Хромосомный набор и размер генома у микроспоридии Paranosema grylli

Насонова, Елена Станиславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хромосомный набор и размер генома у микроспоридии Paranosema grylli
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Хромосомный набор и размер генома у микроспоридии Paranosema grylli"

На правах рукописи

НАСОНОВА Елена Станиславовна

ХРОМОСОМНЫЙ НАБОР И РАЗМЕР ГЕНОМА У МИКРОСПОРИДИИ РАЛАМОЗЕМА С,К \'1ЛА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ииа177224

Санкт-Петербург 2007

003177224

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители

доктор биологических наук Скарлато Сергей Орестович

кандидат биологических наук Соколова Юлия Яновна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович

доктор биологических наук Фролов Александр Олегович

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет,

Биолого-почвенный факультет

Зашита состоится « Чг » декабря 2007 г в часов на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, г Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , дом 4, факс (812) 297-0341, электронная почта се11Ью@та11 су1врЬ гв51 ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «б» ноября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Каминская Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Микроспоридии - это крупный тип одноклеточных эукариотических организмов, объединяющий более 160 родов облигатных внутриклеточных паразитов Круг хозяев этих организмов включает представителей почти всех таксонов животного мира от простейших до млекопитающих Среди микроспоридий описаны виды, вызывающие серьезные заболевания хозяйственно-важных беспозвоночных, рыб и теплокровных животных (Исси, 1986) Некоторые виды этих паразитов вызывают инфекции у человека (Weiss, 2001)

По современным представлениям, микроспоридии филогенетически близки к грибам Эволюция этих организмов шла в направлении крайнего упрощения и редукции основных систем и структурных компонентов клетки (Edlind et al, 1996, Van de Peer et al, 2000) В миниатюрных клетках микроспоридий (обычно менее 10 мкм) нет канонических митохондрий и классических диктиосом аппарата Гольджи У них не обнаружены лизосомы и пероксисомы, а также кинетосомы и их производные (Keeling, Fast, 2002) Анализ полностью секвенированного генома микроспоридии Encephalitozoon cumcuh показал, что это один из самых маленьких из изученных на данный момент эукариотических геномов Метаболические возможности микроспоридий, в особенности анаболический метаболизм, также чрезвычайно "урезаны" (Katmka et al, 2001, Vivares, Metemer, 2000) Таким образом, всестороннее изучение этих паразитов может существенно расширить наши взгляды на пути и последствия редуктивной эволюции эукариотической клетки Исследования микроспоридий углубляют наши представления о "минимальной клеточной системе", ее обязательных компонентах и неотъемлемых функциях, а также способствуют пониманию основ функционирования более сложных клеточных систем и их компонентов

Одними из наименее изученных аспектов организации микроспоридий остаются структура и функционирование их ядра и хромосомного аппарата На сегодняшний день изучение хромосомных наборов у подавляющего большинства видов микроспоридий возможно только с помощью методов молекулярного кариотипирования Проведение подобных исследований, сопряженных с необходимостью выделения большого количества интактной хромосомной ДНК, весьма затруднено К моменту начала нашей работы были опубликованы результаты лишь шести исследований, посвященных анализу молекулярных кариотипов микроспоридий, причем ни в одном из них не было определено точное число хромосом у

изучаемых организмов (Munderloh et al, 1990, Malone, Mclvor, 1993, Biderre et al, 1994, 1995, Kawakami et al, 1994, Streett, 1994) Для большинства исследованных видов было показано, что при электрофоретическом фракционировании хромосомных ДНК в геле выявляются полосы, которые характеризуются нестехиометрической интенсивностью окрашивания бромистым этидием Интерпретация подобной картины требует привлечения трудоемких методов идентификации индивидуальных хромосом (гибридизация по Саузерну с хромосома-специфичными зондами, анализ паттернов рестрикции хромосомных ДНК), которые только в последнее время начали применять для изучения молекулярных кариотипов микроспоридий В связи с вышесказанным становится понятным, почему вопрос о числе хромосом и размере геномов у этих организмов до сих пор остается малоизученным Вместе с тем эти сведения представляют собой один из ключей к пониманию общих закономерностей эволюции как отдельных групп микроспоридий, так и всего типа в целом

Примерно у половины родов микроспоридий ядерный аппарат на протяжении всего жизненного цикла или только на определенном его этапе представлен парными ядрами, организованными в виде диплокариона Особенности строения диплокариона микроспоридий и его функциональная роль изучены недостаточно Спорным остается вопрос об уровне плоидности ядер диплокариона Не известно, эквивалентны ли эти ядра в отношении их структуры и функции Особенно актуален этот вопрос для изучения генетической конституции мономорфных диплокариотических микроспоридий, в жизненном цикле которых, как традиционно считается, вообще нет монокариотической фазы, и не отмечено никаких свидетельств межъядерной рекомбинации Остается невыясненным, имеет ли место у представителей этой группы межъядерная дивергенция геномов ядер диплокариона, или существуют какие-то генетические механизмы для поддержания их эквивалентности

Таким образом, изучение организации ядра и хромосомного аппарата у микроспоридий, в особенности у мономорфных диплокариотических видов, весьма актуально Исследования такого рода, как правило, лимитированы отсутствием удобных моделей, которые позволяли бы выделять микроспоридий в препаративных количествах Группа профессора И В Исси во Всероссийском институте защиты растений (ВИЗР) РАСХН уже более десяти лет поддерживает в лабораторных условиях модельную систему "микроспоридия Paranosema grylh - сверчок Gryllus bimaculatus", для которой разработаны методы выделения, накопления и очистки клеток Р grylli, находящихся на разных стадиях жизненного цикла (Соколова и др , 1994, Seleznev et

а1, 1995, Долгих, Насонова и др , 1996, Долгих, 1997; вокоЬуа, Во^дкЬ, МогсЫпа, Наввопоуа е! а1, 2003) В этом коллективе нами были освоены методы работы с Р ёгуШ, впоследствии использованные в диссертационном исследовании Появление подобного объекта и арсенала методов впервые сделало возможным исследование организации ядра и, в частности, хромосомного аппарата мономорфных диплокариотических микроспоридий, которому и посвящена настоящая работа

Цель и задачи исследования

Основной целью исследования было изучение хромосомного аппарата мономорфной диплокариотической микроспоридии Рагапояета — паразита сверчка йгуИт Ытаси1аШ Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи

1 Изучить организацию диплокариона и хромосомный аппарат Р ¿гуШ методами электронной микроскопии

2 Исследовать молекулярный кариотип Р %гу1\1 с помощью пульс-электрофореза

3 Изучить паттерны рестрикции хромосомных ДНК Р ^гуШ с помощью двумерного пульс-электрофореза (метод КАМЭ 2-Й РРОЕ)

4 Локализовать гены р-тубулина, актина и 168 рРНК на хромосомах Р цгуйг методом гибридизации по Саузерну

5 Определить абсолютное содержание ДНК в ядрах диплокариона микроспоридии

6 Оценить размер генома и уровень плоидности ядер диплокариона Р ¡>гу1Ь Основные положения, выносимые на защиту

1 У мономорфной диплокариотической микроспоридии Рагапозета ^гуШ обнаружены морфологические маркеры мейоза

2 Для Р '¿гу1!1 характерен размерный полиморфизм гомологичных хромосом Из 17 индивидуальных хромосом, идентифицированных в молекулярном кариотипе микроспоридии, большинство представлено несколькими (до четырех) вариантами, различающимися по размеру на 5-40 т п н

3 Размер гаплоидного генома у Р £гуШ составляет 4 5-4 7 млн п н Абсолютное содержание ДНК в ядре диплокариона споры Р '¿гуПл - около 4 8 ± 0 8 млн п н Сравнение этих оценок позволяет предположить, что каждое из ядер диплокариона у Р §гуШ гаплоидно

Научная новизна полученных результатов

Впервые обнаружены морфологические маркеры мейоза у мономорфной диплокариотической микроспоридии Р grylli Этот результат заставляет пересмотреть существующее в настоящее время представление о мономорфных диплокариотических микроспоридиях как об облигатно бесполых организмах

На примере Р grylli впервые детально изучен молекулярный кариотип мономорфной диплокариотической микроспоридии, впервые идентифицированы индивидуальные хромосомы в подобном кариотипе и получена оценка размера генома, базирующаяся на результатах этой идентификации Для реализации этих задач мы использовали недавно разработанный для анализа хромосом низших эукариот метод двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (KARD 2-D PFGE) Наша работа является первым исследованием такого рода для мономорфных диплокариотических микроспоридий и пятым исследованием в мировой практике Первые четыре работы были выполнены на хромосомах дрожжей Saccharomyces cerevisiae, гриба Pneumocystis carinu, а также микроспоридий Encephalitozoon cunicuh и Spraguea lophn (Brugere et al, 2000a,b, Cornillot et al, 2002, Mansour et al, 2004) С помощью метода KARD 2-D PFGE нами впервые продемонстрирован размерный полиморфизм гомологичных хромосом у Р grylli и показано, что полиморфные гомологи характеризуются идентичными или весьма сходными паттернами рестрикции Предложена гипотеза, согласно которой размерный полиморфизм гомологов Р grylli является следствием рекомбинационных событий, затрагивающих терминальные участки хромосом Рассмотрен возможный теоретический сценарий хромосомных перестроек в ходе пролиферации Р grylli

Впервые измерено абсолютное содержание ДНК в спорах микроспоридии методом цитометрии по изображению Впервые определен уровень плоидности ядер диплокариона микроспоридии путем сопоставления размера генома и абсолютного содержания ДНК в спорах

Теоретическая и практическая ценность работы

Результаты проведенных исследований вносят вклад в изучение жизненных циклов и генетической организации мультигеномных одноклеточных эукариот, в частности, в изучение генетической конституции и механизмов поддержания стабильности генома, а также возможных путей рекомбинации генома ядер диплокариона у мономорфных диплокариотических микроспоридий Данные по особенностям протекания митоза у Р grylli

представляют интерес для исследователей, занимающихся изучением механизмов работы митотического аппарата и эволюции митоза Результаты работы могут быть использованы для углубленного изучения места и роли полового процесса в жизненных циклах мономорфных диплокариотических микроспоридий Дальнейшее исследование обнаруженного нами хромосомного полиморфизма у Р '¿гу111 позволит понять механизмы и функциональное значение этого феномена Полученные нами результаты позволяют предполагать, что хромосомы Р ёгуШ содержат консервативный кор и вариабельные терминальные участки и, следовательно, устроены по тому же принципу, что и хромосомы других паразитических протистов Эти результаты важны для понимания структуры и динамики генома у мономорфных диплокариотических микроспоридий и весьма актуальны для формирования концепции организации хромосом у паразитических протистов вообще Использованные в работе модификации методов получения препаратов хромосомных ДНК и адаптированные программы для фракционирования молекул в пульсирующем электрическом поле могут быть применены в исследованиях молекулярных кариотипов микроспоридий и других низших эукариот Материалы, полученные в работе, могут быть использованы в курсах лекций по протозоологии и клеточной биологии для студентов биологических специальностей высших учебных заведений

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на заседании Санкт-Петербургской секции Российского общества протозоологов (Санкт-Петербург, 1997), на 18-м съезде Немецкого паразитологического общества (Дрезден, Германия, 1998), на семинаре рабочей группы 820 Европейской комиссии по кооперации в области научных и технических исследований (СОЭТ820) "Трансфекция и данные геномных проектов для обнаружения генов и их функций -на пути к созданию вакцин против кокцидиоза" (Рим, Италия, 1998), на 26-й межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии (Санкт-Петербург, 1999), на 3-м Европейском протистологическом конгрессе (Эльсинор, Дания, 1999), на 13-й конференции Международного общества эволюционной протистологии (КЕР) (Ческе-Будеевице, 2000), на 445-м заседании Санкт-Петербургского паразитологического общества (Санкт-Петербург, 2000), на 49-м чтении, посвященном памяти В А Догеля (Санкт-Петербург, 2004), на семинаре Американского фонда гражданских исследований и развития для

независимых государств бывшего Советского Союза (CRDF) "Криптоспоридиоз и микроспоридиоз как ВИЧ/СПИД-сопутствующие инфекции" (Санкт-Петербург, 2004), на рабочем совещании "Патогены 21-го века первый объединенный семинар по микроспоридиям из позвоночных и беспозвоночных хозяев" (Ческе-Будеевице, 2004), на 15-м Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2005), на 5-м Европейском протистологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), на совместном семинаре Лаборатории цитологии одноклеточных организмов, Лаборатории клеточной патологии, Лаборатории структурной организации генома и Группы ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007)

Финансовая поддержка работы была получена от Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 96-04-48578, 00-04-49502, 04-04-49209, 05-04-49222, 07-04-00662), Комитета по науке и высшей школе Администрации Санкт-Петербурга (грант МОО-2 6К-682), Немецкой службы академических обменов (DAAD - грант А/97/53538)

Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах

введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение экспериментальных данных, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы (372 наименования), 28 рисунков, 7 таблиц и приложение, в котором приводятся экспериментальные данные и дополнительные материалы, не вошедшие в основную часть

В обзоре литературы рассмотрены (1) строение ядра и хромосомного аппарата микроспоридий, (2) способы изучения хромосомных наборов у протистов, в особенности, кариотипирование протистов с помощью метода пульс-электрофореза, (3) подходы к определению размера генома и уровня плоидности у протистов, (4) имеющиеся данные о молекулярных кариотипах, размере генома и хромосомном полиморфизме у микроспоридий

Структура и объем диссертации Диссертация объемом

страниц включает

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Методы лабораторной работы с Р grylli Микроспоридию поддерживали в лабораторной культуре сверчков согласно методикам, разработанным в Лаборатории микробиологического метода защиты растений ВИЗР РАСХН (Долгих, 1997, Красильникова, Насонова и др , 1997) Выделение паразитов, находящихся на разных стадиях жизненного цикла, проводили по методикам, предложенным ранее (Seleznev et al, 1995, Долгих, Насонова и др , 1996), с некоторыми изменениями и дополнениями Очистку спор осуществляли с помощью центрифугирования в градиенте плотности 70 %-ного Перколла Для очистки меронтов, споронтов и споробластов использовали центрифугирование в градиенте плотности 20 %-ного Перколла Экструзию полярных трубок и спороплазм из спор стимулировали в среде, содержащей К+, в условиях сдвига pH по адаптированной методике Куртти с соавторами (Kurtti et al, 1990)

Методы световой и электронной микроскопии Для изготовления постоянных препаратов мазки жирового тела сверчка окрашивали по Романовскому-Гимза (Быкова и Исси, 1991) Для наблюдения ядер микроспоридий использовали окрашивание основным фуксином по ДеЛаматру (DeLamater, 1948), лакто-ацето-орсеином (Hazard et al, 1979), ДНК-специфичными флуорохромами DAPI, SYBR Green I и Pico Green (Molecular Probes Inc, США) Подготовку материала для электронной микроскопии осуществляли по стандартным методикам, с незначительными изменениями (Nassonova, Smirnov, 2005)

Методы цитометрии Для измерения содержания ДНК методом цитометрии по изображению препараты гидролизовали в 6 N HCl при температуре +20-22 °С в течение 6 мин и окрашивали в насыщенном сернистым газом 0 3 %-ном водном растворе аурамина O-SO2 (Kasten, 1961) В качестве стандарта с известным содержанием ДНК использовали метафазные хромосомы человека (Mayall et al, 1984) Содержание ДНК измеряли с помощью компьютерного анализатора изображений, построенного на базе микроскопа ЛЮМАМ, используя программу обработки и анализа изображений "Видеотест" (ООО Иста, Санкт-Петербург) (Штейн и др , 1998)

Базовые молекулярно-биологические методы ДНК из спор микроспоридий экстрагировали с помощью фенол-хлороформного метода, гуанидин-тиоцианатного метода (Maniatis et al, 1982) или набора реактивов для экстракции геномной ДНК S&S Elu-Quik DNA

Purification Kit (Schleicher & Schuell Bioscience, Германия) Для увеличения выхода ДНК оболочки спор разрушали механически или путем ферментативной деградации с трипсином и хитиназой В некоторых случаях для увеличения выхода ДНК стимулировали экструзию полярных трубок и выход спороплазм ДНК амплифицировали с помощью ПНР по стандартным методикам (Maniatis et al, 1982), используя микроспоридия-специфичные праймеры (см Nassonova et al, 2005) Продукты ПЦР клонировали с помощью стандартного набора реактивов ТОРО ТА Cloning Kit (Invitrogen™ Life Technologies, США) Секвенирующие реакции проводили, используя наборы реактивов CEQTM DTCS Quick Start Kit (Beckman Instruments Inc , США) и BigDye® Terminator v3 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) по стандартным протоколам фирм-производителей, для секвенирования использовали секвенатор ABI Prism® 377 DNA Sequencer (Perkm Elmer Inc, США) Полученные последовательности идентифицировали с помощью программы BLAST (http //www ncbi nlm nih gov/cgi-bin/BLAST), для сравнительного анализа последовательностей генов |3-тубулина и актина использовали данные Генбанка (http //www ncbi nlm nih gov/entrez) и базы данных проекта по секвенированию генома микроспоридии Antonospora locustae (http //jbpc mbl edu/Nosema и http //gmod mbl edu/perl/site/antonospora) Программную трансляцию и другие операции с нуклеотидными последовательностями осуществляли с помощью приложений, размещенных на сайте www molbiol ru

Молекулярное кариотипирование Для приготовления образцов хромосомной ДНК споры или клетки паразита, находящиеся на внутриклеточных стадиях развития, заключали в агарозные блоки При этом споры подвергали специальной обработке, приводящей либо к стимуляции экструзии полярных трубок m vitro и высвобождению спороплазм, либо к частичной деградации и повышению проницаемости оболочки (см Насонова и др, 1998, Nassonova et al, 2005) Далее проводили лизис клеток и депротеинизацию ДНК (см Pinevitch, Gromov, Mamkaeva, Nasonova, 1997) ДНК фракционировали в системах для пульс-электрофореза, используя самодельную установку для электрофореза в поперечно-переменном электрическом поле (Transverse Alternating-Field Electrophoresis) и аппараты промышленного изготовления для проведения пульс-электрофореза в контролируемом гомогенном электрическом поле (Contour-clamped Homogeneous Electric Field) CHEF-DR®III Pulsed Field Electrophoresis System (Вю-Rad Laboratories, США) и Gene Navigator™ System (Pharmacia Biotech, Великобритания) Для оптимизации условий фракционирования ДНК варьировали

такие параметры, как напряженность поля, время пульса, режим нарастания времени пульса, продолжительность электрофореза (см Насонова и др , 1998, Nassonova et al, 2005) В качестве размерных маркеров использовали коммерческие и приготовленные нами препараты хромосом Saccharomyces cerevisiae и конкатамеры ДНК фага лямбда Гели окрашивали в растворе бромистого этидия и наблюдали в проходящем УФ свете на приборах типа Transillummator Денситометрический анализ изображений гелей проводили с помощью компьютерной программы KODAK ID Image Analysis Software (Kodak, Великобритания)

Двумерный пульс-электрофорез рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (KARD 2-D PFGE) Из геля с фракционированными хромосомными ДНК вырезали тонкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала продольный сегмент одной из дорожек геля Полоски с хромосомными ДНК инкубировали с редкощепящей рестриктазой М1и\ (GE Healthcare UK Ltd, Великобритания) и метили в геле путем ник-трансляции (Brugere et al, 2000а) Меченые фрагменты ДНК фракционировали с помощью пульс-электрофореза во втором направлении В качестве размерных использовали маркеры Low Range PFG Marker и MidRange PFG Marker I (New England BioLabs Inc, США) Для визуализации фракционированных фрагментов ДНК применяли метод радиоавтографии

Гибридизация по Саузерну Для блот-гибридизации ДНК переносили на нейлоновые мембраны типа Hybond-N+ (GE Healthcare UK Ltd, Великобритания) Для гель-гибридизации гели высушивали с помощью аппарата для вакуумной сушки ДНК-зонды для выявления генов актина, Р-тубулина и 16S рРНК синтезировали с помощью ПЦР (см Nassonova et al, 2005) Гибридизацию проводили в буфере Денхардта (Maniatis et al, 1982) при температуре +65 °С в течение 12-16 ч Сигнал визуализировали с помощью радиоавтографии

ГЛАВЫ 3 и 4 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение особенностей организации диплокариона и хромосомного аппарата у P. grylh в интерфазе и митозе

Ядерный аппарат микроспоридии Р grylh на всех стадиях жизненного цикла представлен диплокарионом, состоящим из двух тесно сближенных ядер Внешние мембраны ядерной оболочки ядер диплокариона контактируют настолько плотно, что ширина перинуклеарного пространства зачастую превышает межъядерное расстояние В оболочке диплокариона хорошо

заметны ядерные поры, однако в зоне тесного контакта ядер пор никогда не обнаруживали (рис 1А) Наблюдали деление ядер диплокариона, протекающее по обычной для микроспоридий схеме закрытого внутриядерного плевромитоза У каждого из полюсов делящегося ядра Р gtylll в анафазе обнаруживали 5-6 электронно-плотных агрегатов размером 200-250 нм, которые интерпретировали как слабоконденсированные мелкие хромосомы С каждой хромосомой связана только одна кинетохорная микротрубочка Морфологически выраженных кинетохоров у Р grylh не наблюдали (рис 1 Б, В) Отметили характерную особенность митоза Р цгуШ - асинхронное расхождение хроматид Анализ описаний митозов других микроспоридий показал, что эта особенность является общей, хотя ранее никогда не отмечалась как характерная черта митоза микроспоридий Эта особенность митоза Р вкупе со слабой конденсацией митотических хромосом и отсутствием морфологически выраженных кинетохоров, делает практически невозможным подсчет числа хромосом на электронограммах и вынуждает использовать неморфологические методы для изучения хромосомного набора этого организма

Рис 1 Организация диплокариона Р '¿гуЧл в интерфазе и митозе

А - диплокарион меронта - раннего споронта в интерфазе Направленными друг к другу стрелками обозначена зона контакта ядер диплокариона Видны четыре параллельные мембраны Ширина межъядерного расстояния меньше ширины перинуклеарного пространства, ядерные поры отсутствуют Б - диплокарион в митозе, детали организации веретена деления В - анафаза в ядрах диплокариона споронта ВМт - внутриядерная микротрубочка, КМт -кинетохорная микротрубочка, ПЭк - примордиальная экзоспора, Хр - хромосома, ЦП -центриолярная пластинка, Яд - ядрышко, ЯП - ядерная пора Масштабная линейка 500 нм

Рис 2 Организация диплокариона Р ёгу111 в мейозе (из Каввопоуа, впитоу, 2005 с изменениями)

А, В - характерная для профазы I мейоза конфигурация ядер диплокариона Синаптонемные комплексы выглядят как совокупность трех параллельно расположенных линейных элементов Диплокарион имеет несколько увеличенное межъядерное расстояние, ядра соединены электронно-плотными образованиями - "скрепками" (на электронограмме А видно только одно из двух таких образований) Б - увеличенный фрагмент электронограммы А с синаптонемным комплексом, видны его центральный и латеральные элементы Г - межъядерная "скрепка" Д - поперечный срез диплокариона, в котором видны синаптонемные комплексы, выглядящие как совокупность трех близкорасположенных точек Е — область контакта ядер в мейотическом диплокарионе Межъядерное расстояние увеличено, видны симметрично расположенные ядерные поры МС - межъядерная "скрепка", СК - синаптонемный комплекс, ЯО - ядерная оболочка, ЯП - ядерная пора Масштабная линейка А, В, Г - 500 нм, Б - 100 нм, Д, Е —250 нм

Рисунок 1. Организация диплокариона Р. ¿¡уШ в интерфазе и митозе.

Рисунок 2. Организация диплокариона P. grylli в мейозе.

Рисунок 3. Молекулярный кариотип P. grylli.

А18-А16 А15 АН А13-А10 А9-А8 А7-А6 А5-А4 АЗ-А2 А1

Рисунок 4. Анализ хромосомного набора у Р. %гуШ с помощью метода КА1ТО 2-0 РРвЕ.

Обнаружение морфологических маркеров мейоза у Р ёгуШ (Насонова, 2005, Ыавзопоуа, Зпнгпоу, 2005)

В одной из серий приготовленных нами блоков для электронной микроскопии обнаружили необычную стадию развития Р grylll, никогда ранее не описанную у этой микроспоридии В клетках этой стадии наблюдали диплокарионы с увеличенным межъядерным расстоянием (рис 2А, В) В отличие от типичных диплокарионов, в зоне контакта таких ядер обнаружили симметрично расположенные ядерные поры (рис 2Е) На границах зоны контакта присутствовали электронно-плотные образования, которые формировали "скрепки", соединяющие ядра диплокариона между собой (рис 2А, В, Г) В кариоплазме наблюдали электронно-плотные структуры в виде совокупности трех параллельно расположенных элементов Эти структуры по строению были идентичны синаптонемным комплексам (рис 2Б, Д) Подобная организация ядерного аппарата очень напоминает состояние диплокариона, характерное для профазы I мейоза микроспоридий (ЬоиЬев, 1979, Веспе1 е1 а1, 1989, АпскеасЬв, УовзЬппск, 2002 и др )

Рис 3 Молекулярный кариотип Р grylli Хромосомные ДНК фракционированы в системе для пульс-электрофореза в контролируемом гомогенном электрическом поле (CHEF) (из Nassonova et al, 2005 с дополнениями)

А - хромосомные ДНК Saccharomyces cerevisiae YNN 295, размерный стандарт, слева указаны размеры четырех самых маленьких хромосом Б - полный набор хромосомных ДНК Р grylli Справа обозначены границы трех условных зон кариотипа нижней (135-220 т п н ), средней (220-325 т п н ) и верхней (325-485 тпн) В1-Д1- фракционирование хромосомных ДНК Р grylli из отдельных зон кариотипа Полосы, идентифицированные в исследуемой зоне, указаны черными стрелками, остальные полосы - серыми стрелками Al - Al8 - мажорные полосы, b 1 - b 13 - минорные полосы В2 - Д2 - денситограммы гелей

Рис 4 Анализ хромосомного набора у микроспоридии Р grylli с помощью метода KARD 2-D PFGE (из Nassonova et al, 2005)

А, Б, Д - фракционированные хромосомные ДНК (молекулярные кариотипы) В, Е -радиоавтографы меченых рестрикционных фрагментов ДНК, разделенных в ходе пульс-электрофореза в поперечном направлении Г, Ж - схематические диаграммы с идентифицированными пятнами, соответствующими фрагментам рестрикции Пятна в паттернах каждой индивидуальной хромосомы изображены своим специфическим цветом Индивидуальные хромосомы указаны стрелками и обозначены римскими цифрами (I-XVII) Нижние индексы а, Ь, с, d обозначают полиморфные гомологи Паттерны гомологичных хромосом изображены одним цветом

Таким образом, в ходе электронно-микроскопического исследования мономорфной диплокариотической микроспоридии Р %гуШ были впервые обнаружены стадии развития, на которых у паразита наблюдаются конфигурация ядер диплокариона, характерная для профазы I мейоза, и синаптонемные комплексы Эта находка дала нам основание подвергнуть сомнению устоявшееся представление о мономорфных диплокариотических микроспоридиях как об агамных организмах

Изучение молекулярного кариотипа Р ¡¡гуШ (Насонова и др , 1998, Соколова, Насонова и др , 1998, Каввопоуа е1 а1, 2005)

Фракционирование хромосомных ДНК микроспоридии методом пульс-электрофореза показало, что молекулярный кариотип этого организма представлен многочисленными полосами близкого размера (135-485 т п н), интенсивность окрашивания которых бромистым этидием сильно варьирует Оказалось, что точный подсчет числа полос и их отчетливое разделение в одном геле затруднены Для оптимизации фракционирования хромосомных ДНК Р цгуНг мы условно разбили молекулярный кариотип на три зоны, соответствующие трем размерным диапазонам 135-220 т п н , 220-325 т п н и 325—485 т п н , и для каждой из этих зон подобрали оптимальные параметры для проведения пульс-электрофореза Обобщение результатов, полученных в ходе анализа отдельных зон кариотипа, позволило идентифицировать в молекулярном кариотипе Р '¿гуИл не менее 18 мажорных и 13 минорных полос (рис 3) Как мажорные, так и минорные полосы различались по интенсивности окрашивания Таким образом, оказалось невозможно определить точное число хромосом у этой микроспоридии только на основании результатов фракционирования молекул хромосомных ДНК в пульсирующем электрическом поле Это обстоятельство заставило нас провести идентификацию индивидуальных хромосом в молекулярном кариотипе изучаемого организма

Идентификация индивидуальных хромосом в молекулярном кариотипе Р цгуШ с помощью двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (метод КА1Ш 2-1) РГСЕ) (Маввопоуа с! а1, 2005)

На радиоавтографах гелей с фракционированными фрагментами рестрикции хромосомных ДНК Р '¿гуЩ были обнаружены как уникальные, так и идентичные или очень сходные паттерны рестрикции Всего было идентифицировано 17 уникальных вариантов

паттерна рестрикции Считая, что для каждой индивидуальной хромосомы характерен свой уникальный набор фрагментов рестрикции и что гомологичным хромосомам свойственны схожие паттерны рестрикции, мы предположили, что у Р '¿гуШ гаплоидный набор включает 17 хромосом Для каждой хромосомы было идентифицировано от 1 до 4 вариантов, различающихся по размеру на 5-40 т п н (рис 4) Размерный полиморфизм у гомологичных хромосом Р £гуШ связан с варьированием размера одного или двух (редко больше) рестрикционных фрагментов В некоторых случаях в паттернах рестрикции гомологов не удалось выявить вообще никаких различий Таким образом, полиморфные гомологи у Р '¿гу111 отличались чрезвычайно консервативными паттернами рестрикции Интересно отметить, что хромосомы верхней зоны кариотипа (ХШ-ХУП) характеризуются уникальными, хотя во многом сходными паттернами рестрикции (от 30 до 60 % фрагментов одинакового размера) Сходство паттернов рестрикции этих хромосом может быть связано с гомологией последовательностей их протяженных участков

Анализ молекулярного кариотипа Р ¡руШ с помощью метода КА1Ш 2-13 РРОЕ позволил заключить, что в пределах мажорных полос зачастую комигрируют молекулы с разными паттернами рестрикции (т е гетерологичные молекулы) В минорных полосах обычно локализуются хромосомные ДНК, которые гомологичны молекулам, мигрирующим в смежных мажорных полосах Таким образом, присутствие размерных вариантов гомологичных хромосом и комиграция ДНК гетерологичных хромосом близкого размера приводят к возникновению трудно интерпретируемой картины полос в молекулярном кариотипе микроспоридии

Локализация ген-специфичных зондов на хромосомах Р. ¿гуШ

Для того, чтобы подтвердить наличие у Р цгуШ гомологичных хромосом, провели гибридизацию по Саузерну с ДНК-зондами к белок-кодирующим однокопийным генам и к гену 168 рРНК При блот-гибридизации хромосомных ДНК микроспоридии с зондом к (3-тубулину сигнал был выявлен на двух соседних полосах, соответствующих двум различающимся по размеру вариантам хромосомы XII Гель-гибридизация с рестрикционными фрагментами хромосомных ДНК подтвердила этот результат, показав, что зонд связывается только с двумя одиночными фрагментами из паттернов этих хромосом При блот-гибридизации с зондом к актину сигнал был выявлен на двух полосах, соответствующих хромосомам XIII и XIV Для этих хромосом был отмечен высокий уровень сходства паттернов рестрикционных фрагментов,

и мы предполагаем, что у них имеются протяженные гомологичные регионы При блот-гибридизации хромосомных ДНК с ДНК-зондом, специфичным для 16S рРНК, сигнал выявлялся на всех полосах молекулярного кариотипа В опытах по гибридизации этого зонда с фрагментами рестрикции хромосомных ДНК в гелях после двумерного пульс-электрофореза было показано, что меченые фрагменты есть в паттерне каждой из идентифицированных хромосом При этом распределение метки в паттернах рестрикции предполагаемых гомологов было идентичным Таким образом, данные Саузерн-гибридизации подтвердили наличие в молекулярном кариотипе микроспоридии гомологичных хромосом

Определение абсолютного содержания ДНК в спорах Р. grylli и оценка уровня плоидности ядер диплокариона (Nassonova et al, 2005)

Просуммировав размер 17 индивидуальных хромосом, идентифицированных в кариотипе микроспоридии с помощью метода KARD 2-D PFGE, размер гаплоидного генома Р grylli оценили в 4 5—4 7 млн п н Чтобы сделать заключение об уровне плоидности генома, мы измерили содержание ДНК в спорах микроспоридии, окрашенных флуоресцентным аналогом реактива Шиффа — аурамином O-SO2 Была измерена интегральная интенсивность флуоресценции (ИИФ) у диплокариона и у метафазных хромосом человека I и II, которые использовались в качестве количественных стандартов содержания ДНК Основываясь на полученном соотношении ИИФ, абсолютное содержание ДНК в ядре диплокариона споры Р grylli оценили в 4 9 ± 0 8 фг, т е около 4 8 ± 0 8 млн п н Таким образом, наша оценка размера гаплоидного генома Р grylh, полученная с помощью метода KARD 2-D PFGE, хорошо согласуется с результатами цитометрических измерений абсолютного содержания ДНК в спорах Это позволяет предположить гаплоидное состояние каждого из ядер диплокариона

Размерный полиморфизм гомологичных хромосом у Р grylh и его возможные причины

(Nassonova, 2007)

Основной результат исследования хромосомного набора Р grylli - это демонстрация выраженного размерного полиморфизма хромосом у этого организма Анализируя причины этого феномена, мы рассматриваем проблему плоидности ядер диплокариона, особенности популяционной структуры Р grylh и репродуктивную стратегию этой микроспоридии

Уровень плоидности диплокариона микроспоридий Существуют две противоборствующие точки зрения на проблему плоидности ядер диплокариона Лубэ и Моран наблюдали синаптонемные комплексы в каждом из ядер диплокариона в мейозе у Thelohama spp , Polydispyi ema simulu, Janacekia debaisieuxi и других микроспоридий и предположили, что ядра диплокариона диплоидны (Loubes, Maurand, 1971, Loubes, 1979) Позднее, Хазард и Брукбэнк в результате микрофотометрических измерений содержания ДНК в ходе мейоза у Amblyospora sp пришли к выводу, что синаптонемные комплексы в каждом из ядер диплокариона наблюдаются на протяжении кратковременной стадии цикла между окончанием кариогамии и началом мейоза Эти авторы постулировали, что спаренные ядра диплокариона гаплоидны, за исключением вышеупомянутой стадии (Hazard, Brookbank, 1984) Проведенное нами сравнение оценки размера генома Р grylh, полученной с помощью метода KARD 2-DPFGE, с данными цитометрических измерений содержания ДНК в спорах Р grylli также свидетельствует в пользу гипотезы о гаплоидносги ядер Более того, распределение размерных вариантов гомологичных хромосом, наблюдаемое на KARD 2-D PFGE радиоавтографах Р grylli, не соответствует теоретически рассчитанному для гипотетической модели диплокариона с диплоидными ядрами

Популщиопиая структура Р grylli Молекулярный кариотип представляет собой кумулятивный результат анализа хромосомных наборов 2xl0s-3xl08 спор из одной инфрапопуляции - паразитов, изолированных из одного насекомого-хозяина Неизвестно, является ли каждая такая инфрапопуляция Р grylli одним клоном или совокупностью многих клонов Основываясь на результатах анализа молекулярного кариотипа микроспоридии с помощью метода KARD 2-D PFGE, мы предлагаем гипотетическую модель, согласно которой наблюдаемый хромосомный полиморфизм является результатом последовательных рекомбинационных событий, происходящих в ходе размножения паразита в организме хозяина В рамках этой модели мы приходим к выводу о том, что инфрапопуляции могут состоять из субпопуляций, для которых характерны разные размерные варианты хромосом, возникшие в результате рекомбинации

У многих организмов обнаружена функциональная компартментализация хромосом Показано, что центральный домен хромосомы обычно консервативен, а концевые участки, прилегающие к теломерам, полиморфны, содержат многочисленные повторяющиеся последовательности и играют роль так называемых "горячих точек" рекомбинационных

событий (Pryde et al, 1997) У паразитических протистов рекомбинации в субтеломерных регионах хромосом играют важную роль в экспрессии и диверсификации локализованных в этих регионах мультигенных семейств, вовлеченных в паразито-хозяиные отношения и контролирующих антигенную вариабельность, клеточную адгезию, устойчивость к лекарственным препаратам и др (Freitas-Junior et al, 2000, Barry et al, 2003) Отмеченный нами у P grylli консерватизм паттернов рестрикции полиморфных гомологов указывает на то, что на уровне нуклеотидной последовательности различия между хромосомными корами у гомологов, по-видимому, невелики Это наблюдение позволило нам сформулировать гипотезу, согласно которой кор хромосом у Р grylli стабилен, а размерный полиморфизм является следствием рекомбинационных событий, затрагивающих терминальные участки хромосом

Репродуктивная стратегия Р grylli - представитель группы мономорфных диплокариотических микроспоридий, которые традиционно рассматриваются как агамные организмы, сохраняющие диплокариотическую организацию ядерного аппарата на протяжении всего жизненного цикла и размножающиеся путем последовательных митотических делений При сегрегации ядер диплокариона в митозе в каждую дочернюю клетку попадает по одному потомку от каждого из ядер диплокариона При независимой дупликации и равномерной сегрегации ядер диплокариона в отсутствие полового процесса, включающего в той или иной форме межъядерную рекомбинацию, различия между ядрами диплокариона должны были бы накапливаться из поколения в поколение, приводя к хромосомной, аллельной и другим видам генетической гетерогенности В частности, происходила бы прогрессирующая дивергенция хромосом Результаты изучения хромосомного набора у Р grylli не согласуются с ожидаемой дивергенцией хромосом из разных ядер диплокариона, поскольку, несмотря на выраженный размерный полиморфизм гомологичных хромосом, отмечен консервативный характер их паттернов рестрикции Можно предполагать, что у Р gryl.li имеется механизм межъядерной гомогенизации геномов, который, как мы предполагаем, базируясь на данных электронно-микроскопических исследований, ассоциирован у данной микроспоридии с мейозом

ВЫВОДЫ

1 Ультраструктура ядерного аппарата Рагапояета ^гуШ в целом типична для диплокариотнческих микроспоридий Деление ядра проходит по типу закрытого внутриядерного плевромитоза, в ходе которого хромосомы конденсированы слабо, кинетохоры морфологически не выражены, хроматиды расходятся к полюсам ядра асинхронно С помощью традиционных методов электронной микроскопии хромосомы этой микроспоридии не могут быть точно подсчитаны ни на одной стадии развития паразита

2 У Р ^гуШ обнаружены морфологические маркеры мейоза (синаптонемные комплексы, специфическая конфигурация диплокариона), в связи с чем этот организм более нельзя считать агамным Представление о мономорфных диплокариотнческих микроспоридиях как об исключительно бесполых организмах должно быть пересмотрено

3 В молекулярном кариотипе Р grylh выявляется не менее 18 мажорных и 13 минорных полос, содержащих молекулы хромосомных ДНК размером 135-485 т п н

4 С помощью двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (метод КАШЗ 2-й РРОЕ) в молекулярном кариотипе Р ^гуШ идентифицировано 17 индивидуальных хромосом Каждая индивидуальная хромосома представлена либо одним размерным вариантом, либо несколькими (до четырех) вариантами, различающимися по размеру на 5-40 т п н В пользу этого говорят и результаты опытов по Саузерн-гибридизации с ДНК-зондами к генам (З-тубулина, актина и 16Э рРНК

5 В ядре диплокариона в споре Р ру111 абсолютное содержание ДНК равно 4 9 ± 0 8 фг, что соответствует 4 8 ± 0 8 млн п н На основании данных, полученных с помощью метода КАИ) 2-й РРОЕ, размер гаплоидного генома микроспоридии оценен в 4 5-4 7 млн п н Сравнение размера генома и абсолютного содержания ДНК в спорах позволяет предположить, что каждое из ядер диплокариона у Р ру1и гаплоидно

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1 Насонова ЕС, Соколова ЮЯ, Скарлато СО 1998 Хромосомные ДНК и размер генома микроспоридии Nosema grylh Докл Акад паук 361(4) 554-557

2 Соколова Ю Я , Насонова Е.С , Сомова H В , Скарлато СО 1998 Ультраструктура ядерного аппарата и электрофоретический кариотип микроспоридии Nosema grylli -внутриклеточного паразита сверчка Gryllus bimaculatus Цитология 40(5) 407-416

3 Sokolova Y Y, Dolgikh VV, Morzhina EV, Nassonova E.S., Issi IV, Terry RS, Ironside J E , Smith J E , Vossbnnck С R 2003 Establishment of the new genus Paranosema based on the ultrastructure and molecular phylogeny of the type species Paranosema grylh Gen Nov , Comb Nov (Sokolova, Selezniov, Dolgikh, Issi 1994), from the cricket GryUus bimaculatus Deg J Invertebr Pathol 84(3) 159-172

4 Nassonova E , Smirnov A 2005 Synaptonemal complexes as evidence for meiosis m the life cycle of the monomorphic diplokaryotic microspondium Paranosema grylh Eur J Protistol 41(3) 175-181

5 Nassonova E, Cornillot E, Metenier G, Agafonova N, Kudryavtsev В , Skarlato S , Vivares С P 2005 Chromosomal composition of the genome m the monomorphic diplokaryotic microspondium Paranosema grylh analysis by two-dimensional pulsed-field gel electrophoresis Folia Parasit 52(1/2) 145-157

Тезисы докладов на отечественных и международных научных форумах

1 Nassonova Е, Sokolova J, Issi I, Skarlato S 1998 Analysis of Nosema grylh (Microsporia, Nosematidae) chromosomal DNA by transverse alternating gel electrophoresis (TAFE) Abstr 18 Parasitologische Tagung (Marz 24-28, 1998, Dresden, Deutschland) -S 90

2 Nassonova E., Sokolova J, Issi I, Skarlato S , Entzeroth R 1998 Chromosome analysis and diplokaryon ultrastructure in microsporidian parasite Nosema grylh (Microsporia Nosematidae) Proc COST82Û meeting "Transfection and whole genome approaches to gene discovery and function the way forward for vaccine research in coccidians9" (June 19-21, 1998, Rome, Italy) - p 3

3 Nassonova E.S, Bobyleva NN, Skarlato SO 1999 Nuclear apparatus in the microsporidian Nosema grylli Proc 3rd European Congress of Protistology, 9th European Conference on Ciliate Biology (July 25-30, 1999, Elsinore, Denmark) -p 53

4 Nassonova E S 2004 Lessons from chromosome analysis m Paranosema grylli (Microsporidia) genome plasticity and chromosome architecture Proc CRDF-Workshop on Cryptosporidiosis and Microspondiosis as HIV/AIDS Co-Related Infections (July 7-9, 2004, St Petersburg, Russia) - p 23

5 Nassonova E S , Cornillot E, Metenier G , Kudryavtchev В N , Skarlato S О , Vivares С P 2004 Chromosome repertoire m the diplokaryotic microsporidia Paranosema grylli Proc Advanced Research Workshop "Emergent Pathogens in the 21st Century First United Workshop on Microsporidia from Invertebrate and Vertebrate Hosts" (July 11-18, 2004, Ceske Budejovice, Czech Republic) -p 44

6 Насонова E.C. 2005 Хромосомный аппарат микроспоридий Материалы XV Всероссийского совещания "Структура и функции клеточного ядра" (18-20 октября 2005, Санкт-Петербург) Цитология 47(9) 821

7 Nassonova Е S. 2007 Miniature chromosomes of microsporidia structure, segregation and compaction Proc V European Congress of Protistology and XI European Conference on Ciliate Biology (July 23-27,2007, St Petersburg) Protistology 5(1) 57

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Быкова Х.И, Исси ИВ 1991 Микроспоридии - паразиты слепней Петрозаводск Карельский научный центр АН СССР, 105с Долгих ВВ. 1997 Особенности углеводного и энергетического обмена микроспоридий Nosema grylli и их патогенного воздействия на организм насекомых-хозяев Дисс на соиск уч ст канд биол наук СПб, 130 с Долгих В В, Насонова Е.С., Паскерова Г.Г. 1996 Паразитология 30 178-181 Исси И.В. 1986 Микроспоридии как тип паразитических простейших В кн Микроспоридии Л Наука, с 6136 Красильникова М.Н., Насонова Е.С и др 1997 Мат XI съезда Русск эптомол общ, СПб, с 211 Насонова Е.С. 2005 Цитология 47 821 Насонова Е.С., Соколова ЮЯ, Скарлато С.О 1998 Докл Акад наук 361 554-557 Соколова ЮЯ. и др. 1994

Паразитология 28 488-494 Штейн Г.И и др 1998 Цитология 40 913-916 Andreadis T.G., Vossbrinck C.R. 2002 J Eukaryot Microbiol 49 350-364 Barry J D. et al 2003 Int J Parasitol 33 29-45 Becnel J.J et al 1989 J Protozool 36 119-130 Biderre С et al. 1994 С R Acad Sci Paris, Sciences de la vie 317 399-404 Biderre С etal. 1995 Mol Biochem Parasit 74 229-231 Brugere J F etal 2000a Nucleic Acids Res 28 E48 BrugereJF etal. 2000b Nucleic Acids Res 28 2026-2033 Cornillot E. et al 2002 Gene 293 87-95 DeLamater E.D 1948 Stain Technology 23 161-176 EdlindT.D etal. 1996 Mol Phylogenet Evol 5 359-367 Freitas-Jumor L.H etal. 2000 Nature 407 1018-1022 Hazard E.I etal 1979 J Parasitol 65 117-122 Hazard EI, Brookbank JW. 1984 J Invertebr Pathol 44 3-11 Kasten F.H. 1961 J Histochem Cytochem 9 599 Katinka M D. et al. 2001 Nature 414 450-453 Kawakami Y. et al 1994 Appl Entomol Zool 29 120-123 Keeling P J, Fast N M 2002 Annu Rev Microbiol 56 93-116 Kurtti T J., Munderloh U.G , Noda H 1990 J Invertebr Pathol 55 61-68 Loubes С 1979 J Protozool 26 200-208 Loubes C., Maurand J. Remarque sur le "diplokaryon" Microsporidies Acad D'Agric de France Extrait du process-verbal de la Seance du 8 Dec 1971 pp 1540-1543 Malone LA., MclvorC. 1993 J Invertebr Pathol 61 203-205 Mamatis T , Fntsch E E , Sambrook J 1982 Molecular Cloning A Laboratory Manual .Cold Spring Harbor Laboratory Press Mansour L. et al 2004 Electrophoresis 25 3365-3377 Mayall В M etal 1984 Cytometry 5 376-385 Munderloh U.G, Kurtti T.J, Ross SE 1990 J Invertebr Pathol 56 243-248 Nassonova E S. 2007 Protistology 5(1) 57 Nassonova E., Smirnov A. 2005 Eur J Protistol 41 175-181 Nassonova E etal. 2005 FoliaParasit 52 145-157 Pinevitch A., Gromov В, Mamkaeva К, Nasonova E. 1997 Curr Microbiol 34 122-126 Pryde F E., Gorham H.C , Louis E J. 1997 Curr Opin Genet Dev 1 822-828 Seleznev K.V. et al. 1995 J Eukaryot Microbiol 42 288-292 Sokolova, Dolgikh, Morzhina, Nassonova et al 2003 J Invertebr Pathol 84 159-172 Streett DA 1994 J Invertebr Pathol 63 301-303 Van de Peer Y., Ben AH A, Meyer A 2000 Gene 246 1-8 Vivares С P, Metenier G. 2000 Curr Opin Microbiol 3 463-467 Weiss L.M. 2001 ActaTrop 78 89-102

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 02 11 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2230Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул, 29 Тел 550-40-14 Тел /факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Насонова, Елена Станиславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение ядра и хромосомного аппарата микроспоридий.

1.1.1. Общая организация ядра.

1.1.2. Митоз у микроспоридий.

1.1.3. Половой процесс у микроспоридий: закономерности изменения плоидности ядер диплокариона.

1.1.4. Хромосомные циклы микроспоридий. Классификация жизненных циклов.

1.2. Способы изучения кариотипа у протистов.

1.3. Кариотипирование протистов с помощью метода пульс-электрофореза.

1.4. Определение размера генома и уровня плоидности у протистов.

1.5. Молекулярные кариотипы, размер генома и хромосомный полиморфизм у микроспоридий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Методы лабораторной работы с микроспоридией Paranosema grylli.

2.1.1. Происхождение культуры микроспоридии.

2.1.2. Поддержание микроспоридии в культуре насекомых-хозяев.

2.1.3. Выделение и очистка стадий жизненного цикла микроспоридии из жирового тела сверчка.

2.1.4. Стимуляция экструзии полярных трубок из спор P. grylli и получение препарата спороплазм.

2.2. Методы световой и электронной микроскопии.

2.2.1. Световая микроскопия и гистохимическое окрашивание.

2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия.

2.3. Методы цитометрии.

2.3.1. Кислотный гидролиз и окрашивание препаратов для цитометрии.

2.3.2. Измерение содержания ДНК в ядрах диплокариона с помощью цитометрии по изображению.

2.4. Базовые молекулярно-биологические методы.5£

2.4.1. Выделение геномной ДНК из спор P. grylli.

2.4.2. Амплификация ДНК.6S

2.4.3. Клонирование продуктов ПЦР.6f

2.4.4. Секвенирование ДНК.

2.4.5. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

2.5. Молекулярное кариотипирование.

2.5.1. Приготовление образцов высокомолекулярной хромосомной ДНК

Р. grylli дпя пульс-электрофореза.

2.5.2. Приготовление агарозных блоков с размерными маркерами для пульс-электрофореза.

2.5.3. Пульс-электрофорез хромосомной ДНК.

2.5.4. KARD2-D PFGE.

2.5.5. Гибридизация по Саузерну.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изучение структуры диплокариона и хромосомного аппарата

Paranosema grylli.

3.1.1. Интерфаза.

3.1.2. Митоз и цитокинез.

3.1.3. Мейоз.

3.2. Изучение молекулярного кариотипа микроспоридии Paranosema grylli.

3.2.1. Фракционирование хромосомных ДНК P. grylli с помощью пульс-электрофореза.

3.2.2. Особенности молекулярного кариотипа микроспоридии P. grylli.

3.3. Идентификация индивидуальных хромосом в молекулярном кариотипе Paranosema grylli с помощью двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (KARD 2-D PFGE).

3.4. Локализация ген-специфичных зондов на хромосомах Paranosema grylli.

3.4.1. Гибридизация с ДНК-зондами к однокопийным белок-кодирующим генам.

3.4.2. Локализация ДНК-зонда к гену 16S рРНК.

3.5. Определение абсолютного содержания ДНК в спорах

Paranosema grylli и оценка уровня плоидности ядер диплокариона.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Особенности организации диплокариона и хромосомного аппарата у Paranosema grylli.

4.1.1. Интерфаза.

4.1.2. Митоз.

4.2. Особенности протекания мейоза и его место в жизненном цикле Paranosema grylli.

4.2.1. Морфологические маркеры мейоза у P. grylli: сравнение с другими микроспоридиями.

4.2.2. Место мейоза в жизненном цикле P. grylli.

4.3. Хросомный набор микроспоридии Paranosema grylli. Полиморфизм гомологичных хромосом и его возможные причины.

4.3.1. Популяционная структура P. grylli.

4.3.2. Уровень плоидности диплокариона микроспоридий.

4.3.3. Возможные сценарии хромосомных перестроек в ходе пролиферации P. grylli.

4.3.4. Репродуктивная стратегия P. grylli.

4.3.5. Функциональное значение хромосомного полиморфизма.

4.4. Хромосомный репертуар и размер генома Paranosema grylli в сравнении с другими микроспоридиями.

4.5. Биологическое значение межъядерной гомогенизации геномов и возможные варианты ее реализации у мономорфных диплокариотических микроспоридий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хромосомный набор и размер генома у микроспоридии Paranosema grylli"

Микроспоридии - это крупный тип одноклеточных эукариотических организмов, объединяющий более 160 родов облигатных внутриклеточных паразитов. Круг хозяев этих организмов включает представителей почти всех таксонов животного мира: от простейших до млекопитающих. Среди микроспоридий описаны виды, вызывающие серьезные заболевания хозяйственно-важных беспозвоночных, рыб и теплокровных животных (Исси 1986; Исси и Воронин 2007; Canning 1990). Некоторые виды этих паразитов вызывают инфекции у человека (Didier et al. 1998; Franzen and Muller 2001; Weiss 2001).

По современным представлениям, микроспоридии - это группа филогенетически близких к грибам организмов, эволюция которых преимущественно шла в направлении крайнего упрощения и редукции основных систем и структурных компонентов клетки (Edlind et al. 1996; Li et al. 1996; Keeling and Doolittle 1996; Edlind 1998; Hirt et al. 1999; Weiss and Vossbrinck 1999; Van de Peer et al. 2000; James et al. 2006; Liu et al. 2006). В миниатюрных клетках (обычно менее Юмкм) этих паразитических организмов нет канонических митохондрий и классических диктиосом аппарата Гольджи. У них не обнаружены лизосомы и пероксисомы, а также кинетосомы и их производные (Keeling 2001; Metenier and Vivares 2001; Keeling and Fast 2002). Анализ полностью секвенированного генома микроспоридии Encephalitozoon cuniculi показал, что это один из самых маленьких из изученных на данный момент эукариотических геномов. Он сильно редуцирован за счет укорочения последовательностей генов и межгенных регионов, а также практически полного исчезновения интронов и повторяющихся последовательностей. Метаболические возможности микроспоридий, в особенности анаболический метаболизм, также чрезвычайно "урезаны" (Katinka et al. 2001; Vivares and Metenier 2000; Vivares et al. 2002). Всестороннее изучение этих паразитов существенно расширяет наши взгляды на пути и последствия редуктивной эволюции эукариотической клетки. Исследования микроспоридий углубляют наши представления о "минимальной клеточной системе", ее обязательных компонентах и неотъемлемых функциях, а также способствуют пониманию основ функционирования более сложных клеточных систем.

Одними из наименее изученных аспектов организации микроспоридий остаются структура и функционирование их ядра и хромосомного аппарата. Хромосомы у большинства микроспоридий -мелкие и морфологически неоформленные; они остаются слабоконденсированными на протяжении всего клеточного цикла и представляют собой весьма трудный объект для морфологических исследований (Larsson 1986; Canning 1988; Vavra and Larsson 1999). Лишь у двух видов полиморфных микроспоридий, в жизненном цикле которых присутствует мейоз, описан мейотический кариотип и, соответственно, на морфологическом уровне определено количество хромосом в ядре (Hazard et al. 1979; Chen and Barr 1995). Изучение хромосомного состава ядер у подавляющего большинства других видов возможно только с помощью методов молекулярного кариотипирования. У микроспоридий проведение подобных исследований, сопряженных с необходимостью выделения большого количества интактной хромосомной ДНК, весьма затруднено. К моменту начала нашей работы были опубликованы результаты лишь шести исследований, посвященных анализу молекулярных кариотипов микроспоридий, причем ни в одном из них не было определено точное число хромосом у изучаемых организмов (Munderloh et al., 1990; Malone, Mclvor, 1993; Biderre et al., 1994, 1995; Kawakami et al., 1994; Streett, 1994). Для большинства исследованных видов было показано, что при электрофоретическом фракционировании хромосомных ДНК в геле выявляются полосы, которые характеризуются нестехиометрической интенсивностью окрашивания бромистым этидием. Интерпретация подобной картины требует привлечения трудоемких методов идентификации индивидуальных хромосом (гибридизация по Саузерну с хромосома-специфичными зондами, анализ паттернов рестрикции хромосомных ДНК), которые только в последнее время начали применять для изучения молекулярных кариотипов микроспоридий (Biderre et al. 1997; Brugere et al. 2000b; Mansour et al. 2004). В связи с вышесказанным становится понятным, почему вопрос о числе хромосом и размере геномов у этих организмов до сих пор остается малоизученным. Вместе с тем эти сведения представляют собой один из ключей к пониманию общих закономерностей эволюции как отдельных групп микроспоридий, так и всего типа в целом.

Примерно у половины всех родов микроспоридий ядерный аппарат на протяжении всего жизненного цикла или только на определенном его этапе представлен парными ядрами, организованными в диплокарион. Особенности строения диплокариона микроспоридий и его функциональная роль изучены недостаточно. Спорным остается вопрос об уровне плоидности ядер диплокариона. Не известно, эквивалентны ли эти ядра с точки зрения их структуры и функции: идентичны ли хромосомные наборы в обоих ядрах, содержат ли они одинаковое количество ДНК, параллельно ли в них происходят матричные и другие ядерные процессы. Особенно актуальны эти вопросы для изучения генетической конституции мономорфных диплокариотических микроспоридий, в жизненном цикле которых, как традиционно считается, вообще нет монокариотической фазы, и не отмечено никаких свидетельств межъядерной рекомбинации. Остается невыясненным, имеет ли место у представителей этой группы дивергенция геномов ядер диплокариона, или существуют какие-то генетические механизмы для поддержания их эквивалентности.

Таким образом, круг неизученных вопросов, касающихся организации ядра и хромосомного аппарата у микроспоридий и, в особенности у мономорфных диплокариотических видов, оказывается весьма широк. Однако исследования такого рода сильно лимитированы отсутствием удобных моделей, которые позволяли бы выделять клетки микроспоридий в препаративных количествах.

Группа профессора И.В. Исси во Всероссийском институте защиты растений РАСХН в течение многих лет изучает модельную систему: микроспоридия Paranosema grylli - сверчок Gryllus bimaculatus (Соколова и др. 1994; Sokolova, Dolgikh, Morzhina, Nassonova et al. 2003). На этой модели исследуются как особенности паразито-хозяинных отношений у микроспоридий и насекомых, так и собственно биология микроспоридий. Культуру сверчков круглый год можно поддерживать в условиях лаборатории. Подобраны условия искусственного заражения сверчков, при которых имеет место высокая интенсивность инвазии. Разработаны методы выделения, накопления и очистки спор P. grylli; найдены подходы к получению препаратов, обогащенных внутриклеточными стадиями1 развития паразита (Seleznev et al. 1995; Долгих 1997). Именно на этой удобной лабораторной модели проводились исследования углеводного и энергетического метаболизма микроспоридий (Долгих, Насонова и др. 1996; Dolgikh et al. 1997; Dolgikh 2000), особенностей организации спор (Sokolova et al. 2000) и аппарата экструзии (Dolgikh and Semenov 2003), a также изучение взаимоотношений микроспоридий с защитными системами хозяина (Соколова и Сундуков 1999; Соколова и др. 2000; Sokolova et al. 1998; Nassonova et al. 2001; Tokarev et al. 2007).

Paranosema grylli представляет собой весьма удобный объект для проведения исследований, требующих значительного количества материала - выделенных и очищенных спор и внутриклеточных стадий паразита. Появление подобного объекта сделало возможным исследование организации ядра и хромосомного аппарата мономорфных диплокариотических микроспоридий, которому и посвящена настоящая работа.

Исследования были начаты с изучения ультраструктуры ядра и хромосомного аппарата P. grylli, которое было выполнено в ходе обучения в аспирантуре на базе Лаборатории микробиологического метода защиты растений Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) РАСХН под руководством д.б.н., проф. И.В. Исси и к.б.н. Ю.Я. Соколовой. Часть исследований, посвященных изучению ультраструктуры ядра P. grylli, была выполнена во время стажировки в Лаборатории частной зоологии проф. Р. Энцерота (R. Entzeroth) в Институте зоологии JexHH4ecKoro университета г. Дрезден (Германия). Однако уже к моменту окончания обучения в аспирантуре ВИЗР РАСХН стало ясно, что изучать ядерный аппарат подобных организмов необходимо молекулярными методами. Поэтому было принято решение перенести последующие исследования хромосомного набора и плоидности ядер диплокариона P. grylli на базу Лаборатории цитологии

1 В литературе, посвященной изучению микроспоридий, для обобщенного обозначения меронтов, споронтов и споробластов - жизненных форм паразита, развивающихся в цитоплазме клетки хозяина, принят термин "стадии", а также такие его варианты, как "внутриклеточные стадии", "преспоровые стадии" и "пролиферативные стадии". Последний термин используют для обозначения только меронтов и споронтов (см., например: Селезнев и др. 1994, 1997; Соколова и др. 2001 и др.). одноклеточных организмов Института цитологии (ИНЦ) РАН, где они проводились под руководством д.б.н. С.О. Скарлато. К моменту окончания аспирантуры были получены первые данные по молекулярному кариотипу; по совокупности полученных морфологических и молекулярных данных был написан первый вариант и проведена апробация кандидатской диссертации. Однако сложность наблюдаемого паттерна полос в молекулярном кариотипе P. grylli побудила нас отложить защиту. Стало очевидно, что для корректной интерпретации наблюдаемой картины необходимо идентифицировать индивидуальные хромосомы. К этому моменту уже начали появляться первые публикации, посвященные разработке метода идентификации хромосом в молекулярных кариотипах с помощью рестрикционного анализа хромосомных ДНК (метод KARD 2-D PFGE). В ходе стажировки в Лаборатории биологии протистов Университета Блеза Паскаля (Клермон-Ферран, Франция), в сотрудничестве с создателями этого метода -Э. Корнийо (Е. Cornillot) и проф. К. Виваресом (С.P. Vivares) - было выполнено исследование, позволившее нам корректно интерпретировать сложный паттерн полос молекулярного кариотипа P. grylli и представить к защите настоящую работу.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Основной целью исследования было изучение хромосомного аппарата мономорфной диплокариотической микроспоридии Paranosema grylli- паразита сверчка Gryllus bimaculatus.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить организацию диплокариона и хромосомный аппарат P. grylli методами электронной микроскопии.

2. Исследовать молекулярный кариотип P. grylli с помощью пульс-электрофореза.

3. Изучить паттерны рестрикции хромосомных ДНК P. grylli с помощью двумерного пульс-электрофореза (метод KARD 2-D PFGE).

4. Локализовать гены р-тубулина, актина и 16S рРНК на хромосомах P. grylli методом гибридизации по Саузерну.

5. Определить абсолютное содержание ДНК в ядрах диплокариона микроспоридии.

6. Оценить размер генома и уровень плоидности ядер диплокариона P. grylli.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Насонова, Елена Станиславовна

ВЫВОДЫ

1. Ультраструктура ядерного аппарата Paranosema grylli в целом типична для диплокариотических микроспоридий. Деление ядра проходит по типу закрытого внутриядерного плевромитоза, в ходе которого хромосомы конденсированы слабо, кинетохоры морфологически не выражены, хроматиды расходятся к полюсам ядра асинхронно. С помощью традиционных методов электронной микроскопии хромосомы этой микроспоридии не могут быть точно подсчитаны ни на одной стадии развития паразита.

2. У P. grylli обнаружены морфологические маркеры мейоза (синаптонемные комплексы, специфическая конфигурация диплокариона), в связи с чем этот организм более нельзя считать агамным. Представление о мономорфных диплокариотических микроспоридиях как об исключительно бесполых организмах должно быть пересмотрено.

3. В молекулярном кариотипе P. grylli выявляется не менее 18 мажорных и 13 минорных полос, содержащих молекулы хромосомных ДНК размером 135-485 т.п.н.

4. С помощью двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (метод KARD 2-D PFGE) в молекулярном кариотипе P. grylli идентифицировано 17 индивидуальных хромосом. Каждая индивидуальная хромосома представлена либо одним размерным вариантом, либо несколькими (до четырех) вариантами, различающимися по размеру на 5-40 т.п.н. В пользу этого говорят и результаты опытов по Саузерн-гибридизации с ДНК-зондами к генам р-тубулина, актина и 16S рРНК.

5. В ядре диплокариона в споре P. grylli абсолютное содержание ДНК равно 4.9 ± 0.8 фг, что соответствует 4.8 ± 0.8 млн.п.н. На основании данных, полученных с помощью метода KARD 2-D PFGE, размер гаплоидного генома микроспоридии оценен в 4.5-4.7 млн.п.н. Сравнение размера генома и абсолютного содержания ДНК в спорах позволяет предположить, что каждое из ядер диплокариона у P. grylli гаплоидно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования позволили констатировать, что у микроспоридии P. grylli хромосомы мелкие и слабоконденсированные. Они не могут быть надежно визуализированы и точно подсчитаны ни на одной из фаз клеточного цикла и ни на одной из стадий развития паразита с помощью традиционных методов световой и электронной микроскопии. Фракционирование хромосомных ДНК с помощью метода пульс-электрофореза (так называемое молекулярное кариотипирование) представляет собой более адекватный метод изучения хромосомного набора у этого организма. Используя этот метод, мы впервые показали, что молекулярный кариотип P. grylli состоит из большого числа полос, интенсивность свечения которых сильно варьирует. Мы выявили не менее 18 мажорных полос и 13 минорных полос, в которых мигрировали хромосомные ДНК размером 135-485 т.п.н. Для идентификации гомологичных и гетерологичных хромосом в молекулярном кариотипе P. grylli был применен недавно адаптированный для хромосомного анализа низших эукариот метод двумерного пульс-электрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК (KARD 2-D PFGE). Наша работа стала пятым исследованием такого рода в мировой практике. Первые четыре работы были выполнены на хромосомах дрожжей Saccharomyces cerevisiae, микроспоридий Encephalitozoon cuniculi и Spraguea lophii, гриба Pneumocystis carinii (Brugere et al. 2000a,b; Cornillot et al. 2002; Mansour et al. 2004). С помощью KARD 2-D PFGE мы смогли показать, что нестехиометрический характер окрашивания полос в молекулярном кариотипе микроспоридии обусловлен комиграцией гетерологичных молекул одинакового размера и значительным варьированием размеров гомологичных хромосом. Оказалось, что каждая индивидуальная хромосома представлена в кариотипе тем или иным из 1-4 размерных вариантов, отличающихся друг от друга на 5-40 т.п.н. Результаты Саузерн-гибридизации с зондами к генам 16S рРНК, р-тубулина и актина также подтвердили наличие в молекулярном кариотипе микроспоридии гомологичных хромосом, мигрирующих в разных полосах. Паттерны рестрикции варьирующих по размеру гомологов практически не различаются, что свидетельствует о консервативности кора хромосом. Мы предполагаем, что размерный полиморфизм гомологов P. grylli является следствием рекомбинационных событий, затрагивающих терминальные участки хромосом. По-видимому, хромосомы P. grylli устроены по тому же принципу, что и хромосомы других паразитических протистов, то есть состоят из консервативного кора и вариабельных терминальных участков.

Всего в кариотипе этой микроспоридии было идентифицировано 17 индивидуальных хромосом. На основании полученных данных размер генома был оценен в 4.5-4.7 млн.п.н. Методом цитометрии по изображению было показано, что абсолютное содержание ДНК в ядре диплокариона составляет 4.9 ± 0.8 фг, т.е. 4.8 ± 0.8 млн.п.н. Согласованность оценок, полученных разными методами, а также наблюдаемая специфика соотношения плотности пятен в паттернах рестрикции гомологичных хромосом позволили нам предположить, что каждое из ядер диплокариона P. grylli гаплоидно, и, следовательно, диплокарион представляет собой функциональный диплоид.

P. grylli - представитель группы мономорфных диплокариотических микроспоридий, которые традиционно рассматриваются как агамные организмы, сохраняющие диплокариотическую организацию ядерного аппарата на протяжении всего жизненного цикла и размножающиеся путем последовательных митотических делений. В митозе диплокарион делится таким образом, что в каждую из вновь образованных клеток попадает по одному потомку от каждого из его ядер. Независимая дупликация и равномерная сегрегация ядер диплокариона в ряду поколений должны были бы приводить к тому, что геном каждого из ядер эволюционировал бы независимо, и возникала бы межъядерная гетерогенность. Обнаруженная консервативность паттернов рестрикции варьирующих по размеру гомологов предполагает наличие механизмов, нивелирующих эту гетерогенность. Одним из таких механизмов может быть факультативный мейоз, морфологические маркеры которого (синаптонемные комплексы, специфические конфигурации ядер) мы впервые обнаружили у P. grylli. Эта находка дает нам основание подвергнуть сомнениям устоявшееся представление о мономорфных диплокариотических микроспоридиях как об исключительно агамной группе организмов. Механизмы, при помощи которых мономорфные диплокариотические микроспоридии поддерживают стабильность генома, до сих пор не ясны, и обнаружение мейоза в жизненном цикле P. grylli в какой-то степени проливает свет на этот вопрос.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Насонова, Елена Станиславовна, Санкт-Петербург

1. Быкова Х.И. и Исси И.В. 1991. Микроспоридии паразиты слепней. Петрозаводск: Карельский научный центр АН СССР, 105 с.

2. Воронин В.Н. 2001. Макротаксономия типа Microsporidia. Паразитология. 35: 35-44.

3. Гиляров М.С. (Ред.) 1986. Биологический энциклопедический словарь. М.: Сов. Энциклопедия, 831 с.

4. Долгих В.В. 1997. Особенности углеводного и энергетического обмена микроспоридий Nosema grylli и их патогенного воздействия на организм насекомых-хозяев. Дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. СПб., 130 с.

5. Долгих В.В., Насонова Е.С. и Паскерова Г.Г. 1996. Активность ферментов углеводного и энергетического обмена в спорах микроспоридии Nosema grylli. Паразитология. 30:178-181.

6. Журба Ю.И. 1990. Краткий справочник по фотопроцессам и материалам. М.: Искусство, 367 с.

7. Исси И.В. 1981. Современное состояние исследований по жизненным циклам микроспоридий. В кн.: Эволюция и филогения одноклеточных животных (М.В. Крылов, ред.). Л.: Тр. Зоол. Инст-та АН СССР, т. 107, с. 58-73.

8. Исси И.В. 1986. Микроспоридии как тип паразитических простейших. В кн.: Микроспоридии (Бейер Т.В., Исси И.В., ред.). Л.: Наука, с. 6-136.

9. Исси И.В. и Воронин В.Н. 2007. Тип Microsporida Balbiani, 1882 -Микроспоридии. В кн.: Протисты: Руководство по зоологии. Часть 2. СПб.: Наука (в печати).

10. Князев А.Н. 1985. Цикл развития сверчка Gryllus bimaculatus Deg. (Orthoptera, Gryllidae) в условиях лабораторного содержания. Энтомол. Обозр. 64: 58-73.

11. Кудрявцев Б.Н. и Розанов Ю.М. 1974. Цитофлуориметрия. Общие принципы. В: Методы биологии развития. М.: Наука, с. 95-107.

12. Марахова Н.В., Скарлато С.О., Фролов А.О. и Цуладзе A.M. 1991. Полиморфизм молекулярных кариотипов низших трипаносоматид. Цитология. 33: 59-66.

13. Марахова Н.В., Сопина В.А., Скарлато С.О. и Громов Д.Б. 1993. Выявление молекул ДНК хромосомного размера Amoeba proteus методом электрофореза в пульсирующем поле. Докл. Акад. Наук. 330: 794-796.

14. Миронов А.А., Комиссачик Я.Ю. и Миронов В.А. 1994. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. СПб.: Наука, 400 с.

15. Насонова Е.С., Соколова Ю.Я. и Скарлато С.О. 1998. Хромосомные ДНК и размер генома микроспоридии Nosema grylli. Докл. Акад. Наук. 361: 554-557.

16. Попенко В.И., Новикова Е.Г., Чуриков И.А., Викторова Л.С. и Черни Н.Е. 1998. Размер ДНК и структурная организация хроматина макронуклеуса инфузории Bursaria truncatella. Мол. Биология. 32: 323331.

17. Райков И.Б. 1978. Ядро простейших. Морфология и эволюция. Л.: Наука. 328 с.

18. Селезнев К.В., Антонова О.А. и Исси И.В. 1997. Влияние микроспоридиоза на состав белков в жировом теле и гемолимфе сверчков Gryllus bimaculatus. Паразитология. 31:181-185.

19. Серавин Л.Н. и Гудков А.В. 1999. Агамные слияния протистов и происхождение полового процесса. СПб., Омск. 154 с.

20. Скарлато С.О. 1997. Структура слабоконденсирующихся хромосом одноклеточных животных. Цитология. 39:105-106.

21. Скарлато С.О. 2000. Примитивные черты структурной организации слабоконденсирующихся хромосом простейших. Цитология. 42: 309.

22. Скарлато С.О. 2003. Слабоконденсирующиеся хромосомы простейших. Дисс. соиск. уч. ст. докт. биол. наук. СПб., 345 с.

23. Скарлато С.О., Сомова Н.В., Розанов Ю.М., Кудрявцев Б.Н., Бобылева Н.Н. и Фролов А.О. 1998. Особенности организации хромосомного аппарата жгутиконосцев Crithidia sp. Цитология. 40: 991-1005.

24. Снигиревская Е.С., Соколова Ю.Я. и Комиссарчик Я.Ю. 2006. Структурно-функциональная организация аппарата Гольджи. Цитология. 48:283-307.

25. Соколова Ю.Я., Селезнев К.В., Долгих В.В., Исси И.В. 1994. Микроспоридия Nosema grylli п. sp. из сверчка Gryllus bimaculatus. Паразитология. 28: 488-494.

26. Соколова Ю.Я. и Исси И. В. 1997. О роде Nosema (Microsporidia) в связи с новыми данными по жизненному циклу микроспоридии N. mesnili. Паразитология. 31: 307-313.

27. Соколова Ю.Я., Насонова Е.С., Сомова Н.В. и Скарлато С.О. 1998. Ультраструктура ядерного аппарата и электрофоретический кариотип микроспоридии Nosema grylli внутриклеточного паразита сверчка Gryllus bimaculatus. Цитология. 40: 407-416.

28. Соколова Ю.Я. и Сундуков О.В. 1999. Подавление активности эстераз специфическая черта микроспоридиоза сверчка Gryllus bimaculatus. Паразитология. 33: 527-535.

29. Соколова Ю.Я., Токарев Ю.С., Лозинская Я.Л. и Глупов В.В. 2000. Морфофункциональный анализ гемоцитов сверчка Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae) в норме и при остром микроспоридиозе, вызываемом Nosema grylli. Паразитология. 34: 408-419.

30. Соколова Ю.Я., Снигиревская Е.С., Скарлато С.О., Комиссарчик Я.Ю. и Миронов А.А. 2001. Необычный аппарат Гольджи микроспоридий на пролиферативной стадии жизненного цикла. Докл. Акад. Наук. 378: 403-406.

31. Сомова Н.В., Скарлато С.О. и Фролов А.О. 1997. Хромосомы свободноживущих жгутиконосцев-кинетопластид. Докл. Акад. Наук. 357:414-416.

32. Штейн Г.И., Пантелеев В.Г., Поваркова А.В. и Кудрявцев Б.Н. 1998. Возможности анализатора изображений "Видеотест" для проведения микрофотометрических исследований в цитологии. Цитология. 40: 913-916.

33. Adam R.D. 2000. The Giardia lamblia genome. Int. J. Parasitol. 30: 475484.

34. Adam R.D., Nash Т.Е. and Wellems Т.Е. 1988. The Giardia lamblia trophozoite contains sets of closely related chromosomes. Nucleic Acids Res. 16: 4555-4567.

35. Ahn J.-H. and Walton J.D. 1996. Chromosomal organization of TOX2, a complex locus controlling host-selective toxin biosynthesis in Cochliobolus carbonum. Plant Cell. 8: 887-897.

36. Aist J.R. and Williams P.H. 1972. Ultrastructure and time course of mitosis in the fungus Fusarium oxysporum. J. Cell Biol. 55: 368-389.

37. Aist J.R. and Morris N.R. 1999. Mitosis in filamentous fungi: how we got where we are. Fungal Genet. Biol. 27:1-25.

38. Alsford S., Wickstead В., Ersfeld K. and Gull K. 2001. Diversity and dynamics of the minichromosomal karyotype in Trypanosoma brucei. Mol. Biochem. Parasit. 113: 79-88.

39. Altschuler M.I. and Yao M.C. 1985. Macronuclear DNA of Tetrahymena thermophila exists as defined subchromosomal-sized molecules. Nucleic Acids Res. 13:5817-5831.

40. Amigo J.M., Gracia M.P., Salvado H. and Vivares C.P. 2002. Pulsed field gel electrophoresis of three microsporidian parasites of fish. Acta Protozool. 41:11-16.

41. Amogan H.P., Martinez J.P., Ciuffetti L.M., Field K.G. and Reno P.W. 2006. Karyotype and genome size of Nadelspora canceri determined by pulsed field gel electrophoresis. Acta Protozool. 45: 249-254.

42. Andreadis T.G. 1983. Life cycle and epizootiology of Amblyospora sp. (Microspora: Amblyosporidae) in the mosquito, Aedes cantator. J. Protozool. 30: 509-518.

43. Andreadis T.G. 1988. Amblyospora connecticus sp. nov. (Microsporida: Amblyosporidae): horizontal transmission studies in the mosquito, Aedes cantator and formal description. J. Invertebr. Pathol. 52: 90-101.

44. Andreadis T.G. and Hall D.W. 1979. Development, ultrastructure and mode of transmission of Amblyospora sp. (Microspora) in the mosquito. J. Protozool. 26:444-452.

45. Arbel Т., Shemesh R. and Simchen G. 1999. Frequent meiotic recombination between the ends of truncated chromosome fragments of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 153:1583-1590.

46. Arkhipova I. and Meselson M. 2000. Transposable elements in sexual and ancient asexual taxa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:14473-14477.

47. Baker M.D., Vossbrinck C.R., Maddox J.V. and Undeen A.H. 1994. Phylogenetic relationships among Vairimorpha and Nosema species (Microspora) based on ribosomal RNA sequence data. J. Invertebr. Pathol. 64:100-106.

48. Baker M.D., Vossbrinck C.R., Didier E.S., Maddox J.V. and Shadduck J.A. 1995. Small-subunit ribosomal DNA phylogeny of various microsporidia with emphasis on AIDS-related forms. J. Eukaryot. Microbiol. 42: 564-570.

49. Barbour A.G. 1990. Antigenic variation of a relapsing fever Borrelia species. Annu. Rev. Microbiol. 44: 155-171.

50. Barry J.D., Ginger M.L., Burton P. and McCulloch R. 2003. Why are parasite contingency genes often associated with telomeres? Int. J. Parasitol. 33: 29-45.

51. Bastien P., Blaineau C. and Pages M. 1992. Molecular karyotype analysis in Leishmania. In: Subcellular Biochemistry Vol. 18: Intracellular Parasites (J.L. Avila and J.R. Harris, eds.). Plenum Press, New York, pp. 131-187.

52. Beadle J., Wright M., McNeely L. and Bennett J.W. 2003. Electrophoretic karyotype analysis in fungi. Adv. Appl. Microbiol. 53: 243-270.

53. Becnel J.J. 1992. Horizontal transmission and subsequent development of Amblyospora californica (Microsporida: Amblyosporidae) in the intermediate and definitive hosts. Dis. Aquat. Organ. 13:17-28.

54. Becnel J.J., Hazard E.I. and Fukuda T. 1986. Fine structure and development of Pilosporella chapmani (Microspora: Thelohaniidae) in the mosquito Aedes triseriatus (Say). J. Protozool. 33: 60-66.

55. Becnel J.J., Hazard E.I., Fukuda T. and Sprague V. 1987. Life cycle of Culicospora magna (Kudo, 1920) (Microsporida: Culicosporidae) in Culexrestuans Theobald with special reference to sexuality. J. Protozool. 34: 313-322.

56. Becnel J.J., Sprague V., Fukuda T. and Hazard E.I. 1989. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N.G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). J. Protozool. 36:119-130.

57. Bernards A., Michels P.A.M., Lincke C.R. and Borst P. 1983. Growth of chromosome ends in multiplying trypanosomes. Nature. 303: 592-597.

58. Beverley S.M., Coderre J.A., Santi D.V. and Schimke R.T. 1984. Unstable DNA amplifications in methotrexate-resistant Leishmania consist of extrachromosomal circles, which relocalize during stabilization. Cell. 38: 431-439.

59. Biderre C., Pages M., Metenier G., Canning E. and Vivares C.P. 1995. Evidence for the smallest nuclear genome (2.9 Mb) in the microsporidium Encephalitozoon cuniculi. Mol. Biochem. Parasit. 74: 229-231.

60. Biderre С., Mathis A., Deplazes P., Weber R., Metenier G. and Vivares C.P. 1999a. Molecular karyotype diversity in the microsporidian Encephalitozoon cuniculi. Parasitology. 118: 439-445.

61. Biderre C., Canning E.U., Metenier G. and Vivares C.P. 1999b. Comparison of two isolates of Encephalitozoon hellem and E. intestinalis (Microspora) by pulsed field gel electrophoresis. Eur. J. Protistol. 35: 194196.

62. Biggins S. and Walczak C.E. 2003. Captivating capture: how microtubules attach to kinetochores. Curr. Biol. 13: R449-R460.

63. Biggs B.A., Gooze L., Wycherley K., Wollish W„ Southwell В., Leech J.H. and Brown G.V. 1991. Antigenic variation in Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 9171-9174.

64. Bigliardi E., Riparbelli M.G., Selmi M.G., Lanzarini P., Corona S., Gatti S., Scaglia M. and Sacchi L. 1998. Mechanisms of microsporidial cell division: ultrastructural study on Encephalitozoon hellem. J. Eukaryot. Microbiol. 45: 347-351.

65. Birnboim H.C. and Doly J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.

66. Birren B.W., Lai E„ Clark S.M., Hood L. and Simon M.I. 1988. Optimized conditions for pulsed field gel electrophoretic separations of DNA. Nucleic Acids Res. 16: 7563-7582.

67. Blunt D.S., Khramtsov N.V., Upton S.J. and Montelone B.A. 1997. Molecular karyotype analysis of Cryptosporidium paivum: evidence for eight chromosomes and a low-molecular-size molecule. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:11-3.

68. Britto C., Ravel C., Bastien P., Blaineau C., Pages M., Dedet J.P. and Wincker P. 1998. Conserved linkage groups associated with large-scale chromosomal rearrangements between Old World and New World Leishmania genomes. Gene. 222: 107-117.

69. Brody H. and Carbon J. 1989. Electrophoretic karyotype of Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 6260-6263.

70. Brugere J.F., Cornillot E., Metenier G. and Vivares C.P. 2000a. In-gel DNA radiolabelling and two-dimensional pulsed field gel electrophoresis procedures suitable for fingerprinting and mapping small eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res. 28: E48.

71. Brugere J.F., Cornillot E., Metenier G., Bensimon A. and Vivares C.P. 2000b. Encephalitozoon cuniculi (Microspora) genome: physical map and evidence for telomere-associated rDNA units on all chromosomes. Nucleic Acids Res. 28: 2026-2033.

72. Brugere J.F., Cornillot E., Bourbon Т., Metenier G. and Vivares C.P. 2001. Inter-strain variability of insertion/deletion events in the Encephalitozoon cuniculi genome: a comparative KARD-PFGE analysis. J. Eukaryot. Microbiol. Suppl.: 50S-55S.

73. Byers В. and Goetsch L. 1975. Electron microscopic observations on the meiotic karyotype of diploid and tetraploid Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 5056-5060.

74. Cali A. and Takvorian P.M. 2001. Brachiola algerae sporoplasms. J. Eukaryot. Microbiol. Suppl: 81S-82S.

75. Campbell S.R., van Keulen H., Erlandsen S.L., Senturia J.B. and Jarroll E.L. 1990. Giardia sp.: comparison of electrophoretic karyotypes. Exp. Parasitol. 71:470-482.

76. Canning E.U. 1953. A new microsporidian, Nosema locustae n.sp., from the fat body of the African migratory locust, Locusta migratoria migratorioides R.& F. Parasitology. 43: 287-290.

77. Canning E.U. 1988. Nuclear division and chromosomal cycle in microsporidia. BioSystems. 21: 333-340.

78. Canning E.U. Phylum Microspora. 1990. In Handbook of Protoctista. (L. Margulis, J.O. Corliss, M. Melkonian and D.J. Chapman, eds.). Jones and Bartlett Publ., Boston, pp. 53-72.

79. Canning E.U. and Sinden R.E. 1973. Ultrastructural observations on the development of Nosema algerae Vavra and Undeen (Microsporida: Nosematidae) in the mosquito Anopheles stephensi Liston. Protistologica. 9: 405-415.

80. Canning E.U., Refardt D., Vossbrinck C.R., Okamura B. and Curry A. 2002. New diplokaryotic microsporidia (Phylum Microsporidia) fromfreshwater bryozoans (Bryozoa, Phylactolaemata). Eur. J. Protistol. 38: 247-265.

81. Cantor C.R., Gaal A. and Smith C.J. 1988. High-resolution separation and accurate size determination in pulsed-field gel electrophoresis of DNA. 3. Effect of electrical field shape. Biochemistry. 27: 9216-9221.

82. Carle G.F. and Olson M.V. 1985. An electrophoretic karyotype for yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 3756-3760.

83. Carlson C.R., Grallert В., Bernander R., Stokke T. and Boye E. 1997. Measurement of nuclear DNA content in fission yeast by flow cytometry. Yeast. 13: 1329-1335.

84. Cavalier-Smith T. 1985. Cell volume and evolution of eukaryotic genome size. In: The evolution of genome size (T. Cavalier-Smith, ed.). John Wiley, New York, pp. 105-184.

85. Cavalier-Smith T. 1995. Cell cycles, diplokaryosis and the archezoan origin of sex. Arch. Protistenkd. 145:189-207.

86. Chen W.-J. and Barr A.R. 1995. Chromosomal evidence on the sporogony of Amblyospora californica (Microspora: Amblyosporidae) in Culex tarsalis (Diptera: Culicidae). J. Eukaryot. Microbiol. 42:103-108.

87. Chiurillo M.A., Cano I., Da Silveira J.F. and Ramirez J.L. 1999. Organization of telomeric and sub-telomeric regions of chromosomes from the protozoan parasite Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasit. 100: 173-183.

88. Clark C.G., Lai E.Y., Fulton C. and Cross G.A.M. 1990. Electrophoretic karyotype and linkage groups of the amoeboflagellate Naegleria gruberi. J. Protozool. 37:400-408.

89. Codreanu R. and Vavra J. 1970. The structure and ultrastructure of the microsporidian Telomyxa glugeiformis Leger and Hesse 1910, parasite of Ephemera danica (Mull) nymphs. J. Protozool. 17: 374-384.

90. Colley F.C., Joe L.K., Zaman V. and Canning E.U. 1975. Light and electron microscopical study of Nosema eurytremae. J. Invertebr. Pathol. 26:11-20.

91. Conover R.K. and Brunk C.F. 1986a. Macronuclear DNA molecules of Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 6: 900-905.

92. Conover R.K. and Brunk C.F. 1986b. Characterization of the macronuclear DNA of different species of Tetrahymena. J. Mol. Evol. 24:143-151.

93. Cornillot E., Keller В., Cushion M.T., Metenier G. and Vivares C.P. 2002. Fine analysis of the Pneumocystis carinii f. sp. carinii genome by two-dimensional pulsed-field gel electrophoresis. Gene. 293: 87-95.

94. Dacks J. and Roger A.J. 1999: The first sexual lineage and the relevance of facultative sex. J. Mol. Evol. 48: 779-783.

95. Daviere J.M., Langin T. and Daboussi M.J. 2001. Potential role of transposable elements in the rapid reorganization of the Fusarium oxysporum genome. Fungal Genet. Biol. 34: 177-192.

96. Debaisieux P. 1919. Les microsporidies parasites des larves de Simulium. Thelohania varians. La Cellule. 30: 47-79, 3 plates.

97. Debaisieux P. 1928. Etudes cytologiques sur quelques Microsporidies. La Cellule. 38: 389-450.

98. Debaisieux P. and Gastaldi L. 1919. Les microsporidies parasites des larves de Simulium. II. La Cellule. 30:187-213, 3 plates.

99. De Jonckheere J.F. 1989. Variation of electrophoretic karyotypes among Naegleria spp. Parasitol. Res. 76: 55-62.

100. Delarbre S., Gatti S., Scaglia M. and Drancour M. 2001. Genetic diversity in the microsporidian Encephalitozoon hellem demonstrated by pulsed-field gel electrophoresis. J. Eukaryot. Microbiol. 48: 471-474.

101. DeLamater E.D. 1948. Basic fuchsin as a nulear stain. Stain Technology. 23: 161-176.

102. Desportes I. 1976. Ultrastructure de Stempellia mutabilis Leger & Hesse, microsporidie parasite de I'ephemere Ephemera vulgata L. Protistologica. 12:121-150.

103. Desportes I. and Theodorides J. 1979. Etude ultrastructurale d'Amphiamblys laubieri n.sp. (Microsporidie, Metchnikovellidae) parasite d'une gregarine (Lecudina sp.) d'un echiurien abyssal. Protistologica. 15: 435-457.

104. De Wulf P., McAinsh A.D. and Sorger P.K. 2003. Hierarchical assembly of the budding yeast kinetochore from multiple subcomplexes. Gene Dev. 17: 2902-2921.

105. Dia N., Toguebaye B.S., Vivares C.P. and Cornillot E. 2005. Multigenic family analysis among the Encephalitozoon genus. J. Eukaryot. Microbiol. 52: 44S-45S.

106. Didier E.S., Vossbrinck C.R., Baker M.D., Rogers L.B., Bertucci D.C. and Shadduck J.A. 1995. Identification and characterization of three Encephalitozoon cuniculi strains. Parasitology. 111:411-421.

107. Didier E.S., Snowden K.F. and Shadduck J.A. 1998. Biology of microsporidian species infecting mammals. Adv. Parasitol. 40: 283-320.

108. Dien B.S., Peterson M.S. and Srienc F. 1994. Cell-cycle analysis of Saccharomyces cerevisiae. In: Methods in Cell Biology, Vol. 42. Flow Cytometry (Z. Darzynkiewicz, J.P. Robinson, H.A. Crissman, eds.). Acad. Press, San Diego, pp. 457-475.

109. Ding R., McDonald K.L. and Mcintosh J.R. 1993. Three-dimensional reconstruction and analysis of mitotic spindles from the yeast, Schizosaccharomyces pombe. J. Cell Biol. 120:141-151.

110. Dolgikh V.V. 2000. Activities of enzymes of carbohydrate and energy metabolism of the intracellular stages of the microsporidian, Nosema grylli. Protistology. 1: 87-91.

111. Dolgikh V.V., Sokolova J.J. and Issi I.V. 1997. Activities of enzymes of carbohydrate and energy metabolism of the spores of the microsporidian, Nosema grylli. J. Eukaryot. Microbiol. 44: 246-249.

112. Dolgikh V.V. and Semenov P.B. 2003. The spore wall and polar tube proteins of the microsporidian Nosema grylli: the major spore wall protein is released before spore extrusion. Цитология. 45: 324-329.

113. Dresser M.E. and Giroux C.N. 1988. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. J. Cell Biol. 106: 567-773.

114. Dujon B. 2006. Yeasts illustrate the molecular mechanisms of eukaryotic genome evolution. Trends Genet. 22: 375-387.

115. Edlind T.D., Li J. Visvesvara G.S., Vodkin M.H., McLaughlin G.L. and Katiyar S.K. 1996. Phylogenetic analysis of beta-tubulin sequences from amitochondrial protozoa. Mol. Phylogenet. Evol. 5: 359-367.

116. Edlind T.D. 1998. Phylogenetics of protozoan tubulin with reference to the amitochondriate eukaryotes. In: Evolutionary Relationships among protozoa (Goombs et al., eds.). Chapman & Hall, London, pp. 91-108.

117. Eschbach S., Hofmann C.J.В., Maier U.-G., Sitte P. and Hansmann P.A. 1991. Eukaryotic genome of 660 kb: electrophoretic karyotype of nucleomorph and cell nucleus of the cryptomonad algae, Pyrenomonas salina. Nucleic Acids Res. 19:1779-1781.

118. Fan J.В., Chikashige Y., Smith C.L., Niwa 0., Yanagida M. and Cantor C.R. 1989. Construction of a Notl restriction map of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe genome. Nucleic Acids Res. 17:2801-2818.

119. Faye N., Cornillot E., Toguebaye B.S. and Vivares C.P. 2003: On the organization of subterminal chromosomal regions in Encephalitozoon cuniculi. J. Eukaryot. Microbiol. 50: 29A.

120. Feinberg A.P. and Vogelstein B. 1983. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal Biochem. 132: 6-13.

121. Fierro F. and Martin J.F. 1999: Molecular mechanisms of chromosomal rearrangement in fungi. Crit. Rev. Microbiol. 25:1-17.

122. Fischer G., James S.A., Roberts I., Oliver S. and Louis E. 2000. Chromosomal evolution in Saccharomyces. Nature. 405:451-454.

123. Fischer G., Rocha E.P., Brunet F., Vergassola M. and Dujon B. 2006. Highly variable rates of genome rearrangements between hemiascomycetous yeast lineages. PLoS Genet. 2: 0253-0261.

124. Flegel T.W. and Pasharawipas T. 1995. A proposal for typical eukaryotic meiosis in microsporidians. Can. J. Microbiol. 41:1-11.

125. Foote S.J., Thompson J.К., Cowman A.F. and Kemp D.J. 1989. Amplification of the multidrug resistance gene in some chloroquine-resistant isolates of P. falciparum. Cell. 57: 921-930.

126. Francis D.M. and Michelmore R.W. 1993. Two classes of chromosome-sized molecule are present in Bremia lactucae. Exp. Mycol. 17: 284-300.

127. Franzen C. and Miiller A. 2001. Microsporidiosis: human diseases and diagnosis. Microbes Infect. 3: 389-400.

128. Franzen C., Nassonova E.S., Scholmerich J. and Issi I.V. 2006. Transfer of the members of the genus Brachiola (Microsporidia) to the genus Anncaliia based on ultrastructural and molecular data. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 110.

129. Fraissinet-Tachet L., Reymond-Cotton P. and Fevre M. 1996. Molecular karyotype of the phytopathogenic fungus Sclerotica sclerotiorum. Curr. Genet. 29: 496-501.

130. Fulton C. 1970. Amebo-flagellates as research partners: the laboratory biology of Naegleria and Tetramitus. In: Methods in Cell Physiology, Vol. 4 (Prescott D.M., ed.). Acad. Press, New York, pp. 341-376.

131. Gardiner К. 1992. Transverse Alternating-Field Electrophoresis. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 12: Pulsed-Field Gel Electrophoresis (M. Burmeister and L. Ulanovsky, eds.). The Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 51-61.

132. Giannini S.H., Schittini M., Keithly J.S., Warburton P., Cantor C.R. and Van der Ploeg L.H.T. 1986. Karyotype analysis of Leishmania species and its use in classification and clinical diagnosis. Science. 232: 761-765.

133. Gibson W.C. and Miles M.A. 1986. The karyotype and ploidy of Trypanosoma cruzi. EMBO J. 5:1299-1305.

134. Grasse P.P. 1970. Remarques sur la note de M.A. Hollande et Mm J. Carruette-Valentin: Le role possible des complex synaptonematiques. C. R. Acad. Sc. Paris, Serie D. 270: 2554-2555.

135. Gregory T.R. (ed.) 2005. The evolution of the genome. Elsevier. 768 pp.

136. Grimont F. and Grimont P.A.D. 1991. DNA fingerprinting. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics (Stackebrandt E. and Goodfellow M., eds.). John Wiley, New York, pp. 249-279.

137. Hazard E.I., Andreadis T.G., Joslyn D.J. and Ellis E.A. 1979. Meiosis and its implications in the life cycles of Amblyospora and Parathelohania (Microspora). J. Parasitol. 65:117-122.

138. Hazard E.I. and Brookbank J.W. 1984. Karyogamy and meiosis in an Amblyospora sp. (Microspora) in the mosquito Culex salinarius. J. Invertebr. Pathol. 44: 3-11.

139. Hazard E.I., Fukuda Т. and Becnel J.J. 1984. Life cycle of Culicosporella lunata (Hazard and Savage 1970) Weiser, 1977 (Microspora) as revealed in the light microscope with a redescription of the genus and species. J. Protozool. 31: 385-391.

140. Hazard E.I., Fukuda T. and Becnel J.J. 1985. Gametogenesis and plasmogamy in certain species of Microspora. J. Invertebr. Pathol. 46: 6369.

141. Heath I.B. 1981. Nucleus-associated organelles in fungi. Intern. Rev. Cytol. 69: 191-221.

142. Heath I.B. 1994. The cytoskeleton. In: The growing fungus (N.A.R. Gow and G.M. Gadd, eds.). Chapman and Hall, London, pp. 99-134.

143. Henriksson J., Aslund L. and Pettersson U. 1996. Karyotype variability in Trypanosoma cruzi. Parasitol. Today. 12:108-114.

144. Henry J.E. 1967. Nosema acridophagus sp.n., a microsporidian isolated from grasshoppers. J. Invertebr. Pathol. 9: 331-341.

145. Henry J.E. 1971. Nosema cuneatum sp. n. (Microsporida: Nosematidae) in grasshoppers (Orthoptera: Acrididae). J. Invertebr. Pathol. 17: 164-171.

146. Hernandez-Rivas R. and Scherf A. 1997. Separation and mapping of chromosomes of parasitic protozoa. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 92: 815819.

147. Hildebrand H. and Vivier E. 1971. Observations ultrastructurales sur le sporoblaste de Metchnikovella wohlfarthi n. sp. (Microsporidie) parasite de la gregarine Lecudina tuzetae. Protistologica. 7:131-139.

148. Hirt R.P., Logsdon J.M. Jr., Healy В., Dorey M.W., Doolittle W.F. and Embley T.M. 1999. Microsporidia are related to Fungi: evidence from the largest subunit of RNA polymerase II and other proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 580-585.

149. Hollande A. 1972. Le deroulement de la cryptomitose et les modalites de la segregation des chromatides dans quelques groupes de Protozoaires. Ann. Biol. 11:427-466.

150. Ironside J.E. 2007. Multiple losses of sex within a single genus of Microsporidia. BMC Evol. Biol. 7: 48.

151. Ironside J.E., Smith J.E., Hatcher M.J., Sharpe R.G., Rollinson D. and Dunn A.M. 2003. Two species of feminizing microsporidian parasite coexist in populations of Gammarus duebeniJ. Evol. Biol. 16: 467-473.

152. James T.Y., Kauff F., Schoch C.L., Matheny P.B., Hofstetter V., Cox C.J., Celio G., Gueidan C., Fraker E., Miadlikowska J., Lumbsch H.T., Rauhut A., Reeb V., Arnold A.E., Amtoft A., Stajich J.E., Hosaka K., Sung G.H.,

153. Johnson D., O'Rourke В., Crockett M., Binder M., Curtis J.M., Slot J.C., Wang Z., Wilson A.W., Schussler A., Longcore J.E. et al. 2006. Reconstructing the early evolution of Fungi using a six-gene phylogeny. Nature. 443: 818-822.

154. Janbon G., Sherman F. and Rustchenko E. 1998: Monosomy of a specific chromosome determines L-sorbose utilization: a novel regulatory mechanism in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 51505155.

155. Janse CJ. 1993. Chromosome size polymorphism and DNA rearrangements in Plasmodium. Parasitol. Today. 9:19-22.

156. Janse C.J., Carlton J.M., Walliker D. and Waters A.P. 1994. Conserved location of genes on polymorphic chromosomes of four species of malaria parasites. Mol. Biochem. Parasit. 68: 285-296.

157. Jaronski S.T. 1984. Microsporida in cell culture. In: Advances in Cell Culture. Vol. 3 (K. Maramorosch, ed.). Acad. Press, New York, pp. 183229.

158. Jones S.H., Lew A.E., Jorgensen W.K. and Barker S.C. 1997. Babesia bovis: genome size, number of chromosomes and telomeric probe hybridisation. Int. J. Parasitol. 27:1569-1573.

159. Judelson H.S., Coffey M.D., Arredondo F.R. and Tyler B.M. 1993. Transformation of the oomycete pathogen Phytophthora megasperma f. sp. glycinea occurs by DNA integration into single or multiple chromosomes. Curr. Genet. 23: 211-218.

160. Kasten F.H. 1961. Auramine O-SO2, a highly fluorescent Shiff-type reagent for DNA in the Feulgen reaction. J. Histochem. Cytochem. 9: 599.

161. Katinka M.D., Duprat S., Cornillot E., Metenier G., Thomarat F., Prensier G., Barbe V., Peyretaillade E., Brottier P., Wincker P., Delbac F., El Alaoui

162. H., Peyret P., Saurin W., Gouy M., Weissenbach J. and Vivares C.P. 2001. Genome sequence and gene compaction of the eukaryote parasite Encephalitozoon cuniculi. Nature. 414: 450-453.

163. Kawakami Y., Inoue Т., Ito K., Kitamizu K., Hanawa C., Sunairi M., Ando Т., Iwano H. and Ishihara R. 1994. Comparison of chromosomal DNA from four microsporidia pathogenic to the silkworm, Bombyx mori. Appl. Entomol. Zool. 29: 120-123.

164. Keeling P.J. 2001. Parasites go the full monty. Nature. 414: 401-402.

165. Keeling P.J. 2007. Comparative genomics of Microsporidia. Protistology. 5: 40.

166. Keeling P.J. and Doolittle W.F. 1996. Alpha-tubulin from early-diverging eukaryotic lineages and the evolution of the tubulin family. Mol. Biol. Evol. 13:1297-1305.

167. Keeling P.J. and Fast N.M. 2002. Microsporidia: biology and evolution of highly reduced intracellular parasites. Annu. Rev. Microbiol. 56: 93-116.

168. Keeling P.J. and Slamovits C.H. 2004. Simplicity and complexity of microsporidian genomes. Eukaryot. Cell. 3:1363-1369.

169. Kemp D.J., Thompson J.K., Walliker D. and Corcoran L.M. 1987. Molecular karyotype of Plasmodium falciparum: conserved linkage groups and expendable histidine-rich protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7672-7676.

170. Kistler H.C. and Miao V.P.W. 1992: New modes of genetic change in filamentous fungi. Annu. Rev. Phytopathol. 30:131-152.

171. Klein F., Laroche Т., Cardenas M.E., Hofmann J.F., Schweizer D. and Gasser S.M. 1992. Localization of RAP1 and topoisomerase II in nuclei and meiotic chromosomes of yeast. J. Cell. Biol. 117: 935-948.

172. Kondrashov A.S. 1994. The asexual ploidy cycle and the origin of sex. Nature. 370: 213-216.

173. Kondrashov A.S. 1997. Evolutionary genetics of life cycles. Annu. Rev. Ecol. Syst. 28: 391-435.

174. Kudo R. 1924. A biological and taxonomic study of the Microsporidia. Illinois biological monographs, Vol. 9. (S.A. Forbes, W. Trelease, H.B. Ward, eds.). 268 pp.

175. Kurtti T.J., Munderloh U.G. and Noda H. 1990. Vairimorpha necatrix: infectivity for and development in a Lepidopteran cell line. J. Invertebr. Pathol. 55: 61-68.

176. Kurtti T.J., Ross S.E., Liu Y. and Munderloh U.G. 1994. In vitro developmental biology and spore production in Nosema furnacalis (Microspora: Nosematidae). J. Invertebr. Pathol. 63:188-196.

177. Lahlafi T. and Metenier G. 1991. Low-molecular-weight DNA in the heteromeric macronuclei of two cyrtophorid ciliates. Biol. Cell. 73: 79-88.

178. Lanzer M., De Bruin D., Wertheimer S.P and Ravetch J.V. 1994. Organization of chromosomes in Plasmodium falciparum: a model for generating karyotypic diversity. Parasitol. Today. 10:114-116.

179. Lanzer M., Fischer K. and Le Blancq S.M. 1995. Parasitism and chromosome dynamics in protozoan parasites: is there a connection? Mol. Biochem. Parasit. 70:1-8.

180. Larraya L.M., Perez G., Penas M.M., Baars J.J.P., Mikosch T.S., Pisabarro A.G. and Ramirez L. 1999: Molecular karyotype of the white rot fungus Pieurotus ostreatus. Appi. Environ. Microbiol. 65: 3413-3417.

181. Larsson J.I.R. 1980. Ultrastrutural study of Toxoglugea variabilis n. sp. (Microsporida: Thelahaniidae), a microsporidian parasite of the biting midge Bezzia sp. (Diptera: Ceratopogonidae). Protistologica. 16: 17-32.

182. Larsson J.I.R. 1981a. An ultrastructural study of Amblyospora undulata n. sp., a microsporidian parasite of the caddis fly Cyrnus trimaculatus (Trichoptera, Polycentropidae). Protistologica. 17: 511-523.

183. Larsson R. 1981b. The ultrastructure of the spore and sporogonic stages of Telomyxa glugeiformis Leger and Hesse, 1910 (Microspora: Telomyxidae). Zool. Anz. 206:137-153.

184. Larsson R. 1986. Ultrastructure, function and classification of microsporidia. Prog. Protistol. 1: 325-390.

185. Larsson J.I.R. 1989a. Light and electron microscope studies on Jirovecia involuta sp. nov. (Microspora, Bacillidiidae), a new microsporidian parasite of oligochaetes in Sweden. Eur. J. Protistol. 25:172-181.

186. Larsson J.I.R. 1989b. The light and electron microscopic cytology of Bacillidium filifemm sp.nov. (Microspora, Bacillidiidae). Arch. Protistenkd. 137: 345-355.

187. Le Blancq S.M. 1994. Chromosome rearrangements in Giardia lamblia. Parasitol. Today. 10: 177-179.

188. Le Blancq S.M., Korman S.H. and Van der Ploeg L.H.T. 1991. Frequent chromosome rearrangements in Giardia lamblia. Nucleic Acids Res. 19: 4405-4412.

189. Le Blancq S.M., Korman S.H. and Van der Ploeg L.H. 1992. Spontaneous chromosome rearrangements in the protozoan Giardia lamblia: estimation of mutation rates. Nucleic Acids Res. 20:4539-4545.

190. Le Blancq S.M. and Adam R.D. 1998: Structural basis of karyotype heterogeneity in Giardia lamblia. Mol. Biochem. Parasit. 97:199-208.

191. Lehker M.W. and Alderete J.F. 1999. Resolution of six chromosomes of Trichomonas vaginalis and conservation of size and number among isolates. J. Parasitol. 85: 976-979.

192. Li J., Katiyar S.K., Hamelin A., Visvesvara G.S. and Edlind T.D. 1996. Tubulin genes from AIDS-associated microsporidia and implications for phylogeny and benzimidazole sensitivity. Mol. Biochem. Parasit. 78: 289295.

193. Liu T.P. 1972. A freeze-etching study on the nuclear envelope during development in microsporidian Thelohania bracteata (Strickland, 1913). J. Parasitol. 58: 1151-1161.

194. Liu Y.J., Hodson M.C. and Hall B.D. 2006. Loss of the flagellum happened only once in the fungal lineage: phylogenetic structure of kingdom Fungi inferred from RNA polymerase II subunit genes. BMC Evol. Biol. 6: 74.

195. Logsdon J.M., Dorey M. and Doolittle W.F. 1997. Molecular evolution of гесД-homologous genes in protists: implications for the origin of meiosis. Proc. 10th Intern. Cong. Protozool. Sydney, Australia, p. 135.

196. Logsdon J.M.Jr., Malik S.-B. and Ramesh M.A. 2002. Origins and evolution of meiosis in protists: complex machinery for sex. Proc. Annual BSSP meeting. University of Bristol, UK.

197. Loidl J., Nairz K. and Klein F. 1991. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100: 221-228.

198. Lom J. and Nilsen F. 2003. Fish microsporidia: fine structural diversity and phylogeny. Int. J. Parasitol. 33:107-127.

199. Loubes C. 1979a. Recherches sur la meiose chez les microsporidies: consequences sur les cycles biologiques. J. Protozool. 26: 200-208.

200. Loubes C. 1979b. Ultrastructure, sexualite, dimorphisme sporogonique des Microsporidies (Protozoaires). Incidences taxonomiques et biologiques. These pour obtenir le grade de Docteur d'Etat. Univ. Sci. Tech. du Languedoc, 346 p.

201. Loubes C. and Maurand J. Remarque sur le "diplokaryon" Microsporidies Acad. D'Agric. de France. Extrait du process-verbal de la Seance du 8 Dec. 1971. pp. 1540-1543.

202. Loubes C. and Maurand J. 1975a. Etude ultrastructurale de Gurieya chironomi n. sp. microsporidie parasite des larves d'Orthocladius (Diptera: Chironomidae). Protistologica. 11: 233-244.

203. Loubes C. and Maurand J. 1975b. Etude ultrastructurale d'une Microsporidie du genre Gurieya Doflein, 1898. J. Protozool. 22: 42A-83A.

204. Loubes C. and Maurand J. 1976. Etude ultrastructurale de Pleistophora debaisieuxi Jirovec, 1943 (Microsporida): son transfert dans le genre

205. Tuzetia Maurand, Fize, Michel et Fenwick, 1971 et remarques sur la structure et la genese du filament polaire. Protistologica. 12: 577-591.

206. Loubes C., Maurand J., Gasc C. and Bouix G. 1976a. Cycle de developpement et ultrastructure de Glugea habrodesmi n. sp., Microsporidie parasite de Polydesmidae (Myriapoda, Diplopoda). Acta Trop. 33: 246-253.

207. Louis E.J. 1995. The chromosome ends of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 11:1553-1573.

208. Maercker C., Kortwig H. and Lipps H.J. 1999. Separation of micronuclear DNA of Stylonychia lemnae by pulsed-field electrophoresis and identification of a DNA molecule with a high copy number. Genome Res. 9: 654-661.

209. Malone L.A. and Mclvor C. 1993. Pulsed-field gel electrophoresis of DNA from four microsporidian isolates. J. Invertebr. Pathol. 61: 203-205.

210. Maniatis Т., Fritsch E.E. and Sambrook J. 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press.

211. Martin F. 1995. Meiotic instability of Pythium sylvaticum as demonstrated by inheritance of nuclear markers and karyotype analysis. Genetics. 139: 1233-1246.

212. Mathew M.K., Smith C.J. and Cantor C.R. 1988. High-resolution separation and accurate size determination in pulsed-field gel electrophoresis of DNA. 1. DNA size standarts and the effect of agarose and temperature. Biochemistry. 27: 9204-9210.

213. Matthews R.A. and Matthews B.F. 1980. Cell and tissue reactions of turbot Scophthalmus maximus (L.) to Tetramicra brevifilum gen. п., sp. n. (Microspora). J. Fish Dis. 3: 495-515.

214. Mayall B.M., Carrano A.V., Moore II D.H., Ashworth L.K., Bennett D.E. and Mendelsohn M.L. 1984. The DNA-based human karyotype. Cytometry. 5: 376-385.

215. McAinsh A.D., Tytell J.D. and Sorger P.K. 2003. Structure, function, and regulation of budding yeast kinetochores. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 19: 519-539.

216. Mclvor C.A. and Malone L.A. 1995. Nosema bombi, a microsporidian pathogen of the bumble bee Bombus terrestris (L.). N. Z. J. Zool. 22: 2531.

217. Melville S.E., Leech V., Gerrard C.S., Tait A. and Blackwell J.M. 1998. The molecular karyotype of the megabase chromosomes of Trypanosoma brucei and the assignment of chromosome markers. Mol. Biochem. Parasit. 94: 155-173.

218. Melville S.E., Gerrard C.S. and Blackwell J.M. 1999. Multiple causes of size variation in the diploid megabase chromosomes of African tyrpanosomes. Chromosome Res. 7:191-203.

219. Mercier L. 1909. Contribution a I'etude de la sexualite chez les Myxosporidies et chez les Microsporidies. Mem. Class. Sci. Acad. Roy. Belgique. 2:1-50.

220. Metenier G. and Vivares CP. 2001. Molecular characteristics and physiology of microsporidia. Microbes Infect. 3: 407-415.

221. Metenier G. and Vivares C.P. 2004. Genomics of microbial parasites: the microsporidial paradigm. In: Organelles, genomes and eukaryote phylogeny: An evolutionary synthesis in the age of genomics (R.P Hirt and D.S Horner, eds.). CRC Press, pp. 207-236.

222. Migheli Q., Berio T. and Gullino M.L. 1993. Electrophoretic karyotypes of Fusarium spp. Exp. Mycol. 17: 329-337.

223. Mills D. and McCluskey K. 1990. Electrophoretic karyotypes of fungi: the new cytology. Mol. Plant-Microbe Interact. 3: 351-357.

224. Mortimer R.K. and Schild D. 1980. The genetic map of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Rev. 44: 519-571.

225. Morzaria S.P. and Young J.R. 1992. Restriction mapping of the genome of the protozoan parasite Theileria parva. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 5241-5245.

226. MQIIer A., Trammer Т., Chioralia G., Seitz H. M., Diehl V. and Franzen C. 2000. Ribosomal RNA of Nosema algerae and phylogenetic relationship to other microsporidia. Parasitol. Res. 86:18-23.

227. Munderloh U.G., Kurtti T.J. and Ross S.E. 1990. Electrophoretic characterization of chromosomal DNA from two microsporidia. J. Invertebr, Pathol. 56: 243-248.

228. Murray A.W. and Szostak J.W. 1985. Chromosome segregation in mitosis and meiosis. Annu. Rev. Cell. Biol. 1: 289-315.

229. Nassonova E.S., Tokarev Y.S., Trammer Т., Entzeroth R. and Sokolova Y.Y. 2001. Phagocytosis of Nosema grylli (Microsporida, Nosematidae) spores in vivo and in vitro. J. Eukaryot. Microbiol. Suppl: 83S-84S.

230. Nassonova E. and Smirnov A. 2005. Synaptonemal complexes as evidence for meiosis in the life cycle of the monomorphic diplokaryotic microsporidium Paranosema grylli. Eur. J. Protistol. 41:175-181.

231. Naumov G.I., Naumova E.S. and Michels C.A. 1994. Genetic variation of the repeated MAL loci in natural populations of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. Genetics. 136: 803-812.

232. Naumov G.I., Naumova E.S. and Louis E.J. 1995. Genetic mapping of the alpha-galactosidase MEL gene family on right and left telomeres of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 11:481-483.

233. Naumov G.I., Naumova E.S., Sancho E.D. and Korhola MP. 1996. Polymeric SUC genes in natural populations of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Lett. 135: 31-35.

234. Ohshima K. 1973. On the autogamy of nuclei and the spore formation of Nosema bombycis Nageli. Annot. Zool. Jap. 46: 30-44.

235. O'Mahony E.M., Tay W.T. and Paxton R.J. 2007. Multiple rRNA variants in a single spore of the microsporidian Nosema bombi. J. Eukaryot. Microbiol. 54:103-109.

236. Orbach M.J., Vollrath D., Davis R.W. and Janofsky C. 1988. An electrophoretic karyotype of Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol. 8: 14691473.

237. Ord M.J. 1976. Chemical mutagenesis. In: The biology of amoeba (K.W. Jeon, ed.). Acad. Press, New York, pp. 349-369.

238. Ormteres R., Baudoin J., Brugerolle G. and Pralavorio R. 1976. Ultrastructure de quelques stades de la microsporidie Octosporea muscaedomesticae Flu, parasite de Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptere, Trypetidae). J. Protozool. 23: 320-328.

239. Ormieres R., Loubes C. and Maurand J. 1981. Amphiamblys bhatiella n. sp., microsporidie parasite de Bhatiella marphysae Setna, 1931, eugregarine d'annelide polychete. Protistologica. 17: 273-280.

240. Palladino F., Laroche Т., Gilson E., Axelrod A., Pillus L. and Gasser S.M. 1993. SIR3 and SIR4 proteins are required for the positioning and integrity of yeast telomeres. Cell. 75: 543-555.

241. Perez-Morga D., Amiguet-Vercher A., Vermijlen D. and Pays E. 2001. Organization of telomeres during the cell and life cycles of Trypanosoma brucei. J. Eukaryot. Microbiol. 48: 221-226.

242. Peterson J.B. and Ris H. 1976. Electron-microscopic study of the spindle and chromosome movement in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Cell. Sci. 22: 219-242.

243. Pinevitch A., Gromov В., Mamkaeva K. and Nasonova E. 1997. Study of molecular karyotypes in Amoeboaphelidium protococcarum, the endotrophic parasite of chlorophycean alga Scenedesmus. Curr. Microbiol. 34: 122-126.

244. Pologe L.G. and Ravetch J.V. 1988. Large deletions result from breakage and healing of Plasmodium falciparum chromosome. Cell. 55: 869-874.

245. Prensier G. and Slomianny Ch. 1986. The karyotype of Plasmodium falciparum determined by ultrastructural serial sectioning and 3D reconstruction. J. Parasitol. 72: 731-736.

246. Pryde F.E., Gorham H.C. and Louis E.J. 1997. Chromosome ends: all the same under their caps. Curr. Opin. Genet. Dev. 7: 822-828.

247. Raikov I.В. 1982. The protozoan nucleus. Morphology and evolution. Wien, New York: Springer Verlag. 474 p.

248. Raikov I.B. 1994. The diversity of forms of mitosis in Protozoa: a comparative review. Eur. J. Protistol. 30: 253-269.

249. Ravel C., Macari F., Bastien P., Pages M. and Blaineau C. 1995. Conservation among Old World Leishmania species of six physical linkage groups defined in Leishmania infantum small chromosomes. Mol. Biochem. Parasit. 69:1-8.

250. Ravetch J.V. 1989: Chromosomal polymorphism and gene expression in Plasmodium falciparum. Exp. Parasitol. 68:121-125.

251. Rautian M.S. and Potekhin A.A. 2002. Electrokaryotypes of macronuclei of several Paramecium species. J. Eukaryot. Microbiol. 49:296-304.

252. Rieder C.L. 1982. The formation, structure and composition of the mammalian kinetochore and kinetochore fiber. Int. Rev. Cytol. 79:1-57.

253. Rudenko G. 2000. The polymorphic telomeres of the African trypanosome Trypanosoma bmcei. Biochem. Soc. Trans. 28: 536-540.

254. Sacchi L., Bigliardi E., Lanzarini P., Corona S., Gatti S. and Scaglia M. 1997. Ultrastructural features of spindle microtubule organization during the nuclear division of Encephalitozoon hellem. J. Eukaryot. Microbiol. 44: 80S.

255. Sanger F., Coulson A.R., Hong G.F., Hill D.F. and Petersen G.B. 1982. Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J. Mol. Biol. 162: 729-773.

256. Santos M.R., Cano M.I., Schijman A., Lorenzi H., Vazquez M., Levin M.J., Ramirez J.L., Brandao A., Degrave W.M. and da Silveira J.F. 1997. The

257. Trypanosoma cruzi genome project: nuclear karyotype and gene mapping of clone CL Brener. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 92: 821-828.

258. Scherf A. and Mattei D. 1992. Cloning and characterization of chromosome breakpoints of Plasmodium falciparum: breakage and new telomere formation occurs frequently and randomly in subtelomeric genes. Nucleic Acids Res. 20:1491-1496.

259. Scherf A., Figueiredo L.M. and Freitas-Junior L.H. 2001. Plasmodium telomeres: a pathogen's perspective. Curr. Opin. Microbiol. 4: 409-414.

260. Schrock E., du Manoir S., Veldman Т., Schoell В., Wienberg J., Ferguson-Smith M.A., Ning Y., Ledbetter D.H., Bar-Am I., Soenksen D., Garini Y. and Ried T. 1996. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273: 494-497.

261. Schwartz D.C. and Cantor C.R. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell. 37: 67-75.

262. Selmecki A., Forche A. and Berman J. 2006. Aneuploidy and isochromosome formation in drug-resistant Candida albicans. Science. 313: 367-370.

263. Sibley L.D. and Boothroyd J.C. 1992. Construction of a molecular karyotype for Toxoplasma gondii. Mol. Biochem. Parasit. 51: 291-300.

264. Sheppard M., Thompson J.K., Anders R.F., Kemp D.J. and Lew A.M. 1989. Molecular karyotyping of the rodent malarias Plasmodium chabaudi, Plasmodium berghei and Plasmodium vinckei. Mol. Biochem. Parasit. 34: 45-52.

265. Sherman F., Lawrence C.W. and Fink G.R. 1974. Methods in yeast genetics. Cold Spring Harb. Lab., Cold Spring Harb., New York, 643pp.

266. Shirley M.W., Kemp D.J., Pallister J. and Prowse S.J. 1990. A molecular karyotype of Eimeria tenella as revealed by contour-clamped homogeneous electric field gel electrophoresis. Mol. Biochem. Parasit. 38: 169-173.

267. Slamovits C.H., Williams B.A. and Keeling P.J. 2004. Transfer of Nosema locustae (Microsporidia) to Antonospora locustae n. comb, based on molecular and ultrastructural data. J. Eukaryot. Microbiol. .51: 207-213.

268. Skinner D.2., Budde A.D. and Leong S.A. 1991. Molecular karyotype analysis in fungi. In: More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennett and L.L. Lasure, eds.). Acad. Press, San Diego, CA, pp. 86-102.

269. Smith C.L. and Condemine G. 1990. New approaches for physical mapping of small genomes. J. Bacteriol. 172:1167-1172.

270. Smith C.L., Matsumoto Т., Niwa O., Klco S., Fan J.В., Yanagida M. and Cantor C.R. 1987. An electrophoretic karyotype for Schizosaccharomycespombe by pulsed field gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 15: 44814489.

271. Sokolova J. and Entzeroth R. 1995. Immunological studies on Microsporidia: antigene properties of Nosema mesnili spores. Arch. Protistenkd. 145:100-105.

272. Sokolova J.Y., Dolgikh V.V., Weck-Heimann A. and Entzeroth R. 2000. Analysis of antibodies raised against soluble and membrane bound proteins of Nosema grylli (Microspora) spores. Цитология. 42: 993-1003.

273. Sokolova Yu., Snigirevskaya E., Morzhina E.f Skarlato S., Mironov A. and Komissarchik Ya. 2001. Visualization of early Golgi compartments at proliferate and sporogenic stages of a microsporidian Nosema grylli. J. Eukaryot. Microbiol. 48: 86S-87S.

274. Somova N.V. 2001. Electrophoretic karyotypes of some species of the genus Leptomonas (Kinetoplastida, Trypanosomatidae), homoxenous trypanosomatids parasites of insects. Цитология. 43: 815-821.

275. Sprague V. 1977. Systematics of the Microsporidia. In: Comparative Pathobiology (L.A. Bulla and T.C. Cheng, eds), Vol. 2. Plenum Press, New York, pp. 1-510.

276. Sprague V. 1978. Characterization and composition of the genus Nosema. Misc. Publ. Entomol. Soc. Amer. 11: 5-16.

277. Sprague V. and Vernick S.H. 1971. The ultrastructure of Encephalitozoon cuniculi (Microsporida, Nosematidae) and its taxonomic significance. J. Protozool. 18:560-569.

278. Sprague V. and Vernick S.H. 1974. Fine structure of the cyst and some sporulation stages of Ichtyosporidium (Microsporida). J. Protozool. 21: 667-677.

279. Sprague V., Becnel J.J. and Hazard E.I. 1992. Taxonomy of phylum Microspora. Crit. Rev. Microbiol. 18: 285-395.

280. Sprague V. and Becnel J.J. 1998. Note on the Name-Author-Date combination for the taxon Microsporidies Balbiani, 1882, when ranked as a phylum. J. Invertebr. Pathol. 71: 91-94.

281. Stempell W. 1909. Ober Nosema bombycis Nageli nebst Bemerkungen ijber Mikrophotographie mit gewohnlichem und ultraviolettem Licht. Arch. Protistenkd. 16:281-358 and plates 19-25.

282. Streett D.A. and Henry J.E. 1987. Ultrastructural investigation of the microsporidium Nosema cuneatum (Microspora: Nosematidae) in the grasshopper Melanopus sanguinipes (Orthoptera: Acrididae) with emphasis on mitosis. Eur. J. Protistol. 23:18-27.

283. Streett D.A. 1994. Analysis of Nosema locustae (Microsporida: Nosematidae) chromosomal DNA with pulsed-field gel electrophoresis. J. Invertebr. Pathol. 63: 301-303.

284. Sweeney A.W., Hazard E.I. and Graham M.F. 1985. Intermediate host for an Amblyospora sp. (Microspora) infecting the mosquito, Culex annuiirostris. J. Invertebr. Pathol. 46: 98-102.

285. Sym M., Engebrecht J.A. and Roeder G.S. 1993. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72: 365378.

286. Taga M. and Murata M. 1994. Visualization of mitotic chromosomes in filamentous fungi by fluorescence staining and fluorescence in situ hybridization. Chromosoma. 103: 408-413.

287. Takahara M., Takahashi H., Matsunaga S., Sakai A., Kawano S. and Kuroiwa T. 2000. Isolation, characterization, and chromosomal mapping of an ftsl gene from the unicellular primitive red alga Cyanidium caldarium RK-1. Curr. Genet. 37: 143-151.

288. Taylor J.E. and Rudenko G. 2006. Switching trypanosome coats: what's in the wardrobe? Trends Genet. 22: 614-620.

289. Taylor J.L., Borgmann I. and Seguin-Swartz G. 1991. Electrophoretic karyotyping of Leptosphaeria maculans differentiates highly virulent from weakly virulent isolates. Curr. Genet. 19: 273-277.

290. Taylor J.W., Geiser D.M., Burt A. and Koufopanou V. 1999: The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing. Clin. Microbiol. Rev. 12:126-146.

291. Toguebaye B.S. and Marchand B. 1983. Developpement d'une microsporidie du genre Unikaryon Canning, Lai et Lie, 1974 chez un

292. Coleotere Chrysomelidae, Euryope rubra (Latreille, 1807): etude ultrastructurale. Protistologica. 19: 371-383.

293. Toguebaye B.S. and Marchand B. 1985. Pathogenie, cycle de developpement et ultrastructure d'Amblyospora culicis n.sp. (Protozoa, Microspora), parasite du moustique Culex quinquefasciatus Say, 1823 (Diptera, Culicidae). Can. J. loot. 63:1797-1809.

294. Tokarev Y.S., Sokolova Y.Y. and Entzeroth R. 2007. Melanization enhances teratospore formation in microsporidia-infected tissues of Locusta migratoria and Gryllus bimaculatus (Insecta, Orthoptera). J. Invertebr. Pathol. 94: 70-73.

295. Umesono K., Hiraoka Y., Toda T. and Yanagida M. 1983. Visualization of chromosomes in mitotically arrested cells of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Curr. Genet. 7:123-128.

296. Vavra J. 1965. ЁЫе au microscope electronique de la morphologie et du developpement de quelques Microsporidies. C. R. Acad. Sc. Paris, Serie D. 261: 3467-3470.

297. Vavra J. 1976a. Structure of the Microsporidia. In: Comparative Pathobiology: Vol. 1. Biology of the Microsporidia (L.A. Bulla and T.C. Cheng, eds.). New York, Plenum Press, pp. 1-86.

298. Vavra J. 1976b. Development of the Microsporidia. In: Comparative Pathobiology: Vol. 1. Biology of the Microsporidia (L.A. Bulla and T.C. Cheng, eds.). New York, Plenum Press, pp. 86-109.

299. Vavra J. 1977. The microsporidian mitotic apparatus. J. Protozool. 24: 17A.

300. Vavra J. and Undeen A.H. 1970. Nosema algerae n. sp. (Cnidospora, Microsporida), a pathogen in a laboratory colony of Anopheles stephensi Liston (Diptera, Culicidae). J. Protozool. 17: 240-249.

301. Vavra J. and Larsson J.I.R. 1999. Structure of the Microsporidia. In: The Microsporidia and Microsporidiosis (M. Wittner M. and L.M. Weiss, eds.). ASM Press, Washington DC, pp. 7-84.

302. Van de Peer Y., Ben Ali A. and Meyer A. 2000. Microsporidia: accumulating molecular evidence that a group of amitochondriate and suspectedly primitive eukaryotes are just curious fungi. Gene. 246: 1-8.

303. Van der Ploeg L.H.T., Schwartz D.C., Cantor C.R. and Borst P. 1984. Antigenic variation in Trypanosoma brucei analyzed by electrophoretic separation of chromosome sized DNA molecules. Cell. 37: 77-84.

304. Van der Ploeg L.H., Smits M., Ponnudurai Т., Vermeulen A., Meuwissen J.H. and Langsley G. 1985. Chromosome-sized DNA molecules of Plasmodium falciparum. Science. 229: 658-661.

305. Van Dijk M.R., McConkey G.A., Vinkenoog R., Waters A.P. and Janse C.J. 1994. Mechanisms of pyrimethamine resistance in two different strains of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasit. 68:167-171.

306. Viaud M., Couteaudlier Y., Levis C. and Riba G. 1996. Genome organization in Beauveria bassiana: electrophoretic karyotype, gene mapping and telomeric fingerprint. Fungal Genet. Biol. 20:175-183.

307. Vilhar В., Greilhuber J., Dolenc Косе J., Temsch E.M. and Dermastia M. 2001. Plant genome size measurement with DNA image cytometry. Ann. Botan. 87: 719-728.

308. Vivares C.P. and Metenier G. 2000. Towards the minimal eukaryotic parasitic genome. Curr. Opin. Microbiol. 3:463-467.

309. Vivares C.P. and Sprague V. 1979. The fine structure of Ameson pulvis (Microspore, Microsporida) and its implication regarding classification and chromosome cycle. J. Invertebr. Pathol. 33: 40-52.

310. Vivares C.P., Biderre C., Duffieux F., Peyreyaillade E., Peyret P., Metenier G. and Pages M. 1996. Chromosomal localisation of five genes in Encephalitozoon cuniculi (Microsporidia). J. Eukaryot. Microbiol. 43: 97S.

311. Vivares C.P. and Metenier G. 2000. Towards the minimal eukaryotic parasitic genome. Curr. Opin. Microbiol. 3: 463-467.

312. Vivares C.P., Gouy M., Thomarat F. and Metenier G. 2002. Functional and evolutionary analysis of a eukaryotic parasitic genome. Curr. Opin. Microbiol. 5: 499-505.

313. Vivier E. 1965. Presence de microtubules intranucleaires chez Metchnikovella hovasseiVivier. J. Microscop. 4: 559-562.

314. Vollrath D. and Davis R.W. 1987. Resolution of DNA molecules greater than 5 megabases by contour-clamped homogeneous electric fields. Nucleic Acids Res. 15: 7865-7876.

315. Vossbrinck C.R. and Debrunner-Vossbrinck B.A. 2005. Molecular phylogeny of the Microsporidia: ecological, ultrastructural and taxonomic considerations. Folia Parasit. 52:131-142.

316. Wada M. and Nakamura Y. 1996. Unique telomeric expression site of major-surface-glycoprotein genes of Pneumocystis carinii. DNA Res. 3: 55-64.

317. Walker M.H. and Hinsch G.W. 1972. Ultrastructural observations of a microsporidian protozoan parasite in Libinia dubi (Decapoda). I. Early spore development. Z. Parasitenkd. 39:17-26.

318. Walliker D„ Quakyi I.A., Wellems Т.Е., McCutchan T.F., Szarfman A., London W.T., Corcoran L.M., Burkot T.R. and Carter R. 1987. Genetic analysis of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 236:1661-1666.

319. Welch D.M. and Meselson M. 2000. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288: 1211-1215.

320. Welch D.B. and Meselson M.S. 2001. Rates of nucleotide substitution in sexual and anciently asexual rotifers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 6720-6724.

321. Weiss L.M. 2001. Microsporidia: emerging pathogenic protists. Acta Trop. 78: 89-102.

322. Weiss L.M., Zhu X., Cali A„ Tanowitz H.B. and Wittner M. 1994. Utility of microsporidian rRNA in diagnosis and phylogeny: a review. Folia Parasit. 41:81-90.

323. Weiss L.M. and Vossbrink C.R. 1999. Molecular biology, molecular phylogeny and molecular diagnostic approaches to the Microsporidia. In: The Microsporidia and Microsporidiosis (Wittner M. and Weiss L.M., eds) ASM Press, Washington DC, pp. 129-171.

324. Westermann S., Cheeseman I.M., Anderson S., Yates J.R. 3rd, Drubin D.G. and Barnes G. 2003. Architecture of the budding yeast kinetochore reveals a conserved molecular core. J. Cell Biol. 163: 215-222.

325. Willhoeft U. and Tannich E. 1999. The electrophoretic karyotype of Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasit. 99: 41-53.

326. Williamson D.H. 1991. Nucleus, chromosomes and plasmids. In: The Yeasts, Vol. 4: Yeasts organelles (eds A.H. Rose and J.S. Harison). Acad. Press, London, pp. 433-482.

327. Wincker P., Ravel C., Blaineau C., Pages M., Jauffret Y., Dedet J.P. and Bastien P. 1996. The Leishmania genome comprises 36 chromosomes conserved across widely divergent human pathogenic species. Nucleic Acids Res. 24:1688-1694.

328. Youssef N.N. and Hammond D.M. 1971. The fine structure of the developmental stages of the microsporidian Nosema apis Zander. Tissue Cell 3: 283-294.

329. Yuh Y.S., Liu J.Y. and Shaio M.F. 1997. Chromosome number of Trichomonas vaginalis. J. Parasitol. 83: 551-553.

330. Xu J., Pan G., Fang L., Li J., Tian X., Li Т., Zhou Z. and Xiang Z. 2006. The varying microsporidian genome: existence of long-terminal repeat retrotransposon in domesticated silkworm parasite Nosema bombycis. Int. J. Parasitol. 36:1049-1056.

331. Zolan M.E. 1995. Chromosome-length polymorphism in fungi. Microbiol. Rev. 59: 686-698.1. БЛАГОДАРНОСТИ

332. Спасибо Сергею Удалову (ВИЗР РАСХН) за оказанную много лет назад помощь при освоении программ сканирования и обработки изображений. Я весьма признательна Галине Борисовне Белостоцкой (ИЭФиБ РАН) за демонстрацию возможностей программ анализа изображений.

333. Спасибо также всем моим друзьям и коллегам из ВИЗР РАСХН и ИНЦ РАН и, в частности, Александру Берестецкому, Михаилу Григорьеву, Александру Самошкину, Надежде Свежовой и Петру Семенову за оптимистический настрой и помощь во всех проблемных ситуациях.

Информация о работе

Насонова, Елена Станиславовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Хромосомный набор и размер генома у микроспоридии Paranosema grylli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы