Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полиэлектролитов на функциональную активность и агрегационное состояние глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние полиэлектролитов на функциональную активность и агрегационное состояние глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы"

004612042

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Факультет Биоинженерии и Биоинформатики и отдел биохимии животной клетки НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского

На правах рукописи

ч

Сергей Владимирович Стогов ^

УДК 577.152.121

ВЛИЯНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И АГРЕГАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\ 1 НОЯ 2010

Москва-2010

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Муронец Владимир Израилевич

доктор химических наук,

профессор Изумрудов Владимир Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Чеботарёва Наталья Александровна

доктор химических наук,

профессор Банков Александр Андреевич

Ведущая организация: институт Биоорганической Химии имени М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН *

Защита состоится ОкТЯс>Р^ 2010 г. в " часов на заседании

Диссертационного совета Д.501А)01.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан с е-нт^Ъ ^_2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета — Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназа* катализирующая реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата с образованием NADH, наряду с основной гликолитической активностью проявляет многочисленные негликолитические функции. Имеются данные об участии ГАФД в различных процессах посредством взаимодействия с природными полимерами (белками, нуклеиновыми кислотами), в том числе вовлечение ее в процесс белковой агрегации. На наш взгляд, важным представляется изучение белковой агрегации, по той причине, что она лежит в основе ряда патологических процессов. ГАФД в них принимает самое активное участие как благодаря достаточно высокой концентрации, так и способности специфически связываться с определенными биомакромолекулами (например, амилоидогенными белками). В представленной работе для изучения взаимодействия этого фермента с природными заряженными полимерами мы применяли модельный подход, основанный на использовании различных природных и синтетических полиэлектролитов. Помимо изучения роли полианионов в подавлении агрегации белков мы исследовали возможность их использования для разрушения уже сформировавшихся белковых агрегатов. Изучение данного вопроса представляется нам важным в связи с тем, что переход рекомбинантных белков в состав «телец включения» существенно усложняет или даже делает полностью невозможным получение белковых препаратов в ходе биотехнологических процессов, а определенные типы полиэлектролитов могут быть использованы для их разрушения.

Важным представляется проведенное исследование и с фундаментальной точки зрения. Оно позволяет лучше понять процессы, протекающие в живых организмах. Ведь как в случае созданных нами систем, так и in vivo в основе взаимодействия макромолекул лежат электростатические и гидрофобные взаимодействия. Такой подход позволяет сблизить науку о полимерах с биологическими науками. Цели исследования.

A) Выявление характеристик полианионов, позволяющих им наиболее эффективно предотвращать термоагрегацию ГАФД.

Б) Выявление характеристик полианионов, позволяющих им оказывать минимальное воздействие на функциональное состояние и структуру фермента.

B) Исследование возможности использования полисульфоанионов для растворения «телец включения», состоящих из зелёного флуоресцентного белка или сперматозоидной изоформы ГАФД._

•Список сокращений: ГАФД - глицсральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ГАФДс - сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ДС - декстрансульфат натрия, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, ПАК - полиакриловая кислота, ПАМС - поли-2-акриламид-2-метил-1-нропансулифонат калия, ПАС - полизнетолсульфонат натрия, ПВС - поливинилсульфат калия, ПМАК -полиметакриловая кислота, ПСС - полистиролсульфонат натрия, 3-ФГА - 3-фосфоглицериновый альдегид, ЭДТА - этилендиаминтетраацетат, GFP - green fluorescent protein - зеленый флуоресцентный белок, NAD -никотинамидадениндинуклеотид окисленный, NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

Научная новизна. В настоящей работе была выявлена группа полиэлектролитов -полисульфоанионов, наиболее эффективно предотвращающих термоагрегацию белка. Были выявлены параметры полисульфоанионов, определяющие их эффективность при подавлении термоагрегации. Также при помощи измерения каталитической активности, аналитического ультрацентрифугирования, дифференциальной сканирующей калориметрии, получении спектров кругового дихроизма были изучены параметры полисульфоанионов, определяющие степень их воздействия на ферментативную активность и структуру ГАФД. Таким образом было показано, что наиболее эффективно предотвращают агрегацию и оказывают минимальное воздействие на ферментативную активность и структуру белка гидрофильные высокомолекулярные полисульфоанионы. В этой связи наиболее перспективными соединениями нам представляются сульфатированные полисахариды. Впервые было показано, что наиболее сильное денатурирующее воздействие на белок оказывают короткие гидрофобные заряженные цепи. Также впервые была показана возможность использования полиэлектролитов для разрушения белковых агрегатов. Практическая значимость работы. На основании установленных в нашей работе факторов, определяющих способность полиэлектролитов наиболее эффективно предотвращать белковую агрегацию и при этом оказывать минимальное воздействие на структуру и активность белка, могут быть предложены перспективными соединения (прежде всего сульфатированные полисахариды) для регенерации денатурированных белков. Продемострированная нами возможность разрушения белковых агрегатов при помощи полиэлектролитов, позволяет использовать их для увеличения эффективности биотехнологических процессов, в ходе которых целевой продукт нарабатывается в виде «телец включения».

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также на конференциях «Ломоносов-2007» , «Ломоносов-2008», пятом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2008) и на международной конференции «РЕВ8-2009».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ (3 статьи и 4 тезиса докладов).

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (244 ссылки). Объем работы составляет 120 страниц, содержит 29 рисунков к таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы исследования

Глицеральдегид-З-фосфатдегидуогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill et al., 1975). Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH^SC^. Рекомбинантная сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы была любезно предоставлена Ю.Л. Элькиной.

Зелёный флуоресцентный белок нарабатывали в культуре E.coli BL 21 (DE 3), трансформированная плазмидой рЕТ 21. Индукцию синтеза белка осуществляли при помощи IPTG.

Клонирование рекомбинантной сперматозоидной изоформы ГАФД. Клон MGC:26494 со штаммом E.coli, содержавшим плазмиду с кДНК вставкой полной кодирующей последовательности спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (ГАФДс) был получен через компанию Geneservice Ltd.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при 280 нм, при этом использовали значение А28о°'1% равное 1 (Kirchenbaum, 1972).

Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически по увеличению поглощения NADH при длине волны 340 нм в реакционной среде pH 8,9, содержащей 100 мМ глицин, 100 мМ КН2Р04, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ 3-ФГА и 1 мМ NAD+. Реакцию начинали внесением белка в реакционную среду. Растворы полиэлектролитов готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, pH 7,5. Концентрацию полианинов в растворе рассчитывали относительно заряженных групп полимера.

Кинетику термоагрегации ГАФД измеряли на термостатированном спектрофотометре "SIM Aminco DW - 2000", США. За увеличением количества агрегатов белка следили по увеличению оптического поглощения при 320 нм. В кварцевую кювету вносили 10 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,5, нагревали до 60°С, вносили белок (t = 37°С) в небольшом объёме до конечной концентрации 0,7 мкМ, быстро перемешивали и записывали увеличение оптического поглощения. При работе с полиэлектролитами препараты полимеров вносили в кювету с буферным раствором до необходимой концентрации, процесс термоагрегации начинали внесением белка. Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи программного обеспечения "OriginPro 7.5" (MicroCal ine, США).

Относительную гидрофобиость мономерных звеньев полисульфоанионов оценивали используя коэффициент гидрофобности Ганша - log Р (Hansch and Klein 1986) и рассчитывали с помощью программы ACD Labs.

Термоинактивацию ГАФД (концентрацией 0,7 мкМ) проводили в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,5 мМ ЭДТА в присутствии различных полианионов при температуре 45 °С.

Измерения коэффициента седиментации методом аналитического ультрацентрифугирования проводили при помощи аналитической ультрацентрифуги Beckman Spinco Е, оснащённой фотоэлектрической сканирующей приставкой. Скорость вращения ротора AnF составляла 56000 об/мин. Оптическую плотность определяли при длине волны 280 нм. В пробах, содержащих 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5, концентрация ГАФД составляла 3,5 мкМ, полисульфоанионов - 0,5 мМ.

Анализ термодинамических параметров методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ИСК) проводили на адиабатическом микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия). Измерения проводили при скорости нагрева 1,0 °С/мин в диапазоне температур от 20 до 90°С. Спектры кругового дихроизма получали с помощью спектрополяримертра Chirascan (Applied Photophysics Ltd. UK). Концентрация ГАФД составляла 1,4 мкМ, полисульфоанионов - 200 мкМ. Спектры регистрировали при 25° и 45 °С с интервалом 5 минут в диапазоне 260 — 180 нм.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние полианионов на термоагрегацию ГАФД

В данной работе ГАФД была нами использована в качестве модельного белка для изучения влияния полианионов на процесс белковой термоагрегации. Ранее была обнаружена крайне высокая эффективность полистиролсульфоната натрия (ГТСС) при подавлении термоагрегации белка (Shalova et al. 2005). Однако оставалось невыясненной причина этого явления: она могла заключаться как в большей гидрофобности данного соединения, так и в наличии сульфогрупп. Для того чтобы установить причину этого явления, было проведено сравнение эффективности подавления белковой термоагрегации различными полисульфоанионами и карбоксилсодержащими полианионами. Структурные формулы их мономерных звеньев представлены на Рис. 1 и 2.

За ходом термоагрегации следили следующим образом. Измеряли нарастание оптической плотности растворов, содержащих свободную ГАФД или фермент в смесях с различными полианионами, при 60 °С при 320 нм. На Рис. 3 представлены типичные кинетические кривые термоагрегации свободного белка (кривая 1) и его же в смесях с ПСС (кривые 2-4). Из них мы видим, что даже при относительно небольшой концентрации полианиона (15 мкМ) уровень агрегации значительно снижается (кривая 2). При дальнейшем увеличении концентрации этот эффект лишь усиливается: при наличии 50 мкМ ПСС в пробе агрегация подавлена практически полностью (кривая 4).Также из кинетических кривых мы видим, что основное нарастание

80." к*

Поливмнилсульфаг Полистиролсульфонат Полианетолсульфонат калия, ПВС натрия, ПСС натрия, ПАС

4сн2-снЭ;-I

-ЕСНз-СНЗ^ соон

БОГ

Двкстрансульфзг натрия, ДС

ни о

.-•К

305- ю

Поли-2-акриламид-2-иетил-1-лролансульфонат калия, ПАМС

Рис.1 Структурные формулы мономеров полисульфоанпонов.

Рис.2 Структурные формулы карбоксильных полианионов.

оптической плотности происходит в течение первых 2 минут. Для дальнейших расчетов нами бралось значение оптической плотности через 5 минут после начала инкубации.

Р,

0.4

0,3

Рисунок 3. Кинетические кривые термоагрегации свободного фермента (1) н смесей ГАФД с ПСС.

Концентрация ПСС равнялась: 15 мкМ (2), 20 мкМ (3) и 50 мкМ (4). 10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 60 °С. Концентрация ГАФД 0,7 мкМ.

Время, мин

Эффективность подавления термоагрегации оценивали следующим образом. Брали значение оптической плотности смеси ГАФД и полиэлектролита через 5 минут после начала инкубации О32о- Сравнивали его со значением оптической плотности, которое регистрировали в растворе свободного фермента через 5 минут после начала инкубации О32о, гафд. Чем ближе отношение Оз2(Д)з2о, гафд к нулю, тем эффективнее подавлена агрегация. Если же значение этого отношения близко к 1, значит полианион не оказывает влияния на ход белковой агрегации.

На Рис. 4 представлены результаты сравнения эффективности подавления термоагрегации ГАФД рядом полисульфоанпонов (кривые 1-6) и карбоксильными полианионами (кривые 7, 8). Мы видим, что при концентрации 0,1 мМ любой из полисульфоанионов полностью подавляет термоагрегацию ГАФД. Для достижения подобного эффекта при помощи карбоксильных полианионов необходимо повысить концентрацию заряженных групп более чем на два порядка.

0,01

0,1 1 Полианион, мМ

Рисунок 4. Термоагрегация ГАФД в смесях с различными полисульфо-анионами (1-6) и карбоксильными полианиоиами (7,8): ПВС (1), ДС 1000 кДа (2), ПСС со степенью полимеризации 430 (3), ПАМС (4), ПАС (5), гепарин (6), полиакриловая кислота (7) и иолиметакриловая кислота (8).

Остальные условия те же, что и в подписи к рисунку 3.

Крайнее левое положение на графике занимают кривые 1 и 2, отражающие подавление агрегации в присутствии поливинилсульфата калия и декстрансульфата натрия 1000 кДа. Таким образом, наибольшую эффективность показали не гидрофобные, а, напротив, гидрофильные полисульфоанионы. В то время как наиболее гидрофобные ПСС и ПАС (кривые 3 и 5) подавляют агрегацию значительно менее эффективно. Это свидетельствует о том, что наличие сульфогрупп является основным фактором, определяющим эффективность полианиона при подавлении агрегации.

На Рис. 5 представлены результаты сравнения эффективности подавления термоагрегации при помощи фракций ДС, отличающихся молекулярной массой. Для оценки эффективности действия полиэлектролита можно использовать значение его концентрации в точке помутнения (отношение Вз2о/Оз2о,гафд близко к нулю). В таком случае можно заключить, что ДС с молекулярной массой 1000 кДа (кривая 1) в 4 раза эффективнее ДС с молекулярной массой 100 кДа (кривая 2) и в 10 раз эффективнее ДС с молекулярной массой 5 кДа (кривая 3).

Полианион, мМ

Рисунок 5. Темоагрегация ГАФД в смесях с ДС различных молекулярных масс: 1000 (1), 100 (2) п 5 кДа (3) после 5 минут инкубации.

Остальные условия те подписи к рисунку 3.

же, что и в

Схема, представленная на Рис. 6, иллюстрирует зависимость эффективности подавления агрегации от длины цепи полиэлектролита. Как мы видим на правой части рисунка, высокомолекулярный полиэлектролит предотвращает агрегацию максимально эффективно: белок не агрегирует вовсе. При уменьшении длины цепи эффективность подавления агрегации снижается. Это происходит по той причине, что при одной и той же концентрации

мономерных звеньев часть коротких цепей остаётся свободной. В то время как все длинные цепи входят в состав белок-полиэлектролитных комплексов (Зайцев и др. 1992). При отсутствии полиэлектролита белковые агрегаты образуются значительно быстрее и достигают максимальных размеров.

О »

Рисунок 6. Схема,

иллюстрирующая влияние полиэлектролитов различной степени полимеризации на белковую термоагрегацию.

Э

г}

иолиэлекгролпт

париж-снпыс олшомеры

Влияние полисульфоанионов на структуру и функциональное состояние

ГАФД

Нами было показано, что полисульфоанионы способны наиболее эффективно предотвращать термоагрегацию ГАФД. Дальнейшей нашей задачей было выявление характеристик полисульфоанионов, позволяющих им оказывать минимальное воздействие на функциональную активность и структуру ГАФД. Для этого мы использовали ряд методов: измерение ферментативной активности, аналитическое ультрацентрифугирование, дифференциальная сканирующая калориметрия, круговой дихроизм.

Влияние полисульфоанионов на функциональное состояние ГАФД

При изучении влияния полисульфоанионов на ферментативную активность ГАФД мы основное внимание уделяли двум параметрам: относительной гидрофобности мономерного звена и степени полимеризации.

Для того чтобы определить влияние относительной гидрофобности мономерного звена на активность фермента мы сравнили действие двух полисульфоанионов; относительного гидрофильного ПВС и относительно гидрофобного ПАС.

Как мы видим из Рис. 7А, уже при температуре 25°С относительно гидрофобный ПАС вызывает инактивацию фермента: за 20 минут инкубации ГАФД теряет более 60% активности (кривая 3). В то время как относительно гидрофильный ПВС не оказывал никакого влияния на активность ГАФД (кривая 2). При более высокой температуре 45 °С (Рис. 7 Б) ПВС приводил к ускорению термоинактивации фермента (кривая 2), однако в значительно меньшей степени, чем более гидрофобный ПАС (кривая 3). Активность свободного фермента при этом оставалась практически неизменной (кривая 1).

Активность, % юоЦ.|_|.—

-I 1,2

Активность, %

100

-• 3

5 га 15

Время, мин

Время, мин

Рисунок 7. Каталитическая активность свободного фермента (1) и

ГАФД в смеси с ПВС (2) и ПАС (3) при 25 "С (А) и 45 "С (Б).

10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Концентрация ГАФД 0,7 мкМ.

Концентрация полисульфоанионов 50 мкМ.

Для изучения влияния степени полимеризации полисульфоанионов на активность фермента нами было проведено сравнение воздействия двух фракционированных образцов относительно гидрофильного ДС (с молекулярными массами 5 и 1000 кДа). Ни один из образцов относительно гидрофильного ДС при температуре 25 °С не оказывал влияния на активность фермента. Поэтому сравнение проводили при 45 °С. Из Рис. 8 мы видим, что оба образца ДС ускоряли термоинактивацию ГАФД. Однако в присутствии более низкомолекулярного образца фермент терял свою активность быстрее: через 20 минут после начала инкубации разница между двумя образцами полиэлектролитов составила около 25% исходной активности ГАФД.

Активность, %

Рисунок 8. Каталитическая активность свободной ГАФД (1) и ГАФД в смесях с ДС различных молекулярных масс: 1000 (2) и 5 кДа (3).

Температура 45°С. Концентрация полисульфоаниона 100 мМ. Остальные условия те же, что и в подписи к рисунку 7.

10 15

Время, мин

Таким образом, минимальное воздействие на ферментативную активность ГАФД оказывают относительно гидрофильные высокомолекулярные полисульфоанионы.

Влияние полисульфоанионов на четвертичную структуру ГАФД

Для того чтобы изучить воздействие полисульфоанионов на четвертичную структуру фермента, мы воспользовались методом аналитического ультрацентрифугирования. Нами было установлено, что комплексообразование с гидрофильными полисульфоанионами не вызывает никаких изменений в четвертичной структуре фермента. В случае низкомолекулярного ДС с молекулярной массой 5 кДа, значение коэффициента седиментации практически совпадало с таковым у свободного фермента: 9,2 Б и 9,0 Б соответственно. Комплекс ГАФД с высокомолекулярным ДС 103 кДа осаждается несколько быстрее: значение коэффициента седиментации составляет 10,2 Б. Примерно с той же скоростью осаждается комплекс фермента с ПВС. Коэффициент седиментации равнялся 10,5 Б.

Совершенно иная картина наблюдалась при изучении смесей ГАФД с гидрофобным ПСС (Рис. 9, Табл. 1). В левой части рисунка представлены значения коэффициента седиментации свободного ПСС. Образец со степенью полимеризации 31 не осаждался. Для свободного ПСС наблюдается рост значений коэффициента седиментации от 2,35 Б до 4,4 Б при увеличении степени полимеризации от 77 до 430 (колонка 2 Табл. 1).

В центральной части рисунка отображены значения коэффициентов седиментации, определённые в смесях ГАФД с ПСС различных степеней полимеризации (колонка 3 в Табл. 1.). Здесь также наблюдается рост значений коэффициента седиментации при увеличении длины цепи ПСС. Следует отметить, что во всех случаях значения коэффициента седиментации, полученные для свободного ПСС, меньше, чем определённые в смесях ПСС с ГАФД. Это позволяет сделать вывод о том, что в смесях ГАФД

Степень пополимери-зации ПСС

Рисунок 9. Значения коэффициентов седиментации свободного фермента (правая часть), ПСС с различными степенями полимеризации (левая часть) и их смесей (центральная часть).

10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Концентрация ГАФД 3,5 мкМ. Концентрация ПСС 0,5 мМ.

Таблица 1. Значения коэффициентов седиментации свободного фермента, белок-полиэлектрблитных комплексов и свободного ПСС.

Степень полимеризации ПСС ПСС + ГАФД Форма фермента Свободная ГАФД

31 3,9 в мономер 3,0 8

77 2,35 Э 4,75 8 димер 4,7 3

170 2,9 8 5,37 8 тетрамер 8,9 8

360 3,7 8 8,2 8; 10,2 Э

430 4,4 8 8,6 8; 12,8 Э

с ПСС белок и полисульфоанион существуют не отдельно, а в составе белок-полиэлектролитных комплексов.

В смесях с ПСС со степенями полимеризации 31, 77, 170 определяется одно значение коэффициента седиментации. Следовательно, в системе присутствует один вид комплексов. В то же время при значении степени полимеризации 360 и 430 в смесях определяется 2 компонента. Что указывает на существование двух типов комплексов в системе.

Значение коэффициента седиментации в смеси ГАФД и ПСС со степенью полимеризации 31 составило 3,9 Б. Это больше, чем у мономера ГАФД, но меньше, чем у димера: 3,0 8 и 4,7 Б соответственно. Это даёт основания предполагать, что мы имеем дело с комплексом ПСС с мономерной формой фермента. Мы полагаем, что во всех смесях ГАФД с ПСС существуют комплексы с мономерной формой фермента. В случае ПСС со степенями полимеризации 360 и 430 присутствуют комплексы, характеризующиеся более высоким значением коэффициента седиментации. Вероятно, в этих комплексах фермент находится в форме димеров или даже тетрамеров.

На четвертичную структуру ГАФД оказывают воздействие лишь гидрофобные полисульфоаиионы: они вызывают диссоциацию фермента на субъединицы. Сила этого воздействия увеличивается при уменьшении степени полимеризации полисульфоаниона. Возможные варианты комплексов ГАФД с ПСС представлены на Рис. 10.

л

Уменьшение степени полимеризации полиэлекгролита

Обозначения;

пгграигрнав форм! 6слк( -0- гнлрафобнмЦ

О ли мерная — форм* белка - ГКЛрифобиые

_ моишгршя форма <*лм ч — пряженные алигвм«ры

Рисунок 10. Предполагаемая структура белок-иолиэлектролнт-ных комплексов, образующихся в смесях ГАФД с ПСС.

Влияние полисульфоанионов на третичную структуру ГАФД

Для изучения влияния комплексообразования на третичную структуру фермента мы воспользовались дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК). При этом мы анализировали такие параметры как калориметрическая энтальпия (Нса|), температура, соответствующая максимуму теплопоглощения (Тт) и полуширина пика на кривой теплопоглощения (АТт).

Сначала мы сравнили воздействие высокомолекулярных полисульфоанионов. Данные ДСК, полученные таким образом (Рис. 11), говорят о сильном изменении термодинамических параметров плавления и, следовательно, изменениях структуры молекулы ГАФД в присутствии полисульфоанионов. Кривые теплопоглощения могут быть разделены на три группы. В первой окажутся кривые, полученные при изучении воздействия гидрофильных полимеров: ПАМС, ДС и гепарина (кривые 2,3,6). Все они характеризуются относительно большой высотой и малой полушириной пиков теплопоглощения. Иными словами, плавление связанной ГАФД происходит кооперативно при сохранений большей части структурных элементов, хотя и при существенно более низкой температуре, чем свободного белка. Весьма сильно от них отличаются кривые теплопоглощения, выделяемые в третью группу: ПСС и ПАС (кривые 5, 7). Пики на них низкие и широкие, что говорит о снижении кооперативное™ плавления и уменьшении доли упорядоченных структур в молекуле фермента. Промежуточное положение между этими группами занимает ПВС (кривая 4).

Ср, кДж/моль*К

Рисунок 11. Кривые тепло-поглощения свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с различными полисульфоанионами: ПАМС (2), гепарин (3), ПВС (4), ПСС со степенью полимеризации 430 (5), ДС, 103 кДа (6) и ПАС (7).

Концентрация полианионов 1 мМ. Остальные условия те же, что и в 40 50 60 70 ПОДПИСИ К рисунку 3.

Температура,°С

Таким образом, было показано, что с ростом гидрофобности полисульфоаниона возрастает его денатурирующее воздействие. После этого мы исследовали влияние другого параметра: длины цепи. Как уже было известно, длина цепи полиэлектролита - один из ключевых параметров, определяющих эффективность предотвращения агрегации. Однако не было в достаточной степени изучено влияние этого параметра на стабильность белка.

На рис. 12 представлены кривые теплопоглощения свободного фермента (кривая 1) и ГАФД в смесях с ДС, различающимися молекулярными массами (кривые 2-4). Как мы видим из представленного графика и таблицы 4, с уменьшением длины цепи значение максимума и полуширина пика на кривой теплопоглощения изменяются крайне незначительно. В то же время высота пика и, соответственно, калориметрическая энтальпия изменятся весьма существенно. При уменьшении молекулярной массы ДС с 1000 до 5 кДа значение калориметрической энтальпии уменьшается почти в два раза.

Ср, кДж/моль'К

Рисунок 12. Кривые теплопоглощения свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ДС различных молекулярных масс: 1000 (2), 100 (3) и 5 кДа (4).

Условия те же, что и в подписи к рисунку 11.

60 70

Температура,"С

Таблица 4. Зависимость термодинамических характеристик плавления ГАФД от молекулярной массы связанного с ним ДС.

Молекулярная масса, кДа ЛНса| А ш» ^ ДТт, "С

1000 2014,96 49,1 5,2

100 1307,24 48,3 5,1

5 1022,96 48,3 5,1

Наиболее ярко дестабилизирующее воздействие коротких заряженных цепей проявилось в смесях ГАФД с относительно гидрофобным ПСС (Рис. 13). Связывание с наиболее высокомолекулярным образцом со степенью полимеризации 430 уже приводило к сильной дестабилизации фермента (кривая 2). При снижении степени полимеризации происходило уменьшение значений ЛДя1 и Тт. Когда же степень полимеризации ПСС достигла 8 звеньев, максимум на кривой теплопоглощения не был зарегистрирован вовсе - столь значительны

Рисунок 13. Кривые тепло-поглощения свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ПСС различных степеней полимерии-зации: 430 (2), 77 (3) и 31 (4).

Условия те же, что и в подписи к рисунку 11.

Температура,°С

Эти данные хорошо согласуются с ранее выявленным сильным денатурирующим воздействием ПСС на ГАФД (Shalova et al. 2005) и лизоцим (Cousin etal. 2005).

Есть основания полагать, что повышение денатурирующего воздействия полимера при уменьшении длины его цепи не является отличительной особенностью изучаемой системы, а носит более общий характер. Так ранее были получены интересные результаты при изучении влияния карбоксильных полианионов на термодинамические параметры плавления лизоцимы (fvinova et al. 2003). Было обнаружено, что в результате уменьшения степени полимеризации полиакрилата калия с 2400 до 70 высота пика на кривой теплопоглощения уменьшилась более чем в два раза.

Таким образом, было показано, что с ростом гидрофобности структурных звеньев или уменьшением степени полимеризации полисульфоанионов возрастает и их денатурирующее воздействие.

Влияние полисульфоанионов на вторичную структуру ГАФД

Для изучения воздействия комплексообразования с различными полисульфоанионами на вторичную структуру фермента мы использовали регистрацию спектров кругового дихроизма. Мы не ставили перед собой задачу соотнести изменения в спектре с перераспределением доли элементов вторичной структуры. Нас интересовало, происходят ли эти изменения и в каких случаях они более выражены.

Нами было установлено, что при 25°С ни один из гидрофильных полисульфоанионов не оказывал сколь либо заметного влияния на спектр кругового дихроизма ГАФД (кривая 2 на Рис. 14). В то время как присутствие

были нарушения структуры белка.

относительно гидрофобного ПСС приводило к изменениям спектра кругового дихроизма (кривая 3 на Рис. 14).

К НМ

Рисунок 14. Спектры кругового дихроизма свободного фермента (1) и ГАФД в смесях с ПВС (2) п ПСС со степенью полимеризации 8 (3).

10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 25 °С. Концентрация ГАФД 1,4 мкМ. Концентрация полианионов 200 мкМ.

При более высокой температуре (45 °С) изменения в спектре кругового дихроизма стали более значительны (Рис. 15). К наибольшим изменениям спектра ГАФД (кривая 1) приводило наличие гидрофобного ПСС со степенью полимеризации 8 (кривая 2).

[0], град/ М*см

15000

220 240

X, НМ

Рисунок 15. Спектры кругового дихроизма свободного фермента (1) и ГАФД в смеси с ПСС со степенью полимеризации 8 (2).

10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 45 °С. Концентрация ГАФД 1,4 мкМ. Концентрация ПСС 200 мкМ.

Для того чтобы провести сравнение степени воздействия различных полисульфоанионов мы использовали значение эллиптичности при длине волны 222 нм. Минимум, наблюдаемый на спектре при этой длине волны, возникает благодаря а-спиралям. Таким образом, возрастание значения эллиптичности сообщает об уменьшении их доли и дезорганизации структуры белка в целом. Результаты сравнения представлены на Рис. 16.

Из него мы видим, что инкубация при 45°С при полном отсутствии полианионов (кривая Г) вызывает небольшое возрастание эллиптичности. Все без исключения полисульфоанионы в той или иной степени нарушают структуру ГАФД. Гидрофильные ДС (кривые 2 и 3), вне зависимости от своей молекулярной массы, оказывают одинаковое воздействие на фермент, лишь немного увеличивая значение эллиптичности. Наибольшее воздействиё на белок оказывает ПСС со степенью полимеризации 8 (кривая 6). Следует

[в] , град/ М*см

-6000

6

5

4

-7000

2,3

10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 45 "С. Концентрация ГАФД 1,4 мкМ. Концентрация полисульфоанионов 200 мкМ.

1

-вооо

о

5

10

15

20

Время, мин

отметить, нто в его присутствии значение эллиптичности не изменяется во времени. Несколько меньшее возрастание эллиптичности наблюдали в присутствии ПСС со степенью полимеризации 430. ПВС занимает промежуточное положение: он приводит к значительному возрастанию эллиптичности, однако оно не столь велико, как в случае гидрофобных ПСС.

На основании представленных данных можно сделать следующее заключение. С ростом гидрофобности полисульфоаниона возрастает его денатурирующее воздействие. Наибольшие нарушения структуры белка наблюдаются в случае низкомолекулярного ПСС.

Изучение возможности использования полисульфоанионов для растворения белковых агрегатов

В качестве объектов исследования нами были выбраны «тельца включения», состоящие из зелёного флуоресцентного белка (СРР) или рекомбинантной спермоспецифической ГАФД (ГАФДс). Следует отметить, что в литературе имеются данные о разрушении белковых агрегатов при помощи хаотропных агентов (мочевина, гуанидингидрохлорид) и/или детергентов (ЗБЗ). Однако нами не было найдено упоминаний об использовании для этой цели полиэлектролитов.

Сначала нами было проведено разрушение агрегатов ОГР («телец включения» выделенных из клеток продуцентов этого белка) при помощи полисульфоанионов. Было показано, что инкубация «телец включения» с полисульфоанионами приводит к их частичному растворению. За переходом белка СИР в раствор можно следить по изменению его спектральных характеристик. Так было показано, что характерное для белков поглощение при 280 нм в растворе возрастает. Однако появления характерной для ОБР

Д, ----- .. ~ - ------ - ~ п^поп^! ПЛТ^ГПП Т Г ПМ1 ГГТ^ТТ/Ч ТТО ^Т.ТГТГ>

ШЛУииС^ЦСЛЦИП а ^^Л^пип иила^Щ ЧУ V дыр} Л\ИУ 11 - - •'"'

предположили, что отсутствие флуоресценции может быть обусловлено ее тушением или денатурацией белка при связывании с полианиоми. Полученные результаты были подтверждены при помощи динамического лазерного светорассеяния. Как мы видим из рис. 17, большинство исходных белковых агрегатов имеет гидродинамический диаметр около 600 нм. Наличие в пробе 0,2

мМ поливинилсульфата калия (ПВС) приводит к тому, что уменьшается доля крупных белковых агрегатов и появляются частицы диаметром 19 нм. Дальнейшее увеличение концентрации ПВС приводит к тому, что крупные агрегаты практически исчезают. Основная масса частиц имеет гидродинамический диаметр около 14 нм. Сам же ПВС в растворе образует частицы диаметром всего 9 нм. Это позволяет предположить, что образующиеся в ходе растворения частицы диаметром около 14 нм представляют собой белок-полиэлектролитные комплексы.

Также возможность растворения «телец включения» при помощи полисульфоанионов была показана на другом объекте: рекомбинантной сперматозоидной изоформе ГАФД (ГАФДс). Особенностью данного фермента является наличие гидрофобного участка, богатого остатками пролина. Это приводит к тому, что в клетках Е. соН этот белок. практически полностью находится в нерастворимом состоянии в виде «телец включения».

Для изучения растворения этого типа «телец включения» кроме описанных выше спектральных методов мы использовали электрофоретический анализ и определение ферментативной активности. Было показано, что также как и в случае белка ¿РР, «тельца включения» содержащие ГАФДс могут быть переведены в растворимое состояние с помощью полисульфоанионов. Однако, обнаружить ферментативную активность в растворенных форм ГАФДс на не удалось. Был также проведен анализ растворенных препаратов ГАФДс с помощью электрофореза ■ в присутствии додецилсульфата натрия. Для проведения этих экспериментов мы смешивали равные объёмы суспензии «телец включения» с ГАФДс и 100 мМ полисульфоаниона поливинилсульфата калия (ПВС) и инкубировали 30 минут. Затем нерастворимые белки отделяли

100 1000 10000

Размер

Рисунок 17. Гидродинамический диаметр частиц, определённый для телец включения СИ' при различных концентрациях ПВС, мМ: 0 (А), 0,2 (Б), 0,3 (В) п 1,0 (Г) и свободного ПВС (Ц).

10 мМ фосфатный буфер рН 7,5. Температура 25°С. Концентрация СРР 0,28 мкМ.

ю

центрифугированием (15 мин при 5000 g). Из полученного таким образом супернатанта отбирали пробы для электрофоретического разделения. Результаты представлены на Рис. 18.

66 Рисунок 18. Электрофореграмма супернатантов

после инкубации ГАФДс (1) с ПВС (2).

36 29

24 "* Дорожка 2 - супернатант после инкубации ГАФДс

19 „ „ : с ПВС.

Дорожка 3 - супернатант после инкубации ГАФДс без ПВС.

Дорожка 1 - белки-маркёры (слева указаны их молекулярные массы).

Как видно из прведенных данных, в отсутствии ПВС в пробе (дорожка 3) весь белок остаётся в нерастворимом состоянии. В то же время, совместная инкубация с ПВС приводит к тому, что существенная часть белка переходит в растворимое состояние (дорожка 2). При этом в раствор переходит белок с молекулярной массой, соответствующей ГАФДс (около 40 кДа), а также минорные компоненты с более низкой молекулярной массой (возможно, продукты протеолиза ГАФДс).

Таким образом, нами было показано, что полисульфоанионы могут быть использованы для переведения в растворимое состояние белков, содержащихся в «тельцах включения». Растворенные белки в виде комплексов с полимерами могут быть использованы для решения ряда задач, прежде всего при их применении в качестве антигенов для получения антител. Однако получение таких растворенных белков в функционально активном состоянии требует индивидуального подбора условий для их правильного сворачивания.

выводы

1. Показано, что полнсульфоанионы (синтетические, природные и модифицированные природные) наиболее эффективно предотвращают термоагрегацию ГАФД, при этом основную роль в их действии играет сильное электростатическое связывание, обусловленное наличием сульфогрупп.

2. Показано, что эффективность защитного действия полисульфоанионов от термоагрегации увеличивается при повышении степени их полимеризации и относительной гидрофильности.

3. Показано, что полнсульфоанионы, способные подавлять термоагрегацию и оказывать при этом минимальное денатурирующее воздействие на белок, должны обладать высокой степенью полимеризации и относительной гидрофильностью.

4. Обнаружено, что наиболее сильное денатурирующие действие на олигомерный белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу оказывают короткие гидрофобные полнсульфоанионы, а также нефракционированные образцы сульфоанионов.

5. Показано, что полнсульфоанионы могут быть использованы для растворения телец включения, состоящих из зелёного флуоресцентного белка или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Yu.L. Elkina, M.L. Kuravsky, M.A. El'darov, S.V. Stogov, V.I. Muronetz, E.V. Schmalhausen (2010) Recombinant Human Sperm-Specific Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase: Structural Basis for Enhanced Stability. Biochim. Biophys. Acta, DOI: 10.1016/j.bbapap.2010.09.002.

2. C.B. Стогов, B.A. Изумрудов, В.И. Муронец (2010) Изменение структуры белка определяется гидрофобностыо и длиной цепи связанного с ним полиэлектролита. Биохимия. 75(4), с. 437-442.

3. С.В. Стогов, В.И. Муронец, В.А. Изумрудов (2009) Короткие синтетические полиэлектролиты наиболее эффективно дестабилизируют белки. Доклады Академии паук, 427(2), с. 265-269.

4. S. Stogov, V. Muronetz, V. Izumrudov (2009) Synthetic polyelectrolytes as a tool for artificial chaperons creation. FEES Journal (Suplement) 276(1), p. 166-167.

5. В.И.Муронец, А.П. Плетень, И.Н. Налетова, Г.Г. Киселев, С.В. Стогов, Е.В. Шмальгаузен (2008) Активаторы системы шаперонов как средства профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы. Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, с. 239-240.

6. C.B. Стогов (2008) Введение гидроксильных групп в поли-Ы-этил-4-винилпирадиниевый катион как способ повышения эффективности подавления термоагрегации белков синтетическими полиэлектролитами. XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Секция Биологии, Подсекция Биохимии, Москва, с. 46-47.

7. C.B. Стогов (2007) Влияние сополимера НЫ-диметилакриламида и N-акрилоил-т-аминофенилборной кислоты на активность и термоагрегацию ГАФД из скелетных мышц кролика. Тезисы докладов XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» Секция Биологии, Подсекция Биохимии, Москва, с. 39-40.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 939-33-38 Объём 1,0 печ.л. Тираж 70 экз. Подписано в печать 13.09.2010 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Стогов, Сергей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Б-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура, свойства и функции.

Структура глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы.'.

Механизм дегидрогеназной реакции.

Многофункциональность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Синтетические полиэлектролиты и их полнкомплексы.

Основные свойства полиэлектролитных комплексов.

Основные свойства белок-полиэлектролитных комплексов.

Применение синтетических полиэлектролитов в биотехнологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Методы.

Выделение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.

Выделение телец включения, содерэ/сащих зелёный флуоресцентный белок.

Определение концентрации реагентов.

Определение концентрации белков.

Определение активности глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

Приготовление растворов полиэлектролитов.

Термоинактивация глгщералъдегид-З-фосфатдегидрогеназы в смесях с полиэлектролитами.

Кинетика агрегации белка.

Метод дифференциальной сканирующей калориметрии.

Получение спектров кругового дихроизма.

Спектрофотометрическое изучение растворения телец включения ОГР

Метод динамического лазерного светорассеяния.

Электрофорез белков по методу Лэммли.

Рассчёт относительной гидрофобности мономерных звеньев полисулъфоанионов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Раздел 1. Влияние полианионов на термоагрегацию ГАФД.

Раздел 2. Влияние полисульфоанионов на структуру и функциональное состояние ГАФД.

Влияние полисульфоанионов на функциональное состояние ГАФД.

Влияние полисульфоанионов на четвертичную структуру ГАФД.

Влияние полисульфоанионов на третичную структуру ГАФД.

Влияние полисульфоанионов на вторичную структуру ГАФД.

Раздел 3. Изучение возможности использования полисульфоанионов для растворения белковых агрегатов.

ВЫВОДЫ.