var. Italica) Peroxidases. // J. Agric. Food Chem., 2005. 53(8): p. 3206-3214.

3. Roberts E., Kutchan Т., Kolattukudy P.E., Cloning and sequencing of cDNA for a highly anionic peroxidase from potato and the induction of its mRNA in suberizing potato tubers andtomatofruits. //Plant. Mol. Biol., 1988. 11(1): p. 15-26.

4. Duarte-Vazquez M.A., Whitaker J.R., Rojo-Dominguez A., Garcia-Almendarez

5. B.E., Regalado C., Isolation and thermal characterization of an acidic isoperoxidase from turnip roots. // J. Agric. Food Chem., 2003. 51(17): p. 50965102.

6. Schmitz N., Giles K.A., van Huystee R.B., Characterization of anionic soybean (Glycine max) seed coat peroxidase. // Can. J. Bot., 1989. 75: p. 1336-1341.

7. Brooks J.L., Oxidase Reactions of Tomato Anionic Peroxidase. II Plant. Physiol., 1986. 80(1): p. 130-133.

8. Mazza G., Welinder K.G., Covalent structure of turnip peroxidase 7. Cyanogen bromide fragments, complete structure and comparison to horseradish peroxidase

9. C. II Eur. J. Biochem., 1980. 108(2): p. 481-489.

10. Clemente E., Purification and thermostability of isoperoxidase from oranges. H Phytochem., 1998. 49: p. 29-36.

11. McLellan K.M., Robinson D.S., Purification and heat-stability of Brussels-sprout peroxidase isoenzymes. II Food Chem., 1987. 23(4): p. 305-319.

12. Abeles F.B., Dunn L.J., Morgens P.H., Callahan A.H., Dinterman R.E., Schmitt J., Induction of 33-kDa and 60-kD peroxidases during ethylene-induced senescence of cucumber cotyledons. II Plant. Physiol., 1988. 87: p. 609-6015.

13. Anthon G.E., Barrett D.M., Kinetic parameters for the thermal inactivation of quality-related enzymes in carrots and potatoes. II J. Agric. Food Chem., 2002. 50(14): p. 4119-4125.

14. Halpin В., Pressey R., Jen J., Mondy N., Purification and Characterization of Peroxidase Isoenzymes from Green Peas (Pisum sativum). II J. Food Sci., 1989. 54(3): p. 644-649.

15. Civello P.M., Martinez G.A., Chaves A.R., Anon M.C., Peroxidase from Strawberry Fruit (Fragaria ananassa Duch.): Partial Purification and Determination of Some Properties. // J. Agric. Food Chem., 1995. 43(10): p. 25962601.

16. Ito H., Hiraoka N., Ohbayashi A., Ohashi Y., Purification and characterization of rice peroxidases. // Agric. Biol. Chem., 1991. 55(10): p. 2445-2454.

17. Duarte-Vazquez M.A., Garcia-Almendarez B.E., Regalado C., Whitaker J.R., Purification and properties of a neutral peroxidase isozyme from turnip (Brassica napus L. Var. Purple Top White Globe) roots. II J. Agric. Food Chem., 2001. 49(9): p. 4450-4456.

18. Сахаров И.Ю., Использование новых пероксидаз растений в ттуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией. II Биохимические методы анализа, под ред. Дзантиева Б.Б. 2010, Наука: Москва, р. 349-365.

19. Sakharov I.Y., Long-Term Chemiluminescent Signal Is Produced in the Course of Luminol Peroxidation Catalyzed by Peroxidase Isolated from Leaves of African Oil Palm Tree. //Biochem., 2001. 66(5): p. 515-519.

20. Cano M.P., Lobo M.G., de Ancos В., Galeazzi M.A.M., Polyphenol Oxidase from Spanish Hermaphrodite and Female Papaya Fruits (Carica papaya Cv. Sunrise, Solo Group). II J. Agric. Food Chem., 1996. 44(10): p. 3075-3079.

21. Da Silva E., Lourenco E.J., Neves V.A., Soluble and bound peroxidases from papaya fruit. //Phytochem., 1990. 29(4): p. 1051-1056.

22. Kouakou T., Dué E., Kouadio N., Niamké S., Kouadio Y., Mérillon J.-M., Purification and Characterization of Cell Suspensions Peroxidase from Cotton (Gossypium hirsutum L.). // Appl. Biochem. Biotechnol., 2009. 157(3): p. 575592.

23. Buffard D., Breda C., van Huystee R.B., Asemota O., Pierre M., Ha D.B., Esnault R., Molecular cloning of complementary DNAs encoding two cationic peroxidases from cultivated peanut cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. 87(22): p. 88748878.

24. Kristensen B.K., Bloch H., Rasmussen S.K., Barley coleoptile peroxidases. Purification, molecular cloning, and induction by pathogens. II Plant. Physiol., 1999.120(2): p. 501-512.

25. Vazquez-Duhalt R., Westlake D.W., Fedorak P.M., Lignin Peroxidase Oxidation of Aromatic Compounds in Systems Containing Organic Solvents. I I Appl. Env. Microbiol., 1994. 60(2): p. 459-466.

26. Hernandez-Ruiz J., Rodriguez-Lopez J.N., Garcia-Canovas F., Acosta M., Arnao M.B., Characterization of isoperoxidase-B2 inactivation in etiolated Lupinus albus hypocotyls. // Biochim. Biophys. Acta, 2000. 1478(1): p. 78-88.

27. Dugad L.B., Goff H.M., Abeles F.B., 1H-NMR characterization of cucumber peroxidases. //Biochim. Biophys. Acta, 1991. 1118(1): p. 36-40.

28. Pomar F., Bernal M.A., Diaz J., F. M., Purification, characterization and kinetic properties of pepper fruit acidic peroxidase. II Phytochem., 1997. 46(8): p. 13131317.

29. Miki Y., Ichinose H., Wariishi H., Molecular characterization of lignin peroxidase from the white-rot basidiomycete Trametes cervina: a novel fungal peroxidase. I IFEMS Microbiol. Lett, 2010. 304(1): p. 39-46.

30. Mao L., Lu J., Gao S., Huang Q, Transformation of 17ss-Estradiol Mediated by Lignin Peroxidase: The Role of Veratryl Alcohol. II Arch. Environ. Contam. Toxicol, 2010. 59(1): p. 13-19.

31. Dai C.C., Tian L.S., Zhao Y.T., Chen Y., Xie H., Degradation of phenanthrene by the endophytic fungus Ceratobasidum stevensii found in Bischofia polycarpa. И Biodegrad., 2010. 21(2): p. 245-255.

32. Kamal J.K., Behere D.V., Activity, stability and conformational flexibility of seed coat soybean peroxidase. II J. Inorg. Biochem., 2003. 94(3): p. 236-242.

33. Sessa D.J., Anderson R.L., Soybean peroxidases: purification and some properties. III. Agric. Food Chem., 1981. 29(5): p. 960-965.

34. Henriksen A., Mirza O., Indiani C., Teilum K., Smulevich G., Welinder K.G., Gajhede M., Structure of soybean seed coat peroxidase: A plant peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. I I Prot. Sci., 2001. 10(1): p. 108-115.

35. Сахаров И.Ю., Пероксидазы пальмы. II Биохимия, 2004. 69(8): с. 823-829.

36. Wang В., Li В., Wang Z., Xu G., Wang Q., Dong S., Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium. //Anal. Chem., 1999. 71(10): p. 1935-1939.

37. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник, под ред. Воробьева А.А. 2004, Москва: Мед. информац. агентство. 601 с.

38. Goodrow М.Н., Hammock B.D., Hapten design for compound-selective antibodies: ELISAS for environmentally deleterious small molecules. II Anal. Chim. Acta, 1998.376(1): p. 83-91.

39. Tessier D.M.,Clark J.M., Hapten Design in the Development of Competitive Enyme-Linked Immunosorbent Assays for Ge no toxic Metabolites of Alachlor. II J. Agric. Food Chem., 1999. 47(9): p. 3925-3933.

40. Lee N., McAdam D.P., Skerritt J.H., Development of Immunoassays for Type II Synthetic Pyrethroids. 1. Hapten Design and Application to Heterologous and Homologous Assays. //J. Agric. Food Chem., 1998. 46(2): p. 520-534.

41. Smith D.S., Hassan M., Nargessi R.D., Principles and practice of fluoroimmunoassay procedures. И Modern Fluorescence Spectroscopy, Wehry, E.L., Editor. 1981, Plenum Press: New York. p. 143-191.

42. Goodrow M.H., Harrison R.O., Hammock B.D., Hapten synthesis, antibody development, and competitive inhibition enzyme immunoassay for s-triazine herbicides. //J. Agric. Food Chem., 1990.38(4): p. 990-996.

43. Katmeh M.F., Aherne G.W., Stevenson D., Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of the phenylurea herbicide chlortoluron in water and biological fluids. II Analyst, 1996. 121(11): p. 16991703.

44. Franek M., Pouzar V., Kolar V., Enzyme-immunoassays for poly chlorinated biphenyls: structural aspects of hapten-antibody binding. II Anal. Chim. Acta, 1997. 347(1-2): p. 163-176.

45. Hermanson G.T., Bioconjugate techniques. Vol. 2. 2008, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto.: Academic Press, p. 745-783.

46. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M., Теория и практика гшмуноферментного анализа. 1991, Москва: Высшая школа.

47. Bauminger S.,Wilchek М., The use of carbodiimides in the preparation of immunizing conjugates. //Meth. Enzymol., 1980. 70(A): p. 151-159.

48. Erlanger B.F., The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates: a survey. I I Meth. Enzymol., 1980. 70(A): p. 85-104.

49. Queffelec A.-L., Nodet P., Haelters J.-P., Thouvenot D., Corbel В., Hapten Synthesis for a Monoclonal Antibody Based ELISA for Deltamethrin. II J. Agric. Food Chem, 1998. 46(4): p. 1670-1676.

50. Fields R., The measurement of amino groups in proteins and peptides. // Biochem., 1971. 124(3): p. 581-590.

51. Holland G.P., Steward M.W., The influence of epitope density on the estimation of the affinity of antibody for complex antigens. II J. Immunol. Meth., 1991. 138(2): p. 245-255.

52. Степанов B.M., Молекулярная биология. Структура и функции белков. 1996, Москва: Высш. шк. с. 204 205, 292 - 302.

53. Попечителев Е.П.,Старцева О.Н., Аналитические исследования в медицине, биологии и экологии. 2003, Москва: Высшая Школа, 280 с.

54. Ricci F., Volpe G., Micheli L., Palleschi G., A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. II Anal. Chim. Acta, 2007. 605(2): p. 111-129.

55. Yang M., Li H., Javadi A., Gong S., Multifunctional mesoporous silica nanoparticles as labels for the preparation of ultrasensitive electrochemical immunosensors. //Biomater., 2010. 31(12): p. 3281-3286.

56. Miles L.E., Hales C.N., Immunoradiometric assay of human growth hormone. II Lancet, 1968. 2(7566): p. 492-493.

57. Miles L.E., Hales C.N., Labelled antibodies and immunological assay systems. U Nature, 1968. 219(5150): p. 186-189.

58. Van Weemen B.K., Schuurs A.H., Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. IIFEBS Lett., 1971.15(3): p. 232-236.

59. Engvall E., Perlmann P., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. //Immunochem., 1971. 8(9): p. 871-874.

Информация о работе

Берлина, Анна Николаевна
кандидата химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе"

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Берлина, Анна Николаевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Берлина, Анна Николаевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Берлина, Анна Николаевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия