Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений

Матасова, Лариса Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений"

На правах рукописи

МЛТЛСОВА Лариса Владимировна

ФОСФОГЛЮКОМУТАЗА И ФОСФОМАННОМУТАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж -1998

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета

Научный руководитель - доктор биологических наук.

профессор Попова Т.Н.

Официальные оппоненты доктор биологических наук.

профессор Пашков А Н.

доктор оиологических наук.

профессор Измайлов С Ф

Ведущая организация - Институт биохимии РАН имени А Н Баха

Защита состоится 24 ноября 1998 года в 13 30 час на заседании Диссертационного Совета Д 063.48 11 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693, Воронеж. Университетская пл.. 1 С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан2?октября 1998 года.

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

кандидат биологических наук, доцент

Ковалева Т. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование особенностей функционирования, регуляции активности, механизма действия ферментов представляет интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения. Знание структуры и характеристик ферментов, разработка способов их выделения являются объектом внимания медицины и некоторых отраслей промышленности, поскольку ферментные препараты широко используются в диагностических и лечебных целях, практике лабораторных исследований, промышленном синтезе ряда биологически активных соединений. Исследования отдельных ферментных систем позволяют приблизиться к глубокому анализу регуляции метаболизма высших растений на уровне клетки с выходом на более высокий организменный уровень

В этом плане многие аспекты регуляции метаболизма изучены крайне недостаточно. Это относится, в частности, к ферментам, катализирующим взаимопревращения гексозомонофосфатов: фосфоглюкомугазе (ФГМ, КФ 2.7 5.1) и фосфоманномутазе (ФММ, 2.7.5.5). Как правило, ФГМ встречается в клетках в большом количестве и является важным пунктом регуляции обмена запасных Сахаров (Galloway, Dugger, 1994). Этап ФММ реакции необходим для синтеза различных полисахаридов маннановой структуры, в том числе составляющих матрикс клеточкой стенки, а также компонентов гликопротеидов (Small. Matheson , 1979) ФГМ была выделена и охарактеризована из ряда объектов, в основном микроорганизмов и тканей животных (Ray, lr. Peck, Гг. ¡972; Joshi. Lane, I97S), ФММ - малоизученный фермент. Ряд аспектов функционирования ФГМ и ФММ в клетках высших растений остается практически неисследованным Поскольку метаболизм углеводов в растительной клетке протекает в основном в двух компартментах: цитозоле и хлоропластах, представляет интерес изучение субклеточной локализации ФГМ и ФММ в растительной клетке и возможное участие данных ферментов в сопряжении процессов, протекающих в различных компартментах клетки. До сих пор остается открытым вопрос о субстратной специфичности ФГМ и ФММ. Исследование каталитических и регуляторных свойств данных ферментов имеет существенное значение для понимания физиолого-биохимической роли ФГМ и ФММ в клеточном метаболизме высших растений.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование распространения, субклеточной локализации, свойств и регуляции активности ФГМ и ФММ высших растений. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение и субклеточную локализацию ФГМ и ФММ в высших растениях. Исследовать изменение активностей ферментов при прорастании семян некоторых растений.

2. Разработать эффективные методы получения высокоочищенных препаратов ФГМ и ФММ из различных растений.

3. Провести изучение субстратной специфичности ФГМ и ФММ

4 Исследовать и сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные свойства ФГМ и ФММ из разных растений,

5. Дать сравнительную характеристику различно локализованных форм

ФГМ.

6. Провести исследование влияния некоторых внешних факторов (засоления, света) на ФГМ и ФММ

7. С учетом особенностей свойств ФГМ и ФММ разработать гипотетическую схему регуляции и сопряжения метаболических процессов в различных компартментах растительной клетки на уровне данных ферментов

Научная новизна. Показано, что ФГМ и ФММ встречаются в высших растениях в виде различно компартментализованных форм: цитоплазматической и хлоропластной; причем преобладающей формой является цптоплазматическая Г-80-95% от общей активности). Разработаны эффективные способы выделения и впервые получены высокоочишенные (в том числе гомогенные) ферментные препараты ФГМ и ФММ листьев гороха и кукурузы. Впервые проведены комплексные исследования свойств и дана сравнительная характеристика различно компартментализованных форм ФГМ. Показано, что для различно компартментализованных форм ФГМ наряду со сходными чертами характерны существенные отличия (чувствительность к субстратному ингибированию, концентрациям АТФ, влиянию 3-фосфоглицерата, различные электрофоретические подвижности). Разработаны способы разделения ФММ и ФГМ. Изучены некоторые свойства ФММ листьев гороха и кукурузы. Исследована субстратная специфичность ФГМ и ФММ, и выявлено, что ФГМ является бифункциональным ферментом, в то время как ФММ - монофункциональный фермент. Предложена гипотетическая

схема регуляции метаболизма углеводов в клетке на этапе фосфоглюкомутазной реакции. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления об организации и регуляции углеводного метаболизма растений.

Практическая значимость. Разработанные методы получения электрофоретически гомогенных препаратов ФГМ и ФММ из растений могут применяться в лабораторной практике и производственных условиях для выделения и очистки ферментов. Полученные ферментные препараты могут быть использованы для моделирования сопряженных ферментных систем in vitro. В связи с этим большое значение имеют результаты исследований по изучению специфичности ФГМ и ФММ.

Поскольку реализация потенциальной продуктивности растений во многом зависит от эффективности углеводного обмена, изучение закономерностей его ферментативной регуляции имеет важное значение для изыскания оптимальных путей применения различных биологически активных веществ в практике сельского хозяйства, а также для понимания адаптивных реакций растений на внешние воздействия.

Материалы работы используются в учебном процессе набиолого-почвенном факультете Воронежского госуннверситета при чтении курсов "Энзимология", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апроб.шия работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино. 1996): симпозиуме Российского общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996); 10-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Флоренция, Италия, 1996); VII Всероссийской конференции "Физико-химические основы и применение ионообменных процессов", (Воронеж, 1996); Всероссийской с участием стран СНГ конференции "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996); II Открытой городской научной конференции молодых ученых г.Пущино (Пущино, 1997); II Съезде фотобиологов (Пущино, 1998), II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета (1998).

Публикации. Основные результаты настоящем диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 9 статьях и 6 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Показано существование двух основных фондов ФГМ и ФММ активностей в растительной клетке: цитоплазматического и хлоропластного. В количественном отношении преобладающим является цитоплазматический фонд (80-95% от общей активности).

2. Исследования, проведенные на высокоочищенных ферментных препаратах ФГМ из растении показали, что различно локализованные формы фермента могут участвовать в процессах сопряжения и контроля метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет регуляции ферментативной активности путем изменения концентраций субстратов, адениловых нуклеотидов, ионов некоторых металлов (Mg2~, Мп2'), интермедиатов углеводного обмена (6-фосфоглюконата. фруктозо-6-фосфата, 3-фосфоглицерата) и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (цитрата, изоцитрата)

3. Хлоропластная и цитозольная формы ФГМ, имея сходные каталитические свойства (кинетическое поведение по отношению к ионам Mg" и Мп" . близкие молекулярные массы, оптимумы рН и сродство к субстратам), различаются по электрофоретической подвижности, стабильности, и могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии.

4. Несмотря на сходные хроматографические и каталитические свойства, достигнуто разделение ФГМ и ФММ. Цитоплазматическая ФГМ может катализировать реакцию изомеризации как глюкозо-1-фосфата, так и маннозо-1-фосфата. ФММ, напротив, является моноспецифическим ферментом Выявлены различия в оптимумах рН, сродстве к субстрату, стабильности ФГМ и ФММ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 173 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (137 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 51 рисунок и 21 таблицу; в приложении - 2 рисунка и 7 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве основных объектов исследования служили листья кукурузы (Zea mays L.), сорт "Воронежская-76", и гороха (Pisum

Материалы работы используются в учебном процессе набиолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Энзимология", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пушино. 1S96); симпозиуме Российского общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996); 10-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Флоренция, Италия, 1996), VII Всероссийской конференции "Физико-химические основы и применение ионообменных процессов", (Воронеж, 1996); Всероссийской с участием стран СНГ конференции "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996); II Открытой городской научной конференции молодых ученых г.Пущино (Пущино, 1997); Н Съезде фотобиологов (Пущино, 1998), II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета (1998).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в ¡5 публикациях - 9 статьях и 6 тезисах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Показано существование двух основных фондов ФГМ и ФММ активностей в растительной клетке: цитоплазматического и хлоропластного В количественном отношении преобладающим является цитоплазматический фонд (80-95% от общей активности).

2. Исследования, проведенные на высокоочищенных ферментных препаратах ФГМ из растений показали, что различно локализованные формы фермента могут участвовать в процессах сопряжения и контроля метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет регуляции ферментативной активности путем изменения концентраций субстратов, адениловых нуклеотидов, ионов некоторых металлов (Mg2*, Мп2'), интермедиатов углеводного обмена (6-фосфоглюконата. фруктозо-6-фосфата, 3-фосфоглицерата) и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (цитрата, изоцитрата).

3. Хлоропластная и цитозольная формы ФГМ, имея сходные каталитические свойства (кинетическое поведение по отношению к ионам Mg"' и Мп"'. близкие молекулярные массы, оптимумы рН и сродство к субстратам), различаются по электрофоретической подвижности, стабильности, и могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии.

4. Несмотря на сходные хроматографические и каталитические свойства, достигнуто разделение ФГМ и ФММ. Цитоплазматическая ФГМ может катализировать реакцию изомеризации как глюкозо-1-фосфата, так и маннозо-1-фосфата. ФММ, напротив, является моноспецифическим ферментом. Выявлены различия в оптимумах рН, сродстве к субстрату, стабильности ФГМ и ФММ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве основных объектов исследования служили листья кукурузы (Zea mays L.), сорт "Воронежская-76", и гороха (Pistim

sativum L.), сорт "Зеленозерный". В некоторых экспериментах использовали проростки бобов, тыквы, фасоли, кабачка, пшеницы, подсолнечника и др. растений. Растения выращивали гидропонным способом при 25° в темноте или при освещении дневным светом интенсивностью 15 ООО эрг. см "'с*1.

Выделение клеточных органелл. Разделение субклеточных фракций проводили методом дифференциального центрифугирования, а также методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы (Cooper, Beevers, 1969) на ультрацентрифуге УЦПЗ-47. Маркерным ферментом микротелец служила каталаза, митохондрий - сукцинатдегидрогеназа (СДГ) и цитохром-с-оксидаза, цитоплазмы - лактатдегидрогеназа (ЛДГ), О наличии хлоропластов судили по количеству хлорофилла, которое определяли по методу Уинтермана (Гавриленко и др., 1975).

Определение аю~ивностн ферментов. Для определения активности ферментов использовали спектрофотометрический метод. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоля продукта реакции за 1 мин. при температуре 25°. Активность ФГМ и ФММ определяли при 340 нм (Oesterhelt et al., 1996). Активность цитохром-с-оксидазы определяли при 550 нм; активность ЛДГ - при 340 нм (Гавриленко и др.. 1975), активность СДГ определяли при 600 нм (Cooper. Beevers, 1969); каталазную активность - при 230 нм (Breidenbach eta!., 1968).

Определение общего количества белка проводили по методу Лоури (Lourv et al., 1951), а также по поглощению при 280 нм в высокоочищенных препаратах (Мешкова, Северин, 1979).

Выделение и очистка ферментов. Для получения высокоочищенных препаратов ФГМ и ФММ были разработаны процедуры, включающие несколько стадий. В ходе выделения цитоплазматических форм ферментов после гомогенизации материала проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От низкомолекулярных соединений ферментные препараты отделяли гель-фильтрацией через сефадекс G-25. Далее использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-тойолерле или ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографию на тойоперле HW-65. При очистке хлоропластной ФГМ сначала путем дифференциального центрифугирования выделяли хлоропласты, затем осуществляли солюбилизацию фермента с помощью осмотического шока и

гомогенизатора Поттера. Дальнейшую очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на и ДЭАЭ-фрактогеле и гель-фильтраиии на тойоперле HW-65 Все операции проводили в холодной комнате при 0-4°

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов. Кинетические и регуляторные свойства ферментов изучали на высокоочищенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, ингибирования, расчет Е,кт, рК ионогенных групп осуществляли по Диксону и Уэббу (1982); определение критериев идентичности ферментов - по Холдейну и Диксону (Диксон, Уэбб, 1982).

Аналитический электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ). Разделение изоформ и контроль гомогенности ферментов осуществляли по Дэвису (Davis, 1964) Определение субъединичной молекулярной массы проводили с помощью электрофореза по методу Лэммли (Laemmli. 1980). Для специфического проявления ФГМ в геле использовали тетразолиевый метод (Гааль и др , 1982)

Определение молекулярной массы осуществляли методом гель-фильтрации и методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом Na.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартных статистических методов (Ллойд. Ледерман, 1989). Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации

РАСПРОСТРАНЕНИЕ Н СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФОСФОГЛЮКОМУТАЗЫ Ц ФОСФОМАННОМУТАЗЫ ВЫСШИХ

РАСТЕНИИ

Изучение распространения ФГМ и ФММ показало, что имеет место значительное варьирование ферментативной активности в различных растениях, что, возможно, связано с их видовыми особенностями Наибольшая удельная активность ФГМ присутствует в проростках кукурузы. ФММ - в проростках бобов

Исследование субклеточной локализации и специфическое выявление изоформ ФГМ после электрофореза в ПААГ показало существование в зеленых листьях гороха и кукурузы двух различно локализованных форм, обладающих разной электрофоретической подвижностью.

При сравнении эффективности разрушения органелл различными методами -осмотическим шоком и с помощью детергентов - найдено, что наиболее

эффективным способом солюбилизации ФГМ и ФММ является разрушение органелл осмотическим шоком. Изучение распределения активностей ФГМ, ФММ и маркерных ферментов по клеточным фракциям показало, что наибольшая часть активности ферментов (80-95%) локализована в цитоплазме; 4-18 % активности обнаружено в хлоропластах, процент активности в митохондриальной фракции был незначителен (табл. 1).

Таблица I.

Распределение активностей фосфоглюкомутазы. фосфоманномутазы, маркерных ферментов и содержания хлорофилла по клеточным фракциям листьев

кукурузы

Содержание,% Цитозоль Хлоропласты Митохондрии

ФГМ 96,0±4,0 3,6+0,2 0.4±0,02

ФММ 95,2±4,2 4,8±0.2 -

ЛДГ 92,4±3,8 1,6±0,1 6,0+0,1

СДГ 22,2±1,2 15,9±0,1 61,9±2,2

Хлорофилл 19,4+0,4 62,5 ±0,5 18,1+0,8

Полученные результаты свидетельствуют о наличии двух основных пулов ФГМ и ФММ активностей в листьях гороха и кукурузьг цитозольного и хлоропластного По-видимому, различные изоформы данных ферментов могут быть локализованы в этих клеточных фракциях. Известно, что метаболизм сахарофосфатов в растениях протекает, в основном, в двух компартментах хлоропластах и цитозоле (Heber, 1974; Walker, 1976; Muhlbach , Schnarrenberger, 1978). В связи с этим можно предполагать, что существование различно локализованных изоформ ФГМ и ФММ способствует сопряжению и регуляции процессов метаболизма сахарофосфатов в разных клеточных компартментах.

ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФОСФОГЛЮКОМУТАЗЫ И ФОСФОМАННОМУТАЗЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ Выбор растения, из которого осуществляли выделение и очистку ФГМ и ФММ, определялся уровнем удельной активности ферментов. В качестве источника ферментов использовали зеленые листья 10-12- дневных проростков гороха и 5-6-

дневных проростков кукурузы. Результаты очистки цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы представлены в таблице 2.

В результате 120-кратной очистки был получен ферментный препарат с удельной активностью 11,7 ФЕ/мг белка. Электрофорез в ПААГ показал гомогенность данного ферментного препарата. Были также получены электрофоретически гомогенные препараты цитоплазматической и хлоропластной ФГМ из листьев гороха и частично очищенные препараты хлоропластной ФГМ из листьев кукурузы и ФММ из листьев гороха и кукурузы Получение ферментов в высокоочищенном состоянии позволило исследовать их физико-химические свойства и регуляцию активности.

Таблица 2

Очистка цитоплазматической фосфоглюкомутазы из листьев кукурузы

Стадия очистки Объем мл Кол-во белка, мг Общая активность, ФЕ Удельная активность ФЕ/мг белка Выход % Степень очистки ФГМ/ ФММ

Растительный экстракт 25 242,100 ±0,939 23,521 ±0,795 0,097 ±0,004 100,0 6,3

Фракционирование (КН4)2504 1,3 8,840 ±0,284 3,011 ±0,094 0,339 0,012 12,8 3,5 7,1

Гель-фильтрация на сефадексе в-25 5,5 7,810 ±0,310 4,400 ±0,106 0,560 ±0,013 18,7 5,8 7,3

Хроматография на ДЭАЭ-тойоперле 9,1 0,465 ±0,014 2,11 ±0,067 4,502 ±0,101 9,0 46,4 8,8

Хроматография на тойоперле Н\У-65 5,8 0,0816 ±0,002 0,958 ±0,041 11,700 ±0,190 4,0 120,6 8,9

Молекулярные массы цитоллазматических форм ФГМ из листьев гороха и кукурузы, определенные методом гель-хроматографии на тойолерле НЛУ-бб, сходны и составляют 133±4 кДа; молекулярная масса ФГМ из хлоропластов гороха составляет 125±5 кДа. Величина молекулярной массы ФГМ из хлоропластов кукурузы, по данным гель-хроматографии, равна 158±5 кДа (табл. 3).

Таблица 3.

Некоторые физико-химические и кинетические параметры фосфоглюкомутазы

Источник Кмиж, мкм К „мМ Опти- Молеку-

выделения и глюкозо- глюкозо- глюкозо- Глюкозо- мум лярная

форма ФГМ 1 -фосфат 1,6-бис- 1-фосфат 1,6-бис- рН масса.

фосфат фосфат кДа

Цитоплазмати- 20,0 32,0 1,20 0,61 7,8 133 ±4

ческая ФГМ из ±0,6 ±1,4 ±0,01 ±0,05

листьев гороха

Хлоропластная 18,0 33.0 0.82 0,21 7.9 125±4

ФГМ из листьев =2,0 ±2,0 х0,02 ±0,01

гороха

Цито плазмати- 20,0 16,0 3,3 0,23 8,0 133+4

ческая ФГМ из ±0,9 ±0,8 ±0,1 ±0,06

листьев

кукурузы

Хлоропластная 34,0 не опред. не опред. не опред. 7,8- 158±5

ФГМ из листьев ±2,3 8,0

кукурузы

Субъединичная молекулярная масса цитоплазматической ФГМ листьев кукурузы, определенная методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДЦС^а, составила 66+4 кДа; хлоропластной ФГМ из листьев гороха - 65+3 кДа, что позволяет сделать предположение о днмерной субъединичной структуре фермента.

Кинетические параметры ФГМ и ФММ представлены в табл. 3 Кажущиеся Км ФГМ для глюкозо-1-фосфата и для глюкозо-1,6-бисфосфата оказались довольно близки. Наблюдается падение ферментативной активности за счет субстратного ингибирования избытком как глюкозо-1-фосфата, так и глюкозо-1,6-бисфосфата

Поскольку ферментные препараты цитоплазматической ФГМ проявляли активность при использовании маннозо-1-фосфата в качестве субстрата, то были также определены Км для данной реакции. Они составили 0,61 мкМ для ФГМ кукурузы и 0,26 мкМ для ФГМ гороха. Для реакции превращения маннозо-1 -фосфата. катализируемой ФММ из листьев гороха. Км составляет 1,37 мМ.

Ионы М82' являются активаторами как ФГМ, так и ФММ из листьев гороха и кукурузы (рис. 1а) Оптимальные концентрации Мй*' для проявления активности исследованных ферментов лежат в диапазоне 1,5-5 мМ Активность ФГМ и ФММ в отсутствие данных ионов в среде спектрофотометрирования по сравнению с активностью при их оптимальной концентрации составляла не более 15-20% Очевидно, ионы Mg2 выполняют функцию кофактора при катализе.

Ионы Мп2', по-видимому, не могут служить заместителями ионов в

реакциях, катализируемых ФГМ и ФММ При замене ионов Mg'"' на ионы \1гг" ФГМ практически не проявляет активности. В присутствии ионов М«~' в среде в оптимальной концентрации ионы Мп'" оказывают ингибирующий эффект в концентрациях выше 0,2 мМ (рис. 16). Ионы Мп2' ингибируют также и активность ФММ

Важное значение ионов Mg'1' для каталитического действия ФГМ и ФММ подтверждает сильный ингибирующий эффект ЭДТА на активность ферментов из различных растении Очевидно, ингибирование ЭДТА объясняется хелатным связыванием ионов Mg2', что уменьшает эффективную концентрацию существенного активатора в среде. Ингибирование ФГМ в присутствии ЭДТА также можно объяснить образованием комплекса фермент-металл-ЭДТА (Оа^ЬеПу е! а!., 1975).

Результаты исследования зависимости активности ФГМ от концентрации ионов водорода показали, что оптимум рН для активности ФГМ из исследованных растений лежит в пределах 7,8-8,0 (табл. 3). При использовании маннозо-1-фосфата в качестве субстрата оптимум рН для активности цитоплазматической ФГМ из листьев гороха составил 7,8; для цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы -

7,9; для ФММ из листьев кукурузы - 7,4. Значения рК ионогенных групп ФММ листьев кукурузы, рассчитанные из зависимости lgV-pH, составляют 7,30 и 8,10. Значения рК функциональных групп ФГМ сходны с таковыми для ФММ и близки к рК имидазольной группы гистидина и рК сульфгидрильной группы цистеина

Максимальную активность как цитоплазматическая, так и хлоропластная ФГМ проявляла при 35° Энергия активации для ФГМ, рассчитанная по теории переходного состояния Эйринга, составила для цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы - 48,3 кДж/моль, для хлоропластной ФГМ из листьев гороха - 22,6 кДж/моль.

В регуляции активности ФГМ могут принимать участие нуклеотидфосфаты. АТФ является конкурентным ингибитором цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы по отношению к глюкозо-1-фосфату (ЬС; = 0,13 мМ) (рис. 2а) АТФ также ингибирует и цитоплазматическую ФГМ из листьев гороха. Для воздействия АТФ на ФГМ из хлоропластов гороха характерны отличия: в концентрациях до 50 мкМ данный аденилат вызывает активацию ФГМ, при дальнейшем увеличении концентрации АТФ активирующее воздействие снижается и в концентрациях свыше 100 мкМ АТФ является ингибитором фермента (рис 26). УТФ также ингибирует ФГМ. Ингибирующий эффект нуклеотид-фосфатов можно объяснить образованием хелатных комплексов с ионами Mg2'. Не исключено конкурентное ингибирование благодаря наличию фосфатной группы, обеспечивающей структурное сходство с субстратом.

АМФ и НАД в концентрациях до 0,5 мМ активируют ФГМ из хлоропластов гороха. При более высоких концентрациях АМФ и НАД наблюдается снижение степени активирующего воздействия. АМФ активирует также цитоплазматическую ФГМ из листьев гороха в концентрациях до 0,5 мМ, тогда как для цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы показано ингибирующее воздействие АМФ.

При концентрациях АДФ до 0,5 мМ наблюдается активация цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы (рис. 3). При более высоких концентрациях происходит уменьшение активирующего воздействия. Подобное влияние АДФ оказывает и на другие формы ФГМ.

В регуляции активности ФГМ могут принимать участие некоторые интермедиаты углеводного метаболизма. Фруктозо-б-фосфат и 6-фосфоглюконат

Рис. 1. Влияние ионов Mg(а) и Мп""(б) на активность цитоплазматической фосфоглюкомугазы из листьев кукурузы

Рис. 2. а - влияние АТФ на активность цитоплазматической фосфоглюкомутазы из листьев кукурузы при 0,2 мМ (1) и 0,4 мМ (2) концентрациях глкзкозо-1 -фосфата; б - влияние АТФ на активность хлоропластной фосфоглюкомутазы из листьев гороха

активируют цитоплазматический фермент из листьев кукурузы (рис. 4). Однако 6-фосфоглюконат оказывает слабый активирующий эффект, который максимально проявляется при концентрациях метаболита 0,2-0,3 мМ В присутствии 0,7 мМ 6-фосфоглюконата активность ФГМ становится ниже контрольного уровня. Подобным образом фруктозо-6-фосфат и 6-фосфоглюконат влияют и на другие исследованные формы фермента. Трифосфоглицерат является бесконкурентным ингибитором цитоплазматической формы ФГМ из листьев кукурузы по отношению к глюкозо-1 -фосфату. К,= 1,22+0,05 мМ. Однако, 3-фосфоглицерат не оказывает воздействия на хлоропластную форму ФГМ листьев гороха.

В присутствии галактозо-1-фосфата наблюдается стимуляция активности цитоплазматической формы ФГМ из листьев гороха. Максимальная активность фермента проявляется при 1 мМ концентрации метаболита. При концентрациях выше 1 мМ имеет место снижение активирующего воздействия данного метаболита. УДФ-глюкоза и галактоза практически не оказывали никакого воздействия на фермент при концентрациях до 1 мМ. При более высоких концентрациях наблюдалось снижение ферментативной активности.

Существенное влияние на активность цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы могут оказывать некоторые органические кислоты. Сильное ингибирующее действие на фермент оказывает цитрат Однако, ингибирующий эффект его структурных аналогов, изоцитрата и цис-аконитата, выражен значительно слабее. Как цитрат, так и изоцитрат слабо активируют цитоплазматическую форму ФГМ из листьев гороха в концентрациях до 0,05 мМ. При более высоких концентрациях цитрат и изоцитрат оказывают ингибирующее действие. Так, при при 0,2 мМ концентрации цитрата активность ФГМ падает на 28% по сравнению с контролем; при дальнейшем увеличении концентрации наблюдается постепенное угнетение активности ФГМ Цитрат и изоцитрат также активируют хлоропластную форму ФГМ из листьев гороха в концентрациях до 0,5 мМ. При концентрациях цитрата свыше 0,8 мМ наблюдается ингибирование активности ФГМ.

Изучение специфичности фосфоглюкомутазы п фосфоманномутазы

Поскольку ферментные препараты ФГМ из листьев гороха и кукурузы демонстрировали не только способность катализировать превращения глюкозо-1-фосфата, но и изомеризацию маннозо-1 -фосфата, оставался невыясненным вопрос.

[АДФ]. мМ

Рис. 3. Влияние АДФ на активность цигогтлазматической фосфоглюкомутаэы из листьев кукурузы

Концентрация, мМ

Рис. 4, Влияние фруктозо-6-фосфата (1) и 6-фосфоглюконата (2) на активность цитоплазматической фосфоглюкомутазы из листьев кукурузы

принадлежат ли обе указанные активности разным ферментам, или одному ферменту с широкой субстратной специфичностью. В литературе имеются данные о существовании как моноспецифической (Joshi, Handler, 1964; Small, Matheson, 1978; Oesterhelt et al., 1996), так и полисубстратной ФГМ (Posternac, Rosselet, 1953; 1954; Lowry, Passoneau. 1969). Что касается специфичности ФММ к монофосфатам Сахаров, то по этому поводу также нет единого мнения. Обнаружена как моноспецифичная ФММ (Glazer. 1959; Murata, 1976; Small, Matheson, 1979), так и многофункциональная ФММ (Guha, Rose, 1985; Boles et al., 1994; Oesterhelt et al., 1996; Ye, Zielinski. 1994).

Таким образом, вопрос о том, катализируется ли превращение маннозо-1-фосфата в маннозо-6-фосфат специфической ФММ или же данная реакция является атрибутом ФГМ, остается открытым.

Электрофоретически гомогенный препарат цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы демонстрировал не только активность в реакции превращения глюкозо-1 -фосфата (11,7 ФЕ/мг белка), но и активность в реакции изомеризации маннозо-1-фосфата (1,31 ФЕ/мг белка). Для выяснения специфичности ФГМ использовали критерии идентичности Холдейна-Диксона (Диксон, Уэбб. 1982) Анализ по методу смешанных субстратов не продемонстрировал суммирования скоростей реакций при внесении двух субстратов. В связи с этим можно утверждать, что идентифицируемые активности принадлежат одному ферменту - ФГМ Результаты изучения воздействия ряда ингибиторов на ФГМ и ФММ активности гомогенного ферментного препарата из листьев кукурузы показали, что отношение ФГМ/ФММ активностей в присутствии разных ингибиторов остается практически постоянным, варьируя в пределах 3.8-4.3, что является еще одним доказательством принадлежности ФГМ и ФММ активностей одному ферменту.

Однако в процессе очистки отношение ФГМ/ФММ активностей изменяется довольно в широких пределах (табл. 2), что противоречит положению' о существовании в растительном экстракте только одного фермента, обладающего ФММ и ФГМ активностями.

Были предприняты попытки разделения ФГМ и ФММ экстракта листьев кукурузы с помощью ионообменной хроматографии. Хроматография на КМ-сефадексе не привела к полному разделению ферментов (рис. 5а). Фракции пика с максимальной ферментативной активностью как ФГМ, так и ФММ, полученные

после хроматографии на Км-сефадексе, использовали для изучения влияния ингибиторов на активность ферментов. Результаты влияния различных ингибиторов свидетельствуют, что соотношение активностей ФГМ/ФММ не оставалось постоянным, что может говорить о принадлежности ФГМ и ФММ активностей разным ферментам, с различной устойчивостью к ингибиторам.

Необходимо также отметить, что ФММ гораздо менее устойчива к тепловой инактивации по сравнению с ФГМ: так, частично очищенная в результате хроматографии на КМ-сефадексе ФММ теряла более 40% активности в ходе 3-минутной инкубации при 50°, в то время как активность ФГМ в тех же условиях сохранялась практически полностью.

ФММ из листьев кукурузы была полностью отделена от ФГМ с помощью специально разработанной процедуры хроматографии на КМ-целлюлозе (рис. 56)

Оптимумы рН практически совпадают для ФГМ и ФММ активностей гомогенного препарата цитоплазматической ФГМ из листьев кукурузы^,0), в то время как оптимум рН для ФММ, отделенной от ФГМ - 7,4.

Полученные результаты позволяют утверждать о наличии в листьях гороха и кукурузы двух ферментов: ФГМ и ФММ ФГМ является бифункциональным ферментом, который катализирует реакции превращения как глюкозо-1-фосфата, так и маннозо-1-фосфата Так как электрофорез в присутствии додеиилсульфата N'3 выявил одну полосу, соответствующую белку с молекулярной массой 66 кДа, присутствие комплекса двух ферментов с одинаковой молекулярной массой в одном ферментном препарате маловероятно. Более того, данные, полученные методом смешанных субстратов, а также влияние различных ингибиторов, тепловой инактивации свидетельствуют о принадлежности ФГМ и ФММ активностей одному и тому же ферменту Неудача попыток разделения ФГМ и ФММ на колонке с КМ-сефадексом, очевидно, объясняется близкими физико-химическими свойствами ферментов. Однако ряд параметров Холдейна-Диксона указывает на принадлежность ФГМ и ФММ активностей ферментного препарата, полученного после хроматографии на КМ-сефадексе, разным ферментам. ФММ, полностью отделенная от ФГМ на колонке с КМ-целлюлозой, оказалась моноспецифичной к маннозо-1-фосфат)'. Более того, по ряду свойств ФММ отличается от ФГМ (рН-оптимум, термостабильность). Тем не менее, для многих свойств данных ферментов характерно 'сходство. Так, ФММ, подобно ФГМ, активируется ионами Мц2' и

Объем элюции. мл

Объем элюции. мл б

Рис.?. Элюция фосфоглкжомутазы (1) и фосфоманномутазы (2) с КМ-сефадекса (а) и КМ-целлюлозы (б)

ингибируется ионами Мп2~ (рис. 6). ЭДТА, АТФ, УТФ оказывают на ФММ ингибирующее влияние, подобное влиянию данных веществ на активность ФГМ.

На сегодняшний день моноспецифичность к маннозо-1-фосфату была доказана только для ФММ из Cassia corymbosa (Small. Matheson, 1979). Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют, что листья кукурузы содержат бифункциональную ФГМ, способность которой к использованию маннозо-1-фосфата дублируется моноспецифичной ФММ.

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОГЛЮКОМУТАЗЫ И ФОСФОМАННОМУТАЗЫ

Проведенные исследования свидетельствуют, что может иметь место индукция активности ФГМ и ФММ под действием света. Так, после 24-ч экспозиции этиолированных растений на свету удельная активность ФГМ возрастала в 1,6 раза, а удельная активность ФММ - в 2 раза по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что активность ФГМ и ФММ при прорастании семян значительно выше в зеленых растениях по сравнению с этиолированными Это может являться как результатом индукции хлоролластных форм ферментов, так и интенсификации метаболизма сахарофосфатов в условиях активного фотосинтеза, в целом.

Известно, что активность ряда ферментов может изменяться в стрессовых условиях, что является важным звеном в общей реорганизации клеточного метаболизма при адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды (Косулина и др., 1993) Так, в частности, показано, что в условиях засоления имеют место модификации активности пероксндазы (Sheoram, Gare. 1980), малатдегидрогеназы (Nainawatee, Das. 1972) и др. Проведенные нами исследования показали, что под действием солевого стресса, вызванного 1% NaCl. в листьях гороха и кукурузы наблюдались существенные изменения активности ФГМ и ФММ, имеющие фазовый характер. Так, к 1-3 ч экспозиции наблюдалось значительное повышение активности ФГМ (в 1,5-2,5 раза) Затем активность ФГМ начинала снижаться и падала ниже контрольного уровня. В отличие от кукурузы в листьях гороха после 9 ч инкубации наблюдался второй пик повышения активности ФГМ (удельная активность возрастала в 1,5 раза); к концу инкубации (24 ч) активность ФГМ составляла 50% от контрольного уровня. Активность ФММ в листьях

[М^'], мМ

[Мп:"], мМ

Рис. 6. Влияние ионов (а) и Мп""(б) на активность фосфоманномутазы из листьев гороха

кукурузы в первые часы инкубации снижалась, к 6 ч воздействия ЫаС1 возрастала в 2,5 раза выше контрольной, к 9 ч экспозиции снижалась до уровня контроля. Изменения активности ФММ листьев гороха в условиях засоления были подобны изменениям активности ФГМ в данном растительном объекте.

Таким образом, регуляция активностей ФГМ и ФММ может осуществляться под действием внеклеточных факторов, что, видимо, имеет важное значение для адаптации растений к условиям окружающей среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ФГМ и ФММ играют важную роль в регуляции метаболических процессов в растениях. Это достигается благодаря функционированию в растительной клетке различно локализованных форм ферментов, отличающихся кинетическими параметрами каталитического действия и регуляторными свойствами

Полученные нами сведения о внутриклеточной локализации, специфичности ' и каталитических свойствах ФГМ и ФММ дают возможность предложить гипотетическую схему механизма регуляции метаболизма сахарофосфатов на этапе данных ферментативных реакций (рис. 7) Следует отметить, что регуляция активности ФГМ с помощью трикарбоновых кислот, а также путем изменения энергетического клеточного заряда свидетельствует о возможности координации метаболизма сахарофосфатов с ЦТК и энергетическим обменом в целом При возрастании концентрации АТФ в цитоплазме растительной клетки может происходить снижение интенсивности образования глю.козо-6-фосфата и, соответственно, снижение интенсивности его гликолитического расщепления К снижению интенсивности катаболических процессов ведет и ингибирование ФГМ 3-фосфоглицератом, цитратом и изоцитратом - интермедиатами гликолиза и ЦТК. Активация ФГМ 6-фосфоглюконатом и фруктозо-6-фосфатом, по-видимому, может обеспечивать в условиях высокого энергетического клеточного заряда протекание синтеза глюкозо-6-фосфата, который может расходоваться на синтез компонентов клеточной стенки через стадию образования фруктозо-6-фссфата или окисляться в пентозофосфатном пути. Поскольку АДФ является активатором ФГМ, можно предполагать, что в условиях низкого энергетического клеточного заряда интенсифицируется образование глюкозо-6-фосфата, вовлекаемого в первую очередь в • процессы гликолитического расщепления. Различия в регуляции

глюкозо-1-фосфат

АТФ -АДФ

маннозо-1-фосфат

ФММ

ФГМ

глюкозо-б-фосфат

маннозо-6- фруктозо-б-фосфат фосфат

АТФ АДФ

'б-фосфо-глюконат

цитрат -----

изоцитрат .....

хлоропласт

АТФ АДФ

маннозо-1-фосфат

ФММ

у <--

глюкозо-1 -фосфат

ФГМ

<--<-

глюкозо-6-фосфат

АТФ АДФ

'6-фосфо-глюконат

маннозо-6- <■ -фруктозо-6-фосфат фосфат ^

3-фосфоглицерат

цитрат .....

изоцитрат .....

цитоплазма

Рис. 7. Гипотетическая модель регуляции метаболизма углеводов в растительной клетке на уровне реакций, катализируемых фосфоглюкомутазой и фосфоманномутазой.Сплошными стрелками показаны активирующие воздействия, пунктирными - ингибирующие

активности цитозольной и хлоропластной форм ФГМ (чувствительность к концентрациям субстратов, АТФ, 3-фосфоглицерата) могут иметь значение для обеспечения координации процессов метаболизма сахарофосфатов, протекающих в разных клеточных компартментах. Так, значение К»1 ФГМ листьев гороха глюкозо-1-фосфатом и глюкозо-1,6-бисфосфатом свидетельствуют, что при торможении функционирования фермента в хлоропластах цитоплазматическая ФГМ продолжает интенсивно- катализировать реакцию изомеризации с образованием глюкозо-6-фосфата.

Нами впервые осуществлено разделение ФГМ и ФММ из листьев гороха и кукурузы и показано, что способность бифункциональной ФГМ к использованию в качестве субстрата не только глюкозо-1-фосфата, но и маннозо-1-фосфата дублируется моноспецифичной ФММ. Интересно отметить, что Км ФММ листьев кукурузы выше значения Км цитоплазматической ФГМ для маннозо-1-фосфата и выше константы субстратного ингибирования ФГМ маннозо-1-фосфатом. В связи с этим можно предполагать, что при низких концентрациях маннозо-1-фосфата в растительной клетке реакция его изомеризации до маннозо-6-фосфата катализируется, в основном, ФГМ. Однако при превышении определенной критической концентрации маннозо-1-фосфата в его метаболических превращениях начинает активно участвовать моноспецифичная ФММ. При этом участие ФГМ в превращениях маннозо-1-фосфата подавляется

Следует подчеркнуть, что активности ФГМ и ФММ могут изменяться не только под влиянием эндогенных, но также и экзогенных факторов (свет, солевой стресс), что, очевидно, имеет важное значение для адаптивной реакции растений в ответ на различные внешние воздействия.

Таким образом, для исследованных ферментов характерны разнообразные эффективные механизмы регуляции активности. Существование различных форм ФГМ и ФММ, обладающих специфическими особенностями каталитического действия, позволяет на уровне данных ферментов осуществлять регуляцию и интеграцию метаболизма сахарофосфатов в цитоплазматическом и хлоропластном компартментах растительной клетки.

глюкозо-1 -фосфат

АТФ -АДФ

маннозо-1-фосфат

ФММ

1Н

ФГМ

глюкозо-б-фосфат

маннозо-6- фруктозо-6-фосфат фосфат

АТФ АДФ

'6-фосфо-глюконат

цитрат изоцитрат —

хлоропласт

АТФ АДФ

маннозо-1 -фосфат "]

глюкозо-1-фосфат

ФММ

ФГМ

глюкозо-б-фосфат

АТФ АДФ

'6-фосфо-глюконат

маннозо-6- -фруктозо-6-фосфат фосфат ^

3-фосфоглицерат

цитрат .....

изоцитрат .....

цитоплазма

активности цитозольной и хлоропластной форм ФГМ (чувствительность к концентрациям субстратов, АТФ, 3-фосфоглицерата) могут иметь значение для обеспечения координации процессов метаболизма сахарофосфатов, протекающих в разных клеточных компартментах. Так, значение Ksj ФГМ листьев гороха глюкозо-1-фосфатом и глюкозо-1,6-бисфосфатом свидетельствуют, что при торможении функционирования фермента в хлоропластах цитоплазматическая ФГМ продолжает интенсивно- катализировать реакцию изомеризации с образованием глюкозо-6-фосфата.

ВЫВОДЫ

1 Основная доля ФГМ и ФММ активностей (80-95%) находится в цитоплазме растительной клетки; 4-18% активности связано с фракцией хлоропластов.

2. С помощью разработанных процедур очистки впервые получены электрофоретически гомогенные препараты цитоплазматической ФГМ из листьев гороха и кукурузы с удельной активностью 5,06 и 11,7 ФЕ/'мг белка соответственно, хлоропластной ФГМ из листьев гороха (удельная активность 3,6 ФЕ/мг белка), частично очищенные препараты хлоропластной ФГМ из листьев кукурузы (удельная активность 1,65 ФЕ/мг белка), ФММ из листьев гороха (удельная активность 0.03! ФЕ/мг белка) и ФММ из листьев кукурузы (0,078 ФЕ/мг белка)

3. Молекулярные массы цитоплазматических форм ФГМ из листьев гороха и кукурузы сходны и составляют 133±4 кДа; молекулярная масса ФГМ из хлоропластов гороха - 125+5 кДа; ФГМ из хлоропластов кукурузы - 158±5 кДа. Цитоплазматическая ФГМ является димером, состоящим из идентичных субъединиц с молекулярной массой 66±4 кДа; хлоропластная ФГМ из листьев гороха - димер с субъединичной массой 65±3 кДа.

4. Сродство различных форм ФГМ из листьев гороха и кукурузы к субстрату и коферменту характеризуется величинами одного порядка. Характерным свойством ФГМ и ФММ является ингибирование избытком субстратов. Цитоплазматическая и хлоропластная формы ФГМ проявляют максимальную активность в диапазоне рН 7,8-8,0. Температурный оптимум - 35°.

5. Ионы Мд2~ являются кофакторами ФГМ и ФММ из листьев гороха и кукурузы, ионы Мп2" оказывают существенный ингибирующий эффект В регуляции ферментативной активности могут также принимать участие некоторые интермедиаты углеводного метаболизма (3-фосфоглицерат, фруктозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат), ЦТК (цитрат, изоцитрат) и различные нуклеотидфосфаты.

6. Различно локализованные формы ФГМ, имея одинаковые регуляторные свойства по отношению к ионам ЪЛ^* и Мп2*, близкие молекулярные массы, оптимумы рН и сродство к субстрату и коферменту, различаются по стабильности, электрофоретической подвижности, хроматографическим свойствам, чувствительности к субстратному ингибированию. Выявлены различия в регуляции активности изоформ адениловыми нуклеотидами.

7. С помощью специально разработанной процедуры осуществлено разделение ФГМ и ФММ. Определение ряда критериев идентичности Холдейна и Диксона свидетельствует, что цитоплазматическая ФГМ способна проявлять каталитическую активность в реакции изомеризации как глюкозо-1-фосфата, так и маннозо-1-фосфата, хотя превращение последнего протекает со значительно более низкой эффективностью. ФММ является моноспецифичным ферментом.

8. Наряду со сходными хроматографическими и каталитическими свойствами (влияние ионов Mg2" и Мп2", ряда ингибиторов) для ФГМ и ФММ выявлены различия в оптимумах рН, сродстве к субстрату, стабильности.

9. Воздействие некоторых экзогенных факторов (света, солевого стресса) на растения приводит к изменениям активности ФГМ и ФММ, что может иметь существенное значение в ходе адаптации к условиям внешней среды

10. Контроль метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах растительной клетки может осуществляться путем распределения глюкозо-1-фосфата и маннозо-1-фосфата между различно локализованными формами ФГМ и ФММ с помощью специфических путей регуляции активности ферментов. Предложена гипотетическая схема регуляции углеводного обмена в растительной клетке на этапе ФГМ и ФММ реакций.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

ГМатасова Л.В., Попова Т.Н., Бахарева М.А., Бушаев С В. Регуляция активности ферментов метаболизма сахарофосфатов в высших растениях // I Всероссийская конференция фотобиологов. Пушино, 1996. С. 33-34

2. Matasova L.V., Popova T.N, Igamberdiev A.U.. Ponomarvova N.V.. The regulation of phosphoglucomutase activity from pea leaves // Physical-chemical basis of plant physiology. (Annual symposium of Society of Plant Physiologists of the Russian Academy of Sciences (RSPP) Pushino, 1996. P. 31.

3. Popova T.N„ Matasova L.V., Igamberdiev A.U., Schnarrenberger C. Subcellular localization and properties of phosphoglucomutase and phosphomannomutase from pea leaves // !0lh FESPP Congress, Plant Phisiol. Biochem., special issue, 1996. P 115. Flo4*cet I

4. Матасова JI.B., Попова Т.Н., Бахарева М.А., Бушаев С.В Применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе для разделения и очистки изоферментов фосфоглюкомутазы из листьев гороха // VII Всероссийская

конференция "Физико-химические основы и применение ионообменных процессов", Воронеж, 1996. С. 150-151.

5. Матасова Л.В., Попова Т.Н., Бахарева М.А Влияние света на активность фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы листьев гороха // Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации Воронеж, 1996 С.78-83.

6. Матасова Л.В., Лапотько А.А Каталитические свойства фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы из листьев гороха и кукурузы // II Открытая городская научная конференция молодых ученых г Пушино Пушино, 1997 С. 17-18

7. Матасова ЛВ, Рахманова Т.И., Рябова A.B. Выделение, очистка и некоторые свойства фосфоглюкомутазы из хлоропластов гороха // Состояние и проблемы экосистем Среднего Подонья. Сборник трудов Воронежского госуниверситета. Воронеж, 1998. Вып. XI. С. 119-123.

8. Матасова Л.В., Рахманова Т.Н., Рябова A.B. Попова ТН Применение ионообменной хроматографии для разделения фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы из листьев кукурузы // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж, 1998 N 23. С. 270-276

9. Матасова Л.В, Рахманова Т И. Распространение и субклеточная локализация ФГМ и ФММ в высших растениях // Эколого-физиологпческие и физико-химические основы взаимодействия биоснстем с окружающей средой Сборник трудов В ГУ Воронеж, 1998. С. 90-95.

10. Попова Т.Н., Матасова Л.В., Семеннхина А В Участие фосфоглюкомутазы и глкжозо-6-фосфатдегндрогеназы в регуляции метаболизма сахарофосфатоз в высших растениях//И Съезд фотобиологов Пушино. 1998 С. 98100.

Н.Попова ТН., Матасова Л.В., Лапотько А А Очистка и некоторые каталитические свойства фосфоглюкомутазы из листьев кукурузы // Биохимия, 1998 Т 63, N 6. С. 827-832.

12. Popova T N., Matasova L.V., Lapot'ko A.A. Purification, separation and characterization of phosphoglucomutase and phosphomannomutase from maize leaves II Biochemistry and Molecular Biology International. 1998. (Принято к печати).

13. Матасова Л.В., Семенихина А В., Попова ТН Некоторые параметры каталитического действия глюкозо-6-фосфатдегидрогсназы и фосфоглюкомутазы листьев гороха // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов. Материалы 11 Международного симпозиума Воронеж, 1998. С 149-

14. Матасова Л.В., Семенихина A.B., Бушаев С.В , Попова "Г Н. Некоторые аспекты координации ферментативных процессов цикла трикарбоновых кислот и углеводного метаболизма // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. ВГУ, 1998 - С 91-93

15. Матасова Л.В , Попова Т Н. Изоформы и внутриклеточное распределение фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы в листьях гороха и кукурузы //Известия РАН Серия биологическая 1998 (Принято к печати)

153

Заказ № ¿М. от 19.10.1 ЭЭ8 г. Тир зкз Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матасова, Лариса Владимировна, Воронеж

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Матасова Лариса Владимировна

ФОСФОГЛЮКОМУТАЗА И ФОСФОЫАННОМУТАЗА ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ

(03.00,04 - биохимия)

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор Попова Т.Н.

Воронеж 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................'13

1.1. Распространение и функции фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы в живых организмах............................. 13

1.1.1. Катализируемые реакции..............................13

1.1.2. Распространение....................................14

1.1.3. Участие в метаболических процессах................. 16

1.2. Мзоформы и внутриклеточная локализация фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы.............................18

1.3. Очистка и физико-химические свойства фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы.............................21

1.3.1. Очистка фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы........21

1.3.2. Стабильность ферментов.............................24

1.3.3. Молекулярная масса и структура фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы.............................25

1.4. Кинетическое поведение и регуляция активностей фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы.............................31

1.4.1. Механизм фосфоглюкомутазной и фосфоманномутазной реакций..................................... .31

1.4.2. Зависимость активности фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы от концентрации субстрата и кофермента......... 34

1.4.3. Субстратная специфичность......................... .36

1.4.4. Влияние температуры и рН среды на активность фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы.............................39

1.4.5. Взаимодействие ферментов с ионами металлов.........41

1.4.6. Регуляция активности ферментов.....................44

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................... 49

2.1. Объекты исследования.................................49

2.2. Выделение клеточных органелл.........................49

2.3. Определение активности ферментов.................... .51

2.4. Определение количества белка.........................53

2.5. Выделение и очистка фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы................................................53

2.5.1. Экстракция. ........................................54

2.5.2. Фракционирование белков с помощью сульфата

аммония.........................................................55

2.5.3. Гель-фильтрация....................................55

2.5.4. Ионообменная хроматография.........................58

2.6. Исследование кинетических характеристик и

регуляции активности ферментов..................................57

2.7. Аналитический электрофорез..........................57

2.8. Определение молекулярной массы......................59

2.9. Изучение влияния засоления на активность ферментов...60 2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных....60

ГЛАВА 3. РАСПРОСТРАНЕНИЕ И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФОСФОГЛЮКОМУТАЗЫ И ФОСФОМАННОМУТАЗЫ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ............ .61

3.1. Распространение ферментов............................61

3.2. Исследование изоферментного спектра фосфоглюкомутазы методом электрофореза .........................65

3.3. Изучение субклеточной локализации ферментов..........69

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ й РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФОСФОГЛЮКОМУТАЗЫ И ФОСФОМАННОМУТАЗЫ..................79

4.1. Очистка фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы из растительных объектов....................................... .79

4.1.1. Очистка фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы из листьев кукурузы..............................................................79

4.1.2. Очистка фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы из листьев гороха..............................................................87

4.2. Молекулярная: масса и субъединичная структура..........95

4.3. Кинетические параметры действия ферментов.............97

4.3.1. Влияние концентраций субстрата на скорость реакций, катализируемых фосфоглюкомутазой и фосфоманномутазой............97

4.3.2. Влияние ионов Mg2+ и Мп2+ на активность ферментов..102

4.3.3. Влияние ЭДТА на скорость ферментативных реакций, катализируемых фосфоглюкомутазой и фосфоманномутазой...........108

4.3.4. Исследование влияния рН среды на активность фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы из листьев кукурузы........108

4.3.5. Влияние температуры на активность фосфоглюкомутазы............................................... 114

4.4. Регуляция активности фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы под действием клеточных метаболитов...........117

4.4.1. Влияние некоторых клеточных метаболитов на активность фосфоглюкомутазы из листьев кукурузы................117

4.4.2. Участие различных интермедиатов метаболизма в регуляции активности фосфоглюкомутазы из листьев гороха........ 121

4.5. Специфичность фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы.... 128 ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОГЛЮКОМУТАЗЫ И ФОСФОМАННОМУТАЗЫ............................ 134

5.1. Изменение активности ферментов в листьях

растений в условиях засоления.................................134

5.2. Влияние света на активность ферментов

в листьях растений...........................................140

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................143

ВЫВОДЫ. ....................................................... . 147

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................149

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................164

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДЭАЭ- - диз тиламиноз тил-

ДДС-Ма - додецилсульфат Ма

ДТТ - дитиотреитол

КМ- - карбоксиметил-

ДЦГ - лактатдегидрогеназа

НСТ - нитротетразолиевый синий

ПААГ - полиакриламидный гель

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ФМС - феназинметасульфат

ФГМ - фосфоглюкомутаза

ФММ - фосфоманномутаза

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЗДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование особенностей функционирования, регуляции активности, механизма действия ферментов представляет интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения. Знание структуры и характеристик ферментов, разработка способов их выделения являются объектом внимания медицины и некоторых отраслей промышленности, поскольку ферментные препараты широко используются в диагностических и лечебных целях, практике лабораторных исследований, промышленном синтезе ряда биологических соединений. Исследования отдельных ферментных систем позволяют приблизиться к глубокому анализу регуляции метаболизма высших растений на уровне клетки с выходом на более высокий организменный уровень,

обусловливающих значительные экспериментальные затруднения., следует прежде всего отметить освобождение и выход из клеточных ком-партментов при гомогенизации растительного материала вакуолярного сока с низким значением рН, таннинов, полифенолоксидаз, протеаз, снижающих биологическую активность ферментов. Ряд аспектов функционирования ФГМ и ФММ в клетках высших растений остается практически неизученным. Поскольку метаболизм углеводов в растительной клетке протекает в основном в двух компартментах: цитозоле и хло-ропластах, представляет интерес изучение субклеточной локализации ФГМ и. ФММ в растительной клетке и возможное участие данных ферментов в сопряжении процессов, протекающих в различных компартментах клетки. До сих пор остается открытым вопрос о субстратной специфичности ФГМ и ФММ. Исследование каталитических и регуляторных свойств данных ферментов имеет существенное значение для понимания физиолого-биохимической роли ФГМ и ФММ в клеточном метаболизме высших растений.

Цеж и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование распространения, субклеточной локализации, свойств и регуляции активности ФГМ и ФММ высших растений. Были поставлены следующие задачи:

2. Разработать эффективные методы получения высокоочищенных препаратов ФГМ и ФММ из различных растений.

3. Провести изучение субстратной специфичности ФГМ и ФММ.

4. Исследовать и сравнить физико-химические, кинетические и регуляторные свойства ФГМ и ФММ из разных растений.

5. Дать сравнительную характеристику различно локализованных форм ФГМ.

6. Провести исследование влияния некоторых внешних факторов (засоления, света) на ФГМ и ФММ.

Научная новизна. Показано, что ФГМ и ФММ встречаются в высших растениях в виде различно компартментализованных форм: цитоплазма-тической и хлоропластной; причем преобладающей формой является ци-топлазматическая -ч/80-95% от общей активности). Разработаны эффективные способы выделения и впервые получены высокоочищенные (в том числе гомогенные) ферментные препараты ФГМ и ФММ листьев гороха и кукурузы. Впервые проведены комплексные исследования свойств и дана сравнительная характеристика различно компартментализованных форм ФГМ. Показано, что для различно компартментализованных форм ФГМ наряду со сходными чертами характерны существенные отличия (чувствительность к субстратному ингибированию, концентрациям АТФ, влиянию 3-фосфоглицерата, различные злектрофоретические подвижности) . Разработаны способы разделения ФММ и ФГМ. Изучены некоторые свойства ФММ листьев гороха и кукурузы. Исследована субстратная специфичность ФГМ и ФММ, и выявлено, что ФГМ является бифункциональным ферментом, в то время как ФММ - монофункциональный фермент. Предложена гипотетическая схема регуляции метаболизма углеводов в клетке на этапе фосфоглюкомутазной реакции. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления об организации и регуляции углеводного метаболизма растений.

Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Энзимология", "Биохимия с основами молекулярной биологии".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущина, 1996); симпозиуме Российского общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996); 10-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических сообществ (Флоренция, Италия, 1996); VII Всероссийской конференции ''Физико-химические основы и применение ионообменных процессов", (Воронеж, 1996); Всероссийской с участием стран СНГ конференции "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996); 11 Открытой городской научной конференции молодых ученых г,Пущино (Пущино, 1997); II Съезде фотобиологов (Пущино, 1998), II Международном симпозиуме "Физико-химичес-

кие основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998), ежегодной научной сессии Воронежского госуниверситета

(1998).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 9 статьях и 6 тезисах,

На защиту выносятся следующие положения:

1. Показано существование двух основных фондов ФГМ и ФММ активностей в растительной клетке: цитоплазматического и хлоропласт-ного. В количественном отношении преобладающим является цитоплаз-матический фонд (80-95% от общей активности).

2. Исследования, проведенные на высокоочищенных ферментных препаратах ФГМ из растений показали, что различно локализованные формы фермента могут участвовать в процессах сопряжения и контроля метаболизма сахарофосфатов в цитоплазме и хлоропластах за счет регуляции ферментативной активности путем изменения концентраций субстратов, адениловых нуклеотидов, ионов некоторых металлов (М£2+, Мгг+), интермедиатов углеводного обмена (6-фосфоглюконата, фруктозо-6-фосфата, 3-фос.фоглицерата) и ЦТК (цитрата, изоцитрата).

3. Хлоропластная и цитозольная формы ФГМ, имея сходные каталитические свойства (кинетическое поведение по отношению к ионам М£2+ и Мп2+, близкие молекулярные массы, оптимумы рН и сродство к субстратам), различаются по злектрофоретической подвижности, стабильности, и могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии.

4. Несмотря на сходные хроматографические и каталитические свойства, достигнуто разделение ФГМ и ФММ. Цитоплазматическая ФГМ может катализировать реакцию изомеризации как глюкозо-1-фосфата, так и маннозо-1-фосфата. ФММ, напротив, является моноспецифическим ферментом. Выявлены различия в оптимумах рН, сродстве к субстрату, стабильности ФГМ и ФММ.

Структура и объем работа. Диссертация изложена на 173 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы (137 источников) и приложений. Иллюстративный материал включает 51 рисунок и 21 таблицу; в приложении -2 рисунка и 7 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространение и функции фосфоглюкомутазы и фосфоманномутазы в живых организмах

1.1.1. Катализируемые реакции

Фосфоглюкомутаза (с(-0-глюкозо-1 -фосфат: с(-0-глюкозо-1, 6-бисфосфат фосфотрансфераза, КФ 2.7.5.1; ФГМ) катализирует реакцию обратимого превращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат.

СНО - Р04 СНО

Н-С-ОН Ыg2* Н-С-ОН

НО-С-Н НО-С-Н

Н-С-ОН Н-С-ОН

СН20Н СН20Р04

Для проявления своей активности ФГМ нуждается в коферменте -глюкозо-136- бисфосфате. Кроме того, для эффективного катализа необходимы ионы М§2+.

Фермент существует в двух формах: фосфорилированной и дефос-форилированной. Фосфорилированная форма образуется в результате переноса фосфатной группы глюкозо-1,6-бисфосфата на гидроксильную группу серинового остатка в активном центре фермента. Фосфоглюкомутазная реакция протекает в две стадии: 1. Фосфофермент + глюкозо-1-фосфат = дефосфофермент + глюкозо-1, 6-бисфосфат;

2. Дефосфофермент + глюкозо-1,6-бисфосфат = фосфофермент + глюкозо-6-фосфат.

На первой стадии фосфатная группа из активного центра фосфо-рилированной формы фермента переносится на глюкозо-1-фосфат, образуя глюкозо-1, 6-бисфосфат. На второй стадии фосфатная группа при первом атоме глюкозо-1,6-бисфосфата переносится на гидроксильную группу серинового остатка фермента, образуя глюкозо-6-фосфат и регенерируя фосфорилированную форму фермента.

Фосфоманномутаза (й -0-манно-1-фосфат: й -О-глюкозо-1,6-бисфосфат фосфотрансфераза, КФ 2.7.5.5; ФММ) катализирует реакцию превращения маннозо-1-фосфата в маннозо-6-фосфат:

СН0-Р04 НО-С-Н НО-С-Н Н-С-ОН Н-С-ОН СН20Н

Mg'

СНО НО-С-Н НО-С-Н Н-С-ОН Н-С-ОН СН20-Р04

Подобно ФГМ, для проявления своей активности ФММ нуждается в коферменте - глюкозо-1,6-бисфосфате или маннозо-1,6-бисфосфате (Glaser L., 1966; GuhaS.K., Rose Z. В., 1985). Для эффективного катализа также необходимы ионы Mg2+.

1.1.2. Распространение

ФГМ впервые была открыта в экстрактах мышц кролика и лягушки (Cori G.Т. et al., 1938). Опубликованы данные о выделении ФГМ из

мышц крысы, камбалы (Joshi J.G. et aL, 1967), акулы (Hashimoto Т., Handler Р., 1966), человека (Joshi J.G. et al., 1972), кролика (Joshi J.G., Lane R., 1978), из печени быка (Chiba H. et al., 1976); Escherihia coli (RayW.J., Roscelly G.Ä., 1966), Bacillus cereus и Micrococcus lisodeikticus (Hanabusa K. et al., 1966), пекарских дрожжей (Hirose M. et al., 1970), Flavobacterium ihermop-hilum (Yoshizaki F. et al., 1971), Lactobacillus brevis (Marechal L.K. et al., 1984.), красной водоросли Galdieria sulphuraria (Oesterhelt C. et al., 1996); клубней картофеля (Moura J. et al., 1973; TakamiyaS., Fukui Т., 1978), листьев шпината (Muhlbach H., Schnarrenberger С., 1978), пыльцевых зерен сосны, тыквы, лилии (Нага А., Funaguma Т., 1981), семян гороха (Galloway С.М., Dugger W.М., 1994). Час

Информация о работе

Матасова, Лариса Владимировна
кандидата биологических наук
Воронеж, 1998
ВАК 03.00.04

Диссертация

Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матасова, Лариса Владимировна, Воронеж

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фосфоглюкомутаза и фосфоманномутаза высших растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия