Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение белок-белковых взаимодействий в Д-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ашмарина, Л.И.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экспериментальные подходы, используемые для получения и изучения свойств изолированных субъединиц олигомерных ферментов.

1.2. Структура ГАФД и црявления взаимодействия субъединиц в олигомерной молекуле фермента

1.3. Факторы, влияющие на функционирование ГАФД в физиологических условиях •••••••.•••••••••••.•••••••••••••

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2«1* Материалы.

2.2* Получение 1,3-дафосфоглицерата

2.3. Выделение ГАФД из пекарских дрожжей ••••••.•••••••••••

2.4. Выделение фосфоглицераткиназы из пекарских дрожжей •••••••

2.5. Иммобилизация ферментов.•••••••••••••••••

2.6» Оцределение концентрации белка

2.6.1. Определение концентрации растворимого белка

2.6.2. Оцределение концентрации иммобилизованного белка

2.,7. Определение активностей ферментов .••••••••••••••••••

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 • Получение нативных мономеров ГАФД .•••.•••••

3.2« Получение иммобилизованных мономеров ЛДГ •••••••••••••.••

3.3. Получение иммобилизованных тримеров ГАФД •••••••••••••••••

3.4. Цроявление межсубъедини чной кооперативности ГАФД в катализе

3.5. Комплекс ГАФД с фосфоглицераткиназой.

3.6. Влияние образования комплекса ГАФД с фосфоглицераткиназой на кооперативность активных центров ГАФД

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение белок-белковых взаимодействий в Д-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназе"

Последние десятилетия развития энзимологии ознаменовались решающими достижениями в раскрытии механизмов действия мономерных ферментов. Однако механизмы действия и сам смысл существования ферментов-олигомеров остается во многом невыясненным. Причем, если изучение гетероолигомерных ферментов идет относительно успешно и положение о разделении регуляторных и каталитических функций неодинаковых субъединиц является общепризнанным, то выяснение механизмов действия энзимов, состоящих из идентичных субъединиц, оказалось очень сложной задачей.

К настоящему времени описано немало ферментов, построенных из одинаковых субъединиц, характерным свойством которых является разнообразие проявления кооперативности между активными центрами олигомера. Для некоторых из них получены доказательства взаимодействия активных центров в ходе катализа, что подчеркивает особую важность выяснения молекулярных механизмов специфических белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе этого явления.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) служит удобным объектом для такого рода исследований. На этом модельном ферменте детально изучена кооперативность активных центров тетрамера в отношении связывания кофермента (НАд!) и явление "полуцентровой реактивности"; сделаны первые шаги в выяснении механизмов этих явлений. Демонстрация каталитической кооперативности субъединиц позволила отнести ГАФД к числу ферментов, функционирующих по механизму "флип-флоп", предполагающему тесное сопряжение отдельных стадий реакций на соседних субъединицах. Роль специфических белок-белковых взаимодействийвалигомерной молекул© фермента может быть, таким образом, связана с обеспечением термодинамических преимуществ, благодаря которым отдельная неактивная субъединица приобретает в составе макромолекулы способность к катализу. Существует, однако, альтернативная возможность, обычно не рассматриваемая в тех случаях, когда фермент функционирует по механизму "флип-флоп". Эта возможность предполагает, что изолированные субъединицы олигомера полностью способны к катализу. В этом случае кооперативность активных центров, возникающая при ассоциации субъединиц в тетрамер, уже не может рассматриваться как обязательная предпосылка катализа. Ее роль, очевидно, должна заключаться в определенном изменении каталитических свойств мономера, вызванном образованием контактов с соседними субъединицами.

Основной задачей нашей работы явилась попытка разграничить эти две возможности применительно к ГАФД. При этом мы полагали, что поставленная задача выходит за рамки исследования отдельного фермента, а ее решение поможет выявлению определенных закономерностей в механизме действия ферментов - олигомеров, построенных из одинаковых субъединиц.

В качестве экспериментального подхода мы решили использовать сравнительное исследование свойств мономерной и олигомерной форм фермента, полученных в стабильном состоянии путем иммобилизации на нерастворимом носителе.

Нам удалось, впервые получить нативный мономер ГАФД, полностью сохранивший каталитическую активность, и способный к ре-ассоциации с субъединицами из раствора. Причем, разработанный метод получения отдельной субъединицы олигомерного фермента может быть использован и для изучения других олигомерных ферментов.

Использование иммобилизованного мономера, а также различных способов диссоциации и реассоциации субъединиц ГАФД, позволило получить различные олигомерные формы дегидрогеназы, иммобилизованные на носителе: димеры,тримеры, а также олигомеры-гибриды, построенные из нативных и химически модифицированных субъединиц. Изучая каталитические свойства субъединицы фермента до и после её реассоциации с другими субъединицами, мы ожидали выяснить, какое влияние оказывает образование межсубъединичных контактов на функционирование активного центра этой субъединицы. Так, было важно проверить, как сказывается на активности субъединицы собственно наличие контактов с соседней (соседними) субъединицей при отсутствии влияния, исходящего из другого активного центра. Для этого были найдены условия, цри которых химическая модификация активного центра одной субъединицы не отражалась на активности соседних.

Сравнение каталитических свойств разных иммобилизованных форм ГАФД в прямой и в обратной реакции привело нас к заключению, что кооперативность активных центров олигомера выявляется лишь в определенных условиях, то есть не может считаться предпосылкой катализа. Было также установлено, что каталитическая кооператив-ность сохраняется в изолированном димере и заключается, по-видимому, в попеременном функционировании соседних активных центров.

Исходя из представления о том, что данное свойство фермента зависит от конформационных изменений, передающихся по межсубъеди-ничным контактам, мы считали вероятным влияние на кооперативность активных центров олигомера со стороны факторов, способных изменять (или фиксировать) конформационное состояние белка. К числу таких факторов может относиться взаимодействие с функционально связанными ферментами. Поэтому мы разработали условия получения комплекса ГАФД с фосфоглицераткиназой и исследовали каталитические свойства мономерной и олигомерных форм фермента в составе таких комплексов. Полученные результаты показали, что специфические белок-белковые взаимодействия, возникающие между двумя функционально связанными ферментами, ■ , действительно способны изменить характер кооперативности активных центров.

Б целом результаты настоящей работы показали, что наличие каталитической активности у отдельной субъединицы олигомерного фермента и ярко выраженная кооперативность активных центров субъединиц явления совместимые, и позволили охарактеризовать механизмы регуляции активности мономера ГАФД путем специфических белок-белковых взаимодействий разной природы.

В соответствии с задачами, стоявшими перед нами при выполнении экспериментальной части исследования, обзор литературы включает рассмотрение работ, посвященных получению изолированных субъединиц олигомерных ферментов, а также суммирует основные сведения об особенностях четвертичной структуры ГАФД и различных проявлениях кооперативности активных центров тетрамера.

Заключительный раздел литературного обзора посвящен изучению регуляции функционирования ГАФД в физиологических условиях.

Остальная часть диссертации включает экспериментальный раздел, в котором описаны методы исследований, обсувдены полученные результаты. Мы сочли необходимым суммировать основные итоги работы в кратком заключении.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ашмарина, Л.И.

ВЫВОДЫ

1. Разработан экспериментальный подход, позволяющий проводить диссоциацию иммобилизованных на сефарозе олигомерных ферментов на субъединицы без изменения нативной структуры мономера, связанного с матрицей ковалентно.

Показано, что изолированная субъединица глицеральдегид-3--фосфатдегидрогеназы из пекарских дрожжей способна к катализу.

Этот подход был использован также для получения активных мономеров лактатдегидрогеназы из мышц свиньи.

2. Получен иммобилизованный тример глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы. С помощью гибридизации между нативными и карбок-симетилированными субъединицами на нерастворимом носителе показана передача влияния "полуцентрового" реагента по междимерным контактам в молекуле глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Получены доказательства обратимости этого процесса.

3. В прямой реакции (окисление 3-фосфоглицеринового альдегида) обнаружены отличия в удельной активности мономерной и тет-рамерной форм при концентрациях кофермента от 0,5 до 60 мкМ, что указывает на наличие менсубъединичной кооперативноети в катализе .

4. Исследование каталитических свойств разных иммобилизованных форм фермента в обратной реакции (восстановительное дефосфо-рилирование I,3-дифосфоглицерата) позволило установить, что ассоциация субъединиц в олигомер приводит к снижению их каталитической эффективности; вероятно, одновременно в катализе участвует лишь одна субъединица функционального димера. Каталитическая кооперативность субъединиц сохраняется в изолированном димере.

5. Показано образование комплекса между иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и растворимой фосфоглицераткиназой. Установлено, что каждая субъединица дегидрогеназы способна связать молекулу киназы.

6. Образование комплекса с фосфоглицераткиназой влияет на каталитическую кооперативность субъединиц глицеральдегид-3-фос-фатдегидрогеназы. Связывание молекул киназы с субъединицами дегидрогеназы приводит к независимому функционированию активных центров тетрамера в реакции восстановительного дефосфорилирова-ния 1,3-дифосфоглицерата.

Заключение

В настоящей работе мы стремились показать те новые возможности, которые открывает использование техники иммобилизации на нерастворимом носителе для изучения функциональной роли олигомер-ной структуры ферментов. Полученные нами результаты показывают, что эти возможности далеко не исчерпываются созданием условий для стабилизации мономерной форлы фермента и проверки ее способности к катализу. Сочетание таких приемов, как диссоциация олиго-мера (в нашем случае тетрамера) в разных условиях, обеспечивающих разрыв контактов определенного типа, гибридизация на нерастворимом носителе и химическая модификация функциональных групп позволяет получить набор иммобилизованных на носителе форм разной степени олигомерности. Сравнительное исследование их свойств может дать полезную информацию о функциональной роли межсубъединичных взаимодействиях того или иного типа. Так, нам удалось показать, что ассоциация мономеров- в димер оказывается достаточной для возникновения кооперативности их активных центров. Образование олигомерной структуры накладывает ограничение на функционирование мономера; важно, что этот эффект реализуется только в том случае, если оба активных центра димера являются функционирующими. Это позволяет считать вероятным, что "замедление" работы мономера в составе димера наступает потому, что соседние активные центры работают попеременно, по механизму типа "флип-флоп". Необходимо заметить, что получение экспериментальных доказательств существования такого механизма при работе с растворимыми ферментами сопряжено со значительными трудностями; как отмечено в обзоре литературы, эти данные пока носят в основном косвенный характер.

Наш ошт работы с иммобилизованными фордами ГАФД позволяет надеяться, что более глубокое сравнительное исследование их свойств поможет дальнейшему развитию представлений о механизмах межсубъециничной кооперативности, характерной для этого фермента.

Результаты настоящей работы также показывают новые перспективы, открывающиеся в области изучения физиологической роли полиферментных комплексов и молекулярных механизмов их функционирования. Это касается как самой техники получения комплексов,так и возможности использовать для их формирования изолированные субъециницы или их разные комбинации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ашмарина, Л.И., Москва

1. Березин И.В., Антонов В.К., Мартинек К. (1976). Иммобилизованные ферменты. Изд. МГУ, М., т.1.

2. Гауровиц Ф. Химия и функции белков. М., Мир, 1965, 530 с.

3. Муронец В.И., Чередникова Т.В., Наградова Н.К. (1978). Нековалентная иммобилизация глицеральдегид-3-фосфат дегидро-геназы на антителах и РаЬ-фрагментах антител, связанных с сефарозой. Биохимия, 43, Д 7, 1277-1284.

4. Муронец В.И., Чередникова Т.В., Наградова Н.К. (1981). Использование иммобилизации для изучения глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Иммобилизованные тетрамеры. Биохимия, 46, Я 10, I73I-I739.

5. Кашо В.Н., Бакулева Н.П., Байков А.А. и др. (1982). Получение и каталитические свойства растворимой мономерной формы неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей. Биохимия, 47, гё 6, с.993-998.

6. Andersson L., Mosbach K. (1979). The use of biochemicalsolid-phase techniques in the study of alcohol dehydrogenase. 2. Selective carboxymethylation of bioaffinity-bound alcohol dehydrogenase. Eur.J.Biochem., 94, N 2, p.565-571 (b).

7. Allen J., Harris J.I. (1975)."The binding of nikotinamide-adenine dinucleotide to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilusy Biochem.J., 151» 747-749.

8. Axen R., Ernback S. (1971). "Chemical fixation of enzymes to cyanogen halide activated polysaccharide carriers", Eur.J. Biochem., 18, 351-360.

9. Bartholmes P., Durchschlag H., Jaenicke R. (1973). "Molecular properties of lactic dehydrogenase under the conditions of the enzymatic test. Sedimentation analysis and gel filtration in the microgram and nanogram range," Eur.J.Biochem., 39» 101-108.

10. Bell G.E., Dalziel K. (1975)."Studies of coenzyme binding to rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochim., Biophys. Acta, 391, 249-258.

11. Bernhard S.A., MacQuarrie R.A. (1973). "Half-site reactivity and the "induced-fit" hypothesis". J.Mol.Biol., 14, 73-78.

12. Biellmann J.F., Lapinte C., Haid E,, Weimann G. (1979). "Structure of lactate dehydrogenase inhibitor generated from coensyme". Biochemistry, 18, 1212-1216.

13. Bickerstaff G.F., Price N.C. (1976). "Evidence for active subunits of matrix-bound creatine kinase" FEBS Lett., 64, p.319-322 (a).

14. Bickerstaff G.F., Paterson С., Price N.C. (1980). "The refolding of denatured rabbit muscle creatine kinase". Biochim. Biophys. Acta, 621, 305-314.

15. Bloch W., MacQuarrie R.A., Bernhard S.A. (1971). "The nucleotide and SH group content of native rabbit muscle glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J.Biol.Chem., 246, 780-790.

16. Bode J., Blumenstein M., Raftery M.A. (1975). "Nonidentical alkylation sites in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase", Biochemistry, 14, 1146-1152.

17. Buehner M., Ford G.C., Olsen K.W. (1974). "Threedimensional structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase", J.Mol.Biol., 1974, 90, 25-49.

18. Cardon G., Boyer P.D. (1982). "Subunit interaction in catalysis". J.Biol.Chem., 257, 13, 7615-7622.

19. Carvajal П., Martinez J., Fernandez H. (1977). "Immobilized monomers of human liver arginase". Biochim. Biophys. Acta, 481, 177-183.

20. Chan W.W.-C. (1970). "Matrix-bound protein subunits", Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 1198-1204.

21. Chan W.W.-C., Mawer H.M. (1972). "Studies on protein subunits. II. Preparation and properties of active subunits of aldolase bound to a matrix". Arch.Biochem.Biophys., 149, 136-145.

22. Chan W.W.-C., Schutt H., Brand K. (1973). "Active subunits of transaldolase bound to sepharose",",Eur.J.Biochem., 40, 533-541.

23. Chan W.W.-C. (1976). "Some experimental approaches for studying subunit interactions in enzymes". Canad.J.Biochem., 54, 521-528 (b).

24. Chan W.W.-C. (1976). Immobilized subunits. In "Methods in Enzymology". Acad.Press, New York, 44, 491-503 (c).

25. Chan W.V/., Mosbach K. (1976). "Effects of subunit interactions on the activity of lactate dehydrogenase studied in immobilized enzyme systems". Biochemistry, 15, 4215-4222.

26. Cherednikova T.V., Muronetz V.I., Nagradova U.K. (1980). "Study of subunit interactions in immobilized D-glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochim. Biophys. Acta, 613, 292-308.

27. Cho I.C., Swaisgood H. (1974). "Surface-bound lactate dehydrogenase; preparation and study of the effect of matrix microenvironment on kinetic and structural properties". Biochim. Biophys. Acta, 334, 243-256.

28. Clarke P.M., Masters C.J. (1975). "On the association of glycolytic enzymes with structural proteins of skeletal muscle" Biochim. Biophys. Acta, 381, 37-46.

29. Conway A., Koshland D.E. (1968). "Negative cooperativity in enzyme action. The binding of diphosphopyridine nucleotide to glyceraldehyde-3-phosphare dehydrogenase". Biochem., 7, 4011-4022.

30. Cook R.A., Koshland D.E., Ir. (1970). "Positive and Negative cooperativity in yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 9, 3337-3342.

31. Cuatrecasas P. (1970). Protein purification by affinity chromatography. Derivation of agarose and polyacrylamide. J.Biol.Chem., 245, 3059-3069.

32. Dagher S.M., Hultin H.O. (1975). "Association of glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase with the particulate fraction of chicken skeletal muscle". Hur.J.Biochem., 55, 185-192.

33. Davidson B.E,, Sajgo M., Noller M.P., Harris I.J. (1967). "Amino acid sequence of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from lobster muscle", Nature, 216, 1181-1185.

34. De Vielder J.J.M., Boers W., Slater E. (1969). "Binding and properties of NAD+ in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from lobster tail muscle". Biochim. Biophys. Acta, 191» 214-220.

35. De Vielder J.J.M., Boers W., Slater E.C. (1978). "The reaction between NAD+ and rabbit muscle glyceraldehyde phosphate dehydrogenase". Biochim. Biophys. Acta, 167, 23-34.

36. Engasser J.M. (1978). "A fast evaluation of diffusion effects on bound enzyme activity". Biochim. Biophys. Acta, 526, 301-310.

37. Pell D.A., White C.J.B. (1975). "Evidence for the activity of immobilized monomers of triose phosphate isomerase". Biochem. Biophys. Hes. Commun., 57, 1013-1018.

38. Furfine C.S., Velick S.F. (1965). "The acyl-enzyme intermediate and the kinetic mechanism of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase reaction". J.Biol.Ghem., 240, 844-855.

39. Gabel D. (1973). "The denaturation by urea and guanidinium chloride of trypsin and N-acetylated trypsin derivatives bound to sephadex and agarose". Eur.J.Biochem., 33, 348-356.

40. Garavito R.M., Berger D., Rossman M.G. (1977). "Molecular assymmetry in an abortive ternary complex of lobster glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 16, 43934398.

41. Goldman R., Golstein L., Katchalski E. in "Biochemical Aspects of Reactions in Solid Supports" (Stark G.R., ed.), Acad.Press, New York, London, 1971, p.1-78.

42. Goldstein L. (1972). "Microenvironmental effects on enzyme catalysis. A kinetic study of polyanionic and polycationic derivatives of chymotrypsin". Biochemistry, 11, 4072-4084.

43. Golovina Т.О., Cherednikova T.V., Mevkin А.Т., Hagradova U.K. (1977). "A convenient method for the estimation of sepharose-bound protein". Analytical Biochemistry, 83, 778-781.

44. Golovina Т.О., Muronetz V.I., Nagradova Ж.К. (1978). "Half-of-the-sites reactivity of rat skeletal muscle D-glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochim. Biophys. Acta, 524, 15-25.

45. Grazi E., Magri E., Traniello S. (1973). "Active subunits of rabbit liver fructose diphosphatase". Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 1321-1325.

46. Grazi E., Trombetta G. (1980). "Aldolase-substrate intermediates and their interaction with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in a reconstructed glycolitic system". Eur.J, Biochem., 107, 369-373.

47. Green N.M., Toms E.J. (1973). "The properties of submits of avidin coupled to sepharose." Biochem. J., 133, 687-700.

48. Harada K., Wolfe R.G. (1968). Malic dehydrogenase. VII. The catalytic mechanism and possible role of identical protein subunits". J.Biol.Chem., 243, 4131-4137.

49. Harrington W.F., Karr G.M. (1965). "Subunit structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J.Mol.Biol., 13, 885.

50. Hajdu J., Solti M., Priedrich P. (1975). "Cross-linking and coupling of rabbit muscle aldolase and glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase by glutaraldehyde". Acta Biochim. et Biophys. Hung., 10, 7-16.

51. Hoagland V.D., Jr. and Teller D.C. (1969). Influence of substrate on the dissociation of rabbit muscle D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 8, 594-602.

52. Holland M.G., Westhead E.W. (1973). "Chemical reactivity at the catalytic sites of aspartic-semialdehyde dehydrogenase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 12, 2276-2281.

53. Horecker B.L., Kornberg A. (1948). "The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides". J.Biol. Chem., 175, 385.

54. Huskins K.R., Bernhard S.A. (1982), Dahlquist P.W. "Halibut muscle 3-phosphoglyarate kinase. Chemical and physical properties of the enzyme and its substrate complexes". Biochemistry, 21, 4180-4188.

55. Ikeda S., Pukui S. (1974). "Studies of the activity of sub-units of aspartate-4-decarboxylase immobilized on sepharose". Eur.J.Biochem., 46, N 3, 553-558.

56. Jaenicke R., Schmid D., Knof S. (1968). "Monodispersity and quaternary structure of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 7, 919-926.

57. Jaenicke R. (1974). "Reassociation and reactivation of lactic dehydrogenase from the unfolded subunits". Eur.J.Biochem,, 46, 149-155-.

58. Jaenicke R., Rudolph R., Heider J. (1979). "Quaternary structure, subunit activity and in vitro association of porcine mitochondrial malic dehydrogenase". Biochemistry, 18, 12171222.

59. Girotti A.W. (1976). "Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the isolated human erythrocyte membrane: selective displacement by bilirubin". Arch. Biochem. Biophys., 173, 210-218.

60. Jurgensen S.R., Wood D.C., Mahler J.C. (1981). "The immobilization of mitochondrial malate dehydrogenase on sepharose beads and demonstration of catalytically active subunits".

61. J.Biol.Chem., 256, 2383-2388.

62. Kalman M., Boross L. (1982). "Characterization of enzyme-enzyme interaction using an affinity batch system". Biochim, Biophys. Acta, 704, 272-277.

63. Kelemen N., Kellershohn N., Seydoux P. (1975). "Sturgeon glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Formation of binary complexes with coenzymes and substrates". Eur. J. Biochem., 57, 69-78.

64. Kellershohn N., Seydoux F. (1979). "Functional asymmetry of tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the transient kinetics of reductive dephosphorylation of 1,3-diphosphoglycerate". Biochemistry, 18, 112.

65. Klichko V.I., Ivanov M.V. and liagradova U.K. (1982). "Conformational non-equivalence of subunits in apoglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase detected by a cationic fluorescent probe". Biochem. Int., 5, 77-84.

66. Kochetov G.A., Nikitushkina L.J., Chernov N.N. (1970). "A complex of functionally-bound enzymes: transketolase and gly-ceraldehydephosphate dehydrogenase". Biochem. Biophys. Hes. Commun., 40, 873-879.

67. Koch-Schmidt A.C., Mosbach K. (1977). "Studies of conformation of soluble and immobilized enzymes using different scanning calorimetry. I. Thermal stability of nicotinamide adenine dinucleotide dependent dehydrogenases". Biochemistry, 16, 2101-2105.

68. Koshland D.E., Conway A., Kirtley M.E. "Conformational changes and mechanism of action of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". In "The regulation of enzyme activity and allosteric interactions". Universites Porlaget, Oslo, 131-143.

69. Krebs E.G. (1955). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from yeast. In "Methods in Enzymology"(Editors: S.P.Colowick and И.О.Kaplan) v.1, p.407-411. Academic Press, Hew York.

70. Krietsch W.K.G., Biicher P. (1970). "3-phosphoglycerate kinase from rabbit skeletal muscle and yeast." Eur.J.Biochem., 17, 568-580.

71. KrimBki J., Racker E. (1955). "Acyl derivatives of glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Science, 1225, 319-321.

72. Lakatos S., Zavodszky (1976). "The effect of substrates on the association equilibrium of mammalian D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase". FEBS Lett., 63, 145-148.

73. Lasch J., Iwig M., Koelch R. (1975). "Studies of the distribution of proteins bound to CNBr-activated sepharose 6B at the electron-microscopic level". Eur. J. Biochem., 1975, 60, 163-167.

74. Lasch J., Bessmertnova L., Kozlov L.B., Antonov V.K. (1976). Thermal stability of immobilized enzymes; circular dichroism, fluorescence and kinetic measurements of -chymotrypsin attached to soluble carriers". Eur.J.Biochem., 63, 591-598.

75. Letke G., Bohnensack R. (1975). Investigations on the binding of soluble GAPD to the membrane fraction of rabbit reticulocytes". FEBS Lett., 54, 93-96.

76. Levitzki A. (1973). "Ligand-induced half-of-the-sites reactivity in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 889-893.

77. Levitzki A. (1974). "Half-of-the-sites and all-of-the-sites reactivity in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J.Mol.Biol,, 90, 451-458.

78. Leslie,A.G.W., Wonacott A.G. (1983). "Coenzyme binding in crystals of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase".

79. J.Mol.Biol., 165, 375-395.

80. Leslie A.G.W., Wonacott A.J. (1984). "Structural evidence for ligand-induced sequential conformational changes in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J.Mol.Biol., 178, 743-772.

81. Little C., O'Brien P.G. (1969)."Mechanism of peroxide-inacti-vation of the sulphydryl enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase'", Eur. J.Biochem., 10, 533-538.

82. Malhotra O.P., Bernhard S.A. (1968). "Spectrophotometric identification of an active site-specific acyl glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. The regulation of its kinetic and equilibrium properties by coenzyme". J.Biol.Chem., 243, 1243-1252.

83. Malhotra O.P., Bernhard S.A. (1981). "Role of nicotinamide adenine dinucleotide as an effector in formation and reactions of acylglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 20, 5529-5538.

84. Malhotra O.P., Bernhard S.A., Seydoux P. (1981). Structural and functional consequences of subunit interactions in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemie, 63, 131-141.

85. Marmocchi P., Mavelli I., Rigo A. (1982), Stevanato R., Bossa P., Rotelio G. "Succinylated copper, zinc superoxide dismutase. A novel approach to the problem of active sub-units". Biochemistry, 21, 2853-2856.

86. Masters C.G., Winzor D.G. (1980). "Physicochemical evidence against the concept of an interaction between aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Arch.Biochem. Biophys., 209, 185-190.

87. McCracken S., Meigen E. (1979). "Elucidation of the quaternary structure of reversibly immobilized alcaline phosphate derivatives". Can.J.Biochem., 57, 834-842.

88. McDaniel C.P., Kirtley M.E. (1975). "The interaction of gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with human erythrocyte membranes". Biochem.Biophys.Res.Commun., 65, 1196-1200.

89. Methods in Enzymology (Ed.Colowick S.P., Kaplan N.O.), 1976, 44, 999, New York.

90. Millar D.B. (1974). "The quaternary structure of lactate dehydrogenase. II. The mechanisms, kinetics and thermodynamics of dissociation, denaturation and hydridization in ethylene glycol". Biochim. Biophys. Acta, 359, 152-176.

91. Mills C.C., Hill F.L. (1971). "Metabolic control mechanisms in human erythrocytes. The role of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Arch.Biochem.Biophys., 147, 306-311.

92. Moras D., Olsen K.W., Sabesan M.N., Buehner M., Ford G.C., Rossmann M.G. (1975). "Studies of asymmetry in the three-dimensional structure of lobster D-glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase". J.Biol.Chem., 250, 9137-9162.

93. Müller G., Pfleiderer G. (1980). "Factors affecting the activity of immobilized enzymes. I. Diffusional limitations". Hoppe-Seyler's Ztschr.Physiol.Chem., 361, 675-680.

94. Muronetz V.l., Zueva V.S., Nagradova N.K. (1979). "Half»of-the-sites reactivity in immobilized hybrides of glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase". FEBS Lett., 107, 277-280.

95. Muronetz V.l., Golovina T.C., Nagradova N.K. (1976)."Rat skeletal muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: adenine nucleotide-induced inactivation". Arch.Biochem. Biophys., 177, 16-23.

96. Murthy M.R.N., Garavito R.M., Gohnson G.E., Rossman M.G.1980). "Structure of lobster apo-D-glyceraldehyde-3-phosophate dehydrogenase at 3 A resolution". J.Mol.Biol., 138, 859-872.

97. Nagradova N.K., Golovina T.O., Mevkch A.T. (1974). "Immobilized dimers of D-glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase". FEBS Lett. 49, 242.

98. Nagradova N.K., Muronetz V.l., Grozdova I.D., Golovina T.O. (1975). "Gold inactivation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rat skeletal muscle". Biochim. Biophys. Acta, 377, 15-25.

99. Naoi M., Yagi K. (1978). "Tryptic digestion of immobilized

100. D-amino acid ixidase". FEBS Lett., 88, 231-233.-137108. ITegelein E., Bromel H. (1939). 1,3-Diphosphoglycerinsaure,ihre Isoliering und Eigenschaften". Biochem. Z., 303, 132-144.

101. Oguchi M., Gerth E., Fitzgerald B., Park J.H. (1973). "Regulation of glyaraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by phospho-creatine and adenosine triphosphate. IV. Factors affecting in vivo control of enzymatic activity". J.Biol.Chem., 248, 5571-5576. <

102. Olsen K.W., Moras D., Rossmann M.G., Harris J.I. (1975). "Sequence variability and structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J.Biol.Chem., 250, 9313-9321.

103. Osborne H.H., Hollaway M.R. (1975). "The investigation of substrate induced changes in subunit interactions in glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase by measurement of the kinetics and thermodynamics of subunit exchange". Biochem.J., 151, 37-45.

104. Ovadi G., Teledi M., Batke J., Keleti T. (1971). "Functional non-identity of subunits and isolation of active dimers of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Eur.J.Biochem., 22, 430-438.

105. Ovadi G., Keleti T. (1978). "Kinetic evidence for interaction between aldolase and D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Eur.J.Biochem., 1978, 85, 157-161.

106. Ovadi G., Salerno C., Keleti T., FaBella P. (1978). "Physicochemical evidence for the interaction between aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Eur.J.Biochem., 90, 499-503.

107. Peczon B.D., Spivey H.O. (1972). "Catalytic sites in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Their number and their kinetic and spectral properties". Biochemistry, 11, 2209-2217.

108. Porter D.H., Cardenas J.M. "Single subunits of sepharose-bound pyruvate kinase are inactive". Biochemistry, 1981, 20, 2532-2537.

109. Price U.S., Radda J.K. (1971). "The binding of NAD+ to rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase studied by protein fluorescence quenching". Biochim. Biophys. Acta, 235, 27-31.

110. Rossi A., Menezes L.C., Pudles J. "Yeast hexokinase A. Succinylation and properties of active subunits". Eur.J. Biochem., 1975, 59, 423-432.

111. Schlessinger J., Levitski A. (1974). "Molecular basis of negative cooperativity in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J.Mol.Biol., 82, 547-562.

112. Scopes R.K. (1971). "An improved procedure for the isolation of 3-phosphoglycerate kinase from yeast". Biochim,J., 122, 89-92.

113. Suydoux P., Bernard S., Pfenniger 0., Payne M., Malhotra O.P. (1973). "Preparation and active site specific properties of sturgeon muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochemistry, 12, 4290-4310.

114. Seydoux T.G., Kelemen N., Kellershohn N., Roucous C. (1976). "Specific interactions of 3-phosphoglycerol-glyceraldehyde3.phosphate dehydrogenase with coenzymes". Eur.J.Biochem., 64, 481-489.

115. Sheek R.M., Berden I.A., Hooghiemetra R., Slater E.C. (1979). "Subunit interaction in rabbit muscle glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase is measured by UAD+ and NADH binding". Biochim. Biophys. Acta, 569, 124-134.

116. Shibata Y., Kronmax M.I. (1967). "Inactivation of glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase". Arch.Biochem.Biophys., 118,410.419.

117. Shwendimann B., Ingbar D., Bernhard S.A. (1976). "On the function of half-site reactivity: intersubunit NAD+ dependent activation of acyl-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase reduction by liADH". J.Mol.Biol., 108, 123-138.

118. Sigel P., Pette D. (1969). "Intercellular localization of glycogenolytic and glycolytic enzymes in white and red skeletal muscle. A gel film method for coupled enzyme reaction in histochemistry". J.Histochem.Cytochem., 17, 225-237.

119. Silman H., Katchalski E. (1966). "Water-unsoluble derivatives of enzymes, antigens and antibodies". Annual.Rev.Biochem., 35, 883-892.

120. Silvestrini M.C., Gilosimo A., Brunori M., Antonini (1978). "Properties of cytochrome C modified by attachment to a carbohydrate polymer". Biochem. J., 169, 257-263.

121. Stallcup W.B., Koshland D.E. (1972). "Half-of-the-sites reactivity of yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". Biochem. Biophys. Res. Commun., 49, 1108-1114.

122. Stallcup W.B., Koshland D.E. Jr. (1973). "Half-of-the-sites reactivity and negative cooperativity. The case of yeastglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase". J. Mol. Biol., 80, 41-52.

123. Stancel G.M., Deal W.C., Jr. (1969). "Reversible dissociation of yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by adenosine triphosphate". Biochemistry, 8, 4005-4011.

124. Szewzuk K., Wblny E,, Wolny H., Baranovsky T. (1961). "Nova metoda ortrzymywanica D-glyceraldehydo-3-fosforanu". Acta Biochim. Polar., 8, 201.

125. Tanner M.J.A., Gray W.R. (1971). "The isolation and functional identification of a protein from the human erythrocyte ghost". Biochem.J., 125, 1109-1117.

126. Tu S.C., Hastings W. (1980). "Physical interaction and activity coupling between two enzymes induced by immobilization of one". Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 249-258.

127. Vallee R.B., Williams R.C., Jr. (1970). "The two-step reversible denaturation of lactate dehydrogenase at low pH". Biochemistry, 14, 2574-2580.

128. Vas M., Batke J. (1981). "Evidence for absence of an interaction between purified 3-phosphoglycerate kinase and glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase", Biochim. Biophys. Acta, 660, 193-198.

129. Weber J.P., Bernhard S.A. (1982). "Transfer of 1.3-diphos-phoglycerate between glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseand 3-phosphoglycerate kinase via an enzyme-substrateenzyme complex". Biochemistry, 21, 4189-4194.

130. Wold P. (1972). "Bifunctional reagents" in "Methods in Enzymology" (Ed.Golowick S.P., Kaplan N.O.) 24, 258, 623651.

131. Wood D.C., Hodges C.T., Harrison J.H. (1978). "The relation of the pH and concentration-dependent dissociation of porcine heart mitochondrial malate dehydrogenase". Biochem. Biophys. Res. Commun., 82, 943-950.

132. Выражаю глубокую благодарность Сергею Евгеньевичу Северину за интерес к работе и ценные советы.

133. Искренне признательна Наталье Константиновне Награ-довой и Владимиру Израилевичу ГДуронцу за постоянное внимание и большую помощь, оказанные мне при выполнении диссертационной работы.