Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности углеводного и энергетического обмена микроспоридий Nosema grylli и их патогенного воздействия на организм насекомого-хозяина

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Особенности углеводного и энергетического обмена микроспоридий Nosema grylli и их патогенного воздействия на организм насекомого-хозяина"

i ¡ о ОД

На правах рукописи

- 9 ИЮЛ 1ЯЯ7

долгих

Вячеслав Васильевич

ОСОБЕННОСТИ УГЛЕВОДНОГО И ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА МИКРОСПОРИДИЙ NOSEMA GRYLLIИ ИХ ПАТОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ НАСЕКОМОГО-ХОЗЯИНА

Специальность: 03.00.09 - Энтомология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений (г. Санкт-Петербург)

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор И.В. ИССИ

Официальные оппоненты - доктор сельскохозяйственных наук,

профессор H.A. ВИЛКОВА

кандидат биологических наук, доцент A.A. ДОБРОВОЛЬСКИЙ

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН

Защта состоится "¿16 ÜtOUS 1997 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета Д.020.01.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу:

189620, г. Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан ^ JUCfS.\991 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.А. Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроспоридии - наиболее древние внутриклеточные паразиты среди зукариот, происхождение которых датируется ранним палеозоем (Исси, 1978). В настоящее время тип Microsporidia, представители которого сохранили некоторые прокариотные признаки, переведен из полцарства Protozoa в новое подцарство Archezoa (Corliss, 1994).

Длительная адаптация микроспоридий к развитию внутри клетки животного - хозяина предполагает их глубокую метаболическую зависимость от последнего, а также возможность целенаправленного воздействия на организм хозяина и противодействия его защитным системам. Поэтому системы паразит-хозяин с участием микроспоридий - интересные и перспективные модели для изучения фундаментальных проблем внутриклеточного паразитизма.

Широкое распространение микроспоридий при антагонистическом характере их взаимоотношений с хозяином (Шульман, 1984), объясняет возрастающий практический интерес к этим паразитам, который со стороны специалистов в области микробиометода обусловлен их важной ролью в регуляции численности природных популяций вредных насекомых. В нашей стране и за рубежом зарегистрированы эпизоотии микроспоридиозов в популяциях многих опасных вредителей сельскохозяйственных культур, леса и запасов. Проводятся исследования с целью создания биопрепаратов на основе микроспоридий. Микроспоридия Nosema locusiae послужила основой для создания и производства первых промышленных препаратов "Нолок" и "Нолобайт " для борьбы с саранчовыми (Henry et al., 1985).

Несмотря на это, процессы, лежащие в основе патогенеза микроспориди-оза, остаются все еще не известными и, следовательно, не контролируемыми при использовании этих паразитов в качестве продуцентов биопрепаратов. При внутриклеточном паразитизме отношения между патогеном и зараженной клеткой в значительной мере определяются взаимодействием двух метаболических систем. Вместе с тем, метаболизм микроспоридий, а значит и механизмы, лежащие в основе патогенного воздействия этих паразитов на организм хозяина, остаются совершенно не исследованными.

Традиционно изучение метаболизма начинается с исследования энергетического обмена. Для эндопаразитов (как одноклеточных, так и гельминтов)

основным источником энергии являются углеводы (Сопрунов, 1987). Эго и обусловило цель и задачи наших исследований.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей энергетического и углеводного обменов микроспоридий Nosema grylli и их взаимодействия с обменными процессами насекомого-хозяина -двупятнистого сверчка Gryllus bimaculalus. Для успешного выполнения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методики получения чистой от любых паразитов культуры сверчков и заражения насекомых спорами микроспоридий;

. - разработать методику получения высокоочищенных спор микроспоридий и подобрать условия разрушения очищенных спор;

- провести измерение активностей ферментов углеводного и энергетического обменов в спорах микроспоридий;

- изучить влияние микроспоридий на активность ферментов углеводного и энергетического обменов в жировом теле сверчков;

- сравнить влияние микроспоридий с воздействием другого внутриклеточного паразита жирового тела - кокцидии Adelina grylli, с целью выявления специфичности воздействия микроспоридий;

- сопоставить данные об активностях ферментов в спорах с особенностями влияния микроспоридий на хозяина и сделать выводы об энергетическом обмене этих паразитов и их влиянии на метаболические процессы зараженной клетки и организма насекомого.

Научная новизна. На основании: 1) тестирования активностей 20 ферментов углеводного и энергетического метаболизма в очищенных и разрушенных спорах микроспоридии Nosema grylli, 2) изучения изменений активностей 8 ферментов в клетке хозяина, как ответной реакции метаболического аппарата на микроспоридиоз, 3) сравнения влияния микроспоридий на организм хозяина и метаболический аппарат зараженной клетки с влиянием кокцидий Adelina grylli, впервые в мире получены данные, позволяющие сделать выводы об особенностях углеводного и энергетического метаболизма микроспоридий.. Тестирование ферментов гликолиза показало, что этот путь играет важную роль в энергетике микроспоридий и что самые древние внутриклеточные паразиты - типичные анаэробы, использующие углеводы для синтеза АТФ. Установлено, что микроспоридии имеют ферменты, участвующие в пентозо-фосфатном пути и синтезе трегалозы. Выявлено, что в спорах микроспоридий

отсутствуют или находятся на очень низком уровне активности ряда ферментов, что позволяет предположить наличие специфичных метаболических особенностей у этих паразитов, вероятно связанных с глубокой адаптацией к внутриклеточному развитию. Показано, что ответная реакция клетки хозяина на заражение проявляется в значительном увеличении активности ферментов, предположительно участвующих в утилизации выделяемых микроспоридиями конечных продуктов обмена. Установлено, что патогенное воздействие на сверчков при микроспоридиозе сопровождается снижением активностей ферментов, участвующих в синтезе энергетических субстратов в жировом теле. Впервые проведен сравнительный анализ влияния на организм хозяина и метаболические процессы зараженной клетки двух различных внутриклеточных паразитов жирового тела - микроспоридий и кокцидий. Установлено, что паразиты по разному влияют на хозяина, что, вероятно, обусловлено физиологическими отличиями этих видов.

Практическая значимость работы. Результаты исследования показали, что одной из основных причин патогенеза при микроспоридиозе насекомых является интенсивное использование паразитами углеводов зараженного жирового тела и выделение в клетку хозяина конечных продуктов углеводного катаболизма. Знание механизмов, лежащих в основе патогенеза, позволит контролировать признак патогенности в случае использования определенных видов в качестве продуцентов биопрепаратов - впервые появилась возможность связать в дальнейших экспериментах конкретные количественные физиологические показатели у микроспоридий (удельную активность ферментов) со степенью патогенности различных видов и изолятов, а также с жизнеспособностью спор при хранении биопрепаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийском сьезде по защите растений (1995), на заседаниях Санкт-Петербургских отделений Всероссийского общества протозоологов и Паразитологического общества при РАН (1995-1996), ежегодной отчетной сессии ВИЗР (1996), IV Международном совещании по оппортунистическим простейшим в рамках объединенного собрания Американского общества паразитологов и Общества протозоологов (США, Аризона, Туссон, 1996), научных семинарах кафедры зоологии Дрезденского технического университета (Дрезден, 1996), кафедры зоологии беспозвоночных Санкт-Петербургского государственного университета (Санкт-Петербург, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками. Список литературы включает 195 работ, в том числе 133 работы на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1. МИКРОСПОРИДИИ НАСЕКОМЫХ: ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕННОСТИ, ПАРАЗИТО-ХОЗЯИННЫЕ ОТНОШЕНИЯ, МЕТАБОЛИЗМ (Обзор литературы) На основании публикаций по микроспоридиозам насекомых обосновано положение, что в основе патогенеза при облигатном внутриклеточном развитии микроспоридий лежит паразитирование на метаболических путях зараженной клетки. Другими словами, особенности воздействия паразита на хозяина определяются метаболическими особенностями самих паразитов (количеством и составом потребляемых и выделяемых паразитом соединений). Обобщены имеющиеся в литературе данные о влиянии микроспоридий на организм и клетку хозяина. Приведены немногочисленные данные о метаболизме микроспоридий. Проанализированы данные о метаболических особенностях других групп эндопаразитических простейших.

ГЛАВА 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования выполнены на лабораторной культуре двупятнистого сверчка Gryllus bimaculatus Deg.(Orthoptera, Gryllidae), в клетках жирового тела которого паразитирует микроспоридия Nosema grylli. Относительно крупные размеры сверчков и высокая интенсивность инвазии, сопровождающаяся гипертрофией жирового тела, позволяют выделять из каждой особи достаточное для биохимических исследований количество спор и внутриклеточных стадий развития микроспоридий. Кроме микроспоридий в жировом теле сверчков развивается кокцидия Adelina grylli. Это позволяет проводить сравнительное изучение влияния двух различных паразитов на организм и зараженную клетку одного хозяина.

Методика приготовления проб жирового тела включала: препарирование органа, его гомогенизацию, низкоскоростное центрифугирование для отделения стадий развития паразитов и высокоскоростное центрифугирование для получения растворимой фракции, содержащей исследуемые ферменты. Методика очистки и разушения спор микроспоридий дана в главе 3. Очистку внутриклеточных стадий развития микроспоридий осуществляли по методу Селезнева с соавторами (Selesnev е. а., 1995).

Активность всех ферментов, за исключением фосфатаз и сукцинат-дегидрогеназы, измеряли спектрофотометрическим методом в термоста-тируемых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 340 нм и температуре 37°. В работе использован спектрофотометр СФ-46 (JTOMO). Активности фосфатаз регистрировали по образованию неорганического фосфата. Неорганический фосфат определяли по методу Ратбунр. и Бетлах (Северин и др., 1989). Активность сукцинатдегидрогеназы определяли по снижению оптической плогности реакционной смеси при длине волны 420 нм в ходе восстановления феррицианида калия до ферроцианида.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) осуществляли в пластинах по методу Лэмли (Laemmli, 1970). Нативный электрофорез белков для последующего окрашивания на лактатдегидрогеназу (ЛДГ) проводили так же по методу Лэмли, но без добавления ДСН. Гели скрашивали на ЛДГ по методике Серова и Нечаева с изменениями (Корочкин и др., 1977). Разделение белков для окрашивания глицерол 3-фосфатдегидрогеназы осуществляли по методу Тарентино и Мали с последующим окрашиванием по методу Грелля (Корочкин и др., 1977).

Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).

Достоверность различий между выборками определяли при помощи критериев Фишера и Стьюдента (р<0.05) (Плохинский, 1970).

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ УГЛЕВОДНОГО И ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНОВ В СПОРАХ МИКРОСПОРИДИИ NOSEMA GRYLL1.

В ходе работы в первую очередь были разработаны оригинальные подходы, позволившие получить достаточные количества высоко очищенного материала

для изучения метаболических особенностей микроспоридий: подобраны условия получения чистой от паразитов культуры сверчков; отработано искусственное заражение сверчков спорами, усовершенствована методика высококачественной очистки и разрушения спор. В результате исследования установлено, что для получения чистой культуры сверчков достаточно тщательно отмыть в воде яйца, отложенные свободными от паразитов самками во влажный песок. Успешное заражение сверчков осуществлено путем нанесения спор микроспоридий на ватку поилки, то есть алиментарным способом передачи инвазии. Для получения высокоочищенных спор мы впервые применили инкубацию спор с лизоцимом для разрушения клеточной стенки бактерий, способных загрязнять суспензию спор, и последующую обработку спор неионным детергентом Тритон Х-100 для солюбилнзации возможных примесей с последующей качественной отмывкой в воде. Отсутствие влияния обработки на целостность спор и высокая степень их очистки подтверждены при помощи электронной микроскопии. В работе также успешно использован оригинальный метод разрушения спор в ручном стеклянном гомогенизаторе с очень плотно притертым стеклянным пестиком. Этот результат интересен тем, что разрушение спор микроспоридий различных видов представляет собой сложную проблему для исследователей, так как споры имеют малые размеры и твердую оболочку.

На первом этапе изучения особенностей энергетического обмена микроспоридий проведено тестирование активностей шести гликолитических ферментов. В гомогенате спор нам удалось выявить активности фосфоглюкоюомеразы (КФ 5.3.1.9), фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11), альдолазы (КФ 4.1.2.13), фосфоглицераткиназы (КФ 2.7.2.3) и пируваткиназы (КФ 2.7.1.40). Удельные активности ферментов приведены в Таблице 1. Полученные данные показывают, что гликолиз играет важную роль в энергетическом обмене микроспоридий (Рис.1). Большинство гликолитических ферментов участвуют и в глюконеогенезе, однако реакции, катализируемые фосфофруктокиназой и пируваткиназой, являются не обратимыми in vivo. В то же время мы не обнаружили в спорах активности фермента гексокиназы (КФ 2.7.1.1), ключевого фермента, катализирующего первую реакцию гликолиза (АТФ-зависимое фосфорилирование глюкозы в глюкозо 6-фосфат). Отсутствие гексокиназы в спорах микроспоридий оказалось тем более интересным, что мы обнаружили в них очень высокую удельную активность следующего фермента

Таблица 1

Активность ферментов углеводного и энергетического метаболизма в спорах микроспоридии Nosema grylli

Фермент Удельная Число мкг белка в

активность процедур мл реакцион-

НМОЛЬ/МИН- очистки ной смеси

мг белка спор

Гексокиназа (АТФ -зависимая) — 8 150

Гексокиназа (ФФН -зависимая) — 3 150

Фосфоглюкоизомераза 1549 ± 255 5 2/4

Фосфофруктокиназа 10 ± 1 4 30/60

Альдолаза 5+ 1 6 40/80

3-фосфоглицераткиназа 16± 4 4 30/60

Пируваткиназа 6± 1 6 60/120

Глицерол 3-фосфатДГ 16 ± 2 7 30/60

Глицеролкиназа — 3 150

Глицерол 3-фосфатаза — 2 180

МалатДГ (малат-оксалоацетат) — 3 150

МалатДГ (оксалоацетат-малат) — 9 250

Малик-энзим — 4 150

ЛДГ (лактат-пируват) — 3 150

ЛДГ (пируват-лактат) — 6 250

АлкогольДГ (НАД-зависимая) — 4 150

АлкогольДГ (НАДФ-зависимая) — 3 150

СукцинатДГ — 4 340

Фосфоглюкомутаз а 7 ± 1 7 50/100

Глюкозо 6-фосфагДГ 15± 1 7 50/100

6-фосфоглюконатДГ — 3 150

Глюкозо 1:6-бифосфатаза — 2 180

ПолиолДГ (НАДФН+гл.) — 2 200

ПолиолДГ (НАДФН+гл. 6-Ф) — 2 200

ПолиолДГ (НАДФН+фр. 6-Ф) — 2 200

ПолиолДГ (НАДН+гл.) — 2 200

ПолиолДГ (НАДН+гл. 6-Ф) — 2 200

ПолиолДГ (НАДН+фр. 6-Ф) — 2 200

Трансгвдрогеназа — 2 100

--активность ниже предела чувствительности метода (приблизительно

0.2 нмоль/мин-мг белка).

гликолиза - фосфоглюкоизомеразы, которая составила 1549 ± 255 нмоль/мин-мг белка и была наиболее высокой среди активностей всех изученных нами ферментов спор микроспоридий и зараженного жирового тела. Даже если низкая активность гексокиназы присутствует в спорах микроспоридий, столь

высокое соотношение активностей фосфоглюкоизомеразы и гексокиназы (>7000) необычно.

Исходя из полученных данных, мы предположили, что микроспоридии поглощают из организма хозяина фосфорилированные гексозы и, в частности, ппокозо б-фосфат. В пользу такого предположения свидетельствует то, что в клетках жирового тела при синтезе из гликогена транспортной формы углеводов - трегалозы свободная глюкоза не образуется (Рис 4). Кроме того, можно предположить, что микроспоридии способны фосфорилировать глюкозу с участием АТФ, а низкая активность гексокиназы как раз и обеспечивает им сохранность инвазионности в течение нескольких лет за счет низкой интенсивности обмена в спорах СЛ^сЬег, 1976).

Для изучения механизмов реокисления НАДН, образуемого в ходе гликолиза глицеральдегид З-фосфатдегидрогеназой, и выяснения состава конечных продуктов, выделяемых микроспоридиями, на следующем этапе работы мы предприняли тестирование в спорах активности 9 ферментов, катализирующих заключительные этапы катаболизма глюкозы. В результате исследования мы не обнаружили в спорах микроспоридий ферментов, участвующих в образовании из пирувата лактата (лактатдегнарогеназа (КФ 1.1.1.27) (ЛДГ))> этанола (алкогольдегадрогеназа (КФ 1.1.1.1, КФ 1.1.1.2)), маната (малик-энзим (КФ 1.1.1.40) и НАД-зависимая малатдегадрогеназа (КФ 1.1.1. 37) (МДГ)), а также малата и сукцината из фосфоенолпирувата (МДГ, сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1)). В то же время, мы обнаружили в спорах достоверную активность глицерол 3-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.8). Это позволило заключить, что данный фермент участвует в реокислении НАДН при восстановлении дигидрохсиацетонфосфата в глицерол 3-фосфат. С целью проверки возможности дальнейшего превращения глицерол 3-фосфата в глицерол мы предприняли попытку тестировать в спорах активности глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30) и фосфатазы (как глицерол 3-фосфатазы, так и неспецифичной фосфатазы). Так как активности этих ферментов не были обнаружены, мы предполагаем, что микроспоридии могут выделять в клетку хозяина пируват и глицерол 3-фосфат (Рис 2).

• С целью обнаружения у микроспоридий других путей углеводного обмена мы попытались тестировать в спорах активность фруктозо 1,6-бифосфатазы (КФ 3.1.3.11), ключевого фермента глюконеогенеза, однако не получили достоверного положительного результата. Вероятно, микроспоридии не

синтезируют углеводы самостоятельно, а поглощают их в любом необходимом количестве из организма хозяина.

В то же время, мы обнаружили в спорах достоверные активности фосфоглюкомутазы (КФ 5.4.2.2) и глюкозо 6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49). Наличие фосфоглюкомутазы по всей видимости позволяет микроспоридиям использовать глюкозо 1-фосфат в гликолизе и, возможно, в пентозо-фосфатном пути. С другой стороны, фосфоглтокомутаза необходима для синтеза трегалозы из глюкозо б-фосфата, поскольку необходимая для синтеза УДФ-глюкоза образуется из УТФ и глюкозо 1-фосфата (Рис.3).

Достаточно активная глюкозо 6-фосфатдегидрогеназа позволяет предположить, что микроспоридии способны превращать глюкозо 6-фосфат в пентозо-фосфатном пути, например для синтеза нуклеотидов. Однако, мы не смогли выявить в спорах достоверную активность следующего фермента пентозо-фосфатного пути - б-фосфоглюконатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.44). Вполне вероятно, что низкая активность фермента присутствует в спорах микроспоридий, однако, мы ие можем пока однозначно доказать наличие пентозо-фосфатного пути у микроспоридий.

В го же время остается не понятным смысл образования глюкозо 6-фосфатдегидрогеназой микроепоридий НАДФН, который в цитоплазме различных клеток почти полностью используется для синтеза жирных кислот. Находящиеся в глубокой метаболической зависимости от хозяина микроспоридии не нуждаются, вероятно, в самостоятельном синтезе жирных кислот. Однако, в спорах различных видов микроспоридий обнаружено достаточно высокое содержание сорбитола, поэтому мы предположили, что они реокисляют образованный глюкозо 6-фосфатдегидрогеназой НАДФН при помощи полиолдегидрогеназы (КФ 1.1.1.14) с образованием сорбитола. Однако активность этого фермента в спорах не была обнаружена. В связи с этим мы предположили, что микроспоридии способны катализировать обратимый перенос электронов между НАДФН и НАД при помощи ферментов трансгадрогеназ, но мы также не смогли обнаружить в спорах способности образования НАДФ из НАДФН в присутствии НАД. Таким образом, вопрос о судьбе образующегося НАДФН требует дальнейшего изучения НАДФ-зависимых дегидрогеназ у микроспоридий.

Рис. 1. Участие исследованных ферментов в гликолизе. Толстые черные стрелки - обнаружена активность в спорах микроспоридий; толстые белые стрелки - активность в спорах не выявлена; тонкие стрелки - активность не изучалась.

I УГЛЕВОДЫ |

1

Днгядрокскацггов-Ф —* Гжш?адьдлид

(Глиягрол £ф] 1^дкф-гдипер«т

Г гоцгрмздде» |

Глшшсрол 1

ФЕИ «—• Оксалоацетят

«атааяДГ . нйоче-»ия1м "

Лгетжт ^^ |Пжруи»т| Мялат

НАЛ НАДИ Т НАД<ЬН 11АЦФ |

Азитальдеэд Фу&гаргг

НЛЛНОМФН Я^здг ' НАЯСНАДО) V _Этанол_Сукщнят

Рис. 3. Схема иллюстрирующая участие исследованных ферментов в реакциях глюконеогенеза, пентозо-фосфатного пути и синеза трегалозы. Обозначения как на Рис. 1.

ТРЕГАЛОЗА

кяемкя жиробою тси

, Щр^неогст» • ГЛИКОГЕН

Трсг»лмо 6-Ф ♦ УДФ-глокоаа ГЛЮКОЗА:—ГчРокмо 6-Ф-—-Глюиою 1-ф

-Пнруват*»» Лакмт

I '

-ГдшкролЗ-Ф -Дштадрокидцстез-Ф *—' ^

Рис. 2. Участие исследованных ферментов в заключительных реакциях углеводного катаболизма. Обозначения как на Рис.1.

Рис. 4. Гипотетическая схема интеграции обменных процессов микроспоридий и клетки жирового тела. Прерывистые стрелки - поглощение и выделение соединений паразитами; толстые стрелки - указаны реакции, катализируемые ферментами активность которых увеличивается при заражении (мтх - митохондрия).

ГЛАВА 4. СРАВНЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МИКРОСПОРИДИЙ NOSEMA GR YLLIИ КОКЦИДИЙ ADELINA GR YLLI НА ОРГАНИЗМ СВЕРЧКОВ И АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ УГЛЕВОДНОГО И ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В ЖИРОВОМ ТЕЛЕ Заражение личинок сверчков 2-3 возраста спорами микроспоридий показало, что патогенный эффект начинает проявляться у личинок последних возрастов или у имаго. Этот процесс сопровождается общим ослаблением сверчков, которое проявляется в снижении активности, отставании в росте, в повышеннии смертности и в паразитической кастрации. У зараженных личинок значительно запаздывают сроки линьки и сама линька часто проходит с нарушениями. Перелинявшие особи, по сравнению с незараженными сверчками, более длительное время сохраняют мягкую кутикулу. Микроспоридиоз вызывает очень сильное увеличение размеров жирового тела и подавляет развития яичников (Рис.5).

В отличие от микроспоридий, кокцидии Adelina grylli не оказывают сколько-нибудь заметного влияния на сверчков. При кокцидиозе мы не наблюдали ни заметного снижения акивности насекомых, ни отставания в росте по сравнению с контролем, ни повышенной смертности. A. grylli не вызывает также гипертрофию жирового тела и не охазывает достоверного влияния на развитие яичников. Мы предполагаем, что в основе этого явления лежат различия в физиологии паразитов, и в частности, использование ими различных источников энергии. Если микроспоридии для обеспечения энергией потребляют интенсивно углеводы и тем самым нарушают продукцию трегалозы зараженным жировым телом, то кокцидии, способные к аэробному обмену (об этом говорит наличие митохондрий, высокая активность сукцинатдегидрогеназы у некоторых стадий жизненного цикла, а также предпочтительная локализация в непосредственной близости от трахей), вероятно могут значительно более эффективно использовать разнообразные субстраты - углеводы, аминокислоты и особенно жирные кислоты, которые в большом количестве накапливаются в жировом теле. Таким образом, изменения, наблюдаемые на организменном уровне, связаны с влиянием паразитов на зараженную клетку. Используя для синтеза АТФ малоэффективные анаэробные процессы, микроспоридии, по нашему мнению, поглощают большие количества моносахаров и интенсивно выделяют в зараженную клетку конечные продукты обмена. Это вызывает снижение или

300 •

100 !

50 -

I

Рис.5. Масса яичников у неза-ражешшх и зараженных самок сверчков.

1 - контроль; 2 - заражение микроспоридией; 3 - заражение кокцидней; по оси ординат -масса яичников (мг); по оси абсцисс - возраст сверчков (дни после линьки на имаго).

0 1 3 8 13 21

Рис.6. Динамика удельных активностей МДГ', малик-энзима и Гл.6-фосфатДГ в жировом теле незаряженных самок сверчков.

1 - МДГ(:10); II - малик-энзим; III -Гл.б-фосфатДГ; по оси ординат - удельная активность (нмоль/мин' мг белка); по оси абсцисс - возраст сверчков (дни после линьки на имаго).

увеличение содержания в клетке хозяина различных соединений и ответное изменение интенсивности метаболических ее путей, в частности, активности ферментов. Изучение ответной реакции метаблического аппарата клетки на инвазию представляет интерес как для выяснения метаболических особенностей самих микроспоридий, так и для рассмотрения паразито-хозяинных отношений с точки зрения интеграции партнеров в общую метаболическую систему. В данной работе мы предприняли изучение удельных активностей 8 ферментов углеводного и энергетического обмена в жировом теле контрольных, зараженных микроспоридиями, а также зараженных кокцидиями сверчков .

Изучение динамики удельных активностей МДГ, малик-энзима и глкжозо 6-фосфатдегидрогеназы в жировом теле контрольных самок в различные сроки после линьки на имаго показало, что активность всех трех ферментов достоверно увеличивается на 2-3 день по сравнению с первым днем, а в дальнейшем изменяется незначительно (Рис.6). Увеличение удельных активностей в первые дни после линьки может быть связано со снижением содержания резервных белков в жировом теле или с усилением биосинтетических процессов у самок при развитии яичников. С целью

избежать влияния других факторов на активность ферментов в жировом теле, для измерения активности использовали только самок сверчков 3 -23 дней после линьки на имаго. Только для изучения активности лактатдегидрогеназы использовались как самцы, самки, так и личинки последнего возраста. Это связано с тем, что фермент изучался первым и условия стандартизации материала еще не были подобраны.

Исследование показало (Табл.2), что при микроспоридиозе наблюдается приблизительно 6-кратное увеличение удельных активностей лактатдегидрогеназы (как по прямой, так и по обратной реакциям) и глицерол 3-фосфатдегидрогеназы. Изучение пируваткиназы показало увеличение активности при заражении микроспоридиями не менее, чем в 10 раз. В то же время, мы не обнаружили влияния микроспоридий на активность алкогольдегидрогеназы и гексокиназы.

В связи с тем, что у позоночных животных при различныхх условиях преимущественно синтезируются разные субьединицы ЛДГ (М и Н-типа), представляло интерес изучить, изменяется ли изоферментный состав ЛДГ в жировом теле насекомых при заражении. В результате мы не обнаружили влияния инвазии на изоферментный состав ЛДГ в клетках жирового тела, хотя окраска полос в геле при заражении была значительно интенсивней.

Так как глицерол 3-фосфатДГ и пируваткиназа были обнаружены в спорах микроспоридий, можно было предположить, что увеличение активности ферментов связано с присутствием в пробах зараженного жирового тела высокоактивного фермента из разрушенных стадий паразитов. Однако, ранее мы показали, что в спорах и выделенных по методу Селезнева внутриклеточных стадиях микроспоридий активность глицерол 3-фосфатдегидрогеназы и пируваткиназы была ниже, чем в зараженном жировом теле.

Влияние кокцидий на активность этих ферментов отличается от влияния микроспоридий. При кокцидиозе активность лактатдегидрогеназы увеличивается в несколько большей степени, чем при микроспоридиозе, а активность глицерол 3-фосфатдегидрогеназы, наоборот, сильнее возрастает при микроспоридиозе. Активность пируваткиназы у зараженных микроспоридиями сверчков возрастает в наибольшей степени, тогда как при кокцидиозе вообще не отличается от контроля. Наконец, кокцидии вызывают трехкратное увеличение активности алкогольдегидрогеназы, а микроспоридии не влияют на активность этого фермента. Эти отличия, вероятно, связаны с

Таблица 2

Удельная активность ферментои в жировом теле контрольных и зараженных сверчков (нмоль/мин мг белка)

Фермент Контроль Микросио- Кокцидиоз Совместное Активность при Активность лри

ридиоз заражение мнкроспроридиозе кокцидиозе

ЛДГ (лактат-пируват) 2 + 0.4 10 + 2 25 + 3 38 ±8 Возрастает Возрастает

N=4 N=8 N=8 N=3

ЛДГ (пируват-лактат) 2 + 0.4 14 + 4 24 + 5 31 ±9 Возрастает Возрастает

N=14 N=10 N=10 N=3

Глицсрол 3-фосфатДГ 4 + 1 24+3 17+4 нет данных Возраствает Возрастает

N=19 N=19 N=12

Пируваткииаза 14 + 3 162 ± 13 20 + 4 нет данных Возрастает Не изменяется

N=18 N=23 N=20

АлкогольДГ 12 + 1 13+ 1 33 ±6 24 ±4 Не изменяется Возрастает

N=16 N=13 N=13 N=5

Гексокиназа 71 ±8 71+8 85 + 9 нет данных Не изменяется Не изменяется

N=20 N=19 N=13

Малик-энзим 77 + 6 29 + 2 77 + 7 43 + 5 Снижается Не изменяется

N=45 N=25 N=27 N=5

МДГ (1ЦУК-малат) 1583 + 66 1057 + 50 1377 + 61 1120 + 72 Снижается Не изменяется

N=34 N=17 N=21 N=5

Глюкозо 6-фосфатДГ 261 + 24 194 + 18 282 ± 36 151 + 28 Снижается Не изменяется

N=34 N=21 N=23 N=5

N - количество независимо исследованых особей сверчков

физиологическими особенностями паразитов и, в частности, с составом выделяемых продуктов обмена. Значительное увеличение активности трех ферментов клетки хозяина может быть обьяснено их участием в утилизации предположительно выделяемых микроспоридиями пирувата и глицерол 3-фосфата (Рис.4) и усилением катаболических процессов в зараженной клетке.

Отсутствие изменения активности алкогольдегидрогеназы при заражении микроспоридиями, по-видимому, связано с тем, что для этих паразитов не характерно спиртовое брожение.

Интересно отметить, что микроспоридии вызывают снижение в жировом теле удельных активностей малик-энзима, МДГ и глюкозо 6-фосфатдегидро-геназы (Гл.б-ФДГ) соответственно в 2.6, 1.5 и 1.4 раза. Паразитируя в том же органе, кокцидии в отличие от микроспоридий не оказывают достоверного влияния на активность этих ферментов, так же, как на смертность, активность, развитие и репродуктивную деятельность сверчков. Вероятно, патогенное влияние микроспоридий на сверчков и снижение активности трех ферментов в жировом теле взаимосвязаны.

Указанные ферменты выполняют важную роль в синтезе жирных кислот (малик-энзим и Гл.б-ФДГ в образовании НАДФН, МДГ при образовании цитоплазматического ацетил-КоА), участвуют в глюконеогенезе (МДГ и малик-энзим в обходном превращении пирувата в ФЕП). Таким образом, в зараженном микроспоридиями жировом теле, по-видимому, происходит снижение интенсивности синтеза субстратов энергетического обмена, что может быть связано, например, с подавлением развития яичников.

В том, что касается пластического обмена, то по сравнению с малик-энзимом и МДГ активность Гл.б-ФДГ снижается в меньшей степени. Возможно, это связано с биосинтезом зараженной клеткой нуклеотидов для обеспечения развития паразитов, так как описаны многочисленные факты, свидетельствующие о прямой зависимости между активностью ферментов пентозо-фосфатного пути (в частности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы) и интенсивностью нуклеинового обмена (Кудрявцева, 1978).

выводы

1. Разработаны методические подходы для проведения биохимических исследований на лабораторной модели микроспоридиоза насекомых (сверчки GryUus bimaculatus - микроспоридия Nosema grylli): условия получения чистой от паразитов культуры, искусственного заражения сверчков, выделения, высококачественной очистки и разрушения спор микроспоридий.

2. Результаты исследования показали, что гликолиз играет важную роль в энергетике микроспоридий. При этом получены данные, свидетельствующие в пользу использования микроспоридиями в качестве источника энергии непосредственно фосфогексоз (глюкозо 6-фосфата) клетки хозяина.

3. Микроспоридии реокисляют образуемый в ходе гликолиза НАДН при помощи фермента глицерол 3-фосфатдегидрогеназы, переносящей электроны с НАДН на диоксиацетонфосфат с образованием глицерол 3-фосфата и, вероятно, не используют молочнокислый, спиртовой и сукцинатный типы брожения. В качестве конечных продуктов обмена в клетку хозяина, вероятно, выделяются пируват и глицерол 3-фосфат.

4. Микроспоридиоз вызывает в жировом теле сверчков 6-10 кратное увеличение активностей лактатдегидрогеназы, глицерол 3-фосфатдегидрогеназы и пируваткиназы, но не алкогольдегидрогеназы, что косвенно подтверждает наше предположение о выделении микроспоридиями пирувата и глицерол 3-фосфата, как конечных продуктов обмена, так как усиление активностей указанных ферментов может быть связано с утилизацией выделяемых паразитами конечных продуктов обмена.

5. В жировом теле зараженных микроспоридиями сверчков наблюдается снижение активностей малик-энзима, малатдегидрогеназы и глюкозо 6-фосфат-дегидрогеназы, что может быть связано со снижением интенсивности биосинтеза энергетических субстратов в этой ткани, так как данные ферменты могут участвовать в синтезе жирных кислот и первых этапах глкжонеогенеза при превращении пирувата в ФЕП.

6. Влияние микроспоридий на организм сверчков и активность ферментов в зараженном жировом теле значительно отличается от влияния другого внутриклеточного паразита жирового тела - кокцидии Adelina grylli, что, вероятно, связано с физиологическими различиями паразитов.

7. Полученные результаты позволяют заключить, что одной из основных причин патогенного влияния микроспоридий на насекомого является интен-

сивное потребление углеводов организма хозяина и выделение в зараженную клетку конечных продуктов катаболизма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Предложен метод качественной очистки спор микроспроридий из зараженного жирового тела и их разрушения для дальнейшихх биохимических исследований.

2. Рекомендуется использовать измерение активностей выявленных в спорах ферментов для поиска показателей коррелирующих с патогенностью при создании биопрепаратов на основе микроспоридий.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Селезнев К.В., Исси И.В., Долгих В.В., Соколова Ю.Я., Белос-тоцкая Г.Б., Антонова О.А. Очистка различных стадий жизненного цикла микроспоридии Nosema grylli sp. п. из сверчков Gryllus bimaculatus центрифугированием в градиенте плотности перколла // Паразитология. - 1994. - Т.28, N. 4. - С.298-302.

2. Sokolova Y., Selesnjov К., Dolgikh V.., Issi I. Electronmicroscopic and electrophoretic studies of prespore stages isolated from infected host cells by gradient centrifugation on percoll // Proceedings of 47th Annual Meeting of the Society of Protozoologists and of 3rd Workshop on Opportunistic Protozoan Pathogens, Cleveland, Ohio, US, June 24-29, 1994. - P.71.

3. Sokolova J., Selesnjov K., Dolgikh V., Issi I. . Electronmicroscopic and electrophoretic studies of Microsporidian prespore stages, isolated from infected host cells by gradient centrifugation on Percoll // J. Euk. Microbiol. - 1994. - Vol.41, N 5. - P.62S.

4. Селезнев K.B., Долгих В.В., Маргулис Б.А. Особенности изменения белкового состава жирового тела сверчков Gryllus bimaculatus при заражении микроспоридией Nosema grylli sp.n. И Тезисы дом адов научной конференции "Актуальные проблемы медицинской паразитологии." Санкт-Петербург, 2324 марта, 1994. -С.50.

5. Соколова Ю.Я., Селезнев К.В., Долгих В.В., Исси И.В. Микроспоридия Nosema grylli n.sp. из сверчков Gryllus bimaculatus. // Паразитология. -1994. - Т.28, N 6. - С.488-493.

6. Selesnev К., Issi I., Dolgikh V., Belostotskaya G., Antonova 0., Sokolova J. Fractionation of different life cycle stages of microsporidia Nosema gryili from crickets Gryllus bimaculatus by centrifugation in percoll density gradient for biochemical research // J. Euk. Microbiol. - 1995.- Vol.42, N 3. - P. 288-292.

7. Долгих В.В., Григорьев М.В., Соколова Ю.Я., Исси И.В. Влияние заражения микроспоридией Nosema grylli и кокцидией Adelina sp. на активность и состав изоферментов лактатдегидрогеназы в жировом теле сверчков Gryllus bimaculatus //Паразитология. - 1995,- Т.29, N 6. -С.520-524.

8. Долгих В.В. Определение активности ферментов углеводного и энергетического обмена в спорах микроспоридии Nosema grylli, выделенных из жирового тела сверчков Gryllus bimaculatus. // Тез. докл. Всеросс. сьезда позащите растений. Дек. 1995 г. -Санкт-Петербург, 1995. - С.305-306.

9. Соколова Ю.Я., Долгих В.В., Селезнев К.В., Соколов И.М., Краси-льникова М.Н., Антонова О.А., Исси И.В. Паразито-хозяинная система сверчок Gryllus bimaculatus - микроспоридия Nosema grylli как модель для изучения патогенного воздействия микроспоридий на прямокрылых. // Тез. докл. Всеросс. сьезда позащите растений. Дек. 1995 г. - Санкт-Петербург, 1995. - С.369-370.

10. Селезнев К.В., Антонова О.А., Григорьев М.В., Долгих В.В., Соколова Ю.Я., Исси И.В. Заражение сверчка Gryllus bimaculatus микроспоридией Nosema grylli. // Тез. докл. Всеросс. сьезда по защите растений. Дек. 1995 г.-Санкт-Петербург, 1995. - С. 362-363.

11. Sokolova J., Dolgikh V., Antonova О., Issi I. New data on the pathogenicity of microsporidia Nosema grylli: in favour of its application in the biological control // Proceedings of XIII International Plant Protection Congress, Hague, Netherlands, 2-7 July, 1995.

12. Sokolova J., Dolgikh V., GrigorievM., Issi I. Effect of two intracellular parasites Nosema grylli and Adelina sp. on their host, a cricket Gryllus bimaculatus// Proceedings of Second European Congress of Protistology and Eighth European Conference on Ciliate Biology, Clermont-Ferrand, France, 2126 July 1995. - P.88.

13. Долгих B.B., Григорьев M.B., Соколова Ю.Я., Исси И.В. Сравнительное изучение влияния микроспоридии Nosema grylli и кокцидии Adelina sp. на развитие яичников и активность трех дегидрогеназ в жировом

теле самок сверчков Gryllus bimaculatus // Паразитология. - 1996. - Т.30, N 1. -С. 70-75

14. Долгих В.В., Насонова Е.С., Паскерова Г.Г. Активность ферментов углеводного и энергетического обмена в спорах микроспоридии Nosema grylli // Паразитология. - 1996. -Т.30, N 2. -С. 178-181.

15. Dolgikh Y., Sokolova Y., Issi I. Activity of enzymes of carbohydrate and energetic metabolism in spores of Microsporidian Nosema grylli // Proceedings of Joint Meeting of The American Society of Parasitologists & The Society of Protozoologists, Tucson, Arizona, June 11-15,1996. - P. 125

16. Sokolova Y., Doigikh V., Issi I. Ultrastructural alterations in host cells, caused by Nosema-like species of Microsporidia // Proceedings of Joint Meeting of The American Society of Parasitologists & The Society of Protozoologists, Tucson, Arizona, June 11-15,1996. - P.173.

17. Dolgikh V., Sokolova Y., Issi I, Activities of Enzymes of Carbohydrate and Energy Metabolism of the Spores of the Microsporidian, Nosema grylli II J. Euk. Microbiol. - 1997. - Vol.44, N 3. - P.246-249.