Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, паразитирующей в сверчке Gryllus bimaculatus

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Особенности структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, паразитирующей в сверчке Gryllus bimaculatus"

На правах рукописи

Семенов Петр Борисович

Особенности структурных белков спор микроспоридии Рагапоъета ягуШ) паразитирующей в сверчке Огу11ш ЫтасиШт

Специальность - 03. 00.09 - Энтомология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Аграрном Университете и во Всероссийском институте защиты растений РАСХН в рамках ФЦНТП «Интеграция» № АО 139 «УНЦ: Исследования по инфекционной патологии вредных членистоногих».

Научные руководители:

доктор биологических наук АНАТОЛИЙ ИВАНОВИЧ АНИСИМОВ

кандидат биологических наук ВЯЧЕСЛАВ ВАСИЛЬЕВИЧ ДОЛГИХ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ КОНАРЕВ

кандидат биологических наук, доцент АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ДОБРОВОЛЬСКИЙ

Ведущее учреждение: ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И

БИОХИМИИ ИМ. И.М. СЕЧЕНОВА РАН

Защита состоится «1» июля 2004 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 006.015.01 во Всероссийском институте защиты растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург- Пушкин, ш. Подбельского, д. 3.

Факс: (812)4705110; e-mail: vizrspb@mail333.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского института защиты растений РАСХН

Автореферат разослан « » 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г. А. НАСЕДКИНА

2005-4 12228

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Микроспоридии - чрезвычайно своеобразная группа облигатных внутриклеточных паразитов. Круг хозяев этих паразитических организмов охватывает представителей всех типов царства животных, от простейших до млекопитающих. Благодаря особенностям морфологии, физиологии и биохимии микроспоридий, их позиция в современной филогенетической системе - предмет неутихающих дискуссий.

Наиболее богат и разнообразен видовой состав микроспоридий, паразитирующих в насекомых. Энтомопатогенные микроспоридии - важные регуляторы численности насекомых, что обусловливает значительный интерес к данной группе паразитов как к потенциальным агентам биологического метода борьбы с насекомыми-вредителями. На основе микроспоридии Paranosema (Nosema) locustae созданы промышленные биопрепараты «Нолок» и «Нолобайт», успешно применявшиеся в борьбе с саранчовыми (Henry et al., 1974; 1978; 1981).

Длительное сохранение инвазионного начала во внешней среде и внедрение зародыша в клетку хозяина - главные функции споры и важнейшие факторы, определяющие эффективность биопрепарата на основе микроспоридий. Основными структурами споры, обеспечивающими реализацию упомянутых функций, являются оболочка и полярная трубка.

Наиболее сильное патогенное воздействие микроспоридий на организм хозяина отмечается на заключительном этапе спорогенеза, когда подавляющее большинство особей паразита представлено зрелыми спорами. На данной фазе развития микроспоридии оказывают мощные дистантные эффекты на иммунную и репродуктивную системы насекомых (Селезнев, 1997; Соколова, 2000; Токарев, 2003).

Указанные выше моменты несомненно связаны с уникальными структурными особенностями споры микроспоридий, что обусловливает актуальность изучения структурных белков спор с точки зрения паразито-хозяинных взаимоотношений.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось исследование структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, играющих ключевую роль в патогенезе микроспоридиоза сверчка Gryllus bimaculatus: основного белка оболочки и белков полярной трубки. Для достижения обозначенной цели предполагалось решение следующих задач:

1. Разработать метод выделения и очистки основного белка оболочки и белков полярной трубки спор Р. grylli.

2. Исследовать влияние процесса экструзии, условий хранения на состав белков оболочки спор и изучить возможность использования полученных показателей для оценки жизнеспособности спор.

3. Определить внутриклеточную локализацию выделенных структурных белков на разных стадиях развития паразита, выявить особенности гликозилирования их мо^кул, а также-возможную роль данных белков в паразит-хозяинных <

4. Разработать метод диагностики морфологически сходных видов микроспоридий (на примере рода Paranosema), основывающийся на . анализе состава белков оболочки спор. Научная новизна. К началу экспериментальной работы, результаты которой легли в основу настоящей диссертации, не было ни одной публикации по структурным белкам энтомопатогенных микроспоридий.

Впервые разработан метод выделения основного белка оболочки спор >.

микроспоридии P. gtylli и установлено, что данный белок а больших количествах высвобождается в среду в процессе стимуляции экструзии полярных трубок in vitro. Показано избирательное снижение содержания этого белка в оболочке спор в ходе их хранения. Продемонстрировано наличие больших количеств белка оболочки спор в цитоплазме зараженных клеток насекомого-хозяина и предложены гипотезы для возможного объяснения этого факта. Выявлено, что данный белок гликозилирован по типу О-маннозилирования, описанного только для дрожжевых грибов. Показано, что у микроспоридий отсутствует характерное для большинства типичных эукариот N-гликозилирование белков.

Впервые для энтомопатогенных микроспоридий у P. grylli идентифицированы белки полярной трубки (БПТ). На примере БПТ P. grylli продемонстрирована способность микроспоридий использовать одни и те же белки для построения разных структур спор - оболочки и полярной трубки. Выявлена исключительно высокая степень гликозилирования молекулы одного из выделенных белков (БПТ-1), что, вероятно, связано с его особой функцией в уникальном процессе выброса (экструзии) полярной трубки. Практическое значение работы. На примере микроспоридии P. grylli показано, что содержание количественно преобладающего белкового компонента оболочки спор может служить показателем длительности их хранения и жизнеспособности. Тест на основе электрофоретического разделения белков оболочки может приблизительно показать пригодность данной партии спор для использования в качестве продуцента биопрепарата. <

Белковый состав оболочки спор микроспоридий является надежным видоспецифичным признаком. Многие близкие виды микроспоридий невозможно отличить по морфологии при рассмотрении на светооптическом уровне. Мы рекомендуем использовать электрофоретические спектры белков спор для диагностики видов микроспоридий, например, при учете зараженности этими паразитами популяций вредных членистоногих. Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, декабрь 1998); на XXVI межвузовской конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии (С-Петербург, март 1999); на научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в решение задач научного обеспечения АПК Северо.-Запада РФ» (С-Петербург-Пушкин); на 49 чтении, посвященном памяти В. А. Догеля, на научных семинарах лаборатории'микробнеяогичеекей защиты ВИЗР.

( * Й J <W i *

i • г -4 ti

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 в реферируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав и выводов. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 40 рисунками. Список цитированной литературы включает 91 источник, из которых 74 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава 1. Обзор литературы

Приведен анализ литературных данных по ультратонкой морфологии клеток стадий развития микроспоридий с акцентом на описание морфогенеза органелл аппарата экструзии. Подробно рассмотрены строение и белковый состав оболочки споры и полярной трубки. Отдельный раздел посвящен особенностям процесса активации спор, завершающегося экструзией полярной трубки.

Глава 2. Материалы и методы исследований

Основным объектом исследований была микроспоридия Paranosema grylli из лабораторной культуры сверчка Gryllus bimaculatus. В некоторых экспериментах была задействована микроспоридия P. locustae из азиатской саранчи Locusta migratoria, также содержащейся в культуре. Сверчков культивировали по методу Князева (Князев, 1985), экспериментальное заражение осуществляли путем добавления спор микроспоридии в поилки.

Споры и клетки пролиферативных стадий микроспоридий выделяли из жирового тела зараженных насекомых, отпрепарированного в фосфатно-солевом буфере. Стимуляцию экструзии полярных трубок спор P. grylli осуществляли по методу Куртти с соавторами (Kurtti et al., 1994).

Для идентификации белков и изучения белкового состава проб использовали метод диск-электрофореза в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН). Элетрофорез осуществляли в пластинах по методу Лэммли i (Laemmli, 1970) при комнатной температуре. На общие белки гели

окрашивали в течение суток в растворе, содержащем 0,2% Кумасси (Coomassie brilliant blue), 40% метанола, 10% уксусной кислоты. Специфическую окраску гелей на гликопротеины осуществляли по методу, описанному Гаалем с соавторами (Гааль и др., 1982).

С целью иммунизации кроликов препараты очищенных антигенов (основного белка оболочки и полярной трубки спор P. grylli) инъецировали подкожно. Инъекции осуществляли в 5 повторностях с трехдневными интервалами. Полученные поликлональные антисыворотки тестировали с помощью иммуноблоттинга после полусухого электропереноса разделенных белков из электрофоретических гелей на нитроцеллюлозные мембраны. Очистку антисывороток осуществляли методом бесколоночной аффинной хроматографии. В качестве сорбента использовали измельченные нитроцеллюлозные фильтры, содержащие соответствующие антигены, перенесенные из электрофоретических гелей.

При приготовлении образцов для электронного микроскопирования фрагменты отпрепарированного жирового тела зараженных сверчков фиксировали в смеси, содержащей 0,5 % параформальдегида и 0,1 % глютарового альдегида на 17 мМ фосфатном буфере (pH 7,2). После обезвоживания образцы заключали в заливочную среду LR-white (для последующего приготовления ультратонких срезов) или 10% желатин (для получения криосрезов). Ультратонкие срезы, изготовленные с помощью ультратома Reichert-Yung, размещали на никелевых сетках (300 меш). Крио-срезы, толщиной 50-60 нм изготавливали на криоультратоме R/FCS (Leica), собирали в раствор, содержащий 1,8 % метилцеллюлозы и 2,3 M сахарозы (Martinez-Menarguez et al. 2001) и помещали на медные сетки или бленды, покрытые слоем формовара. После обработки блокирующим раствором сетки помещали в раствор первых антител, отмывали и инкубировали с коммерческими вторыми антителами против кроличьих Ig G, конъюгированными с гранулами коллоидного золота.

Для изучения особенностей гликозилирования структурных белков Р. grylli осуществляли обработку N-гликозидазой F и блот-анализ с использованием лектина из проростков пшеницы (Wheat germ agglutinin, Sigma), конъюгированного с пероксидазой хрена. Также проводили аффинное осаждение изучаемых белков лектином из Galanthus nivale (GNA, Sigma), иммобилизованным на агарозном сорбенте в сочетании с обработками а- и ß маннозидазами. Связавшиеся с сорбентом гликопротеины элюировали кипячением в растворе ДСН.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 3.1. Особенности основного белка оболочки спор микроспоридии Р. grylli

Последовательная инкубация спор микроспоридии Р. grylli в трех растворах: ImM трис, 10 тМ ЭДТА (раствор 1); 10 тМ КОН, 170 тМ KCl (раствор 2); 25 тМ трис, 10 тМ ЭДТА, 170 тМ KCl (раствор 3) приводит к экструзии полярных трубок (Рис. 1). Непосредственным стимулом, запускающим данный процесс, является сдвиг pH среды, возникающий при переносе спор из раствора 2, имеющего щелочную реакцию, в нейтральный раствор 3. Однако некоторые события, предшествующие экструзии и, возможно, играющие в данном процессе определенную функциональную роль, отмечаются на этапе инкубации спор в щелочно-солевом растворе (растворе 2). Так, обработка спор этим раствором приводит к накоплению в среде значительного количества белка, конечная концентрация которого, при измерении колориметрическим методом, достигает 200 мкг/мл на 100 мкл осадка спор. ДСН-электрофорез супернатантов проб, полученных в результате инкубации спор в растворе 2, показал, что белок, выделенный таким образом, имеет молекулярную массу 40 кДа (р40) (Рис. 2). Данный белок количественно преобладает в пробах осадков субклеточных фракций гомогената спор и при этом не выявляется в соответствующих пробах супернатантов. Кроме того, р40 переходит в растворимую форму при

кипячении интактных спор в растворе ДСН, что в сочетании с данными о солюбилизации данного белка в ходе инкубации спор в щелочно-солевом растворе, послужило основой для предположения о локализации р40 в поверхностном слое споровой оболочки.

РАСТВОР 2 (рН 10) РАСТВОР 3 (рН 7)

РАСТВОР 1 (рН 7) 10 тМ кон 25 тМ ТРИС,

1 тМ ТРИС, 170 пм кс,' Ю тМ ЭДТА,

ЮтМЭДТА 170гаМКС1 ф

СДВИГ рН '

О—.....• в-

ВЫДЕЛЕНИЕ р40 ЭКСТРУЗИЯ

Рис. 1. Схема стимуляции экструзии полярных трубок спор Р. gгylli и

выделения р40.

mw,kDa 12 3 4 5 6

Рис. 2. Выделение р40 в раст-""*" вор 2.

тм>, кОа- шкета маркеров моле-45— - П кулярного веса в килодальтонах.

^ + I- споры, хранившиеся в воде 1 год; 2- споры, хранившиеся в воде 4 месяца; 3, 4- свежие споры двух независимых выделений; 5- споры, хранившиеся в 0,02 %-ном растворе азида натрия 18 месяцев; б- споры, хранившиеся в воде 2 недели.

14,3-

Результаты окрашивания диамидинофенилен индолом (ДАФИ) интактных спор и спор, обработанных раствором 2, показали, что оболочка последних в значительной мере утрачивает способность взаимодействовать с красителем. Это проявляется в существенном снижении количества спор с интенсивно окрашенной оболочкой, что, возможно, является следствием значительных изменений свойств оболочки, связанных с выходом в среду р40 (Рис. 3).

Хранение спор в течение 4 месяцев в дистиллированной воде при +4°С сопровождалось существенным снижением содержания р40 и приводило к высвобождению в ходе инкубации в растворе 2 ряда низкомолекулярных белков (Рис. 2, дорожка 2), появление которых может быть результатом протеолиза основного белка оболочки. При увеличении срока хранения спор до одного года, выявить присутствие р40 на электрофоретическом геле в

пробах щелочно-солевого экстракта, было практически невозможно (Рис. 3, Ь, с, дорожка 1). Хранение спор в течение 18 месяцев в присутствии антимикробного агента - азида натрия вызывало полное исчезновение изучаемого белка из оболочки, в то время как состав остальных мажорных белков в пробах поверхностных белков оболочки, полученных кипячением интактных спор в растворе ДСН, изменялся не столь значительно (Рис. 4).

□ интактные споры "

- - I I

■споры, обработанные 1 1 раствором 2 _|

100

о а- 90

X ш >Х~ § 80

О X 5 70

р X 60

X о о 50

о. о О X 40

с о X ф 30

ГС 3 20

с; га

сг и. О 10

0

—

---- Л- -VI

выделение 1

выделение 2

Рис. 3. Окрашивание ДАФИ интактных спор и спор, обработанных

раствором 2.

Мы не имеем прямых доказательств существования функциональной взаимосвязи между процессами солюбилизации основного белка оболочки спор и выбросом их полярных трубок, однако, согласно нашим наблюдениям, наилучшие условия выделения р40 соответствовали оптимальным условиям экструзии (Рис. 2). В качестве объективного показателя эффективности экструзии мы использовали электрофорез проб раствора 3 после инкубации спор. Эти пробы содержат белки экструзированных спороплазм, суммарное количество которых дает представление о том, как прошел выброс полярных трубок у спор данного образца (Рис. 4, а).

Таким образом, из сказанного выше следует, что количество р40 в пробах белков, смытых с поверхности спор Р. %гуШ раствором ДСН, может служить показателем длительности пребывания спор во внешней среде и их жизнеспособности. Мы полагаем, простой в отношении методики и не дорогостоящий тест на содержание белков оболочки, можно использовать при работе с другими видами микроспоридий, представляющими непосредственный интерес для защиты растений.

На р40, выделенный в чистом виде, получена поликлональная антисыворотка. Методом иммуноблоттинга выявлена локализация данного белка в пробах мембрано-связанных фракций белков гомогенатов спор и

клеток доспоровых стадий. В пробах супернатантов исследуемый белок не обнаруживался.

Продемонстрировано присутствие значительных количеств р40 в жировом теле зараженного хозяина после удаления клеток паразита путем центрифугирования. На электрофореграмме (Рис. 5) видно, что этот белок образует мажорную полосу в пробах субклеточных фракций гомогената жирового тела зараженных хозяев и при этом не обнаруживается в аналогич-

3 4 Рис. 4. Сравнение состава бел-

— 67 ков свежих и старых спор Р. - _ grylli.

а- белки, высвобожденные в ** —45 раствор в результате экс-^^ -*-р40 труши спороплазм; Ь- белки, ; смытые с поверхности спор

кипячением в растворе ДСН. mw, kDa- шкала маркеров молекулярного веса в килодаль-тонах; 1- споры, хранившиеся в воде 1 год; 2- споры, хранивши-|—14,3 еся в в°де 4 месяца; 3- свежие д ^ споры; 4- споры, хранившиеся в

0,02 %-ном растворе азида натрия 18 месяцев.

12 34

mw,

kDa •m

67- 'Ш

»

45- *

ных пробах, приготовленных из контрольных сверчков. Интересно, что р40 достоверно выявлялся только в инвазированных микроспоридией органах сверчков, содержавших паразита на заключительном этапе спорогонии, преимущественно на стадии зрелых спор.

Метод иммунофлюоресцентного мечения позволил обнаружить р40 на оболочках споронтов и споробластов. В то же время, лишь часть спор окрашивалась флюоресцирующими конгьюгатами антител. Вероятно, данный факт в определенной мере отражает динамику экспрессии поверхностных антигенов в ходе созревания спор. Имеются литературные данные о белке оболочки спор Encephalitozoon intestinalis - SWP1, который также в больших количествах выявляется на поверхности оболочки споробластов, чем на поверхности экзоспоры зрелых спор.

Иммунная электронная микроскопия с использованием поликлональ-ной антисыворотки, очищенной методом бесколоночного аффинного связывания, продемонстрировала локализацию р40 в экзоспоре зрелых спор и наружной электронноплотной оболочке споронтов и споробластов, которая является морфогенетическим предшественником экзоспоры у клеток стадий спорогонии и спорогенеза.

Рис. 5. Выявление р40 в субклеточных фракциях жирового тела зараженных сверчков G. bimaculatus. а - пробы жирового тела, инвазированного микроспоридией; Ь- пробы жирового тела здоровых сверчков.

mw, kDa- шкала маркеров молекулярного веса в килодальтонах; /- осадок после центрифугирования гомогената жирового тела при 1000 G, предварительно освобожденного от клеток микроспоридии путем центрифугирования при 120 G; 2- осадок после центрифугирования при 5000 G супернатанта, полученного на предыдущем этапе; 3, 4- осадок и супернатант (соответственно), полученные после центрифугирования супернатанта 2 при 20000 G.

Рис. 6. Присутствие р40 в концентрических структурах цитоплазмы клетки хозяина (иммунная электронная микросколия).

Стрелки указывают на гранулы коллоидного золота, мар-кирущие иммунные метки.

С- оболочка споробласта; S — концентрическая структура в цитоплазме клетки хозяина. Масштабная черта - 0,5 мкм.

Интересен факт интенсивного мечения своеобразных структур в цитоплазме клетки хозяина, состоящих из нескольких концентрических

контуров и располагающихся в непосредственной близости от клеток паразита (Рис. 6). В клетках жирового тела незараженных сверчков подобные образования не обнаруживаются и их происхождение и функция неизвестны. Мы предполагаем, что эти концентрические структуры представляют собой фрагменты наружной электронноплотной оболочки клеток стадий спорогонии - своего рода «излишки», формирующиеся в процессе преобразования споробластов в споры. Данный процесс сопровождается сильным обезвоживанием цитоплазмы, что приводит к существенной компактизации клетки и, соответственно, уменьшению площади ее поверхности. По данным Соколовой и соавторов (БокоЬуа е1 а1., 2003), линейные размеры споробластов Р. %гуШ на электронограммах соответствуют 5,74 ± 0,14 * 2,12 ± 0,08 мкм, а зрелых спор - 3,3 ± 0,06 х 1,43 ± 0,07 мкм. Если допустить, что все эти клетки имеют форму цилиндра, то, вычисленная по формуле 8=27111(11+11), площадь поверхности споробласта составит 45,29 мкм2, споры - 18,02 мкм2. Предположим, что экзоспора, развивающаяся из наружной оболочки спорон-та, должна завершить морфогенез на стадии споробласта, площадь поверхности клетки которого в 2,5 раза превышает, таковую споры. Тогда при трансформации споробласта в спору 60 % поверхности экзоспоры оказывается «лишней». «Излишки» экзоспоры накапливаются в цитоплазме клетки хозяина в виде упомянутых концентрических структур и наибольшее их количество отмечается, когда созревание спор уже завершилось. Именно поэтому значительные количества р40 выявляются только на электрофоре-граммах проб жирового тела зараженных сверчков, содержавших преимущественно споры Р. %гуШ.

Согласно полученным нами результатам, р40 является единственным продуктом жизнедеятельности микроспоридий, для которого на настоящий момент достоверно продемонстрировано выделение в клетку хозяина. В то же время, существуют убедительные данные, свидетельствующие о дистантном эффекте, оказываемом микроспоридиями на иммунную систему хозяина, характерным проявлением которого является подавление фермента фенолоксидазы, катализирующего одну из реакций каскада, направленного на образование меланиновых капсул, изолирующих чужеродные объекты в организме насекомого (Лозинская и др., 1998; Токарев и др., 1999а, б, 2003; 8око1оуа et а!., 1999). Описано также угнетающее влияние микроспоридии Р. ЕГуШ на развитие репродуктивной системы С. Ытаси1аШ при том, что паразит не заселяет половые железы хозяина (Селезнев, 1997). Мы можем предположить причастность к подобным феноменам р40, который в наибольшем количестве выделяется на заключительном этапе спорогонеза паразита, в период, когда патогенное воздействие на хозяина особенно сильно. Вполне вероятно, что спора, заключенная в толстую оболочку, не способна к экзоцитозу и воздействие микроспоридии на организм хозяина опосредовано белком, высвобождающимся из поверхностного слоя споровой оболочки.

Предпринятое нами исследование гликозилирования р40 обусловлено двумя причинами. Первая причина состоит в том, что данный тип посттрансляционной модификации белка представляет бесспорный интерес с точки зрения структурно-функциональных свойств белковой молекулы. Углеводные детерминанты гликопротеинов на поверхности клеток многих паразитов обеспечивают специфические взаимодействия с поверхностными антигенами клетки хозяина, без чего невозможно проникновение паразита. Вторая причина связана с наличием у микроспоридий атипичного аппарата Гольджи, характеризующегося отсутствием везикулярного транспорта и представляющего собой уникальный пример редукции. Как белок, секретируемый клеткой паразита, и инкорпорирующийся в формирующуюся наружную оболочку, р40 должен проходить через аппарат Гольджи и подвергаться гликозилированию в ком-партментах этой органеллы.

Обработка N-гликозидазой F не привела к изменению электрофоре-тической подвижности р40, что может свидетельствовать об отсутствии у основного белка оболочки спор P.grylli N-связанных олигосахаридных цепей (Рис. 7). Блот-анализ белков спор с лектином из проростков пшеницы (Wheat germ agglutinin (WGA)), специфичным по отношению к терминальным остаткам N-ацетилглюкозамина в составе углеводных компонентов гликопротеинов, выявил отсутствие взаимодействия WGA с р40 или каким-либо другим белком спор микроспоридии. В то же время, многие белки в пробе гомогената жирового тела сверчка G. bimaculatus, игравшей в этом эксперименте роль положительного контроля, интенсивно связывали лектин из проростков пшеницы (Рис. 8). Данный результат вполне согласуется с предыдущим, так как концевые остатки N-ацетилглюкозамина характерны именно для N-гликозилированных гликопротеинов у «типичных» эукариот.

Вместе с тем, продемонстрировано аффинное осаждение р40 лектином из Galanthus nivale (GNA), иммобилизованным на агарозном сорбенте. Данный лектин избирательно взаимодействует с концевым остатками манннозы (Рис. 9). Обработка р40 маннозидазами предотвращает специфическое связывание белка аффинным сорбентом. На электрофоре-грамме проб смывов р40 с GNA-агарозных частиц видно, что лишь часть молекул изучаемого белка связывается с лектином. Возможно, р40, локализованный в экзоспоре, непосредственно контактирует с цитоплазмой клетки хозяина и подвергается частичному дегликозилированию под воздействием цитоплазматических маннозидаз (Weng, Spiro, 1996).

Таким образом, выявлено, что основной белок оболочки спор P. grylli гликозилирован по типу О-маннозилирования, описанного только у дрожжевых грибов. Эти данные совпадают с результатом полной расшифровки последовательностей генома Е. cuniculi (Katinka et al., 2001), согласно которому у микроспоридий отсутствуют гены ферментов типичного N-гликозилирования, но обнаруживается комплекс генов О-гликозили-

рования по «дрожжевому» типу. Наличие О-маниозилирования у белка микроспоридии, продемонстрированное нами впервые, является еще одним

Рис. 7. Обработка р40 1Ч-гликозидазой Г. а- р40; Ъ- человеческий трансферрин (положительный контроль).

1- интактный белок; 2- белок, обработанный ферментом.

Рис. 8. Блот-анализ белков спор микроспоридии P. grylli и белков жирового тела G. bimaculatus с лектином из проростков пшеницы (WGA). а- окраска пуансо красным на общие белки; Ь- WGA-блоттинг. mw, kDa- шкала маркеров молекулярного веса в килодальтонах; I- белки гомогената жирового тела G. bimaculatus; 2- белки гомогената спор Р. grylli.

2 3 4

Ж

Рис. 9. Аффинное осаждение р40 GNA - агарозным сорбентом

/- выделенный р40; 2- р40, смытый с GNA - агарозного сорбента; 3, 4-смыв с осадка GNA-агарозы после инкубации с р40, предварительно обработанным а- и ß- маннозидазами (соответсвенно).

свидетельством филогенетической близости микроспоридий и грибов, а также подтверждает возможность функционирования системы гликозилиро-вания белков в атипичном, лишенном везикулярного транспорта аппарате Гольджи микроспоридий.

3.2. Особенности белков полярной трубки микроспоридии

P. grylli

Для выделения белков полярной трубки (БПТ) использовали уже описанную в литературе методику (Weidner, 1976, 1982, fieohan and Weiss, 1999) с некоторыми привнесенными нами изменениями (Рис. 10). Данный метод предусматривает избирательную экстракцию белков 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) из спор, предварительно подвергшихся стимуляции экструзии

а

mw,

12 1 2Ша , -Ш

-66

-45 -35 -25

-18

1 I

а

полярных трубок и отмывке в серии растворов детергентов (ДСН, мочевина). Поскольку растворимость в 2-МЭ, является общим свойством БПТ (Keohan and Weiss, 1999), выделенные данным методом и разделенные электрофорети-чески четыре белка мы обозначили как БПТ-1, БПТ-2, БПТ-3 и БПТ-4 (Рис. 11).

На смесь экстрагированных белков получена поликлональная антисыворотка, из которой методом бесколоночной аффинной хроматографии выделены фракции, обогащенные иммуноглобулинами, специфично реагирующими только с одним из перечисленных белков в каждом варианте. Вестерн-гибридизация с использованием очищенных моноспецифичных антисывороток показала, что БПТ-1 присутствует в гомогенате клеток доспоровых стадий Р grylii, в то время как БПТ-2 и БПТ-3 в данной пробе не обнаруживаются. В пробах растворимой и мембрано-связанной фракций гомогената спор присутствуют все упомянутые БПТ (Рис. 12 а, Ь). Очевидно, Выделение __ ,,

,, очистка спор в ^дТнШ-Т

^ у _ f7acr;S0M

J£1P-P2P«

^»• ............ТИнкубация в 3%-ном

Стимуляция экструзии полярных трубок 11 р-ре ДСН

спор _ -'Н в течение 10 мин

Отмывка в 3% -ном

растворе ДСН

Добавление 2-МЭ rjflX р. до концентрации 75%

II к неотмытому осадку

Отмывка в воде

или 4М мочевин^ Инкубация в течение ночи

Ф1 *

Добавление 2-МЭ 1| В экстракте

дэ концентрации 75%\| присутствует

Инкубация в течение ночи только белок

^ с массой 56 кДа

В экстракте присутствуют белки с массами 56,46.34 и 21 кЛа

Рис. 10. Схема выделения белков полярной трубки (БПТ) из спор Р. gryllL

синтез БПТ-1 начинается на более ранних этапах развития клетки паразита. БПТ-2 и БПТ-3 дают перекрестную иммунологическую реакцию при проведении иммуноблоттинга и характеризуются идентичными условиями экстракции (Рис. 10). По-видимому, данные белки обладают значительным сходством по аминокислотному составу.

Результаты иммунного электронного микроскопирования подтвердили принадлежность выделенных нами белков полярной трубке спор и ее зачаткам в клетках стадий спорогенеза. Нередко гранулы коллоидного золота отмечались в комплексе Гольджи клеток доспоровых стадий развития микроспоридии. Обращал на себя внимание факт мечения оболочки спор, причем антитела преимущественно взаимодействовали с наружной частью

экзоспоры, граничащей с цитоплазмой клетки хозяина и с внутренней частью эндоспоры, прилегающей к плазматической мембране. Кроме того, иммунная метка выявлялась в наружной электронноплотной оболочке клеток споронтов и споробластов. Мечение оболочек антителами на БПТ-2 и БПТ-3 было менее плотным по сравнению с таковым антителами на БПТ-1.

Присутствие существенных количеств БПТ в составе оболочки спор продемонстрировано также методом иммуноблотгинга. Данные белки выявлялись в пробах, полученных кипячением интактных спор в растворе ДСН, что говорит об экстракции БПТ из споровых оболочек (Рис. 12, с). Электронное микроскопирование спор, подвергшихся процедуре кипячения в растворе детергента, показало, что их оболочки сохраняют структурную це-

Рис. И. Выделение БПТ из спор Р. gтytíL 12 3 шм>, кЭа- шкала маркеров молекулярного

веса в килодальтонах; выстрелившие спо-БПТ-1 рЫ обработанные: /- 3%-ным р-ром ДСН 45 — —» -^в*БПТ-2 и ресуспендированные в 75%-ном растворе

2-МЭ; 2- 3%-ным раствором ДСН, 9 М ._ -^ЬБПТ 3 РаствоРом мочевины и ресуспендирован-

ные в 75 %-ном растворе 2-МЭ; 3- 3%-ным раствором ДСН, 9 М раствором мочевины -«•БПТ-4 и ресуспендированные в 100 %-ном 2-МЭ.

ШаЯ I -«БПТ-1 кРа 1 2

50- | 66~| БПТ-1

14,3-*

12 3 12 3

I

3530-

I ^

>* а ■ —«БПТ-2 НБПТ-З

45- т —•■БПТ-2

30- *БПТ-3

гг

а Ь с

Рис. 12. Выявление локализации БПТ в клетках стадий развития Р. %туЩ методом иммуноблотгинга. а- гомогенат доспоровых стадий, Ь- гомогенат спор, с- поверхностные

белки оболочки спор.

т\\>, Ша- шкала маркеров молекулярного веса в килодальтонах; I- антисыворотка на БПТ-1; 2- антисыворотка на БПТ-2; 3- антисыворотка на БПТ-3. лостность. Таким образом, наличие БПТ в пробах поверхностных белков не является следствием их солюбилизации из полярных трубок разрушенных спор. Полученные впервые данные о способности микроспоридий

использовать одни и те же белки для построения разных структур можно считать еще одной иллюстрацией эволюционной тенденции этих паразитов к максимально экономичному использованию генома.

Специфическое окрашивание углеводных компонентов гликопро-теинов в электрофоретических гелях с помощью йодной кислоты и реактива Шиффа, продемонстрировало исключительно высокую интенсивность глико-зилирования БПТ-1 (Рис. 11). Служившие положительным контролем глико-протеины гомогената жирового тела сверчка С. ЫтасиЫю, среди которых, несомненно, многие характеризуются большим количеством олигосаха-ридных цепей, обнаруживали достаточно бледное окрашивание не сравнимое по степени яркости с таковым у БПТ-1. При этом, эксперименты с использованием лектина аналогичные проделанным с р40, показали, что БПТ-1, в отличие от основного белка оболочки спор Р. %гуШ, по-видимому, не свойственно О-маннозилирование и тип гликозилирования молекулы данного белка остается неизвестным.

Столь высокая степень гликозилирования БПТ-1 играет, вероятно, важную роль в процессе экструзии полярной трубки и говорит об уникальной функциональной специализации этого необычного белка.

Рис. 13. Окрашивание белков (7. ЫтасиШм и Р. gryШ на гликопротеины. а- гель, окрашенный на общие белки; Ь- гель, окрашенный на гликопротеины.

ти>, кОа- шкала маркеров молекулярного веса в килодальтонах; I-растворимые белки жирового тела ОгуИт ЫтасиШш (супернатант после центрифугирования при 1000 С); 2- выделенные БПТ; 3- выделенный белок оболочки спор (р40); 4- белки, смытые с поверхности спор раствором ДСН;

5- белки общего гомогената спор.

3.3. Белковый состав оболочки спор как видоспецифичный признак у микроспоридий

Белковый состав спор может служить надежным видоспецифичным признаком и применяться в диагностике близких видов микроспоридий, характеризующихся сходной морфологией и неотличимых на светоопти-ческом уровне. ДСН-электрофоретическое разделение белков спор двух видов энтомопатогенных микроспоридий, развивающихся в двух представителях отряда Orthoptera - Paranosema grylli из двупятнистого сверчка Gryllus bimaculatus и Р. locustae из азиатской саранчи Locusta migratoria, продемонстрировало значительные различия в белковом составе, в то время как, даже при электронном микроскопировании отличить данные виды крайне затруднительно (Рис. 14). Особенный интерес представляет сравнительный анализ проб поверхностных белков оболочки, полученных кипячением интактных спор в растворе ДСН. Это объясняется существенно меньшим общим количеством белков в данных пробах по сравнению с пробами гомогената спор наряду с наличием легко идентифицируемых мажорных компонентов. Процедура приготовления проб поверхностных белков не требует гомогенизации спор, что обусловливает ее простоту в методическом отношении. Минимальное количество материала для проведения этого анализа исчисляется микролитрами осадка спор.

Рис. 14. Сравнение поверхностных белков оболочки спор двух видов микроспоридий: Р. %гуШ и Р. 1осиШе. Стрелки указывают на полосы белков, по которым обнаруживаются наиболее значительные различия между видами (черные стрелки - Р. grylli, серые - Р. 1осшШ). ггт, кйа- шкала маркеров молекулярного веса в килодальтонах; 1-, 2- поверхностные белки спор Р. gry¡li и Р. 1ост1ае соответственно.

Выводы

На основе изучения особенностей белков, количественно преобладающих в составе оболочки и полярной трубки споры - структурах, играющих ключевую роль в реализации спорой ее основных функций - длительном сохранении во внешней среде, своевременной активации и распространения

инвазионного начала среди новых хозяев, мы можем сделать следующие выводы:

1. Впервые для энтомопатогенных микроспоридий на примере P. grylli, паразитирующей в сверчке G. bimaculatus, идентифицированы и изучены структурные белки споры, играющие ключевую роль в патогенезе микроспоридиоза сверчка.

2. Разработан метод выделения основного белка оболочки спор ,, микроспоридии P. grylli. Данный белок имеет массу около 40 кДа, в значительных количествах высвобождается в среду при стимуляции экструзии полярных трубок in vitro и постепенно исчезает из оболочки спор в ходе их хранения.

3. Количество р40 в оболочке может служить показателем срока хранения и жизнеспособности спор. Таким образом, впервые получены критерии, возможно позволяющие контролировать активность спор микроспоридий, их способность к экструзии зародышей и заражению насекомых хозяев.

4. р40 является белком экзоспоры зрелых спор и наружной электронноплотной оболочки клеток спорогональных стадий развития микроспоридии.

5. Основной белок оболочки спор P. grylli в значительных количествах присутствует в жировом теле насекомого-хозяина, содержащего паразита на заключительном этапе спорогонии, где ассоциирован со структурами неизвестной функции. Мы предполагаем, что данные структуры представляют собой дериваты наружной оболочки споробластов, которые становятся «излишками» при дегидратации и компактизации клеток в период превращения споробластов в споры.

6. Полученные впервые данные о выделении микроспоридиями в клетку хозяина субстанции белковой природы, совпадающем по времени с наиболее явными патологическими нарушениями в организме насекомого, могут свидетельствовать об участии р40 в ,« развитии данных нарушений при микроспоридиозе G. bimaculatus, вызываемом P. grylli.

7. Основной белок оболочки спор P. grylli является О-маннози-лированным белком. Такой тип гликозилирования характерен для дрожжей и данный результат, впервые полученный на уровне молекулы белка, можно считать еще одним свидетельством в пользу филогенетического родства микроспоридий и грибов.

8. Впервые у эятомопатогенной микроспоридии идентифицированы и выделены белки полярной трубки (БПТ). Для трех БПТ, имеющих молекулярные массы 56 (БПТ-1), 46 (БПТ-2) и 34 (БПТ-3) кДа, методом иммунофлюоресцентного анализа и иммунной электронной микроскопии подтверждена локализация в полярной трубке спор и зачатках этой структуры у споробластов.

9. Достоверно показано, что три белка полярной трубки (БПТ-1, БПТ-2 и БПТ-3) в существенных количествах содержатся в наружной электронноплотной оболочке клеток преспоровых стадий развития и экзоспоре зрелых спор, что говорит о способности микроспоридий использовать одни и те же белки для построения разных структур.

10. Продемонстрирована исключительно высокая интенсивность глико-зилирования БПТ-1, обусловленная, вероятно, функциональной спе-цииализацией данного белка.

И. Показана возможность использования для дифференциальной диагностики морфологически сходных видов микроспоридий нового метода, основанного на анализе состава белков оболочки спор.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется использовать содержание количественно преобладающего белкового компонента оболочки спор после электрофоретического разделения в качестве показателя длительности их хранения и жизнеспособности.

2. Для диагностики близких видов микроспоридий, обладающих сходной морфологией, рекомендуется использовать анализ состава поверхностных белков оболочки спор.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Токарев Ю.С., Семенов П.Б., Григорьев М.В., Соколова Ю.Я. Выявление фенолоксидазной активности в гемоцитах сверчка Gryllus bimaculatus при микроспоридиозе и кокцидиозе. // Материалы Всероссийск. научн. конф. «Взаимоотн. паразита и хозяина». Дек. 1998 г. - Москва, 1998. - С.66

2. Семенов П.Б., Соколова Ю.Я.., Токарев Ю.С., 1998. Протозойные инфекции саранчи Locusta migratoria migratorioides, содержащейся в культуре // Материалы Всероссийск. научн. конф. «Взаимоотн. паразита и хозяина». - М., 1998. - С.58

3. Токарев Ю.С., Семенов П.Б., Глупов В.В., Соколова Ю.Я. Гисто- и биохимическое выявление активности трех ферментов защитной функции гемолимфы сверчка Gryllus bimaculatus при микроспоридозе и кокцидиозе // Материалы XXVI межвузовск. науч.-практ. конф. по пробл. биол. и мед. паразитол. - С-Петербург, 1999. - С.32-33

4. Семенов П.Б., Токарев Ю.С., Долгих В.В., Соколова Ю.Я. Структурные и биохимические особенности двух видов микроспоридий прямокрылых // Материалы XXVI межвузовск. науч.-

практ. конф. по пробл. биол. и мед. паразитол. - С-Петербург, 1999. -С.30-31

5. Семенов П.Б., Токарев Ю.С., Долгих В.В., Соколова Ю.Я. Особенности микроспоридиоза лабораторной популяции перелетной саранчи // Материалы XXVI межвузовск. науч.-практ. конф. по пробл. биол. и мед. паразитол. - С-Петербург, 1999. - С.31

6. Токарев Ю.С., Семенов П.Б., Соколова Ю.Я. Влияние микроспоридии Nosema grylli на гемоциты сверчка Gryllits bimaculatus И Мат. науч-практ. конф. «Вклад мол. уч. в реш. задач науч. обесп. АПК Сев.-Зап. РФ». - С-Петербург-Пушкин, 1999. -С.76-78

7. Sokolova J., Tokarev Y., Dolgikh V., Nassonova E., Sentionov P., Glupov V., Issi I., 1999. Microsporidians influence insect defense system? // Abstr. 3rd Europ. Congr. Protistol. - Helsinger, Denmark, 1999. - P.72.

8. Долгих B.B., Семенов П.Б., Григорьев M.B. Особеннсости энергетического обмена микроспоридии Nosema grylli при внутриклеточном развитии // Паразитология - 2002 - Т. 36, - С. 493501

9. Долгих В.В., Семенов П.Б. 2003. Особенности катаболизма трегалозы в спорах микроспоридии Nosema grylli. // Паразитология -2003,-Т. 37,-С. 333-341

10. Dolgikh V.V., Semenov Р.В. 2003 The spore wall and polar tube proteins of the Microsporidian Nosema grylli: the major spore wall protein is released before spore extrusion. // Tsitologija. - 2003, - Vol. 45, - P. 324329

л

I,

¿1516 0

РНБ Русский фонд

f

2005-4 12228 '

i

г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенов, Петр Борисович

Список основных сокращений.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Своеобразие микроспоридий, как систематической группы внутриклеточных паразитов в свете современных представлений.

1.2.Ультратонкаяморфология стадий цикла развития микроспоридий.

1.2.1. Жизненные циклы микроспоридий.

1.2.2. Характерные особенности ультратонкой морфологии микроспоридий.

1.2.3. Морфология зрелой споры.

1.2.4. Морфология спороплазмы.

1.2.5. Морфология меронта.

1.2.6. Морфология споронта.

1.2.7. Морфология споробласта.

1.3. Строение и состав оболочки споры микроспоридий.

1.3.1. Строение экзоспоры.

1.3.2. Строение эндоспоры.

1.3.3 Белки оболочки спор.

1.4. Строение и состав полярной трубки споры микроспоридий.

1.4.1. Тонкая морфология полярной трубки.

1.4.2. Белки полярной трубки.

1.5. Особенности активации и экструзии полярных трубок спор микроспоридий.

1.5.1. Искусственные стимуляторы активации спор.

1.5.2. Механизм активации и экструзии полярных трубок.

1.5.3. Изменения, претерпеваемые полярной трубкой в процессе экструзии.

1.6. Особенности взаимоотношений микроспоридий с клеткой хозяина.

1.7. Особенности гликозилирования белков эукариот.

1.7.1. N-гликозширование.

1.7.2. О-гликозилирование.

1.7.3. О-гликозилирование по «дрожжевому» типу.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований и методы работы с живыми организмами.

2.2. Методы биохимических исследований.

2.3. Методы микроскопических исследований.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Особенности основного белка оболочки спор микроспоридии Paranosema grylli (р40).

3.1.1. Выделение р40 из спор P.grylli.

3.1.2. Влияние изменений состава компонентов инкубационной среды (раствора 2) и некоторых других факторов на высвобождение р40 и сопутствующих белков.

3.1.3. Влияние инкубации спор в растворе 2 на окрашивание оболочки ДАФИ.

3.1.4. Влияние сроков хранения и степени зрелости спор на содержание р40 в их оболочке, и солюбилизацию этого белка в растворе 2.

3.1.5. Определение локализации р40в пробах гомогенатов стадий жизненного цикла P. grylli с помощью ммуноблотинга.

3.1.6. Выявление р40 в различных фракциях гомогенатов жирового тела зараженных хозяев.

3.1.7. Выявление локализации р40 в клетках паразита и хозяина, иммунофлюоресцент-ным и иммуноцитохимическим методами.

3.1.8. Особенности гликозилирования р40.77.

3.2. Особенности белков полярной трубки микроспоридии P. grylli.

3.2.1. Выделение белков полярной трубки из спор.

3.2.2. Влияние различных концентраций компонентов раствора для экстракции на высвобождение предполагаемых БПТ.

3.2.3. Получение поликлональной антисыворотки.

3.2.4. Очистка полученной антисыворотки и изучение локализации предполагаемых БПТ в клетках микроспоридии методом иммуноблоттинга.

3.2.5. Выявление локализации БПТметодом иммуннофлюоресцентного анализа.

3.2.6. Определение локализации БПТметодом иммунной электронной микроскопии.

3.2.7. Выявление присутствия БПТ в составе оболочки спор методом иммуно-блоттинга.96.

3.2.8. Особенности гликозилирования БПТ-1.

3.3. Белковый состав оболочки спор как видоспецифичный признак у микроспоридий.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, паразитирующей в сверчке Gryllus bimaculatus"

Микроспоридии (Microsporida) - чрезвычайно своеобразная группа облигатных внутриклеточных паразитов. Круг хозяев этих паразитических организмов охватывает представителей всех типов царства животных, от простейших до млекопитающих. Благодаря специфике морфологии, физиологии и биохимии микроспоридий, их позиция в современной филогенетической системе - предмет неутихающих дискуссий.

Стратегия внутриклеточного паразитизма микроспоридий подразумевает высокую степень интеграции клетки паразита с клеткой хозяина в отношении метаболических путей. Будучи типичными анаэробами, эти облигатные ж паразиты используют в своих целях субстраты промежуточных этапов энергетического обмена своих хозяев. (Долгих и др., 1996, 1997, Weidner et al, 1999). В частности, показано, что микроспоридии способны утилизировать АТФ зараженной клетки (Weidner, Trager, 1973, Vivares and Metenier, 2001). Столь сильная зависимость этих паразитов от своих хозяев привела к значительному упрощению структурно-функциональной организации клеток стадий внутриклеточного развития, что позволяет во многих отношениях рассматривать их как минимальные системы, представляющие огромный интерес в качестве моделей для разнообразных исследований.

Многие энтомопатогенные микроспоридии играют роль важных регуляторов численности вредных видов насекомых и представляют интерес для * защиты растений. На основе микроспоридии Paranosema locustae созданы промышленные биопрепараты «Нолок и «Нолобайт», успешно применявшиеся в борьбе с саранчовыми на территории США, Канады и других стран (Henry et al 1974, 1978, 1981). Вспышки массового размножения саранчи, в последнее время регулярно регистрируемые в нашей стране обостряют интерес к поиску и испытаниям разнообразных средств биологической борьбы с этим опаснейшим вредителем.

Единственной стадией жизненного цикла микроспоридий способной существовать вне организма хозяина, является спора, устройство которой свидетельствует о высоком уровне адаптации к долговременному пребыванию в окружающей среде. Способность споры к длительному сохранению инвазионности и своевременной активации при попадании в организм хозяина важнейшие факторы, определяющие эффективность биопрепарата на основе микроспоридий. Однако критерии, по которым можно судить о степени инвазионности спор, пока никем не разработаны.

Способ передачи спорой инвазионного начала клетке хозяина уникален. Под воздействием ряда стимулов внутри споры происходит резкое увеличение гидростатического давления, что приводит к выбросу (экструзии) особой структуры, получившей название полярной трубки, которая прокалывает плазматическую мембрану клетки хозяина. По просвету полярной трубки в цитоплазму клетки хозяина попадает зародыш микроспоридии - спороплазма. Строение и функционирование аппарата экструзии споры - комплекса взаимосвязанных органелл, обеспечивающих проникновение спороплазмы в клетку, а также механизмы, лежащие в основе сохранения спорой инвазионности в ходе пребывания во внешней среде, вызывают огромный интерес у исследователей. И, если морфология споры детально изучена, то данные о структурных белках, входящих в состав аппарата экструзии споры весьма немногочисленны и выполнены главным образом на представителях рода Encephalitozoon, паразитирующих в позвоночных животных. Изучение упомянутых белков также может послужить ключом к пониманию еще очень мало изученных и уникальных закономерностей функционирования клетки микроспоридий, таких, например, как биосинтез, созревания и транспорт белковых молекул.

Кроме того, наиболее сильное патогенное воздействие этих паразитов на организм хозяина и оказываемые микроспоридиями дистантные эффекты на его репродуктивную и иммунную системы отмечаются на заключительном этапе спорогенеза, когда подавляющее большинство особей паразита представлено зрелыми спорами (Селезнев 1995, Токарев 2002). Упомянутые моменты несомненно связаны с уникальными структурными особенностями споры микроспоридий, что обусловливает актуальность изучения структурных белков спор с точки зрения паразито-хозяинных взаимоотношений.

Оболочка обеспечивает возможность создания внутри споры высокого гидростатического давления — движущей силы выброса полярной трубки. Вместе с тем, она образует поверхность контакта с организмом хозяина и служит мишенью для реакций его иммунной системы при пребывании споры вне клетки хозяина. Оболочка защищает спору от разрушающего воздействия внешних факторов при сохранении ее в окружающей среде. За счет другой органеллы аппарата экструзии - полярной трубки осуществляется проникновение в клетку хозяина инвазионного начала - ключевой этап реализации функционального предназначения споры. Таким образом, структурные белки, входящие в состав оболочки и полярной трубки споры представляют особенный интерес. К моменту начала экспериментальной работы, результаты которой легли в основу настоящей диссертации, не было ни одной публикации, затрагивающей тему структурных белков энтомопатогенных микроспоридий.

Кроме того, достаточно актуальной остается проблема диагностики видов микроспоридий паразитирующих в насекомых и представляющих интерес для защиты растений. По современным требованиям световое микроскопирование уже не решает данной проблемы. Дорогостоящие и трудоемкие тесты, включающие элетронную микроскопию и ПЦР-диагностику, могли бы быть заменены анализом состава белков оболочки спор, что значительно проще методически.

Таким образом, в связи со сказанным выше, целью настоящей работы явилось исследование структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, играющих ключевую роль в патогенезе микроспоридиоза сверчка Gryllus bimaculatus: основного белка оболочки и белков полярной трубки. Для достижения обозначенной цели предполагалось решение следующих задач:

1. Разработать метод выделения и очистки основного белка оболочки и белков полярной трубки спор P. grylli.

2. Исследовать влияние процесса экструзии, условий хранения на состав белков оболочки спор и изучить возможность использования полученных показателей для оценки их жизнеспособности.

3. Определить внутриклеточную локализацию выделенных структурных белков на разных стадиях развития паразита, выявить особенности гликозилирования их молекул, а также возможную роль данных белков в паразит-хозяинных отношениях.

4. Разработать метод диагностики морфологически сходных видов микроспоридий (на примере рода Paranosema), основывающийся на анализе состава белков оболочки спор.

Заключение Диссертация по теме "Энтомология", Семенов, Петр Борисович

Выводы

На основе изучения особенностей белков, количественно преобладающих в составе оболочки и полярной трубки споры - структурах, играющих ключевую роль в реализации спорой ее основных функций - длительном сохранении во внешней среде, своевременной активации и распространения инвазионного начала среди новых хозяев, мы можем сделать следующие выводы:.

1. Впервые для энтомопатогенных микроспоридий на примере P. grylli-, паразитирующей в сверчке G. bimaculatus, идентифицированы и изучены структурные белки споры, играющие ключевую роль в патогенезе микроспоридиоза сверчка.

2. Разработан метод выделения основного белка оболочки спор микроспоридии P. grylli. Данный белок имеет массу около 40 кДа и в значительных количествах высвобождается в среду при стимуляции экструзии полярных трубок in vitro и постепенно исчезает из оболочки спор в ходе их хранения спор.

3. Количество р40 в оболочке может служить показателем срока хранения и жизнеспособности спор. Таким образом, впервые получены критерии, возможно позволяющие контролировать активность спор микроспоридий и их способность к экструзии зародышей и заражению насекомых хозяев.

4. р40 является белком экзоспоры зрелых спор и наружной электронноплотной оболочки клеток спорогональных стадий развития микроспоридии.

5. Основной белок оболочки спор P. grylli в значительных количествах присутствует также в жировом теле насекомого-хозяина, содержащего паразита на заключительном этапе спорогонии, где ассоциирован со структурами неизвестной функции. Мы предполагаем, что данные структуры представляют собой дериваты наружной оболочки споробластов, которые становятся «излишками» при дегидратации и компактизации клеток в период превращения споробластов в споры.

6. Полученные впервые данные о выделении микроспоридиями в клетку хозяина субстанции белковой природы, совпадающем по времени с наиболее явными патологическими нарушениями в организме насекомого, могут свидетельствовать об участии р40 в развитии данных нарушений при микроспоридиозе G. bimaculatus, вызываемом P. grylli.

7. Основной белок оболочки спор P. grylli является О-маннозилированным белком. Такой тип гликозилирования характерен для дрожжей и данный результат, впервые полученный на уровне молекулы белка можно считать еще одним свидетельством в пользу филогенетического родства микроспоридий и грибов.

8. Впервые у энтомопатогенной микроспоридии идентифицированны и выделены белки полярной трубки (БПТ). Для трех БПТ имеющих молекулярные массы 56 (БПТ-1), 46 (БПТ-2) и 34 (БПТ-3) кДа методом иммунофлюоресцентного анализа и иммунной электронной микроскопии подтверждена локализация в полярной трубке спор и зачатках этой структуры у споробластов.

9. Достоверно показано, что три белка полярной трубки (БПТ-1, БПТ-2 и БПТ-3) в существенных количествах содержатся также в наружной электронноплотной оболочке клеток преспоровых стадий и экзоспоре зрелых спор, что говорит о способности микроспоридий использовать одни и те же белки для построения разных структур.

10. Продемонстрирована исключительно высокая интенсивность гликозилирования БПТ-1, обусловленная, вероятно, функциональной специализацией данного белка.

11. Показана возможность использования для дифференциальной диагностики морфологически сходных видов микроспоридий нового метода, основанного на анализе состава белков оболочки спор.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенов, Петр Борисович, Санкт-Петербург

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. 1994. Молекулярная биология клетки.,.2. М. Мир.- 544 с.

2. Долгих В.В. 1997. Особенности углеводного и энергетического обмена микроспоридий Nosema grylli и их патогенного воздействия на организм насекомых-хозяев. Дисс.на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. СПб., 130 с

3. Долгих В.В., Семенов П.Б., Григорьев М.С. 2002. Особеннсости энергетического обмена микроспоридии Nosema grylli при внутриклеточном развитии. Паразитология , 36, 6: 493-501

4. Долгих В.В., Семенов П.Б. 2003. Особеннсости катаболизма трегалозы в спорах микроспоридии Nosema grylli. Паразитология , 37, 4: 333-341

5. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика. .:Мир,. 544 с.

6. Исси И.В. Микроспоридии. 1985. Протозоология. Вып. 10.

7. Насонова Е.С., Соколова Ю.Я, Скарлато С.О. 1997. Хромососные ДНК и размер генома микроспоридии Nosema grylli. ДАН, Клеточная биология: 97-101

8. Селезнев К.В. 1997. Микроспоридиоз сверчка Gryllus bimaculatus, вызванный Nosema £?у//г.:Автореф. дис. канд. биол. наук. СПб

9. Соколова ЮЛ. 1990. Ультраструктурные изменения в клетках чешуекрылых при микроспоридиозе и их роль в оценке патогенных форм: Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. JL, - 265 с.

10. Соколова Ю.Я., Селезнев К.В., Долгих В.В., Исси И.В. 1994 Микроспоридия Nosema grylli п. sp. из сверчка Gryllus bimaculatus. Паразитология, 28, 6: 488-493

11. Соколова ЮЛ., Сундуков В.В., 1999. Подавление эстеразной активности как специфичная черта патогенеза микроспоридиоза сверчка Gryllus bimaculatus. Паразитология, 33, 527-535.

12. Степанов В.М. 1996. Молекулярная биология. Структура и функции белка. М, Высшая школа, 336 С.

13. Цыпленков Е.П. Вредные саранчовые насекомые в СССР. 1970. М. "Колос". 280 С

14. Bohne W., Ferguson D.J., Kohler К., Gross U. 2000. Developmental expression of a tandemly repeated, glycine- and serine-rich spore wall protein in the microsporidian pathogen Encephalitozoon cuniculi. Infect, and Immunol. 68: 2268-2275.

15. Biderre C., Canning E.U., Metener G., Vivares C.P. 1999. Comparision of two isolates of Encephalitozoon hellem and E. intestinalis by pulsed Field Gel Electrophoresis. Eur. J. Protistol., 35: 194-196.

16. Bigliardi E., Selmi M.G., Lupetti P., Corona S., Gatti S., Scaglia M., Sacchi L. 1996. Microsporidian spore wall: ultrastructural findings on Encephalitozoon hellem exospore . J. Euk. Microbiol, 43: 181-186.

17. Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

18. Cali A., Takvorian P.M. 1999. Developmental morphology and life cycles of the microsporidia. In: The Microsporidia and Microsporidiosis. M. American Society for Microbiology, Washington, D.C.: 85-128.

19. Delbac F, Duffieux F, Peyret P, David D, Metenier G, Vivares CP 1996. Identification of sporal proteins in two microsporidian species: an immunoblotting and immunocytochemical study. J Euk Microbiol 43: 101

20. Delbac F, Duffieux F, David D, Metenier G, Vivares CP 1998a Immunocytochemical identification of spore proteins in two microsporidia, with emphasis on extrusion apparatus. J Euk Microbiol 45: 224-231

21. Delbac F., Duffieux F., David D., Metenier G., Vivares C.P. 1998 b. Immunocytochemical identification of spore proteins in two microsporidia, with emphasis on extrusion apparatus. J. Euk. Microbiol., 45: 224-231.

22. Diaz M., Pavan C., 1965 Changes in chromosomes induced by microorganism infection. Proc. nation. Acad. Sci. Washington,.54: 1321-1327.

23. Diaz M., Pavan C., Basile R., 1969. Effects of a virus and a microsoridian infections in chromosomes of various tissues of Rhynchosciara angelae (Nonato et Pavan, 1951). Rev. Brasil. Biol., 29 (2): 191-206.

24. Dolgikh V., Sokolova J., Issi I. 1997. Activities of enzymes of carbohydrate and energy metabolism of the spores of the microsporidian, Nosema grylli. J. Euk. Microbiol., 44: 246-249.

25. Dolgikh V. 2000. Activities of enzymes of carbohydrate and energy metabolism of the intracellular stages of the microsporidian Nosema grylli. Protistology, 1: 87-91

26. Dolgikh V.V., Semenov P.B. 2003 The spore wall and polar tube proteins of the Microsporidian Nosema grylli: the major spore wall protein is released before spore extrusion. Tsitologija 45: 324-329

27. Duffieux F., Peyret P., Roe B.E., Vivares C.P. 1999. First report on the systematic sequencing of the small genome of Encephalitozoon cuniculi: gene organization of a 4,3 kbp region on chromosome I. Microb. Сотр. Genomics, 3:1-11.

28. Dvornik V. Y., Ovchinnikov S.A., 1992 Inhibition of acid phosphatase in the black fly immature larvae caused by microsporidia Amblyospora. Eur. J. Protistol., 28 (3): 336-337.

29. Frixione E., Ruiz L., Undeen A.H. 1994. Monovalent cations induce microsporidian spore germination in vitro. J. Euk. Microbiol., 41: 464-468.

30. Hashimoto Т., Hasegawa M. 1996. Origin and early evolution of eukaryotes inferred, from the amino acid sequences of translation elongation factors lalpha/Tu and 2/G. Adv. Biophys., 32: 73-120.

31. Hayman J.R, Hayes S.F, Amon J, Nash T.E 2001 Developmental Expression of Two Spore Wall Proteins during Maturation of the Microsporidian Encephalitozoon intestinalis. Infect. Immun., 69: 7057-7066

32. Henry, J, E., Oma, E. A and Oganser, J. A. Relative effectiveness of ULV spray against grasshoppers.J. Econ.Entomol, 71, 1978

33. Henry, J, E., and Oma, E. A. Pest control by Nosema locustae, a Pathogen of Grasshoppers and Crickets. Microbial Control of Pests and Plant Diseases, London N.-Y.Toronto Sydney San-Fransisco, 1981.

34. Hirt R.P., Logson J.M., Healy В., Dorey M.W., Doolittle W.F. 1999 Microsporidia are releated to fungi: evidence from the largetst subunit of RNA polymerase and other proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 109-116

35. Jurand A., Simoes L.C.G., Pavan C., 1967 Changes in the ultrastructure of salivary gland cytoplasm in Sciara ocellaris (Comstock,882) due to microsporidian infection. J. Insect Physiol., 13: 795-803.

36. Kawarabata Т., Hayasaka S. 1987. An Enzyme-linked immunosorbent assay to detect alkali-soluble spores surface antigens of strains of Nosema bombycis (Microspora: Nosematida). J. Invertebr. Pathol., 50: 118-123.

37. Keeling P.J., Doolittle W.F. 1996. Alpha-tubulin from early-diverging eukaryotic lineages and the evolution of the tubulin family. Mol. Biol. Evol., 13 (10): 112- 117.

38. Keohane E.M., Takvorian P.M., Cali A, Tanowitz H.B., Wittner M., Weiss L.M. 1996 Identification of a microsporidian polar tube protein reactive monoclonal antibody. J. Euk. Microbiol., 43: 26-31

39. Keohane E.M., Weiss L.M. 1999. The structure , function, and composition of the microsporidian polar tube. In: The Microsporidia and Microsporidiosis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.: 196-224.

40. Kim J., Ogawa K. And Wakabayashi H. 1994. Lectin-reactive components of the microsporidian Glugea plecoglossi and their relationship to phagocytosis by head kidney macrophages of Plecoglossus altivelis. Dis. Aquat. Org., 39: 59-63

41. Кибега M., Weiser J., 1985. Different course of proteolytic inhibitory activity and proteolytic activity in Galleria mellonella larvae infected by Nosema algerae and Vairimorpha heterosporum. J. Invertebr. Pathol., 45,41-46.

42. Kurtti T.J., Ross S.E., Liu Y., Munderloh U.G. 1994. In vitro developmental biology and spore production in Nosema furnacalis (Microspora: Nosematidae).i .hwertehr. Pathol., 63: 188-196.

43. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4. Nature., 227: 680-685.

44. Larsson R. 1986. Development, ultracytology and classification of microsporidia. In J.O. Corillis and D.J. Patterson (ed) Progress in Protistology. Biopress, Ltd., Bristol, United Kingdom., 1: 325-390.

45. Larsson J. I. R. 1994. Trichoctosporea pygopellita gen. et sp. nov., a microsporidian parasite of the mosquito Aedes vexans. Arch. Protistenk., 144: 147-161.

46. Letich G.J., He Q., Wallace S., Visvesvara G. S.1993. Inhibition of spore polar filament extrusion of the microsporidium, Encephalitozoon hellem, isolated from an AIDS patient. J .Euk. Microbiol., 40: 711-717.

47. Lom J., Corliss O. 1967. Ultrastructure observation on the development of the microspodian protozoon Plistophora hyphessobryconis. J. Protozool., 14: 141152.

48. Mitchell M.J., Cali A. 1993. Ultrastractural study of the development of Vairimorpha necatrix (Kramer, 1965) in larvae of the corn earworm, Heliotis zeae (Boddie) with emphasia on sporogony., J. Euk. Microbiol., 40: 701-710.

49. Pavan C., Basile R. 1966 Chromosome changes induced by infections in58. tissues of Rhynchosciara angelae . Science., 151: 1556-1558.

50. Pleshinger J., Weidner E. 1985. The microsporidian spore invasion tube. Discharge activation begins with pH triggered Ca influx. J.Cell Biol., 100: 1834-1838/

51. Roberts P.A., Kimball R.F., Pavan C.C., 1967. Response of Rynchosciara chromosomes to microsporidian infection: increased polyteny and generalized puffing. Exp. Cell Res., 47: 408-422.

52. Sokolova J. J., Dolgikh V.V., Weck-Heimann A., Entzeroth R. 2000. Analysis of antibodies raised against soluble and membrane bound proteins of Nosema grylli (Microspora) spores. Cytologia., 42: 993-1003.

53. Sprague V, Benchel J.J., Hazard E.I. 1992.Taxonomy of phylum Microsporidia. Crit. Rev. Microbiol., 18: 285-395

54. Sprague V., Vernick S.H. 1969.Light and electron microscope observations on Nosema nelsoni (Microsporidia, Nosematidae) with particular reference to its Golgi complex J. Protozool., 16(2): 264-271

55. Sthral-Bolsinger S., Immervoll Т., Deutzman R. and Tanner W. 1993. PMT1, the gene for a key enzyme of protein O-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry, 90: 8164-8168

56. Sthral-Bolsinger S. and Scheinost A. 1999 Transmembrane topology of an evolutionary conserved family of protein o-mannosyltransferases. J. Biol. Chem., 274: 9068-9075

57. Timpel C., Sthral-Bolsinger S, Ziegelbauer K. 1998. And Ernst. Multiple functions of Pmtl-p- mediated O-mannosylation in the fungal pathogen Candida albicans. J. Biol. Chem., 273: 20837-20846

58. Togebaye B.S., Marchand B. 1986. Genese des differents organites de la spore uninuclee d'Amblyospora culicis (Protozoa, Microspora). Arach. Protistkend., 132:231-244.

59. Undeen A.H., Vander Meer R.K., Smith В J., Aveiy S.W. 1984. Effect of gamma-radiation of Nosema algerae (Microsporia: Nosematida) spore viability, germination and carbohydrates. J. Protozool., 31: 479-482.

60. Undeen A.H., Avery S.W.1988. Effect of anions on the germination of Nosema algerae (Microsporia: Nosematida). J. Invertebr. Pathol. 52: 84-89.

61. Undeen A.H. 1990. A proposed mechanism for the germination of microsporidian spores. J. Theor. Biol., 142: 223-325

62. Undeen A.H., Epsky N.D. 1990. In vitro and in vivo germination of Nosema locustae (Microsporia: Nosematida) spores. J. Invertebr. Pathol., 56: 371-379.

63. Undeen A.H., Frixione E. 1991. Structural alteration of plasma membrane in spores of the microsporidium Nosema algerae on germination., J.Protozool. 38: 511-518

64. Van de Peer Y., Ben Ali A., Meyer A. 2000. Microsporidia accumulating molecular evidence that a group of amitochondriate and suspectedly primitive eukaryotes are just curious fungi. Gene., 246: 1-8

65. Xu J., Takvorian P., Cali A. And Louis Weiss. 2003. Lectin binding jf the Major Polar tube protein (PTP1) and its role in invaision. J. Euk. Microbiol., 600-601

66. Vavra J. 1976. Structure of Microsporidia. Comparative Pathobiology, 1: 1109.

67. Vandermeer J.W., Gochnauer T.A. 1971. Trehalase activity associated with spores of Nosema apis. J. Invertebr. Pathol., 17:.38-41.

68. Vavra J. 1965. Etude au microscopie electronicue de la morphologie et du developpment de quelqeues microsporidies. C.R. Acad. Soc., 261:3467-3470.

69. Vavra J., Larsson J.I.R. 1999. Structure of the microsporidia. In: The Microsporidia and Microsporidiosis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.: 7-84.

70. Vinclier D., Porchet E., Vivier E., Vavra J., Torpier G.A. 1991. A freez-fracture study of microsporidia (Protozoa, Microspora). II The extrusion apparatus: filament, polaroplast, posterior vacuole. Eur. J. Protistol., 29: 370-380

71. Vivares C.P., Metenier G. 2000. Towards the minimal eukaryotic parasitic genome. Current Opinion in Microbiology., 3: 463-467.

72. Vossbrinck C., Maddox J., Friedman S., Debrunner-Vossbrinck B.,Woese C. 1987. Ribosomal RNA sequence suggests microsporidia are extremely ancient eukaryotes. Nature., 326: 411-414.

73. Weidner E. 1992. Cytoskeletal proteins expressed by microsporidian parasites. Subcell. Biochem., 18: 385-389.

74. Weidner E., Findley A.M., Dolgikh V., Sokolova J. 1999. Microsporidian iochemistry and physiology. In: The Microsporidia and Microsporidiosis. M. Wittner (ed.). American Society for Microbiology, Washington, D.C.: 172-195.

75. Weng S., Spiro R.G. 1996. Endoplasmic reticulum kifunensine-resistant alpha-mannosidase is enzymatically and immunologically related to the cytosolic alpha-mannosidase. Arch. Biochem. Biophys. 325:113-123.

76. Weiss L.M. 2001. Microsporidia: emerging pathogenic protists. Acta Trop., 78: 89-102.

77. Yasunaga C., Inoue S., Funakoshi M., Kawarabata Т., Hayasaka S. 1994A new method for inoculation of poor germinator, Nosema sp. NIS Mil (Microsporida, Nosematida), into an insect cell culture. J. Euk. Microbiol., 42(2): 191-195.

78. Zhu X., Wittner M., Tanowitz H.B., Cali A., Weiss L.M. 1994. Ribosomal RNA sequences of Enterocytozoon bieneusi, Septata intestinalis and Ameson michaelis: phylogenetic construction and structural correspondence. J. Euk. Microbiol., 41:204-209.