Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа высших растений: формы, свойства и регуляция активности

Семенихина, Анастасия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа высших растений: формы, свойства и регуляция активности
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа высших растений: формы, свойства и регуляция активности"

На правах рукописи

о Л

СЕМЕКИХИНА АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: ФОРМЫ, СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ.

03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж -2000

Работа выполнена на кафедре аналитической и медицинской биохимии и микробиологии и кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Попова Т.Н. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ершова А.Н. кандидат биологических наук, доцент Тертычная Т.Н.

Ведущее учреждение:

Институт биохимии РАН имени А.Н. Баха.

Защита состоится 27 октября 2000 года в 13.30 час. на заседании Диссертационного Совета Д 063.48.11 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан 25 октября 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук,

профессор

Т.А.Ковалева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование биохимических основ, ответственных за функциональную целостность, направленность взаимосвязанных физиологических процессов в растении представляют собой проблему, имеющую важное практическое и теоретическое значение. Разработка способов выделения ферментов, результаты изучения их структуры и регуляторных особенностей находят применение в медицине и некоторых отраслях промышленности, так как ферментные препараты широко используются в промышленном синтезе ряда биологически-активных соединений, в диагностических и лечебных целях. Знание механизмов регуляции отдельных ферментных систем являются необходимой предпосылкой для решения проблем, связанных с повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятным условиям, контролем урожайности и продуктивности. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к глубокому анализу регуляции метаболизма высших растений на уровне клетки с выходом на более высокий организменный уровень.

Для организации клеточного обмена в растительной клетке характерно, что на уровне метаболического узла, связанного с превращениями глюкозо-6-фосфата, имеет место пересечение ряда метаболических путей. Глюкозо-б-фосфат является интермедиатом гликолиза, глюконеогенеза и пентозофосфатного пути (ПФП). Физиологическая роль дегидрогеназ пентозофосфатного пути заключается в восстановлении НАДФ до НАДФН, восстановительные эквиваленты которого расходуются в биосинтетических процессах. Другая функция этого пути заключается в образовании пентез (в частности О-рибозы), которые используются для синтеза нуклеиновых кислот.

Осуществление регуляции функционирования данного пути возможно с помощью ключевого лимитирующего фермента - глюкозо-6-фосфатдегидрогеиазы (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49). Г6ФДГ была выделена и охарактеризована из ряда объемов, в основном из микроорганизмов и тканей животных.

экспериментальные затруднения, следует прежде всего отметить освобождение и выход из клеточных компартментов при гомогенизации растительного материала вакуолярного сока с низким значением рН, таннииов, поляфенодоксидаз, протсаз, снижающих биолотическую активность ферментов.

Поскольку метаболизм углеводов в растительной клетке протекает в основном в двух компартментах: цитозоле и хлоропластах, представляет интерес изучение особенностей регуляции активности различно локализованных форм фермента и их роли в сопряжении процессов, протекающих в разных компартментах клетки. Необходимо развитие исследований по изучению координации путей синтеза и распада Сахаров в растительной клетке, утилизации НАДФН в различных бносинтепгческих реакциях (синтез жирных кислот, аминокислот, восстановление глутатиона), а также изучение субстратной специфичности фермента. Выяснение данных аспектов необходимо для более глубокого понимания физиолого-биохимической роли Г6ФДГ в клеточном метаболизме высших растений.

Цели и задачи неследования. Целью настоящей работы было исследование распространения, субклеточной локализации, свойств и регуляции активности различных форм Г6ФДГ высших растеши"!. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение и субклеточную локализацию Г6ФДГ в высших растениях. Исследовать изменение активности фермента при прорастании некоторых растений.

2. Разработать эффективные методы получения высокоочищенньгх препаратов различно локализованных форм Г6ФДГ из растений.

3. Исследовать и сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные свойства цитоплазматической и хлоропластной Г6ФДГ из разных растений.

4. Провести исследование влияния экзогенных факторов (засоления) на активность Г6ФДГ.

5. С учетом особенностей регуляции активности различно локализованных форм Г6ФДГ разработать гипотетическую схему регуляции и сопряжения метаболических процессов в компартментах растительной клетки на уровне данного фермента.

Научная новизна. Разработаны эффективные способы выделения и впервые получены высокоочищешше (в том числе гомогенные) ферментные препараты цитоплазматической и хлоропластной форм Г6ФДГ листьев гороха, ячменя и Spirodela polirizha. Впервые проведены комплексные исследования свойств и дана сравнительная характеристика различно компартментализованных форм ГбФДГ, Показано, что для хлоропластной и цитозольной форм Г6ФДГ наряду со сходными чертами. характерны существенные отличия (чувствительность к субстратному иягибированию, концентрациям АТФ, влиянию рибозо-5-фосфата, галактозо-1-фосфата, галактозо-6-фосфата, различные электрофоретические подвижности). Показано существование диссоциативного механизма регуляции активности ГбФДГ в растительной клетке. Предложена гипотетическая схема регуляции метаболизма углеводов в растительной клетке на этапе Г6ФДГ реакции. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления об организации и регуляции углеводного метаболизма в различных компартментах растительной клетки.

Практическая значимость. Разработанные методы получения высокоочшценных, электрофоретически гомогенных препаратов Г6ФДГ нз ряда растений дают возможность широко использовать их в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием сопряженных ферментных систем in vitro. Полученные в работе данные способствуют созданию более глубоких представлений о механизмах ферментативной регуляции углеводного обмена, что расширяет возможности поиска оптимальных путей интенсификации технологии растениеводства в сельском хозяйстве.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-лочвеяном факультете Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Экологическая биохимия", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийском съезде фотобиологов (Пущино, 1998); 11-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Варна, Болгария, 1998); IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999); II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), 10-ом европейском симпозиуме "Euro Carb X"

(Гауэй, Ирландия, 1999); ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета (1999).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях - 5 статьях и 6 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Исследования, проведенные на высокоочшценных ферментных препаратах Г6ФДГ из растений показали, что цитоплазматнческая и хлоропластная формы фермента могут участвовать б процессах сопряжения и контроля метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет регуляции ферментативной активности путем изменения концентраций субстратов, нуклеотидов (НДДФН, НАД, НАДН, АТФ, АДФ, АМФ, УТФ), ионов некоторых металлов (Mg2+, Mn2+, Ca2*), интермеднатов углеводного обмена и ЦТК.

2. Хлоропластная и цитозольная формы Г6ФДГ имеют различные олтимумы pH, сродство к субстратам, электрофоретическую подвижность, стабильность и хроматографические свойства. Ионы металлов, АТФ, рибозо-5-фосфат, гапактозо-1-фосфат и галактозо-6-фосфат оказывают различное влияние на каталитическую активность хлоропластной и цитозольной форм Г6ФДГ.

3. Для регуляции активности как щггоплазматической, так и хлоропластной Г6ФДГ характерен диссоциативный механизм регуляции. НАДФ способствует переходу димерной формы фермента в тетрамер, что сопровождается возрастанием ферментативной активности.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 152 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (4 глав), заключения, выводов, списка литературы (179 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 45 рисунков и 18 таблиц; в приложении - 4 рисунка и 5 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объекта исследования использовали листья ячменя (Hordeum vulgare L), сорт «Одесский-115», гороха (Pisum sativum L.), сорт «Зеленозерный» и вегетативные вайи ряски (Spirodela polyrhiza L.) клона SJ. В некоторых экспериментах использовали проростки тыквы, кабачка, огурца,

пшеницы, кукурузы и ряда других растении. Растения выращивали гидропонным способом при 25° при освещении дневным светом интенсивностью 15 ООО эрг. см"1 с'.

Выделение клеточных оргапелл. Исследование субклеточной локализации проводили методом дифференциального центрифугирования. Для сравнения различных способов сотобилизации ГбФДГ органоиды разрушали путем создания осмотического шока и с помощью детергентов - Твнна-80 и Тритона Х-100. Маркерным ферментом митохондрий служила цитохром-с-оксндаза и сукцинатдегидрогеназа (СДГ). В качестве маркерного фермента цитоплазмы использовали лактатдегидрогеназу (ДДГ). О наличии хлоропластов в исслед>'емых фракциях судили по количеству хлорофилла, которое определяли по методу Уинтермана (Гавриленко В.Ф.и др., 1975).

Определение активности ферментов. Активность Г6ФДГ определяли спектрофотометр ически при длине волшл 340 нм на СФ-26. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоля продукта реакшда за 1 мин. при температуре 25 °С. Активность щпохром-с-оксидазы определяли при 550 нм (Гавриленко В.Ф. и др., 1975); СДГ - при 600 нм (Cooper T.G., Beevers Н., 1969); активность ЛДГ - при 340 нм (Гавриленко В.Ф. и др., 1975).

Определение количества белка. Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry О. et al., 1951). Содержание белка в высокоочищенных препаратах определяли также по поглощению при 280 нм (Мешкова Н.П., Северин С.Е., 1979).

Выделение и очистка глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы. Для получения высокоочищенных препаратов Г6ФДГ были разработаны процедуры, включающие несколько стадий. В ходе выделения цитоплазматических форм ферментов после гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. ' От низкомолекулярных соединений ферменты отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или -тойоперл и гель-хроматографию на сефадексах G-150 и G-200, а также тойоперл HW-55, 65. Для разделения цитозольной и хлоропластной изоформ использовали как метод дифференциального центрифугирования, так и ионо-обменную хроматографию. В случае дифференциального центрифугировать сначала выделяли хлоропласта, затем осуществляли солюбилизацию фермента с помощью осмотического шока и

гомогенизатора Потгера. Дальнейшую очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-тойоперл и ДЭАЭ-целлкхпозе и гель-фильтрации на сефадексе G-150 или тойоперл HW-55, 65. Все операции проводили в холодной камере при 0-4° С.

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на высокоочшценных препаратах. Определение констант Михаэлиса, ингибирования, рК ионогенных групп осуществляли по Диксону и Уэббу (1982).

Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием стандартных статистических методов (Ивантер Э.В., Коросов A.B., 1992). Обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05. Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации.

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЛКЖОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Исследование распространения Г6ФДГ показало, что имеет место значительная вариация в распространении фермента в ряде высших растений, обусловленная как видовой специфичностью, так и стадией развития.

Результаты распределения ГбФДГ активности по различным клеточным компартментам листьев гороха и ячменя, полученные методом дифференциального центрифугирования, свидетельствуют о наличии двух основных пулов ГбФДГ активности: цитоплазматического и хлоропластного (Табл.1).

Таблица 1.

Распределение активностей глюкозо-б-фосфатдегидрогеиазы, маркерных ферментов и содержания хлорофилла по клеточным фракциям листьев ячменя *

Содержание,% Цитозоль Хлоропласты Митохондрии

ГбФДГ 81,7+3,6 17,9±0,8 0,4±0,0

ЛДГ 70,0+2,8 15,0±0,7 7,0±0,4

сдг 14,0±0,9 12,0±0,5 74,0±4,6

Хлорофилл 11,010,7 76,0±4,2 13,0±0,6

* Примечание: в табл. 1,2,4 обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05.

Исследование субклеточной организации и специфическое выявление изоформ Г6ФДГ после электрофореза в ПААГ показало существование в зеленых листьях гороха и ячменя двух различно локализованных форм, обладающих разной злектрофоретической подвижностью. Существование различно локализованных форм ГбФДГ, вероятно, способствует сопряжению и регуляции процессов метаболизма сахарофосфатов, протекающих как в хлоропластах, так и в цитоплазме (Heber U., 1974; Walker D.A., 1976; Muhlbach Н., Schnarrenberger С., 1978).

ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЛЮКОЗО-б-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Источником выделения и очистки Г6ФДГ служили листья 10-дневных зеленых проростков ячменя и 9-дневных зеленых проростков гороха и вегетативные вайи чистой культуры ряски Spirodela polyrhiza.

Результаты очистки Г6ФДГ из листьев ячменя представлены в таблице 2. Были получены электрофоретически гомогенные препараты Г6ФДГ из листьев ячменя и гороха и частично очищенные препараты фермента из Spirodela poliriza.

Разделение двух изоформ фермента из листьев ячменя было осуществлено при помощи хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с использованием линейного градиента KCl (0-200 мМ) (рис. 1, 2). Так при концентрациях от 90 до 150 м.М KCl получен пик Г6ФДГ (Г6ФДГ1) с максимальной активностью 0,48 ФЕ/мл. После элюшш первого пика Г6ФДГ1 активности в буфер вносили фруктозо-1,6-бисфосфат (ЮмМ), в результате чего элюировался второй пик Г6ФДГ (Г6ФДГ2) активности.

Получение ' ферментов в высокоочищенном состоянии позволило исследовать их физико-химические свойства и регуляцию активности (Табл. 3).

Зависимость скорости реакции, катализируемой различными изофермами ГбФДГ из исследованных растений, от концентрации глюкозо-6-фосфата и НАДФ подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен (Табл. 3). ГбФДГ из исследованных растений является высокоспецифичтгым ферментом по отношению к субстрату и кофермету. Тогда как фермент из ряда микроорганизмов и тканей животных

20 40 60 80 100 Объем элюции, мл

Рис. 1. Разделение изоформ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из листьев ячменя с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе

Рис. 2. Электрофореграмма глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы из листьев ячменя; а- этиолированные листья, б- зеленые листья, в-очищенный фермент из хлоропластов ячменя, г- очищенная цитозогльная форма фермента: 1-цитозольная форма глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы, 2- хлоропластная форма, 3- фронт маркера (бромфеноловый синий). Стрелка указывает направление движения белка во время электрофореза.

Таблица 2.

Очистка глюкозо-6-фосфагдегкдрогелазы из листьев ячменя

Стадии очитсю! Объем Актив- Количество Уд. Степень Выход

фрак- ность, ФЕ белка, мг активность очистки ,%

ции, ФЕ/мг белка

мл

Гомогенат 30.0 8.67±0.83 405.90±3.44 0.02 ± 0.00 — 100.0

Фракционирование 2.5 • 7.34 ±0.55 73.43±8.62 0.10 ±0.01 5.20 84..7

(NH4)2S04 (30-60%

насыщения)

Гель-фильтрация 5.6 6.87± 0.84 6.25 ± 3.48 0.11 ±0.01 5.50 79.2

на сефадексе G-25

Цитозольная

изоформа

Хроматография на 7.0 3.36±0.23 6.54±0.35 0.51±0.04 25.5 38.7

ДЭАЭ-целлюлозе

Хроматография на 6.0 0.49±0.08 0.215±0.02 2.29±0.09 115.0 5.7

сефадексе G-150

Хлоропластная

изоформа

Хроматография на 6.0 1.29±0.15 2.11±0.18 0.63±0.03 31.31 14.9

ДЭАЭ-целлюлозе

Хроматография на 6.0 0.23±0.06 0.17±0.01 1.37±0.08 68.7 2.7

сефадексе G-150

обладает активностью в присутствии НАД и ряда аналогов субстрата (фруктозо-6-

фосфат, маннозо-6-фосфат, галактозо-6-фосфат) (Hiroshi О. et al., 1985; Jeffery J.,

1986; Arriaga D. et al., 1986; Malathi S., 1987; Kiriuchin M.I., Kletsova L.V., 1988;

Neuzif J. et al., 1988; Anderson B.M., Anderson C.D., 1995).

Наблюдается падение ферментативной активности за счет субстратного

ингабирования для хлоропластной формы ГбФДГ из листьев ячменя (К,=0,45 мМ),

из листьев гороха (К, =0,25 мМ) и Spirodela polyrhiza (К;=0,12мМ).

Ионы , Мп2\ С а"' являются активаторами Г6ФДГ из исследованных

растении. Активность Г6ФДГ в отсутствие данных ионов в среде

спеюрофотометрирования по сравнению с активностью при их оптимальной

концентрации составляет около 50-70%. Наибольшая степень активации Г6ФДГ из

хлоропластов ячменя и гороха достигается в присутсвии Са в среде спекгрофотометрирования. Ионы и Мп2* в данном случае оказывают

незначительный активирующий эффект. Тогда как для цитозольной изоформы ГбФДГ из листьев ячменя и гороха наилучшим активатором являются ионы Р^ 2\ Ионы Мп 2* оказывают незначительный активирующий эффект, а С а2" практически не влияет на каталитическую активность цитозольной изоформы Г6ФДГ из листьев ячменя и гороха. Очевидно, что ионы двухвалентных металлов участвуют в регуляции активности ГбФДГ, но не являются необходимыми кофакторами для проявления ферментативной активности.

Результаты исследования зависимости активности ГбФДГ от концентрации ионов водорода показали, что оптимум рН для активности Г6ФДГ из исследованных растений лежит в пределах 7,8-8,2 (Таб. 3). Значения рК функциональных групп хлоропластной формы фермента, рассчитанные нз зависимости ^У-рН, составляют 7,75 и 7,95 и близки к рК имидазольной группы гистидина и рК сульфгадрилыюй группы цистеина. Значения рК

функциональных групп цитозольной формы фермента составляют 8,05 и 8,45 и близки к рК сульфгидрильной группы цистеина. Наличие гистидина в активном центре показано для ГбФДГ из клеток дрожжей (С1ю Б., ЛозЬ! ТС., 1989; 1и Б. е{ а1., 1988). Наличие цистеина показано для фермента из фотосинтезирующих организмов (картофеля, сине-зеленых водорослей) ГСгаеуе К. е! а]., 1994).

Было исследовано влияние ряда нуклеотвдов (НАДФН, НАД, НАДН, АТФ, АДФ, АМФ, УТФ) на каталитическую активность ГбФДГ. Установлено, что в регуляции активности хлоропластной изоформы могут принимать участие НАДФН и АТФ, а цитоплазматической только НАДФН. АТФ является ингибитором хлоропластной изоформы ГбФДГ. При низких концентрациях АТФ (до 0,3 мМ) происходит снижение ферментативной активности на 40-50% для фермента из хлоропластов гороха и ячменя. При последующем увеличении концентрации адешшата ингибирующий эффект снижается, но при увеличении концентрации до 1-2 мМ происходит дальнейшее падение активности. Активность

фермента из ряски снижается на 60% по сравнению с контрольным уровнем при концентраци АТФ 2 мМ.

НАДФН является конкурентным ингибитором цитозольной и хлоропластной форм Г6ФДГ по отношению к НАДФ и цитозольной формы по отношению к глюкозо-6-фосфату. Наблюдается смешанный тип ингибирования хлоропластной формы фермента НАДФН по отношению к глкжозо-б-фосфату (Табл. 3).

Существенное влияние на активность Г6ФДГ могут оказывать некоторые органические кислоты (Табл.4). Наибольший ингибиругощий эффекг на каталитическую активность как цитозольной, так и хлоропластной форм Г6ФДГ из листьев ячменя оказывают транс-аконитат и цис-аконитат. Влияние 2-оксоглутората и сукцината выражено з значительно меньшей степени для цитозольной и хлоропластной форм фермента.

Таблица 4.

Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность цитоплазматической глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из листьев ячменя.

Концентрация метаболита, мМ Активность, % от контроля

Цитрат Изоцит-рат а-кето-глуторат Сукци-нат Цис-аконитат Транс-аконитат

0,0 100,0 ±5,0 100,0 +2,6 100,0 +3,8 100,0 +4,6 100,0 +3,2 100,0 +4,8

0,2 • 92,3+2,7 101,2+4,8 85,7±4,1 85,7+3,6 92,9+4,2 90,9+4,1

0,4. 87,4±3,4 102,6±3,9 82,5+3,8 84,3+3,8 83,3+4,1 86,8+3,7

0,6 88,6+3,6 100,8±2,6 80,4+2,6 80,2+1,6 76,5+3,4 84,8+3,5

0,8 86,5+3,4 98,6+4,1 78,6+3,2 78,6+1,9 64,3+3,8 81,8+3,4

1,0 84,6+2,8 99,8±3,5 72,5+3,4 7 8,4 ±2,7 58,6+2,1 68,7+2,3

2,0 76,9±2,9 97,5+4,6 64,3+2,1 77,6+3,8 42,9±1,6 36,4±1,2

В регуляции активности Г6ФДГ могут принимать участие ряд интермедиатов углеводного метаболизма. Показано, что рибозо-5-фосфат является конкурентным ингибитором хлоропластной изоформы Г6ФДГ по отношению к глюкозо-6-фосфату (Табл. 3.) и практически не влияет на аггивность цитозольной изоформы. З-Фосфоглицериновая кислота является конкурентным ингибитором

Таблица 3.

Некоторые физико-химические и каталитические параметры глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы *

Источник выделения и форма фермента Кмкож. мМ к* (НАДФ ), мМ Оптимум рн Молекуля рная масса, кДа Молекуляр ная масса субъедитсиц ы, кДа Ю (НАДФН), мМ К1 (рибозо-5- фосфат)

Ггаокозо-6-фосфат НАДФ Глюкозо-6-фосфат НАДФ

Цитозолъная форма из листьев ячменя 0,133 ±0,006 0,041 ±0,002 8,5+0,1 112+8 56+6 0,051 ±0,001 0,025 ±0,001

Хлоропластная форма из листьев ячменя 0,275 ±0,0125 0,062 ±0,003 0,450 ±0,018 7,8±0,2 136+7 67±7 0,022 ±0,001 0,010 ±0,000 0,30+0,01

Цитозольная форма нз листьев гороха 2,000 ±0,156 0,500 ±0,012 8,0±0,2 79±2 40+3 ' 0,027 ±0,001 0,050 ±0,002

Хлоропластная форма из листьев гороха 0,371 +0,016 0,024 +0,000 0,250 ±0,009 7,8+0,1 11016 56±3 0,020 +0,001 0,018 +0,001 0,40±0,02

^Примечание: в табл. 3, 5 обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,03.

цитозольной и хлоропластной нзофор.м Г'бФДГ по отношению к глюкозо-6-фосфагу, Ка составляет 0,7 мМ и 0,25 мМ соответственно.

На основании данных аспектов регуляции можно предположить, что при торможении окислительной ветви ПФП в хлоропластах, этот путь продолжает интенсивно функционировать вцитозоле. Обнаружены различия в регуляции каталитической активности хлоропластной и цитозольной форм фермента с помощью галактозо-1 -фосфата и галактозо-6-фосфата (Рис. 3.). Так, при низких концентрациях галактозо- 1-фосфат является активатором цитоплазматической формы Г6ФДГ. Максимум активации наблюдается при 0,4 мМ концентрации концентрации метаболита; при этом активность возрастает в 1,8 раза для фер,мента из гороха и в 1,5 для фермента из ячменя. При 0,5 мМ концентрации галактозо-6-фосфата активность цитозольной формы фермента снижается на 50%. При возрастании концентрации сахарофосфата выше 1мМ ингибируюгций эффект снижается. Тогда как, при действии данных метаболитов на активность хлоропластной изоформы происходит незначительное снижение ферментативной активности (на 25-30%). Фруктозо-б-фосфат является ингибитором как цитозольной, так и хлоропластной форм ГбФДГ. Максимальный ингибирующий эффект достигается при 0,4 мМ концентрации ингибитора (практически в 2 раза для цитозольной изоформы и в 1,5 раза для хлоропластной), но при дальнейшем повышении концентрации наблюдается снижение степени ингибирования.

Фруктозо-1,6-бисфосфат, фосфоенолпируват (ФЕП) и пируват в концентрациях до 2 мМ ингибируют активность Г6ФДГ. Активность фермента под действием 2 мМ концентрации ФЕП снижается на 25-35% от контроля для цитозольной изоформы и 45-50% для хлоропластной формы фермента, под действием пирувата на 35% и 45%соответственно.

Наличие субъединичной структуры ГбФДГ из листьев ячменя определяет возможность явлений диссоциации-ассоциации между их отдельными субьединицами. В этой связи нами было исследовано влияние ряда веществ (аденилаты, аналоги субстрата, НАД и НАДФ) на процесс ассоциации-диссоциации субъединиц фермента. Результаты исследования показали, что в присутствии НАДФ происходит значительное изменение молекулярной массы ГбФДГ. В присутствии других соединений подобного эффекта не наблюдалось. Молекулярная масса цитозольной изоформы ГбФДГ из листьев ячменя в присутствии НАДФ составила 205±6 кДа, хлоропластной — 280±9 кДа, тогда как

молекулярная масса з отсутствии НА.ДФ составляет 110 и 136 кДа соответственно (рис. 4.). Принимая во внимание молекулярную массу субъединиц можно предположить, что димерная форма фермента при наличии НАДФ в среде элюцин в результате ассоциации становится тетрамером. Удельная активность тетрамера увеличивается 1,5-1,6 раза по сравнению с димерной формой (Табл. в.). Возможность существования ГбФДГ в виде различных олигомерных форм показана для фермента, выделенного из эритроцитов человека (Kirkman H.N., Hendrickson Е.М., 1962; Chung А.Е., Langdon R.G., 1963), пекарских дрожжей (Noltmann Е.А. et. al., 1961; Noltmann E.A., Kuby S.A., 1963.; Julian G.R. et al„ 1961; Levy H.R., 1963) и молочных желез крысы (Yue R.H. et al., 1969).

Таким образом, полученные данные позволяют предпологать существование диссоциативного механизма регуляции как для цитоплазматической, так и хлоропластной ГбФДГ нз растений. Поскольку разные олигомерные формы ГбФДГ растений характеризуются различной активностью, эффект ассоциации-диссоциации может, вероятно, играть значительную роль в регуляции каталитической эффективности действия фермента.

Таблица 5.

Исследование диссоциативного механизма регуляции глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы нз листьев ячменя.

Цитозольная изоформа ГбФДГ Хлоропластная форма ГбФДГ

-НАДФ + НАДФ -НАДФ + НАДФ

Активность, ФЕ 0,520+0,002 0,91б±0,045 0,290+0,015- 0,414±0,021

Удельная активность, ФЕ/мг белка 1,670+0,084 2,670±0,134 1,130±0,057 1,690+0,085

Молекулярная масса, кДа 110+6 205+6 136±9 280±9

Проведенные нами исследования показали, что изменения активности ГбФДГ могут происходить также под влиянием экзогенных факторов. Так, в условиях солевого стресса наблюдаютсяизменеция активности фермента,

Рис. 3. Влияние галактозо-1 -фосфата (1), галактозо-6-фосфата (2), глюкозо-1-фосфата (3) на каталитическую активность хлоропластной (а) и цитозольной (б) изоформ глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы из листьев ячменя

Ю 60 80 100 40 60 80 100

Объем злюции, мл Объем элюции, мл

Рис. 4. Определение молекулярной массы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из листьев ячменя хроматографическим методом на Тойоперл 1^-55: а- в отсутствии НАДФ, б- в присутствии НАДФ. Маркерные белки: 1-ферритин из селезенки лошади (450 кДа), 2- альдолаза из мышцы кролика (160 кДа), 3- яичный альбумин (45 кДА), 4- цитохром с (12,5 кДа)

имеющие фазовый характер. Например, в листьях ряда исследуемых растений происходит повышение активности в течение первого часа воздействия и в 6 часовой точке экспозиции. Затем наблюдалось падение активности Г6ФДГ" в листьях всех исследуемых растений, что может свидетельствовать о стойком снижении уровня распада запасных сахароз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Г6ФДГ играет важную роль в регуляции и сопряжении метаболических процессов в различных клеточных компартментах. Это достигается благодаря функционированию в растительной клетке различно локализованных форм ферментов, отличающихся кинетическими параметрами каталитического действия и регуляторньши свойствами.

Полученные сведения об особенностях регуляции, специфичности и каталитических свойствах Г6ФДГ из различных клеточных компартментов дают возможность предложить гипотетическую схему механизма регуляции метаболизма сахарофосфатов на этапе данной ферментативной реакций (рис. 5, 6).

Согласно результатам исследования субклеточной локализации 80% активности ГбФДГ сосредоточено в цитоплазме растительной клетки и около 20% в хлоропласте. Участие цитоплазматической Г6ФДГ в контроле ряда этапов конструктивного обмена требует наличия в растительной клетке соответствующих механизмов регуляции ее функционального состояния. Важными факторами, обеспечивающими регуляцию активности цитозольной формы фермента являются концентрации субстратов, ионов двухвалентных металлов (особенно Mgil), ряда интермедиатов ЦТК (цитрата, изоцитрата, сукцината, 2-оксоглутората, транс- и цис-аконнтата) и углеводного обмена (фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-бисфосфата, 3-фосфоглицерата, рибозо-5-фосфата, галактозо-6-фосфата, галактозо-1-фосфата, глюкозо-l -фосфата, фосфоенолпирувата, пирувата). На этапе Г6ФДГ реакции происходит генерирование НАДФН, необходимого для различных биосинтетических процессов. Известно, что, в цитоплазме клетки возможно существование двух альтернативных путей генерирования НАДФН для биосинтетических процессов: ГбФДГ-реакция и реакция, катализируемая НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназой (Douce R., 1985; Nautigal С.S., Modi V.V.,

1987). Следовательно, необходима координация процессов генерирования восстановительного потенциала клетки. Это может достигаться, с одной стороны благодаря высокой чувствительности Г6ФДГ реакции к концентрации НАДФН, что характеризуется К; порядка 0,01-0,05 мМ; с другой, стороны благодаря участию ряда ди- н трикарбоновых кислот (цитрат, изоцитрат, 2-оксоглуторат, сукцинат, транс- и цкс-аконитаг) в регуляции каталитической активности Г6ФДГ. Активность хлороштастной формы фермента ингябируется цитратом, изоцитратом, 2-оксоглуторатом, сукцхТйтом, транс- и цис-акошгтатом, НАДФН и АТФ, что, также, свидетельствует о возможности координации метаболизма сахарофосфатов с ферментативным превращением трикарбоновых кислот и энергетическим обменом в целом. Ингибирование хлоропластной формы Г6ФДГ АТФ и рибозо-5-фосфатом псвидетельствует о возможности ингибирования ПФП в хлоропластах при интенсивно протекающем фотосинтезе. Предположения о существовании механизмов координации функционирования ПФП и фотосинтеза высказывались в работах Семихатовой О.А., Заленского О.В. (1982) и Мамушиной Н.С. (1986, 1988). Причем, регуляция активности фермента с помощью АТФ и рибозо-5-фосфата показана нами только для хлоропластной формы Г6ФДГ, что говорит о возможности интенсивного функционирования окислительной ветви ПФП в цитозоле при торможении ее функционирования в хлоропластах. Галактозо-1-фосфат при I мМ концентрации активирует каталитическую активность щггозольной формы и ингибирует активность хлоропластной ГбФДГ. Влияние галактозо-6-фосфата на активность хлоропластной и цитозольной форм фермента также имеет существенные отличия. Так, для цитозольной формы наибольший ингибирующий эффект достигается при 0,5 мМ концентрации метаболита и при дальнейшем увеличении концентрации снижается. Активность же хлоропластной формы с увеличением концентрации галактозо-6-фосфата равномерно снижается. Значительный активирующий на хлоропластную изоформу Г6ФДГ оказывают ионы Са2+ , тогда как больший активирующий эффект цитозольной формы наблюдается в присутствии ионов Возможно, особенности в регуляции

активности различно компартментализованных изоформ имеют значение для обеспечения координации пррцессов метаболизма сахарофосфатов, протекающих в разных клеточных компартментах в соответствии с физиологическими потребностями клетки.

Возможность расщепления глюхозо-6-фосфата через различные метаболические пути обусловливает наличие конкуренции за субстрат. Так, фруктозо-6-фосфат ингибирует каталитическую активность Г6ФДГ и, вероятно, участвует в регуляции распределения потока глюкозо-6-фосфата через гликолиз и ПФП. Ряд продуктов гликолиза и цикла Кальвина ингибируют активность Г6ФДГ как в цитоплазме, так и в хлоропластах. З-Фосфоглвдериноеая кислота является конкурентным ингибитором Г6ФДГ по отношению к глюкозо-6-фосфату, константа ингибирования для хлоропластной изоформы в 3 ниже, чем для цитозольной. В этой связи можно предполагать, что возрастание концентрации 3-фосфоглицерата в клетке приводит в первую очередь к ингибированию ПФП в хлоропластах. Возможность явлений ассоциации-диссоциации между отдельными субъединицами фермента под действием НАДФ может, вероятно, играть значительную роль в регуляции каталитической эффективности действия как хлоропластной, так и цитоплазматической форм Г6ФДГ.

Таким образом, показано наличие ряда эффективных механизмов регуляции активности Г6ФДГ. Существование цитоплазматической и хлоропластной форм Г6ФДГ, обладающих специфическими особенностями каталитического действия, позволяет на уровне данного фермента осуществлять регуляцию и интеграцию метаболизма сахарофосфатов в различных компартментах растительной клетки.

ВЫВОДЫ

1. Показано существование двух основных фондов Г6ФДГ активности в растительной клетке: шгтоплазматического и хлорошгастного. Основная доля Г6ФДГ активности (82%) находится в цитоплазме растительной клетки; 18% активности связано с фракцией хлоропластов.

2. С помощью разработанных процедур очистки впервые получены электрофоретически гомогенные препараты цитоплазматической Г6ФДГ из

листьев гороха и ячменя с удельной активностью 3,88 и 2,29 ФЕ/мг белка соответственно, хлоропластной Г6ФДГ из листьев ячменя (удельная активность 1,37 ФЕ/мг белка), частично очищенные препараты хлоропластной Г6ФДГ из листьев гороха (удельная активность 0,29 ФЕ/мг белка), цитозольной и хлороатастной форм Г6ФДГ из ряски 8рпос1е1а роНгЫга (удельная активность 0,29 и 0,64 ФЕ/мг белка соответственно).

3. Молекулярные массы цитоплазматических форм ГбФДГ из листьев ячменя и гороха составляют 112+8 кДа и 79+2 кДа соответственно; молекулярная масса ГбФДГ из хлоропластов ячменя - 136+7 кДа; ГбФДГ из хлоропластов гороха

- 110+6 кДа. Цитоплазматическая и хлоропластная формы ГбФДГ из исследованных источников являются димерами. Молекулярная масса субьедишшы цитозольной формы ГбФДГ из листьев ячменя составляет 56+6 кДа, хлоропластной

— 67±7 кДа; цитозольной формы ГбФДГ из листьев гороха — 40±3 кДа, хлоропластной — 56+6 кДа.

4. Сродство различных форм ГбФДГ из листьев ячменя, гороха и ряски 5рно(1е1а ройгЫга к субстрату и коферменту характеризуются, в основном, величинами одного порядка. Характерным свойством хлоропластной ГбФДГ является субстратное ннгибирование избытком кофермента (НАДФ). Цитоплазматическая и хлоропластная формы ГбФДГ проявляют максимальную активность в диапазоне рН 8,0-8,4 и 7,6-8,0 соответственно.

5. В регуляции ферментативной активности ГбФДГ растений могут принимать участие некоторые интермедиаты углеводного метаболизма (3-фосфоглинерат, фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат, галактозо-6-фосфат, галактозо-1-фосфат, фосфоенолпируват, пируват), ЦТК (цитрат, изоцитрат, 2-оксоглуторат, сукцинат, транс- и цис-аконитат), НАДФН и глутатион. АТФ участвует в регуляции активности только хлоропластной изоформы ГбФДГ.

6. Существует ряд различий между хлоропластной и цитоплазматической формами ГбФДГ: стабильность, электрофоретическая подвижность, хроматсграфические свойства, чувствительность к рибозо-5-фосфату и 3-фосфоглицерагу, ионам металлов (Са2\ MgJ+, Мп2+) и АТФ.

7. Показана возможность диссоциативного механизма регуляции активности как хлоропластной, так и цитоплазматической форм ГбФДГ высших растений. Происходящая под действием НАДФ ассоциация субъединиц фермента

Галактозо-1 <к>сфаг

Галактозо-б-фосфат

Глюкозо-1-фосфат

' Глюкозо-б-фосфат

< ' ПП 1 II » N 'МММ I 4 ' ' п I I I 1 V /И1М1 > \ /'П11 I < \ и,,! 1 1

' ' \ 1 ' , | 1 \

НАДФ11

Рибозо-5-ф^сфат

6-Фосфоглн>конат

ЦИТОПЛАЗМА

Рибулозо-!,5-бисфосфат

ФрукТОЗО-6^ '/||| фосфат / '1111

' I 11 1 , 'III

' / /'III •

ФР;; ; •

бнсфосфат/ //|| I

' I I , I

/1.11 | Транс-, ' II вконитат! / / I I I Г|

ЗФосфо-» I I I I I I I акс

Сукцинат

* /Пируват

2-Оксо 1 | г^орат/Ц"трат

......^Г \

Изоцитрат

осфоенол-

пнруват ^

I !

/ аконптап \

1 ^ \ \ ¡итрат Тргнс-\ I

глицерат ' I I .' ' I

Цитрат

.1зоци -,

X вконитат \ |0нитат/'2-ОксоглутораГ1ч '■ '

Сукцинат _____

/ П^рув

Фосфоенол-^ пируват

" ХЛОРОПЛАСТ

б-Фосфоглюконат

ч\М

'Оч \ \ \

' ЗФосфо-I глицерат ! I

I ' «V

I /б исфосфат ///

Рибозо-5«'"' . / фосфат ,

НАДФН АТФ

' / фосфат

¡1//П

* Глюкозо-6-фосфат

ч I

Гала?стоэо-6-фосфат

\ Глюкозо-!-\ фосфат,

\ 1

Галактозо-1 -фосфат

Рис. 5. Гипотетическая модель регуляции метаболизма углеводов в

ЦИТОПЛАЗМА 2-Оксогаутора

~т Цитрат

ui u

аконит ат "ик_л *т креоса

И Изацитрат

д $

Р 2-Оксоглуторат/

Глюкозо-6-у^фосфаг__у

Рис.б . Гипотетическая модель сопряжении метаболических путей в

сопровождается образование,\! тетра.черной формы и возрастанием ферментативной активности.

8. Воздействие солевого стресса на растения приводит к изменениям активности Г6ФДГ, что может иметь значение для адаптации к условиям внешней среды.

9. Сопряжение и координация процессов углеводного метаболизма в хлоропластах и цитоплазме растительной клетки может осуществляться путем распределения глюкозо-6-фосфата между цитоплазматической и хлоропластной формами Г6ФДГ с помощью специфических путей регуляции их активности. На основе полученных данных .предлагается гипотетическая схема регуляции метаболизма сахарофосфатов на уровне Г6ФДГ реакции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Матасова Л.В., Семенихина A.B., Бушаев C.B., Попова Т.Н. Некоторые аспекты координации ферментативных процессов цикла трикарбоновых кислот и углеводного метаболизма // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов (Сборник статей, посвященный памяти проф. A.A. Землянухина), Воронеж, ВГУ, 1998, С. 91-94

2. Матасова Л.В., Семенихина A.B., Попова Т.Н. Некоторые параметры каталитического действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и фосфоглюкомутазы из листьев гороха. // Материалы II Международного симпозиума «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов», Воронеж, 1998, С. 149-153.

3. Попова Т.Н., Пинейру де Карвалью Мигель A.A., Семенихина A.B., Конотоп С.П. Применение ионо-обменной хроматографии для очистки глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из листьев гороха. // Теория и практика сорбционных процессов. 1998. Воронеж. Вып. 23. С. 313-318.

4. Попова Т.Н., Матасова Л.В., Семенихина А.В Участие фосфоглюкомутазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в регуляции метаболизма сахарофосфатов в высших растениях.// II Всероссийский съезд фотобиологов. Пущино.1998. С. 98100.

5. Семенихина А.В., Парфенова Н.В. Очистка и кинетические параметры глюкоз< 6-фосфатдегидрогеназы из листьев гороха. // Эколого-физиологические и физию химические основы взаимодействия биосистем с окружающей средой. Сборш трудов ВГУ. 1998. Воронеж. С. 138-142.

6. L.V. Matasova, T.N.Popova, С. Schnarrenberger, A.U. Igamberdiev, M.A.A.Pinei de Carvalio., A.V. Semenichina Some aspects of enzymatic conversion of glucose-phosphate and maniiose-6-phosphate in pea leaves. // 11th FESPP Congress. Pla Physiology, special issue. 1998. Vama. Bulgaria. C.176. S10-07.

7. Семенихина A.B., Попова Т.Н., Матасова Л.В. Некоторые каталитическ свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из листьев гороха // Биохимия. 195 Т.64, выи. 8. С. 1029-1033.

8. Семенихина А.В., Попова Т.Н. Субклеточная локализация и некотор: каталитические свойства ппокозо-6-фосфатдегидрогеназы высших растений // Съезд общества физиологов расстений России. Международная конференция Физиология растений - наука III тысячелетия", Москва (4-9 октября 1999), С. 134

9. Matasova L.V., Semenichina A.V., T.N.Popova, M.A.A.Pineiro de Carva Regulation of metabolic conversion of glucose-6-phosphate in pea leaves phosphoglucomutase and gIucose-6-phosphate degydrogenase // Proceedings European Carbohydrate Symposium "Euiocarb X", Galway, Ireland (July 11-16, 199 PD 014.

10. Семенихина A.B., Кузнецова Е.Ю. Определение некоторых параметр каталитического действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из проростков ячмсн: Труды молодых ученых ВГУ. Вып. 1. Воронеж. 1999. С.185-189.

П. A.V.Semenichina, L.V.Matasova, T.N.Popova, M.A.A.Pineiro de Carva Subcellular localization and activity regulation of glucose-6-phosphate dehydrogen and phosphoglucomutase from higher plants // 12lh FESPP Congress. Plant Physiolo special issue. 2000. Budapest. Hungary.

оперативной полиграфии ВГУ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенихина, Анастасия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространение и функции глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в живых организмах

1.1.1. Катализируемая реакция

1.1.2. Распространение

1.1.3. Роль в метаболизме клетки

1.2. Изоформы и внутриклеточная локализация глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.3. Очистка и физико-химические свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.3.1. Очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из различных источников

1.3.2. Стабильность фермента

1.3.3. Молекулярная масса и структура

1.3.4. Идентификация функциональных групп активного центра глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.4. Кинетическое поведение и регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.4.1. Зависимость активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы от концентрации субстрата и кофермента

1.4.2. Субстратная специфичность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.4.3. Влияние рН среды на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.4.4. Влияние ионов металлов на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

1.4.5. Регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 31 ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

-32.2. Выделение клеточных органелл

2.3. Определение активности ферментов

2.4. Определение количества белка

2.5. Выделение и очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

2.5.1. Экстракция

2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония

2.5.3. Гель-фильтрация

2.5.4. Ионообменная хроматография

2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляция активности ферментов

2.7. Аналитический электрофорез

2.8. Определение молекулярной массы

2.9. Изучение влияния засоления на активность ферментов 47 2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных

Глава 3. РАСПРОСТРАНЕНИЕ И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ

ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

3.1. Распространение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в растениях

3.2. Изучение субклеточной локализации глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

3.3. Выявление множества молекулярных форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

4.1. Очистка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы из растительных объектов

4.2. Молекулярная масса и субъединичная структура

4.3. Кинетические параметры действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.3.1. Влияние концентрации субстрата и кофермента на скорость реакции, катализируемой глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой

4.3.2. Субстратная специфичность

4.3.3. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.3.4. Исследование влияния рН среды на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.4. Регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы под действием клеточных метаболитов

4.4.1. Участие нуклеотидов в регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.4.2. Участие интермедиатов цикла трикарбоновых кислот в регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.4.3. Влияние сахарофосфатов на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.4.4. Диссоциативный механизм регуляции активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.4.5. Влияние глутатиона на каталитическую активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

4.5. Влияние солевого стресса на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа высших растений: формы, свойства и регуляция активности"

Актуальность проблемы. Исследование биохимических основ, ответственных за функциональную целостность, направленность взаимосвязанных физиологических процессов в растении представляют собой проблему, имеющую важное практическое и теоретическое значение. Разработка способов выделения ферментов, результаты изучения их структуры и регуляторных особенностей находят применение в медицине и некоторых отраслях промышленности, так как ферментные препараты широко используются в промышленном синтезе ряда биологически-активных соединений, в диагностических и лечебных целях. Знание механизм, мов регуляции отдельных ферментных систем являются необходимой предпосыл- \ I кой для решения проблем, связанных с повышением устойчивости живых организ-/ мов к неблагоприятным условиям, контролем урожайности и продуктивности. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к глубокому анализу регуляции метаболизма высших растений на уровне клетки с выходом на более высокий организменный уровень.

Для организации клеточного обмена в растительной клетке характерно, что на уровне метаболического узла, связанного с превращениями глюкозо-6-фосфата, имеет место пересечение ряда метаболических путей. Глюкозо-6-фосфат является интермедиатом гликолиза, глюконеогенеза и пентозофосфатного пути (ПФП). Физиологическая роль дегидрогеназ пентозофосфатного пути заключается в восстановлении НАДФ до НАДФН, восстановительные эквиваленты которого расходуются в биосинтетических процессах. Другая функция этого пути заключается в образовании пентоз (в частности Б-рибозы), которые используются для синтеза нуклеиновых кислот.

Осуществление регуляции функционирования данного пути возможно с помощью ключевого лимитирующего фермента - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49). Г6ФДГ была выделена и охарактеризована из ряда объектов, в основном из микроорганизмов и тканей животных.

Исследования Г6ФДГ растений крайне малочисленны, что связано с методическими трудностями, возникающими при выделении и изучении растительных белков по сравнению с белками из других организмов. Среди особенностей тканей растений, обусловливающих значительные экспериментальные затруднения, следует, прежде всего, отметить освобождение и выход из клеточных компартментов при гомогенизации растительного материала вакуолярного сока с низким значением рН, танинов, полифенолоксидаз, протеаз, снижающих биологическую активность ферментов.

Поскольку метаболизм углеводов в растительной клетке протекает в основном в двух компартментах: цитозоле и хлоропластах, представляет интерес изучение особенностей регуляции активности различно локализованных форм фермента и их роли в сопряжении процессов, протекающих в разных компартментах клетки. Необходимо развитие исследований по изучению координации путей синтеза и распада Сахаров в растительной клетке, утилизации НАДФН в различных биосинтетических реакциях (синтез жирных кислот, аминокислот, восстановление глутатиона), а также изучение субстратной специфичности фермента. Выяснение данных аспектов необходимо для более глубокого понимания физиолого-биохимической роли Г6ФДГ в клеточном метаболизме высших растений.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование распространения, субклеточной локализации, свойств и регуляции активности различных форм Г6ФДГ высших растений. Были поставлены следующие задачи:

2. Разработать эффективные методы получения высокоочищенных препаратов различно локализованных форм Г6ФДГ из растений.

3. Исследовать и сравнить физико-химические, кинетические и регулятор-ные свойства цитоплазматической и хлоропластной Г6ФДГ из разных растений.

4. Провести исследование влияния экзогенных факторов (засоления) на активность Г6ФДГ.

Научная новизна. Разработаны эффективные способы выделения и впервые получены высокоочищенные (в том числе гомогенные) ферментные препараты ци-топлазматической и хлоропластной форм Г6ФДГ листьев гороха, ячменя и Spirodela polyrizha. Впервые проведены комплексные исследования свойств и дана сравнительная характеристика различно компартментализованных форм Г6ФДГ. Показано, что для хлоропластной и цитозольной форм Г6ФДГ наряду со сходными чертами характерны существенные отличия (чувствительность к субстратному ин-гибированию, концентрациям АТФ, влиянию рибозо-5-фосфата, галактозо-1-фосфата, галактозо-6-фосфата, различные электрофоретические подвижности). Показано существование диссоциативного механизма регуляции активности Г6ФДГ в растительной клетке. Предложена гипотетическая схема регуляции метаболизма углеводов в растительной клетке на этапе Г6ФДГ реакции. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления об организации и регуляции углеводного метаболизма в различных компартментах растительной клетки.

Практическая значимость. Разработанные методы получения высокоочи-щенных, электрофоретически гомогенных препаратов Г6ФДГ из ряда растений дают возможность широко использовать их в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием сопряженных ферментных систем in vitro. Полученные в работе данные способствуют созданию более глубоких представлений о механизмах ферментативной регуляции углеводного обмена, что расширяет возможности поиска оптимальных путей интенсификации технологии растениеводства в сельском хозяйстве.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Экологическая биохимия", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийском съезде фотобиологов (Пущино, 1998); 11-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Варна, Болгария, 1998); IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999); II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), 10-ом европейском симпозиуме "Euro Carb X" (Гауэй, Ирландия, 1999); ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета (1999).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 11 публикациях - 5 статьях и 6 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Исследования, проведенные на высокоочищенных ферментных препаратах Г6ФДГ из растений показали, что цитоплазматическая и хлоропластная формы фермента могут участвовать в процессах сопряжения и контроля метаболизма са-харофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет регуляции ферментативной активности путем изменения концентрации субстрата, нуклеотидов (НАДФН, НАД, НАДН, АТФ, АДФ, АМФ, УТФ), ионов некоторых металлов (М£2+, Мп2+, Са2+), ин-термедиатов углеводного обмена и ЦТК.

2. Хлоропластная и цитозольная формы Г6ФДГ имеют различные оптимумы рН, сродство к субстратам, электрофоретическую подвижность, стабильность и хроматографические свойства. Ионы металлов, АТФ, рибозо-5-фосфат, галактозо-1-фосфат и галактозо-6-фосфат оказывают различное влияние на каталитическую активность хлоропластной и цитозольной форм Г6ФДГ.

3. Для регуляции активности как цитоплазматической, так и хлоропластной Г6ФДГ характерен диссоциативный механизм регуляции. НАДФ способствует переходу димерной формы фермента в тетрамер, что сопровождается возрастанием ферментативной активности.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 155 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (4 главы), заключения, выводов, списка литературы (179 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 45 рисунков и 18 таблиц; в приложении - 4 рисунка и 5 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Семенихина, Анастасия Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Показано существование двух основных фондов Г6ФДГ активности в растительной клетке: цитоплазматического и хлоропластного.Основная доля Г6ФДГ активности (82%) находится в цитоплазме растительной клетки; 18% активности связано с фракцией хлоропластов.

2. С помощью разработанных процедур очистки впервые получены электрофоретически гомогенные препараты цитоплазматической Г6ФДГ из листьев гороха и ячменя с удельной активностью 3,88 и 2,29 ФЕ/мг белка соответственно, хлоропластной Г6ФДГ из листьев ячменя (удельная активность 1,37 ФЕ/мг белка), частично очищенные препараты хлоропластной Г6ФДГ из листьев гороха (удельная активность 0,29 ФЕ/мг белка), цитозольной и хлоропластной форм Г6ФДГ из ряски 8рноёе1а роНгЫга (удельная активность 0,29 и 0,64 ФЕ/мг белка соответственно).

-1243. Молекулярные массы цитоплазматических форм Г6ФДГ из листьев ячменя и гороха составляют 112+8 кДа и 79±2 кДа соответственно; молекулярная масса Г6ФДГ из хлоропластов ячменя - 136+7 кДа; Г6ФДГ из хлоропластов гороха -110±6 кДа. Цитоплазматическая и хлоропластная формы Г6ФДГ из исследованных источников являются димерами. Молекулярная масса субъединицы цитозольной формы Г6ФДГ из листьев ячменя составляет 56+6 кДа, хлоропластной ~ 67+7 кДа; цитозольной формы Г6ФДГ из листьев гороха ~ 40+3 кДа, хлоропластной - 56±6 кДа.

4. Сродство различных форм Г6ФДГ из листьев ячменя, гороха и ряски БршхЫа роНгЫга к субстрату и коферменту характеризуются, в основном, величинами одного порядка. Характерным свойством хлоропластной Г6ФДГ является субстратное ингибирование избытком кофермента (НАДФ). Цитоплазматическая и хлоропластная формы Г6ФДГ проявляют максимальную активность в диапазоне рН 8,0-8,4 и 7,6-8,0 соответственно.

5. В регуляции ферментативной активности Г6ФДГ растений могут принимать участие некоторые интермедиаты углеводного метаболизма (3-фосфоглицерат, фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат, галактозо-6-фосфат, галактозо-1-фосфат, фосфоенолпируват, пируват), ЦТК (цитрат, изоцитрат, 2-оксоглуторат, сукцинат, транс- и цис-аконитат), НАДФН и глутатион. АТФ участвует в регуляции активности только хлоропластной изоформы Г6ФДГ.

6. Существует ряд различий между хлоропластной и цитоплазматической формами Г6ФДГ: стабильность, электрофоретическая подвижность, хроматографические свойства, чувствительность к рибозо-5-фосфату и 3-фосфоглицерату, ионам металлов (Са2+, М%2+, Мп2+) и АТФ.

7. Показана возможность диссоциативного механизма регуляции активности как хлоропластной, так и цитоплазматической форм Г6ФДГ высших растений. Происходящая под действием НАДФ ассоциация субъединиц фермента сопровождается образованием тетрамерной формы и возрастанием ферментативной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно результатам исследования субклеточной локализации 80% активности Г6ФДГ сосредоточено в цитоплазме растительной клетки и около 20% в хлоропласте. Участие цитоплазматической Г6ФДГ в контроле ряда этапов конструктивного обмена требует наличия в растительной клетке соответствующих механизмов регуляции ее функционального состояния. Важными факторами,

Галактозо-1-фосфат

Глюкозо-1-фосфат

Глюкозо-6-фосфат

Галактозо-6-фосфат НАДФН

Рибозо-5-фосфат

ЦИТОПЛАЗМА

- / 111 I ■•' 1

6-Фосфоглюконат

Фруктозо-6-фосфат

I / I у / ' I

Фруктозо-1,6-(' / бисфосфаг / ' ибулозо-1,5-бисфосфат

Сукцинат

2-Оксо глуторат I

Йируват осфоенол-пируват ' 1

Транс

ЗФосфо , глицерат

I I I I I I I I I I

I I аконитат

I I

I I I

I аконитат

Цитрат

Изоцитрат

Ц^с

-1Саконитат \

ЗФосфо глицерат

I т фруктозо-1,6-/ бисфосфат I зоцитра^ и

Транс-"а^сонитат

I I I I

Цитрат

2-Оксоглуторат 1

Сукцинат --- \ \ \ I I /¡у

6-Фосфоглюконат 4 » ч \ \ I

I I I I I I I I I

I Ъруктозо-6-фосфат I

Фосфоенол-пируват

Пируват

Глюкозо-6-фосфат

ХЛОРОПЛАСТ

Рибозо-5-фосфат

НАДФН АТФ

Галактозо-6 фосфат Глюкозо-1 -\ фосфат !

Галактозо-1-фосфат

Рис. 44. Гипотетическая модель регуляции метаболизма углеводов в рпстительно клетке на уровне глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции. Сплошными стрелками показаны активирующие воздействия, пунктирными -ингибирующие

Рис. 45. Гипотетическая модель сопряжегния метаболических путей в растительной клетке на уровне глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции.Сплошными стрелками показаны ингибирующие воздействи обеспечивающими регуляцию активности цитозольной формы фермента являются концентрации субстратов, ионов двухвалентных металлов (особенно Mg ), ряда интермедиатов ЦТК (цитрата, изоцитрата, сукцината, 2-оксоглутората, транс- и цис-аконитата) и углеводного обмена (фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-бисфосфата, 3-фосфоглицерата, рибозо-5-фосфата, галактозо-6-фосфата, галактозо-1-фосфата, глюкозо-1-фосфата, фосфленолпирувата, пирувата). На этапе Г6ФДГ реакции происходит генерирование НАДФН, необходимого для различных биосинтетических процессов. Известно, что, в цитоплазме клетки возможно существование двух альтернативных путей генерирования НАДФН для биосинтетических процессов: ГбФДГ-реакция и реакция, катализируемая НАДФ-ИДГ (Douce, 1985; Nautiyal, Modi, 1987). Следовательно, необходима координация процессов генерирования восстановительного потенциала клетки. Чувствительность Г6ФДГ реакции к концентрации НАДФН достаточно высока, характеризуется К; порядка 0,01-0,05 мМ. Помимо НАДФН, ряд ди- и трикарбоновых кислот (цитрат, изоцитрат, 2-оксоглуторат, сукцинат, транс- и цис-аконитат) участвуют в регуляции каталитической активности Г6ФДГ, ингибируя активность данного фермента. Активность хлоропластной формы фермента ингибируется цитратом, изоцитратом, 2-оксоглуторатом, сукцинатом, транс- и цис-аконитатом, НАДФН и АТФ, что, также, свидетельствует о возможности координации метаболизма сахарофосфатов с ферментативным превращением трикарбоновых кислот и энергетическим обменом в целом. Ингибирование хлоропластной формы Г6ФДГ АТФ и рибозо-5-фосфатом псвидетельствует о возможности ингибирования ПФП в хлоропластах при интенсивно протекающем фотосинтезе. Предположения о существовании механизмов координации функционирования ПФП и фотосинтеза высказывались в работах Семихатовой O.A., Заленского О.В. (1982) и Мамушиной Н.С. (1986, 1988). Причем, регуляция активности фермента с помощью АТФ и рибозо-5-фосфата показана нами только для хлоропластной формы Г6ФДГ, что говорит о возможности интенсивного функционирования окислительной ветви ПФП в цитозоле при торможении ее функционирования в хлоропластах. Галактозо-1-фосфат при 1 мМ концентрации активирует каталитическую активность цитозольной формы и ингибирует активность хлоропластной Г6ФДГ. Влияние галактозо-6-фосфата на активность хлоропластной и цитозольной форм фермента также имеет существенные отличия. Так, для цитозольной формы наибольший ингибирующий эффект достигается при 0,5 мМ концентрации метаболита и при дальнейшем увеличении концентрации снижается. Активность же хлоропластной формы с увеличением концентрации галактозо-6-фосфата равномерно снижается. Значительный активирующий на хлоропластную изоформу Г6ФДГ оказывают ионы Са2+ , тогда как больший активирующий эффект цитозольной формы наблюдается в присутствии ионов М^ . Возможно, особенности в регуляции активности различно компартментализованных изоформ имеют значение для обеспечения координации процессов метаболизма сахарофосфатов, протекающих в разных клеточных компартментах в соответствии с физиологическими потребностями клетки.

Возможность расщепления глюкозо-6-фосфата через различные метаболические пути обусловливает наличие конкуренции за субстрат. Так, фруктозо-6-фосфат ингибирует каталитическую активность Г6ФДГ и, вероятно, участвует в регуляции распределения потока глюкозо-6-фосфата через гликолиз и ПФП. Ряд продуктов гликолиза и цикла Кальвина ингибируют активность Г6ФДГ как в цитоплазме, так и в хлоропластах. Что, возможно, свидетельствует о прекращении распада глкжозо-6-фосфата в условиях синтеза крахмала в хлоропластах в условиях фотосинтеза, и снижении его интенсивности в условиях конкуренции за субстрат при интенсификации работы гликолитического пути. 3-Фосфоглицериновая кислота является конкурентным ингибитором Г6ФДГ по отношению к глюкозо-6-фосфату, константа ингибирования для хлоропластной изоформы в 3 раза ниже, чем для цитозольной. В этой связи можно предполагать, что возрастание концентрации 3-фосфоглицерата в клетке приводит в первую очередь к ингибированию ПФП в хлоропластах. Наличие субъединичной структуры Г6ФДГ определяет возможность явлений ассоциации-диссоциации между их отдельными субъединицами. Так, под действием НАДФ может происходить ассоциация белковых молекул с образованием тетрамерной формы фермента, что сопряжено с возрастанием ферментативной активности. Существование данного механизма регуляции показано как для хлоропластной так и для цитозольной формы фермента. Поскольку разные олигомерные формы Г6ФДГ растений характеризуются различной активностью, эффект ассоциациидиссоциации может, вероятно, играть значительную роль в регуляции каталитической эффективности действия фермента.

Следует подчеркнуть, что активность Г6ФДГ может изменяться не только под действием эндогенных факторов, но также и под влиянием условий окружающей среды. Исследование влияния засоления на активность Г6ФДГ показало, что данному ферменту принадлежит определенная роль в ответной реакции растения на стресс. Известно, что активность ряда ферментов может изменяться в стрессовых условиях, что является важным звеном в общей реорганизации метаболизма при адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды (Косулина Л.Г. и др., 1993). Очевидно, изменение активности Г6ФДГ при внешних воздействиях на растения имеет адаптивное значение.

Таким образом, показано наличие ряда эффективных механизмов регуляции активности Г6ФДГ. Существование цитоплазматической и хлоропластной форм Г6ФДГ, обладающих специфическими особенностями каталитического действия, позволяет на уровне данных ферментов осуществлять регуляцию и интеграцию метаболизма сахарофосфатов в различных компартментах растительной клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенихина, Анастасия Владимировна, Воронеж

1. Антоненков В.Д., Пасченко Л.Ф. Дегидрогеназы пентозного цикла в пероксисомах печени крысы// Биохимия.- 1984.-Т.49.-С. 1159-1165.

2. Атауллаханов Ф.М., Жаботинский A.M., Пичугин A.B. // Биохимия.-1981.- Т.46, N3.- С. 530.

3. Батунер Л.М., Позин М.Е. Математические методы в химической технике.-М: Мир, 1968.- 336с.

4. Биохимия человека./Марри Р, Греннер Д., Мейес П., Родуэл В.- М.: Мир, 1993.-415 с.

5. Борзаковская Е.В., Коничев A.C., Филипович Ю.Б. // Биохимия.- 1991.-Т.56.- С. 1759-1767.

6. Войнова Н.Е. Участие глутатионредуктазы в опосредованном действии окисленного глутатиона на деингибирование дегидрогеназ окислительной части пентозофосфатного пути// Вестн. ЛГУ Биол.- 1987.- N4. -С. 103-104.

7. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул.- М.: Мир, 1982.- С. 283-288.

8. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хондобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. -М.: Высш.шк., 1975. 392 с.-12710. Генетическая гетерогенность ГбФД-недостаточности / К. Д.

9. Краснопольская, Т.Л. Шатская, И.К. Филлипов, Г.А. Анненков, Т.В. Захарова, Н.Х.

10. Мехтиев, K.M. Мовсум-заде.// Генетика.- 1977.-Т.4, N3.- С.428-442.

11. И.Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник пофизиологии растений.- Киев: Наукова думка, 1973.- 273 с.

12. Детерман Г. Гель-хроматография.- М.: Мир, 1970.- 252с.

13. Ивантер Э.В., Коросов A.B. Основы биометрии.-Петрозаводск: Изд-во ЛГУ, 1992.- 163 с.

14. Мамедов З.И., Кулиев A.A., Тюльахмедов С.Г. Внутриклеточная локализация и молекулярные формы глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы плодов яблони//Прикл. биохим. имикробиол.- 1993.- N3. -С.449-454.

15. Мамедов З.И., Тюльахмедов С.Г., Кулиев A.A. Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа плодов яблони// Прикл. биохим. и микробиол.- 1993. -Т.29, N2. -С.206-211.

16. Мауэр Г. Диск-электрофорез.-М.: Мир, 1971-222с.

17. Мусил Л., Новикова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах.- М: Мир, 1993.-415 с.

18. Панахова Х.Г., Кичибенов Б.Р., Гургиева Д.Н. Анамалии мембранных белков эритроцитов человека при наследственном дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы//Биол. мембраны.- 1995.- Т.12, N1.- С. 16-21.

19. Панкова Л.М., Лайнис Д.Л. Влияние высоких концентраций глюкозы и этанола на активность ключевых ферментов катаболизма у Zymomonas mobilis// Пробл. соврем, биохим. и биотехнол. -1985. -Т. 248, N 4. -С.122-126.

20. Пичугин A.B. Регуляция пентозного пути и его взаимодействие с энергетическим метаболизмом эритроцитах человека: Автореф. дис. . канд. физмат. наук. Пущино: Ин-т биофизики АН СССР, 1981. 24с.

21. Практикум по биохимии / Под ред. Н.П. Мешковой, С.Е. Северина.- М.: Мир, 1979.-430 с.

22. Семихатова O.A., Заленскии О.В. Сопряженность процессов фотосинтеза и дыхания//Физиология фотосинтеза.- М., 1982.- С. 130—145.

23. Соколов А.П., Лучин С.В., Троценко Ю.А. Очистка и свойства дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата из Pseudomonas oleovorans// Биохимия.- 1980. -T.45,N8. -С.1371-1378.

24. Соколов А.П., Троценко Ю.А. Очистка и свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из факультативного метилотрофа Arthrobacter globiformis// Биохимия.- 1985. -Т.50, N8. -С.1269-1277.

25. Филиппова Л.А., Мамушина Н.С., Зубкова Е.К. Взаимоотношения фотосинтеза и дыхания у ассимилирующих клеток в разных зонах растущего листа ячменя.//Физиол. раст.- 1986.- Т.ЗЗ, N1.- С.66-73.

26. Филлипович Ю.Б., Коничев А.С. Множественные формы ферментов насекомых и проблемы сельскохозяйственной энтомологии.- М.: Наука, 1987.-180с.

27. Хоркавцив Л.Д., Демкив О.Т. Изменение внутриклеточного метаболизма в процессе регинерации изолированных клеток.// Физиол. раст.-1993. -Т. 40. -С.88-92.

28. Чургенова В.В., Нестеренко Г.А. Влияние эпифитных микроорганизмов на активность ферментов гликолиза и гексозомонофосфатного пути в процессе прорастания семян кукурузы// Физиол. и биохимия культурных растений.- 1986. -Т. 18, N3. -С.295-298.

29. Adkins S.W., Gosling, P.G., Ross, J.D. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconic acid dehydrogenase of wild oat seeds// Phytochem.- 1980.- N19.-P.2523-2525.

30. Anderson B.M., Anderson C.D. Purification and characterization of Azotobacter vinelandii glucose-6-phosphate dehydrogenase: Dual coenzyme specificity// Arch. Biochem. andBiophis.- 1995. -V. 321, N 1. -P. 94-100.

31. Anderson L.E. Chloroplasts and cytoplasms enzymes. Pea leaf triose phosphate isomerases//Biochem. Biophys. Acta.-1971. -V. 235. -P. 237-244.

32. Anderson L.E., Advani V.R. Chloroplast and cytoplasmic enzymes. Three distinct isoenzymes associated with the reductive penthose phosphate cycle// Plant Physiol.-1974. -V. 15. -P. 582-585.

33. Anderson L.E., Lim Ng T.C., Park R.E.Y. Inactivation of pea leaf chloroplastic and cytoplasmic glucose 6-phosphate derydrogenases by light and dithbthreitol//Plant Physiol. -1974.- V. 53, N 6.- P. 835—839.

34. Anderson W.B., Horn R.N., Nordlie R.C. Glucose dehydrogenase activity of yeast G6P dehydrogenase II. Kinetic studies of the mode of action by bicarbonate, phosphate and sulphate// Biochem.- 1968.- V.l 1.- P.3997-4004.

35. Arriaga D., Montero S.B.F., Soler S. Partial purification and some kinetic properties of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Phycomyces blakesleeanus// Biochimie.- 1986. -V. 68, N 2. -P. 293-302.

36. Ashihara, H., Komamine, A. Charactirezation and regulation properties of g.lucose-6-phosphate dehydrogenase from black gram, Phaseolus mungo// Plant Physiol.-1976.- V.36.- P.52-59.

37. Bautista J.M., Masow P. J., Luzzato L. Purification and properties of human glucose-6-phosphate dehedrogenase made in E.C.//Mol. Biol.- 1992.-V.1190, N 1. P.74-80.

38. Ben-Bassat D.B., Anderson L. E. Light-induced release of bound glucoses-phosphate dehydrogenase to the stroma in pea chloroplasts// Plant Physiol- 1981. -V.68, N 2. -P.279-283.

39. Berg J.L., Aivoliotis M.J., Samollow P.B. X-Linked glucose-6-phosphate dehedrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase polymorphisms in baboons// Biochem. Genet.- 1992.- V.30, N11-12.- P.567-579.

40. Beutler E., Kure W. Characteristic and significanse of the reverse glucoses-phosphate dehydrogenase reaction// J. Lab. and Clin. Hed.- 1986. -V.107, N6. -P.502-507.

41. Buchanan B.B. Role of light in the regulation of chloroplast enzymes// Ann.Rev. Plant Physiol.- 1980.- V.31.- P.341—374.

42. Cartariel J., Arola L., Romeu A. Characterisation of the inhibition effect induced by nichel on glucose-6-phosphate dehydrogenase and glutstione reductase// Enzyme.- 1989. -V.41, N1. -P. 1-5.

43. Chung A.E., Langdon R.G.// J.Biol.Chem.- 1963.-V. 13, N8.-P. 1455-1459.

44. Cohen M.D., Sen A.C. Vanadium inhibition of yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase// Inogr.Chem. Acta.- 1987. -V.138, N3. -P.179-186.

45. Cooper T., Beevers H. Mitochondria and glyoxysomes from castor been endosperm// J.Biol.Chem.- 1969.- V.244, N13.- P. 3507-3513.

46. Craney C.L., Goffredo M.E. A rapid affinity chromatography procedyre for the isolation of glucose-6-phosphate dehydrogenase from human erythrocytes// Anal. Biochem.- 1983.-N 128.-P. 312-316.

47. Crans D.S., Schelble S.M. Vanadate dimer and tetramer both inhibit glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides// Biochem.- 1990. -V.29, N28.-P.6698-6706.

48. Davis B.L. Disk Electrophoresis. II Method and application to human serum proteins//Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1964.- V.121.- P.404-427.

49. Devlin R.M., Galloway R.A. Oxidative enzymes and pathways of hexose and triose metabolism in chlorella// Physiol. Plantarum -1968.- V.21, N1. P.l 1—25.

50. Ornaldo: Academic Press,1985.- 257p.

51. Dumitru J.T., Nechifar M.T. Decrease in yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase activity due to oxygen free radicals// Int. J. Biochem.- 1994. -V.26, N2. -P.229-233.

52. Eggleston L.V., Krebs H.A.//Biochem.J.- 1974.-V.138, N 3.- P. 425.

53. Eichhorn M., Corbus C. Metabolic role of glucose-6-phosphate dehydrogenase in photoautotrophic organisms// Biochem. Physiol. Pflanzen.- 1988.-N7.-P. 125-134.

54. Evidence for functional convergence of redox regulation in G6PDH isoforms of cyanobacteria and higher plants/ U.K.Wendt, R.Hauschild, C.Lange, M. Pietersma, I. Wenderoth, A. von Schaewen// Plant Mol. Biol.- 1999.- V.40.- P.487-494.

55. Farmer E.E., Easterbi J.S. The purification of yeast glucose-6-phosphat dehydrogenase by dye ligand chromatography// Anal. Biochem.- 1984.- V.141, N1. -P.79-82.

56. Fischer A., Salgo A. Cooperative protection of glucose-6-phosphate dehydrogenase by ligandsin extracts from wheat grains// Biochem und Physiol. Plants. -1992.-V.188, N5.-P.295-303.

57. Fisher A., Feller U. Inactivation and degradation glucose-6-phosphate dehydrogenase from wheat seeds: cooperative protection by solutes// Physiol. Plant.-1990.- V.79, N2.- P. 13-16.

58. Ganea E., Harding J. Molecular chaperones protect against glucation-induced inactivation of glucose-6-phosphate dehydrogenase// Eur. J. Biochem.- 1995.- V.231, N1.- P.181-185.

59. Gho S., Joshi J. G. Inactivation of baker's yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase by aluminium// Biochim.- 1989.- V.28, N8.- P.3613-3618.

60. Gleason F.K. Glucose-6-phosphate dehydrogenase from the cyanobacterium, Anabena sp. PCC 7120: Purification and kinetics of redox modulation// Arch. Biochem. Biophys.- 1996.- V.2, N.334.- P.277-283.

61. Gosling P.G., Ross J.D. Charactirezation of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconic acid dehydrogenase from hazel cotyledons// Phytochemistry.- 1979.- V.18.- P.1441-1445.

62. Graeve K., Schaeven A., Scheibe R. Purification, characterization, and cDNA sequence of glucose-6-phosphate dehydrogenase from potato (Solanum tuberosum L.)// Plant J.- 1994.- V.5, N3.- P.353-361.

63. Grans D.C., Simone C.M., Blanchard J.S. Chemicalli induced modification of cofactor specificity of glucosr-6-phosphate dehydrogenase// J. Amer. Chem. Soc.- 1992.-V.114, N12.- P.4926-4928.

64. Grossman A., MacGowen R.A. Regylation of glucose-6-phosphate dehydrogenase in blue-green elgae// Plant Ptysiol.- 1975.- V.55.- P.658-662.

65. Haghighi B., Flinn T., Geoffrey L. Glucose-6-phosphate dehydrogenase from1.uconostoc mesenteroides. Isolation and seguence of a peptidecontaining en esseensal lysine// Biochim.- 1982.- V.21, N25.- P.6415-6420.

66. Hammond J.B.W. Glucose-6-phosphate dehydrogenase from Agaricus bisporus: Purification and properties// Gen. Microbiol.- 1985.- V.131, N2.- P.321-328.

67. Heber U. Metabolite exchange between chloroplasts and cytoplasm// Ann.Rev. Plant Physiol.- 1974.- V.25.- P.393—421.

68. Heber U. Metabolite exchange between cloroplasts and cytoplasm// Plant Physiol.- 1974.- V.25.- P.393-421.-13583. Hendricks S.B., Taylorson R.B. Promotion of seed germination by nitrate andcyanides//Nature.- 1972.-N237.- P. 169-170.

69. Hendricks S.B., Taylorson R.B. Promotion of seed germination by nitrate nitrite, hydroxylamin and ammonium salts // Plant Physiol.- 1974.-N 54.- P. 304-309.

70. Herber H. Metabolite exchange between chloroplasts and cytoplasm// Ann.Rev. Plant. Physiol.- 1974.- V.25.- P.303-421.

71. Herbert M., Burchard C.H., Schnarrenberger C. A survey for isoenzymes of glucose phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase in C3-, C4-and Crassulaceac-Acid-metabolism plants, and green algae// Planta.- 1979.- V.145.-P.95-104.

72. Hey J.D., Dean D.J. Tandem dye-ligand chromatography and biospecific elution applied to the purification glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides// Biochem.- 1983.- V.209, N2.- P.363-371.

73. Higuchi T., Shimada M. Changes in activity of D-G6P: NADP+ and 6-phospho-D-gluconate: NADP+ oxidoreductase in relation to lignification of bamboo// Plant. Cell Physiol.- 1967.- V.13.- P.821-829.

74. Hill L.M., Smith A.L. Evidence that glucose-6-phosphate is imported as a substrate for lipid synthesis and carbohydrate metabolism// Plant. Physiol.- 1991.- V.79.-P.458-467.

75. Hong Z.Q., Copeland L. Isoenzymes of glucose-6-phosphate dehydrogenase fron the plant fraction of soybeen nodules// Plant Physiol.- 1991.- V.96, N3.- P.862-867.

76. Hoover J.D., Wender S.H., Smith E.C. Isoenzymes of glucose-6-phosphate dehydrogenase from tobacco cells// Phytochemistry .-1977.- N16.- P. 195-197.

77. Huber S.C. Orthophosphate control of glucose-6-phoaphate dehidrogenase lihth modulation in relation of the inductionphase of chloroplast photosinthesis// Plant Physiol.- 1976.- V.64, N5.- P.846-851.

78. Indengaku D. Purification and properties of wild-type and mutant glucoses-phosphate dehydrogenases and of 6-phosphogluconate dehydrogenases from Drosophila melanogaster// Sap. S. Acnet.- 1980.- V.55, N11.- P.211-223.

79. Jeffery J. Fructose-6-phosphate is not a substrate for glucose-6-phosphate dehydrogenase//Exp. Zool.- 1986.- V.239, N1.- P. 131-132.

80. Jeffery J., Hobbs L., Jorwall H. Glucose-6-phosphat dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae: characterization of a reactive Lisine residue labelet with acetylsalicylic acid// Biochem.- 1985.- V.24, N3.- P.666-671.

81. Johnson H.S. Dithiotreitol: an inhibitor of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in leaf exstracts and isolated chloroplast activity// Planta.- 1972.-V.106.- P.273-277.

82. Kaiser W.M., Dassham J.A. Light-dark regulation of starch letabolism in chloroplasts. 1. Levels of metabolites in chloroplasts and medium during light-dark.// Plant Physiol.- 1979.- V.63, N1.- P.105—109.

83. Kelly G.J., Latzko E. Evidence for phosphofructokinase in chloroplasts.// Nature.- 1975.- V.256.- P.429.

84. Kelly G.J., Latzko E. Regulation aspects of photosynthetic carbon metabolism. //Ann. Rev. Plant Physiol.- 1976.- V.27.- P. 184-205.

85. Kiriuchin M.I., Kletsova L.V. Properties of glucose-6-phosphate dehydrogenase of the obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum KT. // Microbil. Lett. -1988. -Vol. 52, N 3. -P.199-204.

86. Kirkman H.N., Hendrickson E.M. // J. Biol.Chem.- 1962.- V.237.- P.2371.

87. Koller D., Mayer A.M., Klein S. Seed germination // Ann. Rev. Plant Physiol.- 1962.- N 13.- P. 437-464.

88. Kovacs M.I.P., Simpson G.M. Dormancy and enzyme levels in seeds of wild oats//Phytochem.- 1976.-N 15.-P. 455-458.

89. Krause G.H., Bassham J.A. Induction of respiratory metabolism in illuminated Chlorella pyrenoidosa and isolated spinach chloroplasts by the addition of vitamin K5// Biochim. Biophys. Acta.- 1969.- V.172, N3.- P.553—558.

90. Kelly G.J., Latzko E. Chloroplast phosphofructokinase. 1. Proof of phosphofructokinase activity in chloroplasts// Plant Phys.- 1977.- V.60, N6.- P.290— 294.

91. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature.-1970.- N227.-P. 680-685.

92. Latzko E., Gibbs M. Distribution and activity of ensymes of the reductive penthose cycle in spinach leaves and in chloroplasts isolated by different methods// Plant Physiol.- 1968.- V.59.-P.184-194.

93. Lendzian K., Ziegler H. Dber die Regulation del Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase in Spinatchloroplasten durch Licht// Planta.- 1970.- V.94.- P.27-36.

94. Lendzian K., Ziegler H. Uber die Regulation der Glucose-6-Phosohat-Dehydrogenase in Spinatchloroplasten durch Licht// Planta.- 1970.- V.94, N1.- P.27-36.

95. Lendzian K.J. Metabolism of specifically labeled glucose, glucose 1-phosphate and glucose-6-phosphate cycle in a reconstitued spinach chloroplast system in darkness and in the light// Plant Physiol.-1980.- V.66, N1.- P.8-12.

96. Biochem.Biophys. Acta.- 1975.- Y.396.- P.260-275.

97. Levi C., Gibbs M. Starch degradation in isilated spinach chloroplasts// Plant. Physiol.- 1976.- V.57, N6.- P.933-935.

98. Levy H.R. Glucose-6-phosphate dehydrogenases// Adv. Enzymol.- 1979.-V.48.- P.97-192.

99. Levy H.R.// J. Biol. Chem.- 1963.- V.238.- P.775.

100. Levy R.H., Rainner R.R., Nevaldine B.H. On the Strukture and Catalytic function of mammary glucose-6-phosphate dehydrogenase.// J.Biological Chem.- 1966.-V.241, N10.- P.2181-2187.

101. Liobell A., Rinaldo J. Glutatione reductase directly mediates the stimulation of yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase by GSSG// J. Biochem.- 1988.-V.249, N1.- P.293-296.

102. Lowry O., Rosebrought N., Farr A., Randall R. Protein mesurement with the Folin-Phenol reagent// J.Biol.Chem.- 1951.- V.194, N1.- P. 265-271.

103. Luzzatto L. Glucose-6-phosphate dehedrogenase// Italich J. of Biochem.-1986.- V.35.- P.375-383.

104. Magnani M., Stoichi V., Fazi A.// Biochem. Biophys. Res. Communs.-1984.-V.125, N 1.- P.14.

105. Malathi S. Atudies on the isolation of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Aspergillus nidulans// J. Indian Inst. Sci.- 1987. -V.67, N1-2,- P.43-46.

106. Mirfakhrai M., Auleb L. Partial purification and kinetic charactirezation of wheat germ glucose-6-phosphate dehydrogenase// J. Plant Physiol.- 1989.- V.135.1. P.191-196.

107. Molecular characterization of the plastidic glucose-6-phosphate dehydrogenase from potato in comparison to its cytosolic counterpart /A.Schaeven, G. Langenkamper, K.Graeve, I.Wenderoth, R.Scheibe// Plant Physiol.-1995.- V.109.-P.1327-1335.

108. Muller K., Braun C. Dithranol, glucose-6-phosphate dehydrodenase inhibition and active oxygen species// Arrneim Forsch.- 1991.- V.41, N11.- P.1176-1181.

109. Muto S., Uritani I. Glucose-6-phosphate dehydrogenase from sweet potato// Plant Cell Physiol.- 1970.- V.ll.- P.767-776.

110. Muto S., Uritani I. Glucose-6-phosphate dehydrogenase from sweet potato// Plant Cell Physiol.- 1972.- V.13.- P.377-380.

111. Mve Akamba L., Anderson L.E. Light modulation of glyceraldegydphosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase activity at photosynthetic electron flow in pea chloroplasts.// Plant. Physiol.- 1981.- V.67.- P. 196201.

112. Naumann M.R. Verfahreu zur Reimgung von glucose-6-phosphate dehydrogenase// Pat. 227-447.

113. Nautigal C.S.,Modi V.V. Malate dehydrogenase and isocitrate dehydrogenase of root nodules of Trigonella// Phytochemistry.-1987.-V.7.- P. 18631865.

114. Noltmann E.A., Gubler C.J., Kuby S.A.// J. Biol. Chem.- 1961.- V.236.-P.1225.

115. Noltmann E.A., Kuby S.A.// Enzymes.- 1963.- V.7.- P.223.

116. Oka K.I., Takahashi T.Y., Hori S.H. Differential effects of the NADPH/NADP ratio on the activities of hexose-6-phosphate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase// Biochem. Biophys. Acta.- 1981.- V. 662.- P. 318375.

117. Pascual C., Acrrera L.S. Coordinate regulation of the pentose phosphate pathway and of the activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase (decarboxylating)// Folia microbiol.- 1982.- V.27, N6.-P.365-369.

118. Peavey D.G., Steup M., Gibbs M. Characterisation of starch breakdown in the; intact spinach chloroplast// Plant Physiol.- 1977,- V.60, N2.- P.305—308.

119. Reed P.W.// J. Biol. Chem.- 1969.-V.224, N9.-P.2459.

120. Reuter R., Naumann M., Hohhmann E. Interactions of immobilized and free triarine dyes with glucose-6-phosphate dehidrogenase from yeast// Biomed. Biochem. Acta.- 1986.- V.45, N3.- P.273-280.

121. Reuter R., Naumann M., Metz P. Purification and characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Pseudomonas W6// Biomed. Biochem. Acta.-1990.- V.49, N7.- P.539-546.-142146. Rodrigues-Segade S., Carrion A., Freire M.// Biochem. Biophys. Res.

122. Communs.- 1979.-V.89, N 1.- P. 148.

123. Rosemeyer M. A. The biohemestry of glucose-6-phosphate degidrogenase, 6-phosphogluconate degidrogenase and glutationereductase// Cell. Biochem. Funct.-1987.-V.5, N2.- P.79-95.

124. Ruwende C., Khoo S.C., Snow R.W. Natural selection of hemi- and heterozygotes for G6PD deficiency in Africa by resistanse to severe malaria// Nature.-1995.-V.376.- P.246-249.

125. Salgo A., Feller V. Inactivation and stabilisation of glucose-6-phosphate dehydrogenase in extracts from germinating wheat// Experimentia.- 1985.- V.41, N6.-P.789.

126. Sanchez M.L., Peleato P.J., Cebrian A.T. Accion del glutation oxidado Sobre la actividad de las enzimas de la fase oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato en Aspergillus orizae// An Estac. Auladei.- 1981.- V. 15, N3-4,- P.251-260.

127. Sanwal B.D. Regulatory mechanisms involving nicotinamide adenine nukleotides as allosteric effectors. Control of glucose-6-phosphate dehedrogenase// J. Biological Chem.- 1970.- V.245, N7.- P.1626-1631.

128. Sceni S., Gnaman A. Isozymes of glucose-6-phosphate dehydrogenase and NAD-malate dehydrogenase in shoot-forming foliar discs of Tobacco// Plant. Cell. Physiol.- 1981.- V.22, N6.- P.969-977.

129. Schnarrenberger C., Oesel A. Two isoenzymes of glucose phosphate isomerase from spinach leaves and their intracellular compartmentation// Biochem.-1974.- V.45.- P.77-82.

130. Schnarrenberger C., Oesel A., Tolbert N.E. Two isoenzumes each of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase in spinach leaves//Arch. Biochem. Biophys.- 1973.- V.154.- P.438-448.

131. Schnarrenberger, C., Flechner, A., Martin, W. Enzymatic evidence for a complete oxidative pentose phosphate pathway in chloroplasts and an incomplete pathway in the cytosol of spinach leaves// Plant Physiol.- 1995.- V.108.- P.609-614.

132. Schnarrenberger, C., Tetour, M., Herbert, M. Development and intracellular distribution of enzymes of the oxidative pentose phosphate cycle in radish cotyledons// Plant Physiol.- 1975.- V.56.- P.836-840.

133. Schray K.S., Gergsts E. Imprond biotinylation of glucose-6-phosphate dehydrogenase usind active-site-blocking agents// Anal. Biochem.- 1985. -V.149, N1.-P.225-228.

134. Shinichi S., Isamu C. Regulation of glucose-6-phosphate dehydrogenase in Brevibacterium flavum//Arg. Biol. Chem.- 1987.- V.51, N1.- P.101-108.

135. Simultaneous purrification and characteriration of glucokinase, fructokinase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase from Zimomonas mobilis /R.K.Scopes, V.Testolin, A.Stoter, K.Griffiths-Smith, E.M.Algar // J. Biochem. -1985. -V.228, N 3. -P. 627-634.

136. Speer H.L Activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase from lettuce seeds, Lactuca sativa//Can. J. Bot. -1974.- V.52.- P.2225-2227.

137. Srveda L.I., Stadtman E. Iron-catalysed oxidative madification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides: Structural adn functional changes//J. Biol. Chem.- 1992.- V.267, N5.- P.3096-3100.

138. Stitt M., Heldt H.W. Simultaneous synthesis and degradation of starch inspinach chloroplasts in the light// Biochim. Biophys. Acta.-1981.- V.638, N1.- P. 1—11.

139. Stitt M., Lilli R., Heldt H. M. Adenine nucleotide levels in the cytosol, chloroplasts and mitochondria of wheat leaf protoplasts// Plant Physiol.- 1982.- V.70, N4.-P.971—977.

140. Takahama U., Shimizu-Takahama M., Heber, U. //Biochim. Biophys. Acta.-1981.- V.637.- P.530-539.

141. Tappia P.S., Jones C.S., Cannock M.S. Purification of guinea pig small intestinal peroxisomes and the subcellular localization of glucose-6-phosphate dehydrogenase//Md. Cell. Biochem.- 1998.- V. 179, N1-2.- P. 13-20.

142. The evolution of isoenzymes of sugar phosphate metabolism in algae./ C.Schnarrenberger, W.Gross, B.Pelzer-Reith, S.Wiegand, S.Jakobshagen // Phylogenetic Changes in Peroxisomes of Algae.Phylogeny of Plant Peroxisomes.- Oldenburg, 1992.-P. 310-329.

143. The nomenclature of multiple forms of enzymes// Eur. J. Biochem.- 1971. -V. 24.-N1.- P. 1-3.

144. Ureto T., Radojkovic J. Organisation of glucose metabolism: a model of compartmens by polyisozymic complexes// Organ Cell Metab.: Proc. NATO Adv. Res. Workshop, Hanstholm, Aug. 31-Sept. 4, 1985.- New Jork; London, 1986. -P. 131-142.

145. Valenti K., Stanghellini M.A., Pupillo P. Glucose-6-phosphate dehydrogenase Isozymes of Maize leaves. Some comparative properties// Plant Physiol.-1984.- V.75, N3.- P.521-526.

146. Walker D.A. Plastids and intracellular transport. Transport in plants. Intracellular interactions and transport processes. Encycl.// Plant Physiol.- 1976. -V.3. -P.85-136.

147. Wang N.B., Li H. Выделение и очистка глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы с помощью хроматографии на иммобилизованном красителе// Biochem. Biophis. Acta.- 1993. -V.25, N2. Р.181-186.

148. Warburg О., Christian W.// Biochem.Z.- 1932.- V.254.- С. 438-458.

149. White В .J., Levy H.R. Modification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides with the 2', З'-dialdehyde derivative of NADP ( oNADP )// J. Biol. Chem.- 1987. -V.262,N3. -P.1223-1229.

150. Wichael V.W., Harel S.M., Fortes R. The regulation of microsomal glucose-6-phosphate dehedrogenase differens between lever and kidney// Biochem Soc. Trans.-1992.- V.20, N3.- P.2725.

151. Xiao-Hua J., Anderson L. Changing activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase from pea chloroplasts during photosynthetic induction// Plant Physiol.-1987.- V.85, N2.- P.598-600.

152. Yue R.H., Noltmann E.A., Kuby S.A. Glucose 6-phosphate dehydrogenase from Brewer's yeast// J. Biol. Chem.- 1969.-V.236, N5.-P. 1353-1364.

153. Zendzian K. J. Modulation of glucôse-6-phosphate dehydrogenase by NADPH ( NADP ratios in an illuminated reconstituted spinach ) chloroplast system// Planta.- 1988. -V.148,N1. -P.l-6.-147

Информация о работе

Семенихина, Анастасия Владимировна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа высших растений: формы, свойства и регуляция активности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы