Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с 3-фосфоглицераткиназой и лактатдегидрогеназой

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с 3-фосфоглицераткиназой и лактатдегидрогеназой"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО . ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Ц. В. Ломоносова

Кафедра биохимии Биологического факультета ЫГУ и

Отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А. а Белозерского

На правах рукописи СУХОДОЛЕЦ МАКСИМ ВИТАЛЬЕВИЧ

УЖ 577.I52.I2I

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛЩЕРАЛЬДЕГВД- 3-ФОСФАТДЕЩГОГЕНАЗЫ С 3- ТОСгоГЛКЦЕРАТКИНАЗОЯ И ЛШАТДЕГИДРОШАЗОЯ. (03.00. 04- Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степзни кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А. К Белозерского.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Й. К. Наградова, доктор биологических наук К И. Ыуронец.

Официальный оппоненты: доктор биологических, наук,

профессор Н.Н. Чернов, доктор химических наук, профессор X М. Гинодыан.

Ведущая организация: Институт биологической и

медицинской химии АШ России.

Залита состоится "_

1992 г. в часов

на васедании специализированного совета в Уэсковском государственном университете ем. ы.в. лзш-носова по адресу: 1/Ьсква, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ, аудитория_

Автореферат разослан "_**

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Ю.К Лейкин

■ ,. , ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ГДи /1 j

■ ртпцк:1 | Актуальность проблемы. Одним из существенных свойств белковых молекул является выработанная в ходе эволюции способность к специфическому взаимодействию с их естественным окружением. Взаимодействие между отдельными ферментами, образование комплексов между ниш усложняет метаболические механизмы, повышает их вариабельность и восприимчивость к внешним воздействиям. Изучение структурной организации гликолитических ферментов в скелетной мышце млекопитающих привело к обнаружению ряда ферментных комплексов, в том числе и с участием глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы■ (ГАФД). Однако, относительно взаимодействия ГАФД с одним из ближайших партнеров по гликолизу -3-фосфогдице'раткиназой - существовала' весьма противоречивая информация. Так,, венгерские авторы Вош и Бзтке [Vas & Batke, 1981], используя целый ряд физико-химических методов, не обнаружили образования комплекса между вышеназванными ферментами. В то же время, в работе Вебера и Бернхарда были приведены кинетические данные, которые авторы трактовали как свидетельство в аодьву прямой передачи интермедката суммарной реакции ГАСИ и З-фосфоглицераткиназы - 1,3-дифосфоглицерата EVeber S Bernhard, 19823. Существование прямой передачи интермэдиата между ГАФД и 3-фосфоглицераткиназой (в работе Вебера и Бернхарда были использованы ферменты, изолированные из скелетных мышц палтуса) должно предполагать возможность физической ассоциации между ферментами. Однако, в 1989 году Квассман и Шттерссон привели опровержение работы Вебера и Бернхарда, также с помощью кинетических методов [Kvassman & Pettersson, 1989].

Таким образом, кинетические методы не позволяют получить однозначную информацию, которая бы свидетельствовала о возможности физической ассоциации медцу ГАФД и 3-фосфоглицераткиназой, изолированными из скелетных мышц.

Сходная ситуация сложилась и при изучении взаимодействия ГАФД с лактатдегидрогеназой (ЛДГ). Кинетические данные о прямой • передаче НАДН между этими ферментами, приведенные Щриваставой и Бернхардом [Srivastava & Bernhard, 1985] также получили последующее опровержение CCzock & Gutfreund, 1989].

Таким образом, вопрос о возможности физической ассоциации

ГАФД с З-фосфоглицёраткиназой и лактатдегидрогеназой является в настоящее время открытый.

Изучение возможности ассоциации ГАФД с 3-фосфоглицератки-назой и ДЦГ представляется также актуальным и в связи с особнностями каталитического механизма ГАФД: в процессе сложного каталитического механизма фермент претерпевает конформа-ционные перестройки, причем различные конфорыационные состояния ГАФД охарактеризованы в ряде работ СSeyáoux et al. ,1975 и др.]. Роль же конформационных переходов ферментов в образовании фермент-ферментных комплексов в настоящее время изучена весьма неполно, и знание механизмов, регулирующих образование и распад функционирующих (осуществляющих сопряженный катализ) ферментных комплексов является в конечной инстанции весьма важной интегральной частью наших знаг.ий о механизме действия ферментов.

Цель работы, таким образом, состояла в изучении возможности физической ассоциаи. ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой и ЛДГ, а также выяснении poja: '■пильных конформационных состояний ферментов в образовании o^i комплексов.

Научная новизна. Показана физическая ассоциация ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой и ЛДГ (все ферменты из скелетных ышц кролика). Образование комплекса ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой продемонстрировано с помощью методов иммобилизации, сшшаодих агентов, а также метода электронной микроскопии; образование комплекса ГАФД с ЛДГ - с помощью метода иммобилизации и сшивающих агентов.

Шказано, что конформационные переходы ферментов, происходящие при связывании субстратов или продуктов катализируемых ими реакций, способны оказывать регулирующее воздействие на сродство друг к другу ферментов, .формирующих комплекс. Обсуждены возможные механизмы функционирования фермент-ферментного комплекса, осуществляющего протекание двух сопряженных ферментативных реакций в условиях, когда в процессе реакции одного каталитического оборота изменяется сродство друг к другу партнеров по комплексу.-

Метод электронной микроскопии применен для выявления архитектуры комплекса ГАФД - 3-фосфэглицераткиназа после стабилизации ГАФД в "благоприятной" для образования комплекса конформа-

ции; выявлена стехиометрия комплекса и взаимная ориентация партнеров по комплексу.

фактическое значение работы определяется тем, что ее результаты углубляет представления о механизмах протекания сопряженных реакций в ферментных комплексах и открывают новые возможности для целенаправленного воздействия на метаболические процессы, опосредованные образованием и распадом фермент-ферментных комплексов.

Теоретические, практические и методологические вопросы, рассматриваемые в работе, могут быть использованы при обучении студентов, стажеров и аспирантов на кафедрах биохимии биологических факультетов.

Апробация. Результаты исследования были доложены на 5 Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Телави, 1985); на 5 Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологвн (Кобулети.1985); на 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага,1988); на 6 Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзаюлогии (Вильнюс, 1988); на 10 Объединенном симпозиуме биохютческих обществ СССР-ГДР (Ташкент, 1989); на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур** (ИЬсква,1989). Работа была удостоена .премии на конкурсе работ молодых ученых ПНИЛ им. А. Е Белозерского.

Публикации. Результаты исследования изложены в 13 печатных работах.

Обьем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы (82 источника). Работа изложена на 153 стр. машинописного текста, содержит_таблиц и 17 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

■Материалы и методы. Иммобилизацию ГАФД ка ВгСН-активиро-ванной сефарозе проводили по методу, описанному в работе С5э1оу1па сЬ а1. ,1978] при степени активации сефарозы 3 мг ВгСК

на 1 мл уплотненного геля. Количество иммобилизованного бедка определяли по методу, представляющему собой модификацию метода Брэдфорд CAsryantz et al. ,1987].

Ыэчение 3-фосфоглицераткиназы флуоресцеин-5' -изотиоциана-том проводили в условиях, описанных в работе [Vas & Batke, 1981], количество метки, включившейся в белок, определяли по коэффициенту молярной экстанкции производного 66 ООО 1Г1 см-1 [Osman et al., 1905]. Степень включения составляла*0,5-1,0 моль флуорес-цеин-5' -изотиоцианата/ыоль 3-фосфоглицераткинзы. Меченый фермент сохранял > 8QZ своей первоначальной активности. Измерения интенсивности флуоресценции 3-фосфоглицераткиназы, помеченной флуоресцеин-5' -изотиоцианатом, проводили на флуориметре Hitachi MPF-4 при длине волны возбуждения 480 нм и длине волны эмиссии 520 нм.

Эксперименты по стационарной кинетике - измерение активностей ферментов и др. проводили на приборе Specord UV, а эксперименты по предстационарной кинетике - на приборе Stopped Flow Spectrofotometer Model 1705 (Applied Photophyslcs Limited) с объемом пробы 0,2 мл и мертвым временем 1,7 мсек.

Электрофорез в пластинках проводили по методу [ Laeml le, 19701..

Эксперименты по электронной микроскопии комплексов ГАфД с 3-фосфоглицераткиназой проводили совместно с докт. ф.-м.н. В.ЛЦупруном (Институт Кристаллографии АН России). Образцы обрабатывали 2Z фосфовольфрамовой кислотой или 1Z уранилацетатом и исследовали с помощью электронного микроскопа Phillips ЕМ-40 (Голландия) при увеличении около 50 ООО.

Значения констант диссоциации для ряда серий экспериментальных данных рассчитывали с помощью компьютерной программы DNRP 53 [Duggleby,19843 непосредственно из полученных изотерм адсорбции. Связывание описывали уравнением:

Y - А X / (BfX), где

Y - степень насыщения участков связывания, X - концентрация несвязанного лиганда, А, В - параметры.

Результаты и их обсуждение.

1. Излучение и характеристика препаратов ГАФД, 3-фосфогли-цераткиназы и ЛДГ.

Основой использованного в работе метода выделения трех вышеназванных ферментов являлся метод аффинной элзоции СScopes,1877]. Предварительное разделение ГАФД, 3-фосфоглице-раткиназы и ДЦГ достигалось в результате фракционирования сульфатом аммония. В качестве злшруюших лигандов в случае ГАФД и ДЦГ использовали НАДН, а в случае 3-фосфоглицераткиназы -3-фосфоглицерат. Выделение З-фосфоглицераткивззы включало тага© две дополнительные стадии: тепловую обработку (которая проводилась после фракционирования сульфатом амшния) и гель-фильтра-цшо на сефадексе 6-150 после аффинной элщии. Схема одновременного выделения трех ферментов из скелетных мьпц кролика показана на Рис 1.

Экстракт скелетных мышц кролика

Фракции

pH элгции лиганд

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ СУЛЬФАТОМ АШЭНИЯ

А, 45-60% В, 60^75% С, 75-80Z ЛДГ 3-фэсфоглицерат- ГАФД киназа |_

ТЕПЛОВАЯ ОБРАБОТКА 10 мин, 45°С._

АФФИННАЯ ЭЛ И Ц И Я

pH 8,0

0,2

мМ НАДН

pH 7,75 0,5 Ш. 3-ФГК

pH 8,0 0,2 мМ НАДН

ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ на сефадексе а-150

КРИСТАЛЛ II ЗАДИЯ

Рис 1. Общая схема выделения мышечных ГАФД. ЛДГ и

3-фосфоглицераткиназы с использованием метода аффинной элюции ферментов их субстратами с кзрбоксиметилцеллюлозы.

Удельная активность препаратов ГАФД, 3-фосфоглицераткиназы и ЛДГ, полученных с помощью метода аффинной элюции, составила, соответственно, 140-160 U/мг, 650-700 U/мг и 550-600 U/мг. Удельную активность ГАФД определяли по методу [Ferdinand,1964], удельную активность 3-фосфоглицераткиназы - по методу [Bûcher,1969] и удельную активность ЛДГ - по методу С Scopes,1977]. Препараты ферментов были-гомогенны при SDS-элек-трофорезе.

Для сравнения препарата 3-фосфоглицераткиназы, подученного с помощью метода аффинной элюции, с ферментом, полученным с помощью иных описанных в литературе методов, были определены константы, характеризующие связывание нуклеотидов (АТФ и ГТФ) с 3-фосфоглицераткиназой (связывание регистрировали по изменению собственной белковой флуоресценции 3-фосфоглицераткиназы при длине водны возбуждения 295 нм; регистрировали изменение интенсивности флуоресцентш при 460 нм). Рассчитанные значения Kd комплексов фермент-Mg-ATO и фермент-Мг-ГТФ (соответственно, 0,4 мМ и 1,53 мЬО хорошо согласуются с константами, определенны,m для препаратов киназы, изолированных- из скелетных мышц кролика с помощью методов, отличных от метода аффинной элюции.

Дня сравнения препарата ГАФД, полученного с помощью метода аффинной элюции с препаратами этого же фермента, полученными с помощью иных описанных в литературе методов, были определены константы, характеризующие скорость протекания отдельных стадий глицеральдегвд-3-фосфатдегидрогеназной реакции:

k+1 к+2 Pi-k+3

E-HAjf + 3-ФГА Е-ацил-НАДН è- Е-ацил-НАД% E-HAjf + 1,3-диФГК (1) к-1 к-2 к-3

стадия 1 стадия 2 стадия 3

Определенная (в условиях стационарной кинетики, когда концентрация фосфата лимитирует скорость суммарного процесса) константа скорости реакции второго порядка, характеризующая стадию 3 приведенного выше уравнения (к+3), составила 2900 Ы s~1(рН 7,0, 20°С). Определенная с помощью метода stopped flow величина кон-

станты скорости ацилирования ГАФ^Ц 3-фосфоглицериновым альдегидом (к+1) > величины 400 ООО Ы"з~(рН 7,0, 20°С). Обе заказанные величины удовлетворительно согласуется с имеющимися на этот счет литературными данными.

Поскольку одной из задач нашей работы было исследование роли конформационных состояний ГАФД в ее способности образовывать комплексы с.другими ферментами, представлялось существенным сравнить свойства иммобилизованной ГАФД со свойствами растворимого фермента. Сродство ГАФД к различным специфическим ли-гандам (и в том числе кооперативность по отноаенио к НАД$, скорости протекания различных стадий катализа ГАЩД, а тага® прочность метздимерных контактов служили для нас своего рода "индикаторами" конформационного состояния ГАФД; сравнение по ряду этих признаков препарата иммобилизованного фериента с растворимым должно было дать ответ на вопрос: накладывает ли ковалент-ная иммобилизация ГАФД конформационныэ ограничения, способные влиять на прочность комплексов ГА2Щ с другими гликолитическими ферментами.

Ва Рис 2 представлен график Скзтчарда, характеризутащй связывание НАД* с иммобилизованной ГАФД Исходно содержащийся в препарате ГАФД НАД* был удален методом отмывания иммобилизованного холофэрмента.

Кто 2. График Скзтчарда, характеризующий связывание НАД* с иммобилизованным препрепа-ратом ГАФД. Связывание регистрировали, определяя в супернатанте проб, содержащих суспензию иммобилизованной ГАФД, равновесную концентрацию несвязанного меченого НАД [С 143. 10 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2,

20°С.

- 8 - .

Связывание ЕАЛ+гдщеральдегид-3-фосфатдегидрогех. азой характеризуется отрицательной кооперативностью; на основании представленных данных мы можем выделить два типа участков связывания НАД*с константами 0,53 мкМ и 1,53 мкЫ. Обе указанные величины удовлетворительно согласуются с данными, полученными Шиком и др. пра изучении связывания НАД* растворимым ферментом СБс1теек еЬ а1.,19783.

Определение прочности междимерных" контактов на препарате иммобилизований ГА5Щ показало, что при диссоциации в соответствии с уравнении, приведенным ниже.

^ ¡ОО + 8

(2)

константа диссоциации составляет 0,'18 нМ (при рН 7,0 и 20°С) в

присутствии 50 мкМ HAjf Эта же величина увеличивается при добавлении в среду ишубаций 3-фосфоглицеринового альдегида (т. е. при ацилировашз ГАС- уо 0,8 HiL Приведенные результаты согласуются с данныа, пол: ,ыш при изучении особенностей диссоциации растворЕзэго фернэнта CHoagland & Teller, 1971].

Константы ЫихаЭлиса для 3-фосфоглицеринового альдегид, определяемые из зависимости скорости глицералъдегид-З-^сфатде-гидрогеназной реакции от концентраты последнего составляют для иммобилизованного и растворимого фермента, соответственно, 0,2 мЫ и 0,15 МЫ.

Таким образом, сравнение различных параметров, характеризующих иммобшпвованный фермент с таковыми растворимой ГАФД не позволяет выявать существенных различий, по крайней мере, на уровне связываная различных специфических лигандов и прочности взаимодействия субьединиц в молекуле ГАфД. В то же время, иммобилизованный фермент сохраняет присущую тетрамерной молекуле ГАФД конформацюнную "подвижность". Об этом, в частности, свидетельствует сохранение на иммобилизованном препарате ГАФД свойств отрицательной кооперативности по отношению к НАД* а также характер влияния лигандов на прочность междимерных контактов.

2. Излучение комплексов ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой и ЛДГ при использовании бифункциональных сшивающих агентов.

Хотя при использовании целого ряда бифункциональных сшивающих агентов (из группы диимидоэфиров) не удалось выявить образования комплексов ГАФД с ДЦГ и 3-фосфоглицераткиназой, тем не менее, обработка эквимолярной смеси ГАФД и ЛДГ (концентрация каждого фермента около 1 мг/мл) разбавленным (0,05%) раствором глутарового альдегида и последующее разделение смеси на колонке с сефадексом &-200 приводит к образованию комплексов с молекулярным весом около 300 ООО, что, по-видимому, следует интерпретировать как образование комплекса, включающего в себя по одной молекуле каждой из дегидрогеназ. Аналогичным образом, обработка смеси ГАФД и 3-фосфоглицераткиназы (концентрация каждого фермента около 1 мг/мл) 0,05% раствором глутарового альдегида приводит к образованию агрегатов, в состав которых входят оба фермента (на основании данных БОЭ-электрофореза).

3. Взаимодействие иммобилизованной ГАФД с растворимой 3-фосфоглицераткиназой.

На Рис 3 показана изотерма адсорбции, полученная в результате титрования иммобилизованной ГАФД растворимой 3-фосфоглицераткиназой. Связывание регистрировали по убыли белка растворимой 3-фосфоглицераткиназы из супернатанта проб после осаждения гранул сефарозы. Изотерма адсорбции, приведенная на Рис 3, характеризует связывание холофермента ГАФД (комплекс Е-НАД) со свободной, лишенной субстратов 3-фосфоглицераткиназой. Это связызание характеризуется константой диссоциации комплекса, равной 4,86+0,51 мкМ и средней стехиометрией связывания около 2 молей 3-фосфоглицераткиназы/моль ГАфД.

Рис 3. Титрование иммобилизованной холо-ГАфД растворимой 3-фос-фоглицераткиназой в равновесной системе. 20 мМ MDPS, 10 ыЫ фосфат калия, 1 мЫ ЭДТА, рН 7,0, 20°С. Связывание регистрировали по убыли белка растворимой 3-фоефоглицераткиназы из супернатанта проб после осаждения гранул сефарозы.

Таблица 1 суммирует результаты титрований иммобилизованной ГАФД растворишй 3-фосфоглицераткиназой в условиях, когда каждый из партнеров пребывает в различных конфориацнонных состояниях. Для получения комплекса киназы с 1,3-дифосфоглице.ра-том, проводили энзиматический синтез последнего по методу CFurfine & Yelick,1965]; добавляли к свободной киназе эквимо-лярное количество 1,3-дифосфоглицерата и проводили титрование иммобилизованной ГАФД. Комплекс 3-фосфоглицераткиназы с 1,3-диФГК отличается весьма высокой прочностью tHusklns et al., 1982; Fifis & Scopes,1978]; наличие 1,3-диФГК,' связанного с 3-фосфоглицераткиназой, после проведения титрования повторно фиксировали с помощью энзиматичеекого теста. Не было отмечено уменьшения количества 1,3-диФГК, связанного с киназой: после

. - 11 -

титрования соотношение киназа/1,3-дифосфоглицерат составляло 1/1.

Таблица 1. Связывание иммобилизованной ГАФД с растворимой 3-фосфоглицераткиназой; величины К<1, мкЫ.

^конформации Х. ГАФД конф. N. 3-фосфо- глицераткиназыЧ Е-НАД+ Е-ацил-НАДН Е-ацил-НАД+

Е (свободная) 4,8б±0,5 2,45±0,1 -

Е-1,3-диФГК (комплекс с 1,3-дифосфогл1щератом) > 10 - < 1

Дня перевода ГАФД в конформацию Е-ациг-НАДН добавляли к холоферменту ГАФД (комплекс Е-НАЛб избыток 3-фосфогл1щеринового альдегида в отсутствие в среде инкубации свободного ЕА]С

Для перевода ГАСД в конфоршцию Е-ащсг-НАД* добавляли к иммобилизованной ГАФД избыток субстратов пряной реакции и регистрировали^ связывание в тот момент, когда ^мобилизованный фермент работает в стационарной фазе (кинетика работы иммобилизованной ГАФД в пробах,контролировалась спеетрофотометрически): согласно СТгегЛЬат, 1971; Ке1еи & 0уасИ,1978] и др. ско-рость-ограничивающей стадией суммарной реакции при рН 7,0 является фосфоролиз комплекса Е-ацил-НАД? следовательно работающий иммобилизованный фермент в этих условиях будет пребывать преимущественно в конформации Е-ацил-НАД^

Как видно из данных, приведенных в Таблице 1, связывание киназы с 1,3-дифосфоглицератом приводит к заметному ослаблению сродства этого фермента к ГАФД; в то те вреыэ, переход ГАФД от

- 12 -•

конформации Е-НАД+ к конформации, завершающей каталитический цикл ГАФД, - конформации Е-ацил-НАД - приводит к последовательному увеличении сродства ГАФД к 3-фосфоглицераткиназе.

4. Взаимодействие иммобилизованной ГАФД с растворимой лак-татдегвдрогеназой.

На Рис 4 приведена изотерма адоорбции, полученная в результате титрования иммобилизованной ГАФД растворимой лактатде-гидрогеназой. Связывание регистрировали по убыли белка растворимой ЛДГ из супернатанта проб после осаждения гранул сефарозы. Сродство двух ферментов в этих условиях (10 мМ фосфат калия, рН 6,5, 20°С) - величина И комплекса - составила 0,25 ыкМ, а средняя стехиоггтрия связывания около 1 моля ЛДГ/модь ГАфД.

Рис 4. Изотерма адсорбции, характеризующая связывание иммобилизованной ГАфД с растворимой ЛДГ. Связывание регистрировали по убыли белка растворимой ЛДГ из супернатанта проб после осаждения гранул сефарозы. 20 мЫ MES, 10 мМ фосфат калия, 1 мЫ ЭДГА, 0,2 мМ НАДН, рН 6,5, 20°С.

Таблица 2 суммирует данные по титрованию иммобилизованной ГАФД растворимой ЛДГ в различных условиях.

Таблица 2. Связывание иммобилизованной ГАФД с растворимой ЛДГ.

N Условия взаимодействия ГАФД с ЛДГ Кс1, мкМ

1. рН 6,5 1,11

г. рН 6,5, НАДН 0,2 мМ 0,25

3. рН 7,0 2,74

4. рН 7,0, НАДН 0,2 мМ 1,10

Обращает на себя внимание тот факт, что добавление в среду инкубации НАДН в обоих случаях (при рН 6,5 и рН 7,0) увеличивает сродство ферментов друг к другу; аналогичным образом, наблюдается увеличение прочности фермент-ферментного комплекса при сдвиге рН от 7,0 на 0,5 единицы в кислую область.

5. Взаимодействие ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой, помеченной шлуоресцэин-5' -изотиоцианатом.

На Рис 5, А показана кинетика изменения интенсивности флуоресценции меченой ®ГГЦ 3-фосфоглицераткиназы при добавлении к ней холофермента ГАФД (момент добавления ГАФД на рисунке отмечен стрелкой). Предполагая, что процесс тушения флуоресценции метки, включенной в 3-фосфоглицераткиназу, связан с образованием комплекса этого фермента с ГАФД, из зависимости скорости тушения флуоресценции от концентрации ГАФД (в условиях, когда концентрация добавленной ГАФД >> концентрации меченой ФИТЦ 3-фосфоглицераткиназы, и кинетика процесса соответствует кинетике реакции псевдопервого порядка) была рассчитана константа скорости реакции второго порядка, которая оказалась равной 1100+200

Определение прочности комплексов меченой ФИТЦ 3-фосфогли-цераткиназы с апо- и холоформами ГАФД (Рис 5, Б) показало, что это взаимодействие описывается константами, соответственно, 0,32 и 0,625 мкЫ. Исследование влияния субстратов 3-фосфоглицераткиназы на прочность комплекса показало, что, добавленные по

п( и

х

°100

75

о.

0

1 50 л

а

о

X

га

В

э

1 »

Рис 5, А. Кинетика тушения флуоресценции меченой ФИТЦ 3-фосфо-глицераткиназы при добавлении к ней холо-ГАФД. Мэмент добавления ГАФД отмечен стрелкой. 10 мМ фосфат калия, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2, 20°с. Концентрация меченой киназы 0,68 мкЫ. Концентрация холо-ГАфД 5,9 мкМ.

минуты

■е хю6

«

га а: Ч о ■ •о ■ о и о

£ Д 2

К Графики Скзтчар-

да, характеризующие

взаимодействие мече-

ной ФИТЦ 3-фосфогли-цераткиназы с апо-(1) и холо-формами

о\ ГАЩГ (2). 10 мМ фос-

■ I фат натрия, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2, 20°С. Концентрация меченой 3-фосфоглицераткиназы

1 в обоих случаях 0,34

2 1 1 мкЫ.

0,2 0,4 0,5

АБ/й7,

0.8

1,0

Млх

отдельности АТФ и 3-фосфоглицерат способны заметно ослаблять взаимодействие меченой киназы с ГАФД, а добавленные совместно ("работающая" киназа) обеспечивают полный распад комплексов меченой киназы с ГАФД. ■

Приведенные выше результаты характеризуют другой тип взаимодействия меченой 3-фосфоглицераткиназы с ГАФД, по сравнению с комплексом тех же ферментов, полученным при помощи метода ш¿мобилизации ГАФД на нерастворимом носителе, поскольку: (1) константа, характеризующая прочность комплекса меченой ©ИТЦ киназы с холо-ГАФД (0,32 мкМ) более, чем на порядок ншэз константы, полученной в аналогичных условиях, но описывающей взаимодействие немеченой 3-фосфоглицераткиназы с холо-ГАФД (4,85±0,5 мкМ); (Ii) константа, характеризующая скорость образования комплекса двух, ферментов в случае иммобилизованной ГАФД и растворимой немеченой 3-фосфоглицераткиназы леетг выше величины 100 ООО MV1, в то время как образование комплекса меченой ФИТЦ киназы с ГАФД происходит значительно более медленно (k obs - 1100+200 М~ s~1). (Iii) Присутствие нуклеотидов и субстратов киназной реакции не препятствовало образованию комплекса двух ферментов в случае немеченой киназы, а в случае 3-фосфоглицераткиназы, помеченной ФйТЦ, способно заметно ослаблять связывание меаду ки-назой и ГАФД.

Мы предположили, что причина образования комплекса "другого типа" кроется в том, что 3-фосфоглицераткиназа была подвергнута кодификации флуоресцеин-5'-изотиоцианатом. Представляется вероятным, что гидрофобная молекула ФИГЦ могла бы "залипать" в нуклеотид-евязывандем центре ГАфД (на это указывает характер действия нуклеотидов, способных ослаблять взаимодействие меченой ФИГЦ киназы с ГАФД). Результаты Рис 6, А и Б свидетельствует о том, что прочность комплекса меченой ®ТЦ киназы с ГАФД увеличивается при увеличении ионной силы среды и температуры, что служит указанием на гидрофобный характер ассоциации и говорит в пользу приведенной выше гипотезы.

Отсутствие конкуренции между меченой ©ГГЦ и немеченой 3-фосфоглицераткиназой при связывании с ГАФД позволило скояча-

^АВД] , ыкЫ

Рис 6, А. Изотермы адсорбции, характеризующие влияние ионной силы на процесс взаимодействия меченой ©ГГЦ 3-фосфоглицерат-киназы с ГАфЦ. 10 мМ фосфат натрия, 1 мЫ ЭДГА, pH 7,2, 20° С. Концентрация меченой киназы 0,6 мкМ. Кривая 1 - проба без добавок; Кривая 2 - в присутствии 170 мМ хлорида натрия. 1,0 ПГ

и.

U. <)

Б.

^АФД] , мкЫ Изотермы адсорбции, характеризующие

црдцесс взаимодействия меченой ЩЯТЦ 3-фосфоглицераткиназы с ГАФД" . Концентрация меченой киназы 0,6 мкМ. Кривая 1 - титрование проведено при 20°С; , Кривая 2 - титрование проведено при 40°С.

тельно убедиться в том, что мы имеем дело с двумя разными типами взаимодействия. Однако, обнаруженный новый тип взаимодействия ГАФД и 3-фосфоглицераткиназы, реализующийся при участии гидрофобной метки, флуоресцеин-5'-изотиоцианата, по-видимому, все-таки нельзя считать неспецифическим. В дальнейших экспериментах к меченой ФИТЦ 3-фосфоглицераткиназе мы добавляли другие ферменты, обладающие нуклеотид-связывающими участками, в частности, мышечную лактатдегидрогеназу (чей нуклеотид-связывающий центр в значительно большей степени экспонирован наружу и доступен по сравнению с находящимися в углублении и попарно сближенными нуклеотид-связывающими центрами тетрамерной молекулы ГАФД), но никаких изменений флуоресценции при этом не было отмечено, т.е. не происходило образования комплекса, инициатором которого был ФЯТЦ. В качестве спекулятивной гипотезы можно предположить, что в случае взаимодействия меченой ФйТД киназы с ГАФД образование комплекса происходит в два этапа; на первой стадии происходит быстрое образование "физиологичного" комплекса со "слабой" К<1, и уке вслед за этим происходит внедрение гидрофобной части молекулы ©ГГЦ, миграция которой в поисках оптимального положения (в гидрофобной складке нуклеотид-связывашцей полости ГАфД) и приводит к значительному замедлению процесса образования этого второго, "кефизиологичного" комплекса

6. Изучение архитектуры комплекса ГАФД-З-фосфоглицератки-кзза с по:.:озз>ю ыэтода электронной микроскопии.

В результате работы, проведенной совместно с д. ф. -м. н. В.Л.Дупруном и А. Г. Кафтановой (Институт Кристаллографии АН России) были получены электронные микрофотографии комплекса ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой. Эти данные даст нам важную информацию об архитектуре фермент-ферментного комплекса и позволяют сравнить результаты, полученные при электронно-микроскопическом исследовании комплекса ГАФД-З-фосфоглицераткиназа с таковыми, полученными при использовании метода иммобилизации ГАФД на нерастворимом носителе.

Во-первых, визуальное сравнение проб," содержащих смесь киназы с ацилированной и неацилированной ГАФД подтвердило наш вывод о роли ацильных конформаций ГАФД в регуляции связывания

- 18 - ■

ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой: во всех случаях в пробах с аци-лированной ГАфД наблюдалось значительно больше комплексов ГАФД-З-фосфоглицераткиназа, чем в пробах, содержащих неацилиро-ванную ГАФД. Таким образом, увеличение сродства ферментов друг к другу, происходящее при переходе ГАФД в ацильную форму, находит свое экспериментальное подтверждение при использовании иного экспериментального подхода.

Во-вторых, представленные данные (Рис 7) и построенные исходя кз этих данных модели (Ва Рис 7 показаны справа) позволяют сделать вывод о том, что каждая субьединица тетрамерной молекулы ГАФД имеет специфический участок для связывания ыономерной молекулы 3-фосфоглицераткиназы. На Рис 7 представлены тетрамер-ные формы ГАФД, связавшие одну (в различных проекциях Рис 7, а, Ь, с) и две (Рис 7, с1) молекулы 3-фосфоглицераткиназы.

И, наконец, расположение области, связываний 3-фосфогли-цераткиназу на поверхности субьединицы ГАФД таково,, что она отстоит на значительное расстояние от активного центра субьединицы ГАФД (как уже было отмечено выше, попарно-сближенные активные центры суСьединиц ГАФД находятся в глубине молекулы: поскольку имеется значительное количество данных рентгеноетрукгур-ного анализа, локализация активных центров ГАФД на поверхности молекулы может бьиь проведена с достаточно высокой точностью); в этом смысле 3-фосфоглицераткиназа связывается на "периферии" ГАФД; активные центры обоих ферментов, таким образом, находятся на достаточном удалении друг от друга

После присоединения к одной из субьединиц ГАФД молекулы 3-фосфоглицераткиназы структура комплекса приобретает компарт-мент, своего рода "карман" (Рис 7, Ь), хотя и несколько дырявый, но, возможно, при связывании с гафд других партнеров по гликолизу или иммобилизации комплекса на естественной подложке изолированность этого компартмента от внешней среды значительно повышается.

Рис 7. Комплекс ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой, представленный в различных проекциях на электронных микрофотографиях (а, Ь, с, с1) и построенных исходя из них моделях (показаны справа), е. Комплекс, в котором тетрамерная молекула ГАФД связала две молекулы мономерной 3-фосфоглицераткиназы.

- 20 -ВЫВОДЫ

1. Показано, что между глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена-зой из мышц кролика, иммобилизованной на сефарозе 4 В, и растворимой 3-фосфоглицераткиназой из того же источника происходит образование комплекса с константоЯ диссоциации около 5 мкМ в отсутствие субстратов обоих ферментов.

2. Црочность комплекса двух вышеназванных ферментов регулируется конфорыационными переходами обоих партнеров, при этом сродство глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы к 3-фосфоглицераткиназе повышается по мере перехода дегид-рогеназы к конформационному состоянию, завершающему цикл одного каталитического оборота - конформации Е-ацил-НАД; сродство же киназы к дегидрогеназе зависит от того, находится этот фермент в свободном состоянии, или ж в виде комплекса с 1,3-дифосфоглицератом, интермедиатом суммарной реакции (связывание с 1,3-дифосфоглицератом приводит к ослаблению сродства киназы к дегидрогеназе).

3. Охарактеризовано взаимодействие глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназы с лактатдегидрогеназой; показано,' что между ГАФД и ЛДГ происходит образование комплекса с И около 2,7 мкМ (в отсутствие эффекторов при рН 7,0). Сродство двух ферментов друг к другу усиливается при сдвиге рН на 0,5 единицы в кислую сторону или при добавлении в систему НАЛЕ.

■ 4. Изучено взаимодействие меченой флуоресцеин-5'-изотиоциана-том 3-фосфоглицераткиназы с ГАФД; показано что при этом между ферментами происходит образование комплекса, посредником которого является гидрофобная молекула флуоресцентной метки.

5. С помощью метода электронной микроскопии • показано,- что структура комплекса ГАФД с 3-фосфоглицераткиназой такова, что каждая субьедишща тетрамерной молекулы ГАФД имеет специфический учзсток связывания 3-фосфоглицераткиназы и потенциально способна связать мономерную молекулу этого фермента; выявлена взаимная ориентация партнеров и общая архитектура комплекса ГАФД - 3-фосфоглицераткиназа.

- 21 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. В. И. Ыуронец, Ы. R Суходолец, К К1 Языкова,

Е К. Наградова. Изучение взаимодействия между структурными белками и ферментами мышц с помощью метода иммобилизации. Труды 5 Всесоюзной конференции по биохимия мышц, Телави, 1985, с. 73-74.

2. В. И. Муронец, М. Ю. Языкова, Ы. В. Суходолец. Бифер-ментная система для регенерации АТФ. Тезисы 5 Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, Ко-булети, 1985.

3. М. R Суходолец, В. И. Муронец, R К. Наградова Комплекс между глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и 3-фосфоглицераткиназой из скелетных мышц кролика. Биохимия, "Наука", 1987, т. 52, N 1, с. 128-133.

4. М. V. Sukhodolets, Y. I. Muronetz, N. К. Nagradova. Kinetic evidence for the . interaction between rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. Blochem. Int., 1987, v. 15, p. 373-379.

5. V. I. Muronetz, L. I. Ashmarlna, 11V. Sukhodolets. The role of heterologous protein-protein Interactions of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Abstracts of 14 International congress of Biochemistry, 1988, Prague, Czechoslovakia, v. 4, p. 119.

6. M.V.Sukhodolets, Y.I.Muronetz, N.K.Nagradova Association of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. The biochemical arid electronmicroscoplc evidence. FEES Lett., 1988, v. 238, N 1, p. 161-166.

7. M. R Суходолец, В И. Муронец, Е К. Наградова Иммобилизованный комплекс глицеральдегид-3-фосфатдегид-рогеназы и фосфоглицераткиназы из мышечной ткани. Материалы 6 Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии, Вильнюс, 1988, часть 1, с. 99.

8. N. К. Nagradova, М. V. Sukhodolets, V. I. Muronetz. On

the role of ollgomeric enzyme structure In the assent-

Ыу of multiprotein aggregates. International Syirposium "Molecular organization of biological structures", Moscow, 1989, 1, p. 127.

9. M. V. Sukhodolets, V. I. Muronetz, N. K. Nagradova Interaction between- d-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase labeled by fluorescein-5'-isothiocyanate: evidence that the dye participates in the interaction. Biochem. Blophys. Res. Com., 1989, v. 161, N 1, p. 187-196.

10. В.И.Ыуронец, M. Ю. Языкова, M. В. Суходолец,

Е К. Наградова Ассоциация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы с ферментами гликолиза и структурными белками мышц. 10 Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР-ГДР, Ташкент, 1989, с. 56.

11. M. V. Sukhodolets, Y." I. lAironetz, N. К. Nagradova Interaction between glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase. Biochem. Int., 1989, v. 19, N 2, p. 379-384.

12. M. R Суходолец. 3-фосфоглицераткиназа скелетных мышц кролика Мэтоды энзимологии, Ыэсква, "Наука", 1992 (в печати).

13. Ы. В. Суходолец. Лактатдегидрогеназа скелетных мышц кролика 1£этоды энзимологии, Мэсква, "Наука", 1992 (в печати).