Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицераткиназы из E. coli

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицераткиназы из E. coli"

щ п i а ; «i »

московский государственный университет

им. м.В.Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

ХОРОШШГОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

УДК Б77.1Б2.121

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛЩЕРАЛЬДЕГВД-3-Ш)ФАТДЕГВДР0Ш1АЗЫ . И 3-ФОСФОГЛИЦЕРАТКИНАШ ИЗ E.ooli. ОЗ. 00. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ■ диссертации на соискание ученой степени '. кандидата биологических наук

Москва - 1Э92

Работа выполнена в лаборатории Физико-химической биологии им. государственного университета

Научный руководитель: Официальные ошюненты:

биохимии животной клетки института А.Н.Белозерского Московского

доктор биологических наук, В.И.Муронец

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Чернов доктор химических наук, профессор Л.Ы.Гинодман

Ведущее учреждение - Институт Биохимии им. А.Н.Баха РАН."

Защита состоится "_"_1992 г. в "_" часов на заседании

Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском, государственном университете имени Н.В.Ломоносова по адресу: г. Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

4

Автореферат разослан ___ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Ю.Н.Лейкин

Актуальность проблемы. Отдельные наблюдения о существовании омплоксов гликолитических ферментов, состоящих из двух и большо-о числа белков, описывались в литературе достаточно часто, одна-

0 до начала 80-х годов-им не уделяли особого внимания, так как в существовало какой-либо концепции о функциональной роли таких .ссоциатов. Ситуация изменилась благодаря исследованиям, начатым

1 лаборатории С.Бернхарда в 1Э81-1982 годах. В первой работе на римере глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицератки-;азы была продемонстрирована возможность прямой передачи промзйу-■очного продукта между активными центрами двух функционалыю-юпряженных ферментов. В 'лоследующих работах еще более дзмонстра-■ивные -результаты были получены при исследовании пар НАД-¡ависимых дегидрогеназ, оказавшихся способными к прямой передаче ;офермента из одного активного центра в другой.При этом прямая [ередача НАДН реализовалась только между дегидрогеназами, обладаниями разной стереоспецифичностькгв отношешш кофактора (типы • А' I В). Очевидное функциональноэ значение такого рода эффектов притекло внимание' многих лабораторий к проблема образования бифер-".ентных комплексов и послужило основой для создания ряда теорий, 'читываххшх роль ассоциации фэрментов в . регуляции ■ метаболизма. 1оследовавшая затем экспериментальная проверка результатов С.Бер-¡харда и сотрудников, проведенная в других лабораториях, выявила тд методических ошибок,что привело не только к отрицанию возмоя-юсти прямого переноса метаболитов между" активными централи фер-«ентов в комплексах, но и к возникновению недоверия в' отношении самого существования таких комплексов.

В нашей лаборатории биферментыми когтлексами (глицеральдегид-3-фосфагдегидрогеназа -3-фзсфэглицераткяназа' и -глицеральдегад-3-

фосфатдегидрогеназа-лактатдегидрогеназа) занимались с начала 80-х годов, удаляя основное внимание доказательству возможности физической ассоциации между этими ферментами. Однако вопрос о функциональном значении такой ассоциации оставался открытым, так как из-за невысокой прочности комплексов не удавалось осуществить эксперименты по выявлению каталитических преимуществ объединения двух ферментов.

Одной из задач настоящего исследования был выбор обьекта,который мог бы служить модельной системой для выяснения вопроса о том, приводит ли физическая ассоциация между глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и З-фосфох'лицераткиназой к изменению кинетических параметров катализируемой ими сопряженной реакции. Решение данного вопроса представлялось важным для понимания функциональной роли белок-белковых взаимодействий между цитоплазматическюш ферментами, прочность которых может зависеть от сложной совокупности факторов, остающихся пока неизвестными. Базируясь на информации о способности гляколитических ферментов ■ E.ooli ассоциировать в достаточно прочный комплекс, ш остановили свой выбор на изучении физического и функционального взаимодействия между гли-церальдегид-З-фосфатдегидрогеназой и 3-фосфоглицераткиназой, выделенными из этого источника.

Целью данной работы, таким образом, было выделение гомогенных препаратов глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы и • 3-фосфоглицераткиназы из E.coli, -изучение особенностей ассоциации этих ферментов и выявление каталитических преимуществ, которые возникают при их функционировании в составе биферментого комплекса.

Научная новизна работы.Показана физическая ассоциация глицер-альде1вд-3-фосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицераткиназы из E.ooii. Образование комплекса глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы с 3-фосфоглицераткиназой продемонстрировано с помощью методов иммобилизации, ультрацентрифугирования, а также метода электронной микроскопии. Показана способность биферментного комплекса, иммобилизованного на носителе через' одну субьедшшцу глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы осуществлять сопряженную реакцию, не диссоциируя в процессе функционирования.

Установление видоспещфческого характера функционирования этих ферментов помогло подобрать систему контроля для кинетических экспериментов, в которых были выявлены функциональные преимущества биферментного комплекса по сравнению с системой невзаимодействующих ферментов. Показанное в работе увеличение стационарной скорости сопряженной реакции указывает либо на туннелировшше интермедиата, либо на изменение- кйнетических параметров ферментов' в комплексе. О помощью кинетических экспериментов определена константа диссоциации комплекса в растворе.

Показано, что глицеральдегвд-З-фзсфатдегидрогеназа из E.ooii проявляет полуцентровую реактивность' по отношению к йодацетату.

Практическое значение работы. Полученные результаты углубляют представления о комплексах гликолитических ферментов и их функционировании. Теоретические, практические и методологические вопросы, рассматриваемые в работе, могут быть использованы при чтении спецкурсов по энзимологии и в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов.

Апробация работы. Результаты работи доложены на совместном . заседании лаборатории биохимии животной клетки Института

физико-химической биологии им.АЛ.Белозерского и кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 7-ом Всесоюзном симпозиуме по Инженерной энзимологии (Шереметьево", 1991), на '20-ой .конференции Конфедераций Европейских Биохимических Обществ (Москва,1990). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы( источника). Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Методы исследования. Иммобилизации глицеральдегид-з-

фосфатдегидрогеназы на Вгси-шчтивировшшой сефчрозе (степень активации сефарозц 3 мг Вгси на I Ш1 уплотненного геля) проводили в I М калий-фосфатном буфере, содержащем '2 мМ ЭДТА, рН 8.0 в. Течение 2 часов при комнатной температуре. Количество иммобилизованного бежа определяли но модифицированному методу Бредфорд [Аэгуа^г е1; а1., 1987 3.

Электрофорез в пластинках проводили по методу [ЬаетлИ, 1970) Тонкослойную хроматографию на полиэтиленимин-целлюлозе (ПЭОД) использовали для разделения АДФ - АТФ и ГДФ - ГТФ. Пластинки ПЭЙЦ с нанесенными образцами помещали в хроматографическую камеру, содержащую 0.2 М фосфат натрия в качества буфера эльции. Хроматографию прекращали после того, как фронт растворителя поднимался на 9 см . Пластинки высушивали в горизонтальном положении током воздуха при 25°С. Отмечали зоны поглощения нуклеотидов (но поглощению в ультрафиолете). Затем пластинки разрезали на полосы ишри-

юй I см. Каждую полосу разрезали на 10 частей, которые помещали ю флаконы с диоксаношм сция тиля тором для радиоактивного счета. 1о результата.»,» радиоактивного счета определяли-на пластинке зоны задиоактивности, соответствовавшие положению нуклеотидов.

Определение содержания радиоактивного фосфата проводили по методу Черепкова (Cherenkov,1968).

Эксперименты по электронной микроскопии комплексов глицераль-1егид-3-фосфатдегидрогеназы с З-фосфоглицераткиназой проводшш -совместно с доктором ф.-м.н. В.Л.Цупруном (Ин-т кристаллографии Ш России). Образцы обрабатывали 256-ной фосфовольфрамозой к-той ми 1Ж-ным уранилацетатом и исследовали с помощью электронного »шкроскопа Phillips EI-40 (Голландия) при увеличении около 50000

Значения констант диссоциации для ряда серий экспоримонтпль-аых данных рассчитывали с помощью компьютерной программы DNRP 53 [Duggleby, 1984) непосредственно йз полученных изотерл адсорбции.' Связывание описывали уравнением

Y=A*X/(B-i-K), [\це Y- степень насыщения участков связывания,

х- концентрация несвязанного лиганда - •.

А,в -параметры

Эксперименты по кинетике проводили на приборе- Hitaohi и Axainoo 2000 (на приставке Stop-Flow).

результаты и ъи обсуждение

¡.Выделение глщеравдегид-З-фосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицераткиназы из Е.ооИ.

Нами был разработан модифицированный метод' выделения этих ферментов.Его преимущества по сравнению с описанными ранее заключаются в формировании сферопластов и их разрушении (а не разрушении целых клеток).использовании более современных материалов для хроматографии, изменении рН буфера выделения и тщательном контроле его во время выделения (незначительные отклонения рН .около 0.1, приводят к ухудшению разделения глицеральдегвд-3-фосфатдегицрогеназы и фосфоглицераткиназы). Предложенная нами новая методика выделения глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы и З-фосфоглидераткиназы из Е.ооИ. включанцая высаливание сульфатом аммония гельфильтрацшо (Тоуо-реаг1 . ОТ-55). ионообменную хроматографию на ВЕАЕ-Тоуо-реаг1 позволяет получить достаточно очищенные ферменты, гомогенные по данным эге -электрофореза обладающие активностью 160-300 мкмоль мин/мг белка глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа и 400-600 мкмоль мин/мг белка 3-фосфоглицераткиназа.

2.Использование модификации йодацетатом для изучения свойств глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы из Е.ооИ.

Для характеристики свойств полученного нами препарата глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы мы исследовали его взаимодействие с йодацетатом, специфически модифицирующим цистеинойые остатки активных центров тетрамера. На рисунке I изображена зависимость активности фермента от количества йодацетата, внесенного в пробу. Каждой точке кривой соответствует

конечная активность фермента после очередной добавки реагента.

Рис Л. Зависимость активности- глицэральдегид-З-фосфатдегидрогеназы от количества йодацетата,внесенного в пробу. 50 мМ глицин. 100 мМ натрий фосфат (рН 8.9), . .

Как видно из рисунка, включение одного эквивалента йодацетата приводит к 50 % снижению активности фермента, через 6 минут инкубации, хотя при этом происходит модификация • лишь одной из четырех SH- групп,имеющихся в активном центре глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы. Отсюда следует,что инактивация одной субьедишшы тетрамерной. молекулы глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы ведет к потере активности функционального димера этого фермента.

Включение второго эквивалента йодацетата происходит' так же быстро, как и первого (8 минут), но не вызывает полной инактивации глщеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы, а лишь ведет к падению оставшейся активности в два раза. Для полной инактивации глйцеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы необходимо включение 4.0 Иолей йодацетата на I Моль фермента. Но второй и третьий

эквиваленты модификатора включается медленнее, чем два перрые(16 и 22 минуты соответственно). Такое поведение глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназй при модификации говорит с шлуцентровой реактивности этого фермента.

2. Взаимодействие иммобилизованной глицаральдегид-З-фосфатдегидрогеназы с растворимой 3-фосфоглицераткиназой.

В первой серии экспериментов нами была сделана попытка заре-гестрировать образование комплекса иммобилизованной глицеральди-гид-з-фосфатдагидрогеназы с растворимой 3-фосфоглицераткиназой с помощью метода , предложенного в работе Бикманса и КанарекЕ [Beekmana, Kanarek, 1981].

В микроколонку диаметром I см вносили 0.6 мл i-оля сефарозы .содержащего 20 мг глицеральдегид-З-фосфатдегидрогоназы из E.coli (10 мМ натрий-фосфатный буфер,pH 7.6),затем добавляли 0.I мл 3-фосфоглицераткиназы из E.ooli в атом же буфере (концентрация белка 4 мг/мл). Смеоь аккуратно перемешивали и инкубировали 10 минуэ при комнатной температуре.

Параллельно ферменты инкубировали с субстратами прямо! дегидрогеназиой реакции (I мМ НАД, I мМ ФШфосфоглицершювиг альдегид)). Мы предполагали, что образование

I,3-дкфосфоглицерата, могло бы способствовать увеличении прочности биферкентного комплекса, как ато наблвдалось в случае ассоциации дрожжевых глицеральдегнд- З-фоо^атдзгвдрогеназы i 3-фосфоглицераткиназы [Ашмарииа.1983]

После инкубации колонку промывали тем же буфером до исчезновения белка'и киназной акишности в элвате.'

Измерение концентрации белка, связанного с сефарозой показало, что З-фосфоглицераткиназа связывается с иммобилизованной глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназой в молярном соотношении 2.8 моля на моль тетрамерной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы без субстратов и 3.1 моль в присутствии субстратов дегидрогеназной реакции. Полученные результаты показывают, ■ что комплекс ферментов достаточно прочен, так как при аналогичной постановке опыта комплекс глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы и

Э-фюсфоглицераткиназы из мышц кролика не образовывался вообще а комплекс ферментов из' дрожжей образовывался только в' присутствии I,3-дифосфоглицерата [Ашмарина,19831. В наших же экспериментах присутствие субстратов дегидрогеназной реакции ( НАД, ФГА) практически не влияло на образование комплекса.

4.Связывание иммобилизованной глицэральдегид-'

з-фосфатдегидрогеназы с фосфоглицераткиназой в равновесных условиях.

В этой серии экспериментов регистрацию связывания иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с растворимой S-фосфоглицераткиназой проводили по уменьшению количества белка и жтивности растворимой киназы иосле осаждения гранул сефарозы. 1ри этом использовали две пары ферментов: иммобилизованная гли-1еральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из В.coli - растворимая 3-рсфоглицераткиназа из E.coli и иммобилизованная глицеральдегид-i-фюсфатдегидрогеназа из в.colt - З-фосфоглицераткиназа из мышц :ролика.

[зотерма адсорбции представлена на рисунке (2)

Из рисунка видно, что в отсутствие субстратов глицеральде-гид-з-фосфатдегидрогеназа и 3-фосфоглицераткиназа связываются в молярном отношении 1.77 - 0.61 моль 'З-фбсфоглицерат-киназы на моль глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы, с кажущейся Кд 1.03 - 0.68 мкМ. Связываание иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с 3-фосфоглицераткиназой из мышц кролика не происходит. Этот факт говорит о видовой специфичности фермент-ферментного взаимодействия, позволившей нам в дальнейшем разработать удобный методический подход при исследовании кинетики сопря-

женной реакции.

мкмоль 3-фосфоглицераткиназы

Рис.2. Взаимодействие иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из В.coli с растворимой фосфоглицераткиназой из Б.coli (1) и мышц кролика (2). 10 мМ натрий фосфатный буфер, pH 7.6, 0.16 М NaCl, 2 мМ ДТТ.

но Мы

Кривая, полученная для той же системы ферментов из E.coli, в присутствии ФГА почти полностью совпадает с кривой на Рис.2 также исследовали влияние АТФ и НАД на прочность образования

комплекса. Кажущиеся Кд комплекса составили 1.12± 0.24 мкМ с НАД и I.0I±0.I4 мкМ с АТФ, стехиометрия , связывания 3-фосфоглицераткиназы на моль дегидрогеназы оказалась I.92*0.22 и 2.Б5±0.18 соответственно.

Сравнение этих величин с аналогичными характеристиками комплексов, образуемых глидеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой и 3-фосфоглидераткиназой из другого источника (мышц кролика) показывает, что бактериальные ферменты образуют между собой более прочный комплекс. Действительно, связывание глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и 3-фосфоглицераткиназы из мышц кролика удавалось наблюдать лишь в условиях относительно низкой ионной силы, тогда как титрование в условиях наших опытов проводилось в присутствии 0.15 M NaCl. Вторым отличием является отсутствие.какого-либо влияния специфических субстратов на прочность комплекса бактериальных ферментов и выраженное влияние этих лигандов в случае ферментов эукариотических организмов.

5.Изучение формирования комплекса глицеральдегид-3-фоефатдегидрогеназа - 3-фосфоглицераткиназа с помощью метода электронной микроскопии.

• В результае работы, проведенной совместно с доктором физико-математических наук В.Л.Цупруном (Институт Кристаллографии АН -России) были получены электронные микрофотографии комплекса гли-церальдигид-з-фосфатдегидрогеназа - 3-фосфоглицераткиназа. Результаты экспериментов представлены на микрофотографиях (Рис.3)

Несмотря на предпринимавшиеся попытки, нам не удалось определить точной .архитектуры комплекса из-за плохого контрастирования Ферментов из E.coli. Вне зависимости от подбираемых условий

очевидно, что 'нетрамерная" молекула глицеральдегид-з-

фосфоглицераткиназы. Вероятно, что участки глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы но которым идет комшюксооОразование удалеш от актишого центра этой молекулы так как известно, что попарно-сблшкенные активные центры субьедшшц глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы находятся в глубине молекулы. Плохое контрас-

ч

тирование связано не с условиями в которых происходит образование

комплекса (буфер, ионная сила), а со свойствами самих ферментов ,

так как известно, что одни и те ке ферменты, выделенные из разлила

чных источников, по-разному контрастируются.

Г ■ —■

.■ • •• ■ -I

Рис.3. Электронная микрофотография комплекса, в котором тетрамер-ная молекула глицершвдегид-З-фосфатдегидрогеназы связала одну . -молекулу мономерной 3-фосфоглицераткшазы.

6. Седиментационный анализ ферментов и их комплекса.

фосфатдегидрогеназы способна связать одну молекулу 3-

Для препаратов глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназн и ки-назы получены коэффициенты седиментации 7.72±0.40 Б и 3.27*0.22 соответственно.

На седиментограмме смеси ферментов присутствует участок, соответствующий компоненту, более тяжелому, чем тетрамерная молекула глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с коффициентом седиментации 8.3±0.34 S и молекулярной массой 199644 - 201222 Да. Этот факт позволяет предположить, что на тетрамер глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы приходится как минимум одна молекула 3-фосфоглицераткиназы.

С помощью данного метода невозможно определить стехиометрии связывания ферментов в комплексе так как осаждение более тяжелого компонента глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназы идет быстрее, это сдвигает равновесие в сторону диссоциации комплекса. Также этому способствует увеличение гидростатического давления.

1 7.Функционирование комплекса, иммобилизованного на носителе через глицеральдегид-З-фюсфатдегидрогеназу.

Целью данных экспериментов было выявление возможности работы ферментов в комплексе иммобилизованном на носителе через одну -субьединицу глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и изучение стабильности этого комплекса. Для этого мы прослеживали сопряженную реакцию, катализируемую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и З-фосфоглицераткиназой, связанными в комплексе. Комплекс получали но методу Бикменса и Канарека (см. выше).

Пробы обьемом 3 мл содержали 300 мкл комплекса с концентрацией глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 48 мкг на I мл осевшей сефарозы и 40.8 мкг З-фосфоглицераткиназы на I мл осевшей сефарозы, 0.5 мМ ФГА, 0.5 мМ НАД, 2.4 мМ АДФ или 2.4 мМ ГДФ, 50 мМ глицин, 100 мМ натрий фосфат (рН 8.9 ). Пробы инкубировали 30 мин при комнатной температуре.

После инкубации -пробы центрифугировали 3 мин 5000 g и определяли присутствие белка и активности 3-фосфоглицераткиназы в супернатанте. Используемыми нами методами определения белка его содержания в супернатанте установить не удалось,- общая активность 3-фосфоглицераткиназы была настолько незначительной, что позволяет предположить значительную стабильность иммобилизованного таким образом комплекса в процессе его функционирования.

Активность ферментов в сопряженной системе прослеживали по накоплению АТФ и ГТФ в ходе реакции. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре из проб отбирали по 6 мкл реакционной смеси и наносили их на пластинку ПЭИЦ. В качестве стандартов наносили но 0.2'мкл растворов АТФ,' АДФ, ГТФ, ГДФ.

* *

—>-•_>_>_■_I_

АДФ комплекс ГДФ АТФ ГТв с

АДФ ГДФ

Ии.4. Хроматографическое разделение нуклеотидов. Пятна идентифи-цир^ьались с помощью свидетелей но поглощению в ультрафиолете.

Результаты экспериментов представлены на рисунке 4, из кото-рох'о видно, что комплекс ферментов функционирует в иммобилизованном состоянии, при этом 3-фосфоглицераткиназа может использовать как АДФ так и ГДФ. Подтверждение этих выьодов' мы получили и в экспериментах, где накопление АТФ и ГТФ прослеживали по включению , радиоактивного фосфата. Для этого в инкубационную смесь вносили Р32. Результаты представлены на рисунке б.

I 2 3 4 5 6 ои

Рис.5. Содержание радиоактивного материала в пробах, содержащих различные нуклеотиды либо их смесь. В контрольной пробе пятна,по-глощанцие в ультрафиолете не содержат радиоактивности.

8.Функциональное взаимодействие глицеральдегид-з-

фисфатдегидрогеназы с 3- фоглицераткиназой в составе растворимого комплекса..

В этой серии экспериментов по изучению быстрой кинетики опиты проводились на спектрофотометре ¿mineo DW-2000 на приставке -

Б1;ор-:Г1о?».

Мы хотели выявить возможную зависимость скорости сопряженной реакции, катализируемой 3-фосфоглицераткиназой (глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназа- сопрягающий фермент) от концентрации глицер-альдегид-3-фосфатдегидрогеназы при насыщающих концентрациях субстратов. Мы использовали концентрации ферментов, достаточные чтобы быть уверенными в образовании комплекса, то есть большие,чем кажущаяся константа диссоциации комплекса этих ферментов.

3-фосфоглицераткиназной реакции от концентрации дегидрогеназы. 80 ММ трис-HCI, pH 7.6, 0.25 мМ НАДН, 0.5 мМ НАД, 2.4 мМ АТФ, Г ММ ДТТ, 7 мМ MgSO^, 15 мМ 3-фосфоглицерат. 2 мкМ З-фисфоглицераткиназы из E.coli и различные концентрации глицера.пьдогид-3-фосфатдегидрогеназы из E.ooli (I) и из мышц кролика (2).3 - то же, что I, но в присутствии 0.3 М NaCl.Кривая 2 -«без NaCl,0-0.3 U NaCl.

Задача эксперимента заключалась в сравнении кинетики сопряженной реакции, катализируемой двумя парами ферментов:

I .гмцеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из E.ooli -3-фосфоглицераткиназа из E.ooli.

2.1'лицвральдигид-3-фосфатдагидрог.еназа из мышц кродика -З-фосфоглицераткиназа из E.coli. Концентрация 3-фосфоглицераткиназы была одинаковой в обоих случаях.

«

При насыщающих концентрациях Mg-АТФ и 3-фосфоглицерата била получена зависимость скорости киназной реакции от концентрации гли-церальдегид-з-фисфатдегидрогеназы.

Как видно из рисунка(6) , характер зависимости бил различным для двух пар ферментов. Для пары , E.ooli

пищеральдегид-з-фисфатдегидрогеназа -E.coli 3-фосфоглицераткина за (кривая 1 ) максимальная скорость в стиционарном состоянии достигается при более низких концентрациях фермента, чем для невзаимодействующей ¡три тех ко ферментов (кривая 2 ). Этот зффокт но может быть объяснен различным сродством хуцщеральдегид-з^сфатдегидрогеназа из E.coli и из мышц кролика к 1.з-дифосфл'лицерату, который является продуктом кнназной и субстратом дех'идрогеназной реакции. Мы экспериментально определяли кажуадюся Юл do I .З-дифисфох'дицерату ■ для обоих ферментов. Для глицеральдегид-з-^исфитдегидрогиназы из E.coli она patüia 19.0 мкМ и IG.7 мкМ . для

х^ицеральдех'вд-з-фисфатдех'идрох'еназн из l'itau кролика.

Отот результат привел нас к заключению, что некоторые кинетические преимущества возникают из-за специфического взаимодействия между ферментами из E.ooli.

I.'ii решим проверить, как поведут себя эти ферменты в условиях, когда образование комплекса практически невозможно. Для этого

/

и среду добавляли значительный избыток NaCl (0.3 М). Как видно из рисунка 2 (кривая 3) в этих условиях кинетическое поведение 3-фисфоглицераткиназы из в.coli и глидеральдегид-з-фисфитдегидрогеназы из того же источника, становится аналогичным поведению пары невзаимодействующих ферментов.

Другая серия экспериментов была выполнена также с использованием различных комбинаций ферментов, с глицеральдегид-з-фосфатдегидрох'еназа из E.coli в качестве сопрягающего фермента. Таким образом, сравнивалась кинетика реакций катализируемых 3-фосфоглицераткиназой из мышц кролика - глицеральдегид-з-фосфатдегидрогенааэйиз E.coli и З-фюсфоглицераткиназой из E.ooll - глицоральдегид-з-фосфатдегидрогеназойиз E.ooli.(Соотно-шение конодентраций активных центров составляло 1:1).

0 3 6 9 фгК.МКМ

Рис.7. Зависимость скорости сопряженной реакции от концентрации З-фосфоглицерата. Условия те же. что на рис.6. Кривая I- 8 мкМ 3-фосфиглнцераткшшзы из мышц кролика, 8 мкМ глицеральдегид-3-фоефатдегидрогеназы из E.ooll, кривая 2-8 мкМ 3-ф^.-фиглВД-р-лткиназы из E.coli, 8 мкМ .глицеральдегид-3-фисфцгдегидрогеназы из E.coli, кривая 3-8 мкМ 3-фио1»л'.'11щераткиназы из мышц кролика, 80 мкМ глицеральдегид-3-фч^итдегидрогеназы из E.coli.

■ На рисунке 7 представлены полученные экспериментальные дан ные, из которых видно, что в стационарном состоянии скорость реакции для взаимодействующих ферментов (кривая 2) значительно выше, чем для аналогичной пары невзаимодействующих ферментов (кривая I). Мы решили проверить, изменится ли поведение невзаимодействующих ферментов при увеличении концентрации сопрягающего фермента до соотношения 1:10. Как оказалось, увеличение концентрации в 10 раз (80 мкМ) позволяет достичь такой же скорости реакции, как у взаимодействующих ферментов,но при соотношении концентраций активных центров в последнем случае равном 1:1.

Надо отметить, что значение Кд, характеризующее бифьрментшй комплекс,, иммобилизованный на нерастворимом носителе, может отличаться от такового для растворимых ферментов. Возможно, нековале-нтное взаимодействие с матрицей придает стабильность 'комплексу, уменьшая Кд. Исходя из этих соображений, мы не предпринимали попытки оценить степень комплексообразования между растворимыми -глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназой к 3-фосфоглицераткиназой в наших экспериментальных условиях. Вполне вероятно, некоторая -часть молекул ферментов находится в несвязанном состоянии и катализирует сопряженную реакцию по механизму свободной диффузии, - но результаты кинетических исследований указывают на существование работащего биферментного комплекса. Большие различия в стационарной кинетике между ассоциирующими и неассоциирующими нарами -ферментов могут объясниться двумя различными молекулярными механизмами или их комбинацией. Либо это "туннелирование" интермедиа-та между киназой и дегидрогеназой, либо кинетические характеристики ферментов в комплексе и в свободном состоянии отличаются между собой, что ведет к более аффективной работе ферментов в коми-

линии.

Эксперименты с увеличивающимся обьемом системы.

Суть эксперимента состояла в том.что при постоянных концентрациях субстратов сопряженной решении уменьшалась концентрация ферментов глицеральдехвд-з-фосфатдегидрогеназн и _ 3-фосфоглицераткиназы, причем их соотношение не изменялось и составляло 1:1 по активным центрам (соответственно молярное отношениес глшць'ршшдегйд-З-фосфатдегидрогоназа - 3-фосфоглицераткиназа --4:1. За ходом реакции сладили по уменьшению оптической плотности при 340 им на спектрофотометре Hitachi.

Концентрации ферментов (по активным центрам) варьировали в . интервале от2.5 до 0.025 г,.лМ. В качестве контроля использовали систему невзаимодействующих ферментов:3-фосфоглицераткиназа из -E.coll - глицершшдепщ-З-фисфатдегидрогеназа из скелетных мышц кролика. Полученные данные представлены на рисунке 8. По оси абсцисс отложены логарифмы концентраций ферментов, по оси ординат -логар№1мы изменения оптической плотности за минуту, причем и в -том и в другом случае, для того, чтобы кривые выходили из начала координат, логарифмы первых значений вычитались из всех последующих.

Как видно из рисунка, в контрольной системе при "увеличении объема" системы .то есть при уменьшении концентрации ферментов в том же объеме,происходит линейное уменьшение скорости реакции (прямая I)

При низких концентрациях ферментов (до 0.25мкМ), поведение пары взаимодействующих ферментов аналогично поведению контрольной пары. При дальнейшем увеличении концентраций глицеральдегид-з-

фосфатдегидрогеназы и киназы из E.coli происходит отклонение от-линейной зависимости, причем система начинает работать более ьф-фективно. По всей вероятности это связано с тем, что достигается концентрация, необходимая для образования комплекса между ферментами. В данном случае происходит либо сближение активных цоьч^кт ферментов. что ведет к .туннелированию субстратов .между ними, либо происходит изменение конфирмации ферментов. Это может,в "свою очередь, привести к изменению каталитических свойств ферментов(уменьшение Км, увеличение Утах).При последующем увеличении концентраций глтцеральдегид-з-фосфатдегидрогоназы и киназы идет линейное увеличение скорости реакции, практически параллельное прямой, полученной для невзаимодействующих ферментов. Скорее всего, скачок на кривой связан со сменой функционирования системы, то есть переходом от свободной диффузии к направленному переносу субстратом сопряженной реакции.

'плотности за минуту при 340 им от концентрации формантов, находящихся в эквимолярлом■ соотношении по актиишм центрам. (я- вз о:г.мол е Г от ву юця е ферменты, e-невза-лмодействуоцяо ферментч )•

2 2

Методам теории контроля метаболизма СХолоденко, 19901 была определена Кд комплекса ферментов в растворе, которая оказалась 1.02^0.14 мкМ.

ВЫВОДЫ

,I. Разработана модифицированная методика выделения глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы и З-фосфоглидераткиназы из E.ooli, включающая стадию разрушения сфоропластов.

Получены гомогенные препараты

глицеральдегид-3-фисфатде1'ид{ю1'еназы с активностью 160-300 мкмоль/шш*мг белка и 3-фосфоглицераткинази с активностью 400-600 мкмоль/мин*мг белка.

2. Показано, что глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из E.ooli обладает нолуцентровой реактивностью но отношению к йодацетату.

3. Методом илектронной микроскопии, иммобшшзации и седиментациояного анализа показана физическая ассоциация мекду глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой и З-фосфоглицераткина^ой. С помощью кинетических подходов определена Кд биферментного комплекса, соответствующая 1-2 мкМ.

4. Взаимодействие Ферментов является видоспецифичным и не зависит от присутствия субстратов как киназной^ так и дегидрогеназной реакции.

5. Показано, что комплекс иммобилизованный на нерастворимом носителе через одну субьедшшцу тетрамерной молекулы гл.июральде1'ид-3-фосфатдегидрогеназы сохраняет стабильность в процессе катализи сопряявыной реакции.

6. Показано увеличение стационарной скорости сопряженной реакции, катализируемой глицеральде1'ид-3-фосфатдегидро1'еназой и 3-фосфоглицераткиназой, являющееся следствием взаимодействия этих ферментов.

Список работ,опубликованных по теме диссертации

1.N.K.Nagradova, N.A.Khoroshilova, V.I.Muronetz. A complex of GPDH and 3-Phosphoglycerate Kinase isolated from E.coli.Abstract of 20 FEBS Meeting, 1990,p.312

2.В.И.Муронец, Н.А.Хорошилова, Н.К.Наградова. Взаимодействие между глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и 3-фосфоглицераткиназой. Тезисы 7 Всесоюзного симпозиума но инженерной энзимологии, Шереметьево, !991, стр.40.

3.N.A.Khoroohilova, V.I.Huronetz,.N.K.Nagradova. Interaction between D-Qlyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase and V Phoaphoglycerate Kinase. Abatraot of 27 Annual Meeting ofPolieh Biochemistry Society, 19?1, p.318

4.N.A.KhoroBhilo7a, Y.I.Uuronetz,.N.K.Kagradova. Interaction between D-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase and 3-Phosphoglycerate Kinase and its Functional Consequences, FEBS -Letters, 1992, Vol.297, pp.247-249