Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, влияющие на взаимосвязь агрегации и каталитической активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на взаимосвязь агрегации и каталитической активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы"

На правах рукописи

ШАЛОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ВЗАИМОСВЯЗЬ АГРЕГАЦИИ И КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Г Л ИЦЕ Р АЛЬДЕ ГИД-3 -ФОСФ АТДЕ ГИДРОГЕНАЗЫ

03.00,04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

¡11111111111111111111

ООЗ159693

Москва - 2007

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им, А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им, М.В Ломоносова

Научный руководитель;

доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевнч

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Изумрудов Владимир Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Медведев Алексей Евгеньевич

доктор химических наук, профессор Гладилин Александр Кириллович

Ведущая организация: институт Биохимии им. А.Н, Баха РАН

Защита состоится "29" октября 2007 г. в "_" часов на заседании

Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им, М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан СШ.У^ЭО^у__2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Медведева М.В,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД)* (NAD+ - зависимая фосфорюшрующая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа, КФ 12 1 12) катализирует один из ключевых этапов гликолиза реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата в 1,3 - дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых на сегодняшний день ферментов гликолиза Это связано не только с важностью исследования его основной гликолитической функции, но и с обнаружением многочисленных негликолитических активностей фермента На данный момент существует обширная информация об участии ГАФД в различных процессах за счет взаимодействия этого фермента с природными полимерами без проявления какой-либо каталитической активности Важность разнообразных функций ГАФД в регуляции клеток во многом связана с высоким содержанием фермента в тканях Особенно важно, на наш взгляд, изучение роли ГАФД в процессе агрегации белков и в образовании амилоидных структур Мы полагаем, что именно благодаря высокой концентрации ГАФД является полноправным участником многих патологических процессов, обусловленных накоплением агрегированных белков Правильность такого предположения подтверждается появлением все новых фактов участия ГАФД в возникновении различных нейродегенеративных болезней Изучение механизмов агрегации белков крайне важно для понимания процессов возникновения амилоидных бляшек, в которых помимо самого белка Р-амилоида (АР), принимают участие и некоторые другие белки, в том числе и ГАФД Таким образом, исследование развития нейродегенеративных заболеваний тесно переплетается с изучением систем, защищающих белки от агрегации

Цели исследования Исходя из выше изложенного, в работе были поставлены следующие цели

• измерить удельную активность и содержание ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера,

• найти способы предотвращения агрегации белков с использованием синтетических полиэлектролитов

Научная новизна В настоящей работе мы впервые изучали изменение удельной активности ГАФД в образцах мозга животных при моделировании болезни Альцгеймера у трансгенных мышей TG2576, а также у крыс после введения им таких препаратов как АР, тиорфан, липополисарид и у-интерферон Обнаружено, что уменьшение удельной активности ГАФД в

*Список сокращений ГАФД - глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеиаза, ПАВП-m - поли-N алкил-4-вииилпирндиинй бромид, содержащий т метнльиьс. групп в N-заместителе ПАК — полиакриловая кислота ПМАК - полимегакриловая кислота ПСС ~ лолистиролсульфонат натрия ПЭВП - полн Ы-зтил-4-винилпиридиний бромид ПЭВП-Д- сополимеры 4-винилпиридина и N этвл-4-винияпйридиний бромида со степенью алкилирования я 3-ФГА - З-фосфоппшернновый альдегид, ЭДТА -этнлендиаминтеграацетат Ар - пептид [i амилоида, РАРР - белок предшественник р амилоида, NAD' -никотинамидадениидинуклеотид окисленный NADH - никотинамидадениидинуклеотид восстановленный, TG - трансгевные мыши WT-мыши дикого типа

образцах мозга животных происходит независимо от способа индуцирования болезни Альцгеймера Было обнаружено, что содержание белка, определенного в нерастворимых фракциях мозга трансгенных мышей TG2576, увеличивается Впервые выявлена кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на Aß, с ГАФД Показана способность синтетических полиэлектролитов подавлять термоагрегацию белков

Практическая значимость работы Подобраны условия избирательной идентификации Aß с использованием антител 6Е10 Выявленные факторы, влияющие на способность синтетических полиэлектролитов подавлять агрегацию белков, дают возможность создавать полимеры с заданными свойствами и эффективно контролировать агрегацию белка, что является важным этапом на пути создания искусственных шаперонов Апробаиия работы Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им АН Белозерского, а также на конференциях «Ломоносов-2004»,«Ломоносов-2005», Москва 2004, 2005, на юбилейной конференции, посвящённой 70-летию основоположника российской школы биоэнергетики академика В П Скулачева, «Российская биоэнергетика от молекулы к клетке», Москва 2005, на международных конференциях «Белки теплового шока при конформационных и раковых зоболеваниях», Польша, Закопаны 2005 и Портурагалия, Томар 2007, на международной конференции «Биокатализ», Санкт-Петербург - Кижи - Валаам 2005, на международной конференции «Биотехнология и здоровье», Армения, Ереван 2005, на международной конференции «Химия, структуры и функции биомолекул», Белоруссия, Минск 2006, на всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку», Москва 2007, на международной конференции болезни Альцгеймера и заболевания Паркинсона, Австрия, Зальцбург 2007 Публикации По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ Структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Объем работы составляет 136 страниц, содержит 30 рисунков и 1 таблицу Список литературы включает 242 источника

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Методы исследования

Глииеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill et al, 1975) Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH^SCU

Мозговую ткань гомогенизировали в течение 30 сек при помощи гомогенизатора Потгера в 4-х кратном объеме 10 мМ калий-фосфатного

буфера, рН 7,5, содержавшего 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупептина Полученную суспензию центрифугировали при 12000 g в течение 5 мин Супернатант и осадок использовали для определения активности и содержания ГАФД

Кониентоаиию белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) и спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при 280 нм, при этом использовали значение А28о равное 1 (Kirchenbaum, 1972) Определение активности ГАФД проводили спектрофотометр ически, измеряя увеличение поглощения NADH при длине волны 340 нм в реакционной среде рН 8,9, содержавшей 100 мМ глицина, 100 мМ КН2Р04, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ 3-ФГА и 1 мМ NAD+ Реакцию начинали внесением белка в реакционную среду

Растворы полиэлектролитов готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5 для полианионов и рН 9,0 для поликатионов, содержавшем 0,5 мМ ЭДТА Концентрацию полианинов в растворе рассчитывали относительно мономеров цепи полиэлектролита, поликатионов - относительно заряженных групп полимера

Кинетику термоагрегаиии ГАФД измеряли на термостатированном спектрофотометре "SIM Ammco DW - 2000", США За увеличением количества агрегатов белка следили по увеличению оптического поглощения при 320 нм В кварцевую кювету вносили 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5 или 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА, нагревали до 60°С, вносили белок (t = 37°С) в небольшом объеме до конечной концентрации 0,7 мкМ, быстро перемешивали и записывали увеличение оптического поглощения При работе с полиэлектролитами препараты полимеров вносили в кювету с буферным раствором до необходимой концентрации, процесс термоагрегации начинали внесением белка Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи программного обеспечения "OrigmPro 7 5" (MicroCal Inc, США)

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия) Измерения проводили при скорости нагрева 1,0°С/мин в диапазоне температур от 20 до 90°С

Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmh, 1970)

Метод иммуноблоттинга Белки, разделенные в полиакриламидном геле, электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану В некоторых экспериментах после переноса белков мембрану кипятили в фосфатно-солевом буфере в течение 5 минут (Kalback et al, 2002) В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела (6С5), выработанные на денатурированную форму ГАФД, или антитела (6Е10), выработанные на 1-17 участок АР человека Денситометрический анализ белковых полос проводили при помощи программного обеспечения QuantiScan Version 2 1 (Biosoft, Великобритания)

5

Статисттеский анализ данных проводили при помощи программного обеспечения Sigma-Stat 3 0 (Чикаго, США) Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка Различие данных при р < 0,05 считали статистически достоверными

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение удельной активности ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера

С целью выяснения роли, которую может играть ГАФД в формировании амилоидных структур, мы исследовали изменение активности и содержания белка ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера Нами были выбраны наиболее используемые для изучения патогенеза болезни Альцгеймера модели Прежде всего, трансгенные мыши TG2576, для которых характерна экспрессия человеческого мутантного РАРР (Лиз670 Асп, Мет671 -> Лей) и накопление в мозге Ар^г (Hsiao et al, 1996) Также нами были использованы образцы мозга крыс после введения таких нейродегенеративных препаратов как АР (Frautschy et al, 1991), тиорфан (Brugg et al, 1995) и смесь липополисахарида и у-интерферона (Hauss-Wegrzymak et al, 1999) Нами были исследованы отделы мозга, которые в первую очередь подвержены нейродегенеративным процессам, а именно мозжечок и кора

Кросс-реактивность антител 6EI0, выработанных на р-амшоид, с ГАФД Исследования т vitro свидетельствуют, что ГАФД способна связываться с цитоплазматическим доменом белка предшественника АР (РАРР) и оказывать влияние на формирование амилоидных фибрилл, что являетя прямым свидетельством участия фермента в патогенезе болезни Альцгеймера Существует довольно противоречивая информация о клеточной локализации данных белков, что связано с возможностью кросс-реактивности антител, выработанных на Ар, с ГАФД По этой причине, прежде чем перейти к определению содержания ГАФД и пептида АР в препаратах мозга с помощью иммунохимических методов, было необходимо выяснить причины перекрестной реакции антител, выработанных на рА, с ГАФД и найти способы раздельной идентификации двух белков В данной работе для выявления РАРР в образцах мозга трансгенных мышей TG2576 мы использовали коммерческие моноклональные антитела 6Е10 на участок 1-17 АР человека Иммуноблот показал ярко выраженное взаимодействие антител с ГАФД (Рис 1 А) Полосы ГАФД можно наблюдать как в экстракте мозга трансгенных мышей, содержащих рАРР, так и в образцах мозга мышей дикого типа Такие же полосы ГАФД мы наблюдали, используя антитела 6С5, выработанные на ГАФД (Рис 1 Б) Нам удалось показать, что после кипячения нитроцеллюлозной мембраны, после электрофоретического

6

переноса белков, антитела, выработанные на А|3, более не взаимодействуют с ГАФД, хотя фермент при этом определяется антителами 6С5 (Рис 1 В и Г) В тоже время нами было показано, что используемые для идентификации ГАФД моноклональные антитела 6С5 не дают перекрестной реакции с амилоидными белками Таким образом, нами были подобраны условия, позволяющие избирательно определять два белка, что особенно важно при проведении иммунофлуоресцентного анализа клеток

кДа

А Б

98 «W -— • РАРР

84 К»

50 #

36 30 gl -ГАФД

УУТ WT TG TG WT WT TG TG

В Г

98 _ _ — -РАРР

М

50 «*

38 ж

30 т

ГАФД

'ГАФД

Рис 1 Иммуноблот образцов мозга трансгенных мышей (Тв2576) и мышей дикого типа (\УТ) с использованием моноклональных антител 6Е10, выработанных на р-амилоид, (А, В) и 6С5, выработанных на ГАФД, (Б, Г) без кипячения мембраны (А, Б) и после кипячения мембраны (В, Г).

После электрофоретического переноса белков мембрану кипятили в течение 5 минут в фосфатно-солевом буфере, затем окрашивали антителами

m vfr те то wr от то tg

Определение удельной активности и содержания ГАФД в мозге животных

Для изучения изменений, происходящих с ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера, мы определяли активность этого фермента в растворимых фракциях различных частей мозга, а также (с помощью иммунохимических методов) измеряли содержание белка ГАФД, как в осадке, так и в супернатанте гомогената мозговой ткани Для определения удельной активности ГАФД из мозга животных различных моделей болезни Альцгеймера мы экстрагировали активную форму фермента, гомогенизируя ткань в калий-фосфатном буфере, рН 7,5

В экстрактах мозга трансгенных мышей Тв2576, содержавших РАРР, нами было обнаружено уменьшение на 25 - 30 % активности ГАФД как в коре головного мозга, так и в мозжечке по сравнению с мышами дикого типа (Рис 2 А) Однако содержание самого белка ГАФД при этом не изменялось, как показано с помощью иммуноблота после его денситометрического анализа (Рис 2 Б и В) Анализ осадков данных препаратов, полученных после элюции активной формы фермента, показал более высокое статистически значимое содержание ГАФД в образцах мозга трансгенных мышей (Рис 2 Г и Д) Мы предполагаем, что данные осадки образцов мозга, содержат

7

амилоидные структуры и неактивные агрегированные молекулы ГАФД Вероятно, каталитическая активность ГАФД уменьшается за счет накопления инактивированной и нерастворимой формы фермента в участках мозга, содержащих амилоидные структуры

Удельная Денситометричсский

активность Иммуноблот анализ

£ ю о 2 » 1« 1 А Б в ш 1 - кора головного мозга WT, 608 — ^ 2 - кора головного мозга ТО, т о 3 - кора головного мозга WT, 5 4 - кора головного мозга ТО, а 5 - мозжечок "'¡УТ, юо * 6 - мозжечок Тв, ш ® 7 - мозжечок УП, 5 8-мозжечокТО л» 2 5 200 £

КОРА МОЗЖЕЧОК Г -X. г- Д

12348678 КОРА МОЗЖЕЧОК

Рис 2, Изменение удельной активности (А) и содержания ГАФД, определенного методом иммуноблота при помощи антител 6С5 (Б, Г) с последующим денситометрическим анализом (В, Д), различных растворимых (А, Б, В) и нерастворимых (Г, Д) фракций мозга трансгенных мышей (14x2576) 8 и мышей дикого типа (ХУТ) □

Препараты мозга гомогенизировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержавшем 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупептина при 22°С Полученный супернатант (А, Б, В) использовали для определения удельной активности и содержания ГАФД Осадки препаратов (Г, Д) использовали для определения содержания ГАФД Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, * р < 0,05 - статистическая разница

Нами также было показано уменьшение каталитической активности ГАФД в мозге крыс после воздействия на них различных препаратов, способствующих развитию нейродегенеративных заболеваний Инъекции. АР|_42) приводящие к значительной деградации нейронов (ГгаЩзсЬу й а1, 1991, БЬт е! а1, 1997), в мозг крыс приводили к уменьшению ферментативной активности ГАФД на 10 - 15 % (Рис 3 А) Инъекции тиорфана (ингибитора фермента неприлизина, принимающего участие в катаболизме А(3) и липополисахарида с интерфероном-у (приводящих к оверэкспрессии (ЗАРР и накоплению АР) (Вп^ а1, 1995, Нашв-\¥е^гутак е1 а1, 1999, 1\чаЫ е1 а1, 2000), сопровождались снижением активности ГАФД как в коре головного мозга, так и в мозжечке крыс (Рис 3 Г и Ж) Нами не было обнаружено изменений в количественном содержании фермента ни в супернатанте при элюции нативной формы ГАФД (Рис 3), ни при анализе осадка препаратов (результаты не показаны) Активность

8

чистого фермента ГАФД при инкубации в течение 2 часов в присутствии АР, тиорфана и липополисахарида не изменялась (результаты не показаны)

Удельная активность

Денситометрический Иммуноблот анализ

3

п

1 - кора контрольных крыс,

2 - кора опытных крыс,

3 - кора контрольных крыс,

4 - кора опытных крыс,

0 5 - мозжечок контрольных крыс, § 6 - мозжечок опытных крыс,

1 7 - мозжечок контрольных крыс, | 8 - мозжечок опытных крыс

I

I

КОРА МОЗЖЕЧОК 1 2 3 4 6 6 7 8 КОРА МОЗЖЕЧОК

Рис 3 Изменение удельной активности (А, Г, Ж) и содержания ГАФД, определенного методом иммуноблота при помощи антител 6С5 (Б, Д, 3) с последующим денситометрическим анализом (В, Е, И), растворимых фракций мозга контрольных крыс □ и крыс после введения (3-амилоида (А, Б, В), тиорфава (Г, Д, Е) и липополисахарида с у-интерфероном (Ж, 3, И) ■ .

Препараты мозга гомогенизировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержавшем 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупептина при 22°С Полученный супернатант использовали для определения удельной активности и содержания ГАФД Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, * р < 0,05 - статистическая разница

Инактивация ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера, обнаруженная в нашей работе, хорошо согласуется с уменьшением активности фермента в фибробластах больных пациентов (Mazzola and Sirover, 2001) В литературе существует несколько объяснений этого явления Высказано предположение о том, что различные белковые взаимодействия могут ингибировать гликолитическую активность ГАФД и приводить к ослаблению метаболизма глюкозы в целом (Mazzola and Sirover, 2001, 2003), способствуя развитию патологических процессов (Roses, 1996, Roses et al, 1996) Уменьшение активности фермента при развитии болезни Альцгеймера может происходить за счет окислительной модификации ГАФД Цис149 в активном центре фермента, являющийся крайне чувствительным по отношению к окислителям, может подвергаться модификации оксидом азота NO (Нага et al, 2006), концентрация которого увеличивается в клетке при развитии болезни (Sultana et al, 2006, Finch and

Cohen, 1997) Незначительное накопление свинца, одного из факторов риска развития болезни Альцгеймера, может значительно ингибироватъ активность ГАФД (Yun and Hoyer, 2000)

Таким образом, нами было показано, что уменьшение удельной активности ГАФД происходит при моделировании болезни Альцгеймера независимо от того, как болезнь была индуцирована Кроме того, все выше перечисленные причины приводят к накоплению амилоидных структур, содержащих неактивную и нерастворимую форму ГАФД Мы полагаем, что денатурированные формы ГАФД могут участвовать в формировании амилоидных структур, характерных для различных типов нейродегенеративных заболеваний

Влияние синтетических полиэлектролитов на термоагрегацию и термоинактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

В данной работе мы использовали ГАФД в качестве модельного белка для изучения влияния синтетических полиэлектролитов на агрегацию белков ГАФД обладает удобным сочетанием свойств, а именно относительно высоким значением изоэлектрической точки, pi 8,0 (Righetti and Caravaggio, 1976), и достаточно протяженным колоколом pH-зависимого изменения активности фермента с pH-оптимумом вблизи 9,0 (Наградова и Асриянц, 1969) Поскольку в физиологических условиях тетрамерная ГАФД заряжена положительно, она способна формировать прочные комплексы с полианионами за счет электростатических взаимодействий Как и следовало ожидать, в этих условиях фермент не проявляет склонности к взаимодействию с поликатионами Однако ситуация меняется на прямо противоположную в щелочных средах Проведение опытов в pH-оптимуме сопровождалось резким ростом стабильности белок-поликатионных комплексов и ослаблением взаимодействия с полианионами Таким образом, исследуя комплексообразование одного и того же белка с полиэлектролитами разного знака заряда, нам удалось выявить влияние полимеров на агрегацию белка и показать, что такое влияние носит общий характер

В данной работе мы использовали следующие синтетические полианионы полиметакриловую кислоту (ПМАК), полиакриловую кислоту (ПАК) и полистиролсульфонат натрия (ПСС) (Рис 4), и синтетические поликатионы поли-К-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП), сополимеры 4-винилпиридина и 1\т-этил-4-винилггиридиний бромида (ПЭВП-Д) различной степени алкилирования Д п,и-ионены, поли-Н-алкил-4-винилпиридиний бромид (ПАВП-m) содержащий т метальных групп в N-заместителе (Рис 5) Использование различных полиэлектролитов позволяло нам варьировать их степень полимеризации, а также степень заряженности цепи и гадрофобность

-Есн-сн.

•+ЦС—ОНг

-ЕСНг-СНЗг -ЕСНг-СНЗ;-I I 1 соон соон . . ^

Полиметакриловая Полиакриловая Полистирол-

кислота, ПМАК кислота, ПАК

—ЬНгС—снЧ^-ЬНгС—а

-ч А

сульфонат натрия

псс

СЛ

Поли-М-этил-4-винилпиридиний бромид, ПЭВП

и

Сополимер 4-вюшлпиридина и этил-4-винилпирвдиний бромида,

пэвп-д(д%=юо;/оы-0)

Ч-НгС—ОНг

—МОйг

РЧ> . СИ | вг [а

п п-ионен

</Ч>

I

сл

Поли-1<-алкш1-4-винилпиридиний бромид, ПАВП-й)

Рис 4 Структуры синтетических полианионов

Рис 5 Структуры синтетических поликатионов

Факторы, влияющие на термоагрегацюо ГАФД

Влияние соотношения заряженных групп белка и полиэлектролита на термоагрегацию ГАФД

Агрегацию белка проводили при 60°С На Рис 6 приведены типичные кинетические кривые термоагрегации ГАФД в свободном виде (кривая 1) и в смесях с ПМАК юоо В данной системе по мере увеличения концентрации полиэлектролита (при фиксированной концентрации белка) оптическая плотность растворов в ходе тепловой агрегации последовательно снижается (кривые 2-4) Такое подавление агрегации наблюдалось при использовании всех вышеперечисленных полиэлектролитов

Отметим, что в экспериментах основное нарастание оптической плотности происходило в течение первых четырех минут В качестве параметра, характеризующего агрегацию в системах, мы выбрали отношение значения оптической плотности после 5 мин агрегации с полимером к оптической плотности соответствующей агрегации свободного белка, Аз20,5мин/Аз20 5мин(ГАФД) Очевидно, что отношение А32о,5мт/Аз:!о,5шш(ГАФД) равное нулю соответствует полному предотвращению агрегации полиэлектролитом, тогда как отношение равное единице соответствует максимальной агрегации

Разумно полагать, что обнаруженное нами последовательное подавление агрегации ГАФД все возрастающими количествами вводимых полиионов происходит в результате образования растворимых белок-полимерных

Рис 6. Кинетические кривые термоагрегации свободной ГАФД (1) и ГАФД в смесях с ПМАКмоо различных концентраций: 0,2 мМ (2), 1 мМ (3), 10 мМ (4)

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, температура 60°С

Время мин

комплексов, стабилизированных электростатическими взаимодействиями разноименно заряженных групп белка и полимера Как следует из результатов многочисленных исследований смесей белков с полиэлектролитами, которые проводили при комнатной температуре, при стехиометрическом (1 1) соотношении противоположно заряженных групп полимера и белка в системах образуются нерастворимые белок-полиэлектролитные комплексы (Xia and Dubm, 1994) Добавление в такие смеси избыточного количества полиэлектролита приводит, как правило, к растворению осадка за счет возникновения растворимых белок-полиэлектролитных комплексов (Izumrudov et al, 1999) Если следовать предложенной нами схеме образования таких комплексов (Рис 7), которая опирается на экспериментально доказанное сосуществование в растворе нерастворимых и растворимых комплексов (Зайцев и др, 1992), то полученные нами результаты можно объяснить следующим образом При относительно низком содержании полимера в смеси (кривая 2 на Рис 6) основными продуктами взаимодействия ГАФД с ПМАК являются электростатически нейтральные нерастворимые комплексы (Рис 7, А) Очевидно, что нерастворимые комплексы не способны защитить белок от агрегации По мере увеличения концентрации полимера (кривые 3 и 4 на Рис 6) происходит перераспределение белковых глобул среди заряженных цепей полиэлектролитов, которое приводит к возникновению и последовательному нарастанию количества растворимых белок-полиэлектролитных комплексов (Рис 7, Б и В) Перераспределение осуществляется за счет межмолекулярных реакций обмена, которые характерны для белок-полиэлектролитных систем и протекают достаточно легко (Izumrudov, 1996) Растворимость комплексов обеспечивают заряженные группы полиэлектролита, не участвующие в электростатическом взаимодействии с белком и находящиеся в смеси в избыточном количестве Наконец, при достижении некоторого критического состава смеси, агрегация ГАФД полностью подавляется, что свидетельствует о превращении всех нерастворимых комплексов в растворимые белок-полимерные комплексы (Рис 7, В) Заряженные петли полимера с некомпенсированными заряженными группами поддерживают белковые глобулы в растворимом состоянии, предотвращая их агрегацию

12

А

Нерастворимый комплекс

Полимер

Нерастворимый комплекс и I Растворимый комплекс

Полимер

Рис 7 Механизм образования белок-полиэлектролитного комплекса

Влияние степени полимеризации подиэлектролита на термоагрегацию ГАФД Способность полиэлектролитов предотвращать термоагрегацию белка во многом определяется длиной их цепи На Рис 8 представлена зависимость агрегации белка от степени полимеризации присутствующих в смеси нолианионов Уменьшение степени полимеризации полимера (при фиксированном соотношении белок/полиэлектролит) понижает эту способность, а использование совсем коротких цепей практически не оказывает влияния на агрегацию ГАФД

Рис 8 Термоагрегация ГАФД в смесях с полианионами: ПМАК (1), ПАК (2) и ПСС (3) различных степеней полимеризации

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, концентрация звеньев полианионов 1 мМ, температура 60°С

Как упоминалось выше, для формирования растворимых белок-полиэлектролитных комплексов необходимо избыточное количество заряженных цепей полиэлектролита в комплексе При уменьшении степени полимеризации полиэлектролита набирание петли нужного размера становится все более затруднительным, а для совсем коротких цепей петлеобразование вовсе не характерно (Рис 9) Тем не менее, формирование растворимых комплексов возможно, но они не эффективны для предотвращения агрегации Вводимые новые избыточные цепи полиэлектролитов накапливаются в растворе и не принимают участия в комплексообразовании

Итак, для эффективного предотвращения агрегации белка следует использовать высокомолекулярные полиэлектролиты, которые образуют протяженные заряженные петли, поддерживающие белок в растворимом состоянии В полном соответствии с этим выводом находятся данные по изучению комплексов с полианионами различной плотности заряда, изложенные далее

Влияние плотности заряда цепи полиэлектролита на термоагрегацжо ГАФД

Способность высокомолекулярных поликарбоновых кислот подавлять агрегацию ГАФД заметно различается, причем у ПАКгзбо (Рис 10, кривая 2) она выражена сильнее по сравнению с ПМАКюоо (кривая I) Это отличие

14

Нерастворимый комп чеке

+ Почнмер

Нерастворимый комплекс Растворимый комплекс

"4" Полимер

■V

/ /

V

В

Растворимый комплекс

Ключ. - Белок

/ - Полимер

Рис 9 Механизм образования комплексов белка с короткими цепями полиэлектролитов

Рис 10 Зависимость

термоагрегация ГАФД от концентрации мономерных звеньев полианионов' ПМАКюло (1), ПАКгзво (2) и ПСС340 (3)

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7 5, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, температура 60°С

3

ю

0,0

6

Концентрация мономеров полианионов 10СМ

можно объяснить разницей в значениях pifa полимерных кислот, которые составляют 5,5 и 6,5 соответственно В условиях экспериментов (рН 7,5) степень ионизации ПМАК (püCa 6,5) ниже, то есть при фиксированной молярной концентрации звеньев полианиона заряд/зарядовое соотношение в смеси не в пользу образования растворимого комплекса ПМАК/ГАФД В отличие от слабых поликарбоновых кислот, полистиролсульфонатный анион в условиях экспериментов полностью ионизован Соответственно, использование ПСС даже в предельно малых концентрациях эффективно подавляет термоагрегацию белка (Рис 10, кривая 3)

Приведенные данные указывают на важную роль плотности заряда цепей в предотвращении термоагрегации ГАФД Рост степени ионизации ионогенных групп полимера способствует образованию растворимых белок-полиэлектролитных комплексов, обуславливая высокий заряд их петель

Влияние гидрофобности цепи полиэлектролита на термоагрегадию ГАФД Чтобы убедиться в универсальности воздействия плотности заряда цепей на образование растворимых белок-полиэлектролитных комплексов, мы расширили рамки исследования, включив в него поликатионы В качестве поликатионов различной плотности заряда использовали высокомолекулярные частично алкюшрованные поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромиды (Рис 5) В сополимерах ПЭВП-Д имеющих одинаковую степень полимеризации 1600, содержатся заряженные алкилированные звенья и незаряженные пиридиновые звенья, распределенные по цепи статистически Плотность заряда ПЭВП-/? определяется долей его алкилированных звеньев /?, %

На Рис 11 приведена зависимость термоагрегации ГАФД от параметра Д полученная в смесях белка с различными ПЭВП-/? при фиксированной концентрации алкилированных звеньев сополимера Вопреки ожиданиям, уменьшение плотности заряда на цепи не приводит к ослаблению ее способности подавлять агрегацию белка, как это наблюдалось в смесях с

полианионами Кривая имеет явно выраженный Б-образный вид, свидетельствующий о росте эффективности воздействия катионного сополимера на белок с уменьшением степени алкилирования его цепи, которое резко усиливается при /?< 70 %

Причина столь явного несходства в воздействии полианионов и поликатионов может заключаться в существенном отличии их незаряженных звеньев Незаряженные протонированные карбоксильные группы поликарбоновых кислот весьма гидрофильны Что касается незаряженных пиридиновых групп ПЭВП-Д то в условиях опытов (рН 9,0) они непротонированы и гидрофобии (неалкилированный поли-4-винилпиридин не растворим в воде при рН > 3,5)

ю

0,8 -

©

<с 06 -

I

ЗГ 0,4 -

0.2 -

0,0 -1-1-1-120 40 60 80

Рис 11 Зависисмость * термоагрегации ГАФД в смесях с поликатионом ПЭВП-Р от степени алкилирования полиэлектролита.

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, концентрация заряженных групп поликатиона 0,05 мМ, температура 60°С

100

Степень алкилирования %

Можно полагать, что гидрофобные неалкилированные звенья ПЭВП-Д взаимодействуют с гидрофобными пятнами белка, которые экспонируются в раствор при нагревании, и блокируют их При этом сродство блокированных участков белка друг к другу уменьшается, что препятствует слипанию молекул ГАФД и предотвращает их агрегацию Для эффективного подавления агрегации цепь должна содержать относительно протяженные гидрофобные участки, для формирования которых при статистическом распределении звеньев сополимера требуется достаточно большое количество незаряженных звеньев

Для подтверждения этого предположения мы изучили термоагрегацию ГАФД в присутствии специально приготовленных поликатионов, несущих в цепях гидрофобные алкильные участки с различным числом метиленовых групп Использовали исчерпывающе алкилированные (¡3 > 95%) поли-Ы-алкил-4-винилпиридиниевые катионы ПАВП-т одинаковой степени полимеризации 1600, имеющие т метиленовых групп в К-алкильных заместителях (Рис 5), а также и,и-ионены, различающиеся количеством п метиленовых групп в алкильных развязках между зарядами в основной цепи (Рис 5) Увеличение гидрофобности алкилированных звеньев ПАВП-т при

возрастании т приводило к уменьшению термоагрегации, особенно заметной при увеличении числа мети леновых групп в заместителе от 3 до 5 (Рис. 12). Тот же эффект наблюдался при удлинении алкильных развязок между зарядами в я.л-иопенах. причем наиболее гидрофобный 10,10-ионен подавлял термоагрегацию ГАФД практически полностью (Рис. 13).

Рис. 12. Термоагрегация ГАФД в смеси с различными поли кат но на ми ПлВП-т.

10 мМ кал ий-фосфатный буфер, рН 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА. Концентрация ГЛФД 0,7 мкМ, концентрация заряженных. групп поликатионов 5 мМ, температура 60"С,

я.^ I ЦЧ * '-^ыд------"

^ / / /

Рис. 13. Термоагрегация ГАФД в смесям с различными н.н-ионекамн.

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 9,0, соде рвавший 0,5 мМ ЭДТА, Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, концентрация заряженных групп поли кати о кок 30 мМ, температура 60" С -

Таким образом, гидрофобные участки цепей полиэлектролитов могут оказывать определяющее воздействие на термоагрегащоо белка, блокируя белок-белковые гидрофобные взаимодействия. По всей вероятности, этот эффект играет главенствующую роль, нивелируя отрицательное влияние, которое должно было бы оказывать снижение плотности заряда поликатионов.

Обнаруженный нами эффект может составить основу для разработки стабилизаторов белковых растворов. Так, химической модификацией заряженных цепей полисахаридов алкилыщмн фрагментами можно создавать гидрофобные области, которые должны значительно усиливать способность подавлять белковую агрегацию, что открывает новые пути создания различных биосовместимых и б иоде градируемых стабилизаторов белковых смесей.

Влияние ионной силы раствора на термоагрегацию ГАФД

Электростатический характер связывания полиэлектролитов с ГАФД предопределяет чувствительность образующихся белок-полиэлектролитных комплексов к ионной силе раствора Введение в системы низкомолекулярного электролита ослабляло эффект подавления агрегации белка, а при достаточно высокой концентрации соли отменяло его Так, термоагрегация ГАФД, подавленная одним из наиболее эффективных поликатионных стабилизаторов ПЭВП-35 (Рис 14, кривая 2), возобновлялась вновь при добавлении в систему хлористого натрия и протекала с всевозрастающей интенсивностью по мере увеличения ионной силы (Рис 14, кривые 3-5) Разрушение белок-полимерного комплекса под действием соли предполагает выход свободного белка в раствор, где при 60°С он немедленно агрегирует

- Рис. 14 Термоагрегация свободной ГАФД (1) и ГАФД в смесях с ПЭВП-

5 35 при добавлении различных концентраций КаС1. О М (2), 0,1 М ± (3), 0,2 М (4) и 0,3 М (5)

1 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ, концентрация заряженных групп

- поликатиона 1 мМ, температура 60°С 10

Таким образом, электростатическое взаимодействие полиэлектролита с олигомерным белком может оказывать существенное влияние на термоагрегацию белка, которое контролируется соотношением заряженных групп полиэлектролита и белка в смеси, длиной и плотностью заряда цепей полииона, а также наличием в цепи полиэлектролита гидрофобных участков, способных связываться с гидрофобными пятнами, появляющимися на белке в результате его тепловой обработки

Термоинактивация глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы

Комплексообразование белка с заряженными полимерами подавляет его агрегацию, но не препятствует термоденатурации фермента, которая может даже усиливаться в присутствии полиэлектролитов Это следует из результатов измерения ферментативной активности свободной ГАФД и ГАФД в смесях с различными ПЭВП-Д после 1 минуты инкубации при различных температурах (Рис 15) Присутствие исчерпывающе алкилированного ПЭВП^оо не сказывалось на каталитическую активность до

45°С, после чего способствовало инактивации фермента Частично алкилированные ПЭВП-/? той же степени полимеризации 1600 оказывали влияние на активность ГАФД даже при невысоких температурах, причем это воздействие усиливалось с уменьшением р (Рис 15)

Рис 15. Термоинактивация свободной ГАФД и ГАФД в смеси с полностью алкилированным ПЭВПшо, ПЭВП-35 и ПЭВП-20 после 1 минуты инкубации при различных температурах.

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ Концентрация заряженных групп 50 ¡5 м поликатиона I мМ Температура, °С

Эти данные указывают на то, что гидрофобные участки полиэлектролита могут не только блокировать взаимодействие гидрофобных пятен денатурированного белка друг с другом, препятствуя термоагрегации, но и вызывать изменения структуры фермента, которые приводят к его инактивации Гидрофобные взаимодействия способствуют разворачиванию белковых глобул, которое может протекать даже при комнатной температуре Эти конформационные изменения влекут за собой нарушения структуры активного центра фермента, приводящие к снижению или даже полной потере каталитической функции

О структурных изменениях белка при его связывании с гидрофобным полиэлектролитом свидетельствуют результаты исследования белок-полиэлектролитных комплексов методом дифференциальной сканирующей калориметрии На Рис 16 в качестве примера приведены данные, полученные для свободного фермента (кривая 1) и смеси ГАФД с ПЭВП-35 (кривая 2), из которых следует, что в присутствии катионного сополимера плавление белка начинается на 7°С раньше Характерно, что температурные сдвиги в смесях ГАФД с различными ПЭВП-/? находятся в хорошем соответствии со способностью тех же сополимеров инактивироватъ фермент Мы показали, что введение в такие системы полиэлектролита-конкурента способно высвобождать белок из комплекса и практически полностью восстанавливать его термостабильность (кривая 3)

Рис 16. Термоденатурация свободной ГАФД (1), ГАФД в комплексе с ПЭВП-35 (2) и ГАФД, освобождённой из комплекса преципитацией ПЭВП-35 с ПАКгзй) (3)

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 7 мкМ, концентрация полимеров 10

30

«

50 80 70

Температура °С

80

и мМ

Реактивация фермента, участвующего в комппексообразовании

Воспользовавшись описанным выше приемом разрушения белок-полиэлетролитного комплекса путем добавления полимера-конкурента, нам удалось показать, что высвобождение фермента сопровождается его частичной реактивацией Присутствие относительно гидрофобного полианиона ПСС приводит к практически полной потере каталитической активности ГАФД за одну минуту инкубации смеси при 55°С (начальный участок кривой 3, Рис 17) Гидрофильная полиакриловая кислота оказывает менее выраженное инактивирующее действие, хотя и в этом случае за 3 минуты инкубации активность фермента падает на 70% (начальный участок кривой 2) Смеси ГАФД/полианион инкубировали 3 минуты при 55°С, а затем к ним добавляли эквимолярное по звеньям количество высокомолекулярного поликатиона ПЭВПшо (отмечено стрелкой на Рис 17) и инкубировали при комнатной температуре Аналогичным образом термоинактивировали свободную ГАФД (Рис 17, кривая 1), добавляли ПЭВП,боо и реактивировали при комнатной температуре Как упоминалась выше, в данных условиях (рН 7,5) ГАФД не взаимодействует с поликатаонами Реактивация фермента в смеси ПЭВП]боо совпадала с реактивацией свободного фермента и составляла не более 3 % (Рис 17, кривая 1) В обеих системах, содержащих полианионы, наблюдалась реактивация фермента (кривые 2, 3), которая в случае ПСС достигала 40% при инкубации смеси в течение 1 часа (кривая 3)

Итак, разрушением белок-полиэлектролитного комплекса, которое осуществляется при добавлении полиэлектролита-конкурента, можно реактивировать фермент Обнаруженное восстановление каталитической активности и предотвращение агрегации фермента важно при моделировании искусственных шаперонов Гомотетрамерный фермент ГАФД был успешно использован в качестве модели для изучения сворачивания белков и механизма ответа на тепловой шок (Ро1уакоуа е1 а1, 2005) Синтетические полиэлектролиты с высокой степенью полимеризации могут быть использованы для выполнения таких функций

Время мин

Рис 17. Изменение активности свободной ГАФД (1) и ГАФД в комплексах с ПМАК2360 (2) и ПСС340 (3) до и после освобождения фермента из комплексов преципитацией

полианионов с ПЭВП.

10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, содержавший 0,5 мМ ЭДТА Концентрация ГАФД 0,7 мкМ Концентрация ПМАК и ПСС 10 мМ и 0,1 мМ, соответственно, концентрация поликатиона ПЭВП эквивалентна концентрациям полианионов

Термоинактивацию проводили при 55°С, реактивацию после освобождения ГАФД из комплексов - при комнатной температуре

как стабилизация неполностью свернутых интермедиатов, предотвращение их агрегации и переведение в нативную форму

ВЫВОДЫ

1 Показано, что удельная активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в мозге животных при различных способах моделирования болезни Альцгеймера уменьшается При этом содержание белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в нерастворимых фракциях мозга трансгенных мышей ТС2576 увеличивается

2 Выявлена кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на [3-амилоид, с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и подобраны условия избирательной идентификации двух белков

3 Показано, что высокомолекулярные синтетические поликатионы и полианионы подавляют агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

4 Показано, что после термоинактивации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в составе белок-полиэлектролитного комплекса и последующего вытеснения белка из комплекса можно провести реактивацию фермента с восстановлением до 40 % удельной активности

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Журнальные статьи

1 Shalova I.N., Naletova IN, Saso L, Muronetz VI, and Izumrudov V A (2007) Interaction of polyelectrolytes with proteins, 3a Influence of complexmg polycations on the thermoaggregation of oligomeric enzyme Macromol Biosci 7, 929 - 939

2 Schmalhausen E V, Zhlobek E В , Shalova I.N., Firuzi О , Saso L, and Muronetz VI (2007) Antioxidant and prooxidant effects of quercetm on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Food and Chemical Toxicology 45,1988-1993

3 Shalova I.N., Cechalova К, Rehakova Z , Dimitrova P , Ogmbene E, Capnoli A, Schmalhausen E V, Muronetz VI, and Saso L (2007) Decrease of dehydrogenase activity of cerebral glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase m different animal models of Alzheimer's disease Biochim Biophys Acta 1770, 826 - 832

4 Налётова И H , Шмальгаузен Е В , Шалова И.Н., Плетень А П, Цирюльников К Н, Эртль Т, Муронец В И (2006) Стимулирование агрегации белков нефункционирующим шаперонином GroEL Биомедицинская химия 52, 518 - 524

5 Shalova I.N., Asryants RA, Sholukh MV, Saso L, Kurganov BI, Muronetz VI, and Izumrudov V A (2005) Interaction of Polyanions with Basic Proteins, Influence of Complexmg Polyanions on the Thermoaggregation of Oligomenc Enzymes Macromol Biosci 5, 1184 — 1192

Статьи в сборниках

1 Markossian К A, Kurganov ВI, Levitsky DI, Khanova H A, Chebotareva N A, Samoilov A M , Eronma T В , Fedurkma N V , Mitskevich L G, Merem'yanm A V, Kleymenov S Yu , Makeeva V F, Muronetz VI, Naletova IN , Shalova I.N., Asryants R A, Shmalhausen E V, Saso L, Panyukov Yu V, Dobrov E N, Yudm IК, Timofeeva А С , Muranov К О and Ostrovsky M A (2006) Mechanism of the chaperone-like activity Protein Folding New Research Nova Science Publishers, USA, New York, p 89 -171

2 Muronetz VI, Schmalhausen E V, Poliakova О V, Naletova IN, Shalova I.N., and Saso L (2005) Amyloidoses and oxidative stress Biotechnology and health, Armenia, Erevan, p 55-62

Тезисы конференций

1 Shalova I.N. and Izumrudov V A (2007) Synthetic polyelectrolytes as a tool for creation of artificial chaperons EMBO-FEBS Workshop on "Chaperones m Normal and Aberrant Protein Folding, Agmg and Cancer", Portugal, Tomar, June 9 - 14, p 113

2 Muronetz VI, Pleten A P , Schmalhausen E V , Asryants R A, Naletova IN, Shalova I.N., and Saso L (2007) Oxidized proteins block chaperones irreversibly (Role m the induction of amyloidoses) VIII International Conference Alzheimer's and Parkinson's Diseases Progress and New Perspectives, Austria, Salzburg, March 14 - 18, p 62

3 Шалова КН., Асриянц РА, Муронед ВИ, Изумрудов В А (2007) Создание искусственных шаперонов на основе синтетических полиэлектролитов IV Всероссийская Каргинская конференция «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 29 января - 2 февраля, том 2, с 444

4 Muronetz VI, Pleten' PA, Schmalhausen EV, Asryants RA, Naletova IN, Shalova I.N, Saso L, and Haertle T (2006) Oxidative stress and amyloidosis II International conference "Chemistry, structure and function of biomolecules" Belorussia, Minsk, October 3 - 5, p 99

5 Muronetz VI, Schmalhausen E.V, Poliakova О V, Naletova IN, Shalova I.N., and Saso L (2005) Amyloidoses and oxidative stress International alumni seminar on "Biotechnology and health", Armenia, Erevan, October 18 -21,p 131-132

6 Muronetz VI, Polyakova О V , Naletova IN, Shalova I.N., Asryants R A, Pleten' AP, Saso L, Izumrudov VA, and Schmalhausen EV (2005) Mechanisms of protein denaturation and design of new inhibitors of protein aggregation for the treatment of condensation diseases International Conference Biocatalysis - 2005 Fundamentals and Application Dedicated to 250th Anniversary of Moscow State University St Peterburg - Kizhiy -Valaam, Russian Federation, 19-23 June, p 58

7 Shalova I.N., Gurecka К, and Saso L (2005) Changes of activity of cerebral glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase m different models of Alzheimer's disease EMBO - FEBS WORKHOP on Biology of Molecular Chaperones Heat Shock Proteins m Molecular Medicine Misfolding Disease and Cancer, Poland, Zakopane, 28 May - 2 June, p 120

8 Шалова И.Н., Асриянц P A, Муронец В И (2005) Влияние синтетических полианионов на термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005», Секция Биоинженерии и Биоинформатики, Подсекция Биоинженерии, Москва, 12-15 апреля, с 49-50

9 Налетова И Н , Шалова И.Н., Сасо Л, Шмальгаузен Е В, Муронец В И (2005) Роль окисления глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в индукции апоптоза и формировании амилоидных структур Юбилейная конференция, посвященная 70-летию основоположника российской школы биоэнергетики академика В П Скулачева, «Российская биоэнергетика от молекулы к клетке», Москва, 21-23 февраля, с 53

10 Шалова И.Н., Асриянц Р А, Муронец В И (2004) Влияние синтетических полианионов на термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдещдрогеназы XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2004», Секция Биологии, Подсекция Биохимии, Москва, 12-15 апреля, с 176 - 177

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДК 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 19 09 2007 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 450 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шалова, Ирина Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

О-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура, свойства и функции.

Структура глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Механизм дегидрогеназной реакции.

Многофункциональность глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы.

Участие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в развитии нейродегенеративных заболеваний.

Синтетические полиэлектролиты и их поликомплексы.

Основные свойства полиэлектролитных комплексов.

Основные свойства белок-полиэлектролитных комплексов.

Применение синтетических полиэлектролитов в биотехнологии.

Болезнь Альцгеймера: общие представления и основные подходы к лечению.

Общие представления о болезни Альцгеймера.

Стадии развития болезни Альцгеймера и основные свойства пептида (3амилоида.

Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Методы.

Выделение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.

Приготовление экстрактов ткани мозга.

Определение концентрации реагентов.

Определение концентрации белков.

Определение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Инкубация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с препаратами, индуцирующими болезнь Алъцгеймера.

Модификация глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы глутаровым альдегидом.

Приготовление растворов полиэлектролитов.

Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в смесях с полиэлектролитами.

Реактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при разрушении белок-полиэлектролитного комплекса увеличением ионной силы.

Реактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы при разрушении белок-полиэлектролитного комплекса полиэлектролитом-конкурентом

Кинетика агрегации белка.

Метод динамического светорассеяния.

Метод дифференциальной сканирующей калориметрии.

Электрофорез белков по методу Лэммли.

Метод иммуноблоттинга.:.

Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изменение удельной активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в мозге животных при моделировании болезни

Альцгеймера.

Кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на ¡3-амилоид, с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой.

Определение удельной активности и содержания глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы в мозге животных.

Влияние синтетических полиэлектролитов на термоагрегацию и термоинактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Факторы, влияющие на термоагрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы в смеси с полиэлектролитами.

Влияние соотношения заряженных групп белка и полиэлектролита на термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Влияние степени полимеризации полиэлектролита на термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Влияние плотности заряда цепи полиэлектролита на термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Влияние гидрофобности цепи полиэлектролита на термоагрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Влияние ионной силы раствора на термоагрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы.

Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Реактивация фермента, участвующего в комплексообразовании.

ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шалова, Ирина Николаевна

1. Показано, что удельная активность глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназы в мозге животных при различных способах

моделирования болезни Альцгеймера уменьшается. При этом

содержание белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в

нерастворимых фракциях мозга трансгенных мышей TG2576

увеличивается. 2. Выявлена кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на Р амилоид, с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и подобраны

условия избирательной идентификации двух белков. 3. Показано, что высокомолекулярные синтетические поликатионы и

полианионы подавляют агрегацию глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназы. 4. Показано, что после термоинактивации глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназы в составе белок-полиэлектролитного комплекса и

последующего вытеснения белка из комплекса можно провести

реактивацию фермента с восстановлением до 40 % удельной активности.