Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение свойства изоформ УДФ-D-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-D-глюкозопирофосфорилазы из Pisum sativum и Galdieria sulphuraria

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение свойства изоформ УДФ-D-галактозо-4-эпимеразы и УДФ-D-глюкозопирофосфорилазы из Pisum sativum и Galdieria sulphuraria"

РГ 5 ОД

2 1 ДЁК 1398 На правах рукописи

Просёлков Павел Владимирович

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ИЗОФОРМ УДФ-Б-ГАЛАКТОЗО-4-ЭПИМЕРАЗЫ И УДФ-В-ГЛЮКОЗОПИРОФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ PISUM SATIVUM И GALDIERIA SULPHURARIA

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Воронеж -1998

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Воронежского государственного университета

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Игамбердиев А. У.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ершова А. Н.; кандидат биологических наук, Маслов А. Ю.

Ведущая организация - институт физиологии РАН им. К. А. Тимирязева,

г. Москва

Защита состоится года в часов на заседании

диссертационного совета Д 063.48.11 при Воронежском государственном университете по адресу: 394693 Воронеж, Университетская пл. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан 1998 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

доцент — - Ковалёва Т. А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. От 20 до 30 различных моносахаридов и до 17 сахарных спиртов присутствует в различных количествах в растениях (Lewis, D.,1984). Метаболизм этих соединений детально изучен только для глюкозы и фруктозы. Главная причина ограниченности знаний об участии Сахаров в метаболизме, транспорте, хранении и осмотическом контроле - низкая активность вовлечённых в данные процессы ферментов. У высших растений их активность может быть определена только на определённых стадиях развития или в специальных тканях. Так, например, до сих пор отсутствует целостная картина относительно метаболизма такого важного для клетки углевода как галактоза. Существует также и проблема галактоз ной токсичности, которая более или менее решена для животных, человека и микроорганизмов (Berry G. и др., 1995; SzczypkaM., 1996; Landt M. и др., 1997; G reber-Platzer S. и др., 1997 и мн. др.), однако, для высших растений её причина остаётся невыясненной уже на протяжении восьмидесяти лет (Knudson L., 1917; White P., 1940; Reinholz P., 1954; Farkas G., 1954; Ferguson J. и др., 1958; Maretzki A. nd Thorn А., 1978; Dressler К. и др., 1982; Frick Н„ 1991; Frick H. and Morley К., 1995 и мн. др.). Из всех ферментов, принимающих непосредственное участие в метаболизме галактозы, особая, ключевая роль принадлежит двум: УДФ-0-галактозо-4-эпимеразе и УДФ-О-глюкозопирофосфорилазе. Продукты этих ферментов являются составляющими многочисленных клеточных компонентов: целлюлозы (Wright В. and Anderson M., 1959; Zetsche К., 1968), клеточных полисахаридов как у высших растении (Feingold D. и др., 1958; Goldemberg and Maréchal, 1963; Павлинова и Прасолова, 1970), так и у микроорганизмов (Fukasawa и др., 1962; Lieberman и др., 1970), трегалозы (Roth R. and Sussman M., 1968), гликозидов (Franz G. and Meier H., 1969), гликолипидов (Curtino J. и др., 1968), гепарина (Danishefsky I. and Heritier-Watkins O., 1957), бактериальных антигенов (Bernstein R. and Robbins P., 1965), лактозы (Steelman V. and Ebner К., 1966), глюкоронидов (Shikamura M. and Tsuboi К., 1961 ; Roberts R. and Rao K.,1971), рамнозы (Sundararajan Т. и др., 1962; Barber G., 1971), рафинозы и стахиозы (Hasegawa M. и др., 1951; Shiroya T., 1963), D- и L-галактанов (Aspinall G., 1970; Morvan С. и др., 1989; Goubet F. и др., 1993; Goubet F. and Morvan C., 1994). Получив достоверные сведения относительно свойств эпимеразы и пирофосфорилазы, представляется возможным не только выяснить регуляторные механизмы галактозного метаболизма клетки, но и, возможно, найти ответ на вопрос о причине токсичности галактозы для высших растений. Воспроизведение полной картины данного процесса позволило бы раскрыть ещё один слабо изученный аспект всего многообразия процессов, происходящих в живой клетке.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучени свойств ферментов, занимающих ключевые позиции в галахтозно? метаболизме клетки, УДФ-0-галактозо-4-эгшмеразы и УДФ-Б-глюкозс пирофосфорилазы, исследование их физико-химических и каталитически характеристик. С целью выяснения причин токсичности галактозы для высши растений предполагалось осуществить сравнение эпимеразы пирофосфорилазы из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентног объектов и предположить возможный механизм, объясняющий токсичность.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Очистить, охарактеризовать и сравнить УДФ-0-галактозо-4-эпимера: из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентного объектов.

2. Очистить, охарактеризовать и сравнить УДФ-О-глюкозопирофосфс рилазу из галактозо-чувствительного и галактозо-резистентного объектов.

3. Исследовать в гомогенате активность основных ферменте галактозного метаболизма у нечувствительного к галактозе растения.

4. Исследовать в гомогенате активность основных ферменте галактозного метаболизма у чувствительного к галактозе растения.

5. Изучить транспорт галактозы в клетки корня гороха, подверженном влиянию галактозы. Затруднение транспорта галактозы может быть одной I причин токсичности.

6. Представить гипотетическую модель молекулярных механизма лежащих в основе токсического действия галактозы на высшие растения. Научная новизна работы. Проведённые исследования расширяю представления о свойствах ферментов галактозного метаболизма клетки позволяют сделать предположение относительно возможной причин токсичности галактозы для высших растений.

Впервые у термоацидофильной красной водоросли СаШепа зи1р!шгаг обнаружено наличие двух изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, которь отличаются как по своим свойствам, так и по стабильности. Активация в хо,1 очистки одной из изоформ предполагает увеличение её роли в метаболиз\ поступающей извне галактозы.

В проростках гороха УДФ-0-галактозо-4-эгшмераза также представле в виде двух изоформ. Обе подвергаются субстратному ингибированию УДО О-галактозой.

Недостаток знаний относительно свойств растительной УДФ-1 глюкозопирофосфорилазы был восполнен характеристикой и получение гомогенного препарата фермента из красной водоросли, а также выделение двух его изоформ из гороха. Способность пирофосфорилаз метаболизировать галактозо-1-Ф указывает на её существенную роль во всё галактозном' метаболизме, однако, это лее свойство является одним ]

ведущих аспектов галактозной токсичности. Данное наблюдение подтверждает предположение об отсутствии у растений УДФ-О-галактозопирофосфорилазы, которой ранее приписывалась одна из ведущих ролей в метаболизме галактозо-1-Ф и функционировании альтернативного пути Isselbacher. Данный фермент у растений отсутствует, что вполне объясняет невозможность его выделения и получения какой-либо чёткой характеристики, а его функция опосредуется неспецифической активностью УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы, роль которой значительно возрастает при увеличении потока экзогенной галактозы.

Из всех девяти ферментов галактозного пути только для УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы обнаружена индукция в два с лишним раза при выращивании красной термоацидофильной водоросли G. sulphuraria на среде с галактозой, что свидетельствует о непосредственном вовлечении данного фермента в метаболизм избытка галактозы. Остальные ферменты, в том числе и из проростков разного возраста P. sativum, не показали заметного изменения своей активности. Никем ранее все ферменты галактозного метаболизма в комплексе не рассматривались.

Впервые экспериментально показано, что скорость транспорта и последующего метаболизма галактозы при её проникновении внутрь клеток корней гороха очень высока и сопоставима со скоростью потребления клеткой глюкозы и фруктозы.

Обнаружена причина токсичности галактозы для высших растений. Ею является субстратное ингибирование УДФ-О-галактозо-4-эпимеразы, которое приводит к накоплению УДФ-О-галактозы и последующему вовлечению в метаболизм УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы. Данное субстратное ингибирование обнаружено только для эпимеразы из проростков гороха, для которых галактоза токсична, но оно отсутствует у G. sulphuraria, для которой галактоза не является ингибитором роста.

Впервые предлагается обобщающая гипотетическая модель молекулярных механизмов, лежащих в основе токсического действия галактозы на растения.

Практическая значимость исследования. Сведения, полученные в ходе выполнения данной работы имеют как фундаментально-теоретическую, так и непосредственную практическую ценность.

Разработанная схема очистки и получения электрофоретически гомогенного препарата УДФ-О-галактозо-4-эпнмеразы может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Высокая термостабильность эпимеразы делает перспективным её применение в лабораторных тестах на содержание в крови УДФ-О-галактозы в клинической диагностике при галактоземии.

Метаболизм галактозы самым тесным образом связан с процессом формирования галактанов растениями, так как субстратами для их синтеза являются галактозо-производные. Применение же галактанов в народном хозяйстве распространяется от их использования в качестве заменителей сахара для больных диабетом до очистителей нефти от кислых загрязнителей.

В сельском хозяйстве морские водоросли широко используются в качестве удобрений и стимуляторов роста. Чаще всего это бурые'водоросли, но могут быть и зелёные, и красные. Полисахаридами бурых водорослей являются альгинаты, а красных - галактаны, которые подвергаются в почве действию гидролитических ферментов, экскретируемых бактериями, (Pseudomonas carrageenovora). Освобождаемая при этом галактоза влияет на рост корней большинства высших растений, поэтому, на основании данной работы, рекомендуется проводить предварительный тест на устойчивость УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы к избытку УДФ-О-галактозы у культивируемых объектов во избежание токсикоза галактозой и последующей гибели растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на конференции Progress in Plant Sciences (Masonmagyarovar, Hungary, 1996). Результаты были сообщены в виде четырёх докладов на Progress-seminar (Freie Universitaet, Berlin, 1995-1998). Они также являются материалами конференций американского общества физиологов растений (Vancouver, Canada, 1997), NATO ARW (Kolymbari, Crete, 1998) и европейского фитохимического общества Bioactive Plant Carbohydrates (Sandoya, Norway, 1998). Данная работа в сентябре 1998 года удостоена премии европейского фитохимического общества.

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья и 5 тезисов, подготовлены к печати 3 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает 13 глав; 122 страниц; 27 рисунков; 10 таблиц и 5 фотографий. Использовано 272 литературных источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований. В качестве объектов исследований были выбраны красная термоацидофильная водоросль Galdieria sulphuraria (Galdieri) Merola, растущая на галактозе в качестве источника углерода, и проростки гороха 1 Pisum sativum L. cv. Kleine Rheinlaenderin, для которых галактоза токсична. ;' " ' Определение активности ферментов. Активность ферментов определяли при комнатной температуре на спектрофотометрах Uvikon 930 (Kontron Instruments, Gosheim, Germany) или 1101M mit Schreiber (Eppendorf, Hamburg,

Germany). Единица ферментативной активности (ФЕ) соответствовала превращению 1 микромоля субстрата в 1 минуту в 1 мл среды измерения. • Получение гомогената. Все этапы очистки ферментов осуществляли при температуре от 0 до 4°С. От 10 до 20 грамм G. sulphuraria разрушали в гомогенизаторе (Bead Beater, Biospec Products, Bartesville, OK, USA) со стеклянными шариками в присутствии 50 мл среды выделения, состоящей из 20 мМ Трис/HCl pH 8.5, 1 мМ DTT, 0.5 мг/мл пепстатина, 0.7 мг/мл леупептина, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ EDTA и 0.5 мМ PMSF. Гомогенизацию продолжали в течение 7 мин с перерывами по 20 секунд для эффективного охлаждения в ледяной бане. 60-70 грамм проростков Р. sativum гомогенизировали в блендоре (Warring Blender, Germany) с высокой скоростью в присутствие 200 мл среды выделения, как и в случае с G. sulphuraria, за исключением того, что был добавлен 0.02 мМ МВТ. Гомогенизация осуществляли в течение 1 минуты в два цикла по 30 секунд с 20 мин паузой для ледяной бани. Образуемую суспензию центрифугировали в течение 60 мин при 37,000 g на центрифуге Centricon Н-401 mit Festwinkelrotor: А8.24 (Kontron Hermle, Gosheim, Germany) или Sorwall RC-5B mit Festwinkelrotor: SS 34 (Du Ponts Instruments, Bad Nauheim, Germany).

Ионообменная хроматография на DEAE-фрактогеле. После центрифугирования супернатант разбавляли буфером до примерно 150 мл и помещали на колонку с DEAE-фрактогелем с адаптором (22 см * 25 мм; BioRad, Muenchen, Germany), уравновешенную 10 мМ Трис/HCl pH 8.5, 1 мМ MgCI2, 0.5 мМ EDTA, 0.5 мМ DTT. После промывки 50 мл колоночного буфера белки элюировали линейным градиентом 2 * 100 мл 0-500 мМ KCl в исходном буфере. Отбор фракций осуществляли коллектором Modell 2110 (BioRad, Muenchen, Germany). Концентрацию KCl контролировали кондуктометром (CG 855 mit Leitfaehigkeitsmesszelle, Schott, Mainz, Germany), фактор пересчёта 6.93. Адсорбционная хроматография на гидроксилапатите. Фракции, содержащие активность исследуемых ферментов, подвергали хроматографии на колонке с гидроксилапатитом и адаптором (16 см * 15 мм; BioRad, Manchen, Germany), уравновешенной тем же буфером, что и для DEAE-фрактогеля, но без EDTA. После промывки 30 мл колоночного буфера белки элюировали линейным градиентом 2 * 50 мл 0-500 мМ фосфатного буфера. При кондуктометрии фосфатов использовали фактор пересчёта 5.25. Гидрофобная хроматография. Для проведения гидрофобной хроматографии применяли колонки Butyl HIC и Phenyl HS-Sepharose (HiTrap HTC Test Kit, Pharmacia Freiburg, Germany) и использовали систему LPLC. Образец ферментативного препарата разводили в соотношении 1:1 с 1 M (NHO2SO4 и помещали на колонку, предварительно уравновешенную следующим буфером: 50 мМ MOPS pH 7.0, 30% насыщения (m4)2S04, 1 мМ MgCl2, 0.5 мМ DTT.

Элюция белков происходила за счёт создания обратного линейного градиента 30 - 0% (NH4)2S04 в исходном буфере.

Аффинная хроматография. Использовали колонки Dyematrex Orange А, Dyematrex Green (8 * 0.5 см, Amicon, Lexington, MA, USA). Матрикс колонок промывали 30 мМ Трис/НС1 pH 8.0, 1 мМ MgCl2 и 0.5 мМ DTT. Ферменть элюировали ступенчатым градиентом 1.5 M NaCl в исходном буфере, 3£ исключением одной из изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, котора? проходила сквозь колонку Dyematrex Green без взаимодействия с ее матриксом.

Гель-фильтрация. Молекулярный вес ферментов определяли посредством гель-фильтрации (система LPLC) на колонке Superdex-200 HiLoad (16 * 60( мм, Pharmacia, Uppsala, Sweden). Колонку уравновешивали 10 мМ Трис/НС1 pH 7.5, содержащим 1 мМ MgCl2 и 0.25 мМ NaCl. Скорость потока составляла : мл/мин. В качестве маркерных ферментов использовали карбоангидразу (29 кДа), пероксидазу (40 кДа), БСА (66 и 132 кДа), малатдегндрогеназу (70 кДа), каталазу (240 кДа), ферритнн (440 кДа) и ß-галактозидазу (540 кДа). Жидкостная хроматография низкого давления (LPLC). Данный метох использовали как для очистки белков, так и для определения и> молекулярного веса. Схема конструкции прибора (Pharmacia, Freiburg Germany): коллектор фракций GradiFrac, насос Р-50, Control Unit UV-1, Optica Unit UV-1, 2-х канальный самописец Ree 102. Все пробы перед, тем как бып помещёнными на колонки, были профильтрованы через бактериальньп фильтр при помощи шприца.

Определение К», и исследование термостабилыюстн УДФ-Р-галак тозо-4-эпимеразы. Для расчёта Keq УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы фер мент инкубировали на протяжении всей ночи при комнатной температуре < определённым количеством УДФ-О-глюкозы. После чего эпимераза был; инактивирована нагреванием на водяной бане в течение 30 мин при 90°С

Количество УДФ-О-глюкозы определяли добавлением УДФ-О-глюкозоде гидрогеназы и NAD. УДФ-О-галактозу измеряли при тех же условиях, з< исключением того, что УДФ-0~галактозо-4-эпимераза была включена i раствор. Термостабильпость фермента исследовали ннкубированем при 46, 5( и 54 °С в водяной бане при различных временных интервалах и измерением активности при 22 °С. Влияние температуры на ферментативную активностг изучали в диапазоне 24 и 35 °С температурно-коитролируемой кюветы. Энергия активации эпимеразы рассчитывали по Gutfreund H. (1972). Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Относительна* молекулярная масса УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы была рассчитана m скорости седиментации в градиенте плотности сахарозы (Martin R. and Ames В. 1961). Шесть' линейных градиентов (9 мл общего объёма каждый) от 5 до 179?

зыли приготовлены при помощи градиентата, капилляра и небольшого сомпрессора в 10 мМ натрий фосфатном буфере pH 7.5, содержащем 0.5 мМ DTT и 0.5 мМ EDTA. На данные градиенты были нанесены по 0.1 мл двух маркерных белков или эпимеразы на градиент. Градиенты центрифугировали в течение 20 часов при 210,000 g на ультрацентрифуге (Du Ponts Instruments, Bad Nauheim, Sorwall Combi Plus mit Ausschwingrotor Beckman SW 41 Ti, Germany). Электрофорез на пластинках. Для определения молекулярной массы фермента, выяснения его субъединичного состава и доказательства гомогенности ферментативного препарата осуществляли SDS- и гель-электрофорезы на пластинках (Laemmli U., 1970). Белки на геле окрашивали либо серебром (Blum H. и др. 1987), либо бриллиантовым Coomassie R-250. Жидкостная хроматография высокой разрешающей способности (HPLC). Данный высокоэффективный метод хроматографии использовали с целью изучения транспорта галактозы в клетки корня гороха. Схема конструкции прибора: Knauer HPLC pump 64 (Typ 364,000, Knauer, Berlin, Germany), Injektor Model 7725 (Rheodyne Incorporates, USA), Soeulenofen (Knauer, Berlin, Germany), дифференциальный рефрактометр (Laboratomi Pristroje, Prague, Czech Republic), интегратор (Hewlett Packard, Bad Homburg, Germany). Использовали HPLC-колонку BC-100 (7.8 * 300 мм, Benson Co., Reno, USA).

Определение концентрации белка. Белок определяли методом окрашивания Coomassie G-250 (Bradford M., 1976) или по Warburg О. and Christian W. (1941) на заключительных этапах очистки.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Все эксперименты в данной работе проводили не менее 4-5 раз, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трёх повторностях. В таблицах и рисунках приведены данные типичного эксперимента. Обсуждению подвергаются только воспроизводимые данные. Отличия в контрольных и опытных сериях анализировали традиционными способами с использованием t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку результатов осуществляли на компьютере Macintosh Classic с помощью прикладных программ Cricket Graph.

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ GALDIERIA

SULPHURARIA НА СРЕДЕ С РАЗЛИЧНЫМИ УГЛЕВОДАМИ

По уровню возрастания активности в гомогенате G. sulphuraria при выращивании данной водоросли на среде с глюкозой, галактозой и машштолом ферменты распределились следующим образом: галактокиназа, фосфо-маннозоизомераза, фосфоманнозомутаза, галактозо-1-Ф-уридилтрансфераза, УДФ-0-галактозо-4-эпимераза, глюкозо-6-Ф-дегидрогеназа, УДФ-Б-глюкозо-пирофосфорилаза, фосфоглюкомутаза, фосфоглюкозоизомераза (Рис. 1). Только у двух ферментов: у УДФ-0-глюкозопирофосфорилазы и фосфо-

1 о

28 24 20

е 16

5 12

26.30'

глюкоза

I

I

1

0.19 «2

1

28 24 20 16 12 8 4 0 28 24 20 16 12 8 4 О

. галактоза

Й

08 2

I

21

26.90

1

- 27. 20 Т

машштол 1

16.00

П.33 1 1

1.67 143 3.00 I 1.33 1,61 1

- Галактокиназа

. - Галактозо-1-Ф-уридил-

трансфераза 1 - УДФ-ЕКгалактозо-4-эпимераза

— УДФ—Е>-глк>козопнро-фосфорнлаза

- Фосфоглюкомутаза

•.' - Фосфоглкжозоизомераза . - Фосфоманнозонзомераза

- Фосфоманнозомутаза

- Глюкозо-6-Ф-дегилро-

• геназа . I - Белок (мг/(г с м;)

1234557 3? 10 Рис, 1. Активность ферментов галактозного метаболизма у СаШепа ¿ЫрИи-гапа культивируемой на среде с глюкозой, галактозой и маннитолом.

манномутазы активность увеличивалась в два раза при использовании галактозы и маннитола в качестве источника углерода. Активность остальных ферментов на различных средах оставалась без изменении, что свидетельствует об отсутствии каких-либо регуляторных эффектов глюкозы, галактозы и маннитола на активность ферментов галактозного метаболизма, за исключением вышеупомянутых.

ОЧИСТКА И СВОЙСТВА УДФ-0-ГАЛАКТОЗО-4-Э1ШМЕРАЗЫ ИЗ GALDIERIA SULPHURARIA

В ходе очистки фермента обнаружено наличие двух изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, которые были охарактеризованы и очищены до гомогенного состояния и условно названы как стабильная и нестабильная изоформы.

Выделение стабильной нзоформы. Данная изоформа была очищена в 350-раз с суммарным выходом 38% хроматографией на DEAE-фрактогеле, гидроксилапатите и аффинном геле Dyematrex Orange А. Достигнутая удельная активность составила 42 ФЕ/мг белка (Таблица 1).

Таблица 1.

Очистка УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из Galdieria sulphuraria.

Этап Объём Активность Белок Удельная Очистка Выход,

очистки (мл) (ФЕ) (мг) активность -раз %

(ФЕ/мг белка)

Гомогенат 126 18.5 176 0.12 1 100

DEAE-фрактогель 37 15.9 20 0.8 7 86

гидроксилапатит 17.5 11.7 5 2.4 22 63

Dyematrex Orange А j 7.1 0.17 42 350 38

Электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие только одной полосы с молекулярным весом белка в 42 кДа, что свидетельствует о гомогенности полученного препарата (Рис. 2). Гель-фильтрация и центрифугирование в градиенте плотности сахарозы дали значения в 83 и 76 кДа, соответственно (Рис. 3). Константа Сведберга равнялась 5.0 S. На основании полученных в ходе выполнения работы данных, была предположена гомодимерная структура белка. Активность УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из G. sulphuraria чрезвычайно стабильна. Даже после хранения в течение 6 месяцев при -20 °С в 50 % глицероле или инкубации при 46°С в течение

нескольких часов очищенный фермент не терял своей активности. Частично очищенные препараты были более лабильны, но они могли быть стабилизированы добавлением 50 % глицерола. Ранее в литературе сообщалось (Fan D. and Feingold D„ 1969; Dey P., 1984), что УДФ-0-галактозо-4-эпиме-

раза нз ткани млекопитающих и высших растений нуждается в NAD дл) активности и сильно ингчбируется NADH._

[kDa] М ЕР1 205 Н ^—

116 -__

97.4"

66 - урящ

29 -

Рис. 2. SDS-электрофорез УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из Galdieria sulphuraria после очистки. М = маркерные белки; EPI = УДФ-0-галактозо-4-эпимераза.

Попытки стабилизировать фермент из G. sulphuraria инкубацией с 1 мМ N AI

не дали положительного результата, однако, преннкубация фермента с данные

кофактором перед этапом очистки на гидроксилапатите значительно снизил

потери активности фермента на колонке. В целом, без предварительног

инкубирования с 1 мМ NAD очистка не имела успеха: фермент слаб

прикреплялся к гидрокснлапатиту и вымывался градиентом уже в самы:

начальных фракциях (Таблица 2). В обычном случае пик активности был боле

смещён к концу (Рис. 4). По всей видимости, в ходе очистки на колонке DEA1

происходило либо нарушение структуры активного центра, либо дестаби

лизация фермента. К сожалению, установить истинную роль NAD так и и

удалось, хотя тот факт, что он не является кофактором для данной эпимеразх

из G. sulphuraria, очевиден. Следует ещё раз подчеркнуть, что ни NAD, н

NADH влияния на активность не показали.

Таблица 2.

Очистка стабильной изоформы УДФ-0-галактозо-4-эгшмеразы из Galdieria ■ sulphuraria без предварительного инкубирования с 1 мМ NAD.

Этап Объём Активность Белок Удельная Очистка Выход,

очистки (мл) (ФЕ) (мг) активность -раз %

(ФЕ/мг белка)

Гомогенат 104 15.2 145 0.11 1 100

DEAE-фрактогель 36 13.0 17 0.8 7.3 86

гидроксилапатит 40 2.6 5 0.5 ' 4.5 17

Катал аз^Х)

УДФ-О-галактозо*

. 4-эттимераза (S = 5) ' /

у Фосфоглюкозо-

изомераза q < * Альдолаза

Aj J* Глюкозо-6-Ф-

Малатдегил- д/ дегидрогеназа

рогеназа ЪСЬ.

Уо

/Пероксиааза 1 , i . 1

0 1 2 3 4 5 6

Вершина Дно

Величина миграции (см) Рис. 3. Определение молекулярной массы УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы.

600

ю 5- 400

200

40 60

Номер фракции

600

-»О

80

£

s

о. 4

400

200

Рис. 4. Активность УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы (наномоль ■ мин '-'мл ) в градиенте гидрокснлапатита без и после преинкубирования с 1 мМ NAD.

В процессе харатеристики фермента была также отвергнута гипотеза о влиянии галактозы и её производных (галактозо-1-Ф и галактозо-6-Ф) на активность эпимеразы. Ни активации, ни ингибирования данные компоненты не вызывали. pH оптимум фермента был около 8.0 с 50 % потерей активности около pH 6.6 и 9.2. Для субстрата УДФ-0-галактозы Кт составила 64 микромоль. Энергия активации очищенного фермента 42 кДж/моль, а Ко, (УДФ-О-глюкоза/УДФ-Б-галактоза) 3.5. В выращенных на галактозе клетках G. sulphuraria эпимераза, очевидно, принимает участие в превращении внешней галактозы в глюкозо-6-Ф. Однако, данный фермент присутствует с высокой степенью активности и в автотрофно выращеных клетках. Здесь его функция может быть связана с биосинтезом галактолипидов, а также компонентов клеточной стенки, таких как пектины и галактаны. Кроме того, УДФ-Б-галактозо-4-эпимераза может быть вовлечена в метаболизм флоридозидов при осмотическом стрессе (Reed R., 1983), также как и для Poterioochrotnonas malhamensis. Однако, так как у Poterioochromonas отсутствует клеточная стенка, осморегуляция через (изо-)флоридозиды является в ней более важной, чем у G. sulphuraria. Ввиду того, что свойства ферментов этих двух представителей различных таксонов (Chrysophyta и Rhodophyta) очень сходны, можно предположить, что это очень гомологичные ферменты. После перемещения культуры G. sulphuraria из автотрофных в миксо- или гетеротрофные условия скорость роста увеличивалась примерно в 10 раз. Однако, специфическая активность УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы значительно не менялась (Рис. 1). Поэтому говорить о наличии какого-либо механизма регуляции или индукции фермента не представляется возможным. Активация нестабильной изоформы в ходе очистки. При использовании более короткого времени преинкубации с 1 мМ NAD - I часа, по сравнению с обычными 18 часами, обнаружено наличие ещё одного пика УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы (Рис. 5). Пик не имел чётко выраженной формы, но показал очень высокий уровень активности. Он был изолирован от пика стабильной эпимеразы и в дальнейшем очищен при помощи той же колонки, что и в обычном случае, - Dyematrex Orange А. Данная изоформа оказалась крайне нестабильной и, буквально, через 2-3 часа полностью теряла какую-либо активность, что сделало невозможным измерение её воспроизводимых кинетических параметров. Попытки стабилизировать фермент оказались безуспешными. Очищенная изоформа имела удельную активность 246 ФЕ/мг белка и была очищена в 2000 раз (Таблица 3). Гомогенность полученного препарата была доказана электрофоретически, однако, SDS-электрофорез продемонстрировал, что данная форма является дигетеромером, состоящим из субъединиц в 46 и 34 кДа/ Вполне возможно, что данная форма эпимеразы является исключительно NAD-зависимой и после потери

кофактора на ОЕАЕ-фрактогеле становится крайне нестабильной, вплоть до полной инактивации, что делало невозможным её определение.

1200

05 —

я Ч

a s «

S-*

3 ■я

£ -а

о g

з: S

и о

1000-

800

600

400

200-

„ у

0 4-00-СН}0-<><з£-

10 30 50

Номер фракции Рис. 5. Два пика УДФ-0-галактозо-4-эпимеразной активности на колонке с гидроксиапатитом после преинкубации с 1 мМ NAD в течение 1 часа.

В ходе же процедуры очистки происходила кратковременная активация фермента, но это его не стабилизировало. Следует отметить, что присутствие данной изоформы обнаруживается только в варианте использования более короткого времени преинкубации с 1 мМ NAD - 1 час - на колонке с гидроксилапатитом.

Таблица 3.

Очистка и активация нестабильной изоформы 4-эпимеразы из G. sulphuraria.

Этап Объём Актив- Белок Удельная Очистка Выход

очистки (мл) ность (мг) активность -раз %

(ФЕ) (ФЕ/мг белка)

Гомогенат 108 16.3 141 0.12 1 100

DEAE-фрактогель 36 13.5 15.8 0.85 7 83

Гидроксилапатит(1пик)* 39 28.3 7.6 3.7 31 174

Dyematrex Orange А 6 89.1 0.36 246 2050 547

*расчёты пргаодятся относительно активности обоих изоформ в гомогенате

Наличие данной изоформы имеет аналогию с фактом присутствия УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы в животной ткани, когда очищенный препарат имел те же свойства, что и обсуждаемая здесь изоформа: высокая степень нестабильности, зависимость от NAD, достигнутая (высокая степень очистки.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА УДФ-Б-ГЛЮКОЗОПИРО-ФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ GALDIERIA SULPHURARIA

УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза была очищена до гомогенного состояния включая следующую серию колонок: DEAE-фрактогель, гидроксилапатит, Butyl HIC, Superdex-200. Препарат был стабилен в течение недели и после всей процедуры очистки показал удельную активность в 100 ФЕ/мг белка, что соответствовало очистке фермента в 152 раза и суммарном выходе 10% (Таблица 4).

Таблица 4.

Очистка стабильной изоформы УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы из Galdieria sulphuraria.

Этап Объём Актив- Белок Удельная Очистка Выход,

очистки (мл) ность (мг) активность -раз %

(ФЕ) (ФЕ/мг белка)

Гомогенат 108 91.3 141 0.65 1 100

DEAE-фрактогель 38 53.4 32 1.7 2.6 59

гидроксилапатит 21 34.5 13 2.7 4.2 38

Butyl HIC 26 24.0 0.17 31.4 48 23

Superdex-200 7.5 9.00 0.09 100 152 10

Полученные данные сопоставимы со свойствами фермента из других источников. Молекулярный вес холофермента, определённый при помощи гель-фильтрации, составил 330 кДа. Кт для субстрата УДФ-Э-глюкозы равнялась 115 микромоль, а достигнутая Vmax - 0.97 ФЕ/мг белка. Влияния NAD, NADH, галактозы, галактозо-1-Ф (при сопоставимых концентрациях с глкжозо-1-Ф), галактозо-6-Ф на активность фермента не обнаружено. Пик активности АДФ-О-глюкозопирофосфорилазы (КФ 2.7.7.27) отличен от пика УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы всего на 6-7 фракций. Данное наблюдение подтверждает наблюдения других авторов, что УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза часто обнаруживается вместе с АДФ-О-глюкозопирофосфорилазой в тканях, которые производят или деградируют крахмал. Это было показано ранее для листьев риса (Nomura U. и др., 1967) и его развивающихся зёрен (Perez С. и др. 1975), семян гороха (Turner J., 1969а), хлоропластов обкладки пучков кукурузы (Huber W. и др., 1969), кукурузного эмбриона и эндосперма (Vidra J. and Loerch L„ 1968; Ozbun J. и др., 1973; Dickinson D. и др., 1977), зёрен пшеницы (Turner J., 1969b; Tovey K. and Roberts R., 1970), проростков бобов (Delmer D. and Albersheim P., 1970), пыльцы лилии (Dickinson D. and Davies M., 1971) и каллуса Nicotiana tabacum (Palmer С., 1976). Факт соместного присутствия обоих пирофосфорилаз теперь справедлив и для проростков гороха. Однако, активность УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы обычно в 30-50 раз выше (Feingold D. and Avigad G., 1980), что и

подтверждается результатом данного эксперимента. Интересно отметить, что в гомогенате клеток, выращенных на глюкозе и маннитоле, фермент показал примерно одинаковый уровень активности, в клетках же на среде с галактозой его уровень в два раза выше (Рис. 1). Определённо, УДФ-О-глюкозопирофос-форилаза принимает самое непосредственное участие в метаболизме галактозы, в частности, одного из его производных - УДФ-Б-галактозы. Здесь же следует отметить, что при неоднократных попытках обнаружить присутствие УДФ-О-галактозопирофосфорилазной реакции отмечена неспецифическая активность УДФ-0-глюкозопирофЬсфорилазы с обоими субстратами: галактозо-1-Ф и УДФ-0-галактозой, растущая при увеличении концентрации данных неспецифических для этого фермента субстратов. Каких-либо измерений данного наблюдения не проводилось, но этот факт как нельзя лучше коррелирует с сообщениями других авторов о метаболизме УДФ-0-глюкозопирофосфорилазой из растений УДФ-0-галактозы и галактозо-1-Ф (Hopper J. and Dickinson D., 1972; Ray M. and Abdul-Baki A., 1968; Smart E. and Pharr D., 1981).

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ГАЛАКТОЗНОГО МЕТАБОЛИЗМА У PIS UM SATIVUM

По уровню возрастания активности в гомогенате проростков Р. sativum разного возраста ферменты распределились следующим образом: галактокиназа, фосфоманнозоизоМераза, галактозо-1 -Ф-урндилтрансфераза, УДФ-0-галактозо-4-эпимераза, фосфоманнозомутаза, глюкозо-6-Ф-дегидро-геназа (Рис. 6). Активность трёх остальных ферментов: УДФ-О-глюко-зопирофосфорилазы, фосфоглюкомутазы, фосфоглюкозоизомеразы варьи -рует в проростках разного возраста.

НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТА - УДФ-Б-ГАЛАКТОЗО-4-ЭПИМЕРАЗЫ ИЗ PISUM SATIVUM

Активность эпимеразы из проростков гороха в 10 раз ниже, чем у G. sulphuraria (Рис. 1, 6). Частичная очистка при помощи аффинного геля Dyematrex Green позволила выявить существование двух изоформ фермента. По распределению ферментативной активности между двумя этими изоформами одна, сорбируемая на колонке, была названа первой, а другая, не взаимодействующая с матриксом колонки, - второй.

Характеристика первой изоформы. Данная изоформа УДФ-О-галак-тозо-4-эпимеразы осаждалась на матриксе колонки Dyematrex Green и показала себя достаточно стабильной для изучения ряда свойств. Удельная активность после частичной очистки составила 0.1 ФЕ/мг белка, и фермент был очищен в 5 раз (Таблица 5).

Таблица 5.

Разделение изоформ УДФ-0-галактозо-4-ошшеразы из Pisum sativum.

Этап Объём Актив- Белок Удельная Очистка Выход,

очистки (мл) ность (мг) активность -раз % .

(ФЕ) (ФЕ/мг белка)

Гомогенат* 50 2.0 102 0.02 1 100

Dyematrex Green

первая изоформа 4 0.5 5 0.10 5 25

вторая изоформа 60 0.8 97 0.01 0.5 40

* расчёты приводятся относительно активности обоих изоформ в гомогенате

Молекулярный вес эпимеразы, определённый при помощи гель-фильтрации на колонке Superdex-200, составил 230 кДа. Расчёт Кеч (УДФ-0-глюко-за/УДФ-Б-галактоза) дал значение 26.4, показывающее преимущественную продукцию УДФ-0-глюкозы из УДФ-О-галактозы. Это совершенно противоположно ферменту из животной ткани (Geren С. and Ebner К., 1977) и микроорганизмов (Maxwell Е. and de Robichon-Szulmajster H., 1960), где отмечена преимущественная работа эпимеразы в ином направлении. Кт для субстрата - УДФ-О-галактозы - 20 микромоль, a Vmax - 0.03 ФЕ/мг белка. Свойства второй изоформы. В процессе очистки эпимеразы из Р. sativum на колонке Dyematrex Green большая часть фермента не прикреплялась к матриксу и проходила сквозь колонку. При повторной попытке осуществить очистку этого фермента с помощью данной колонки результат повторился -изоформа не сорбировалась на колонке Dyematrex Green. Данная эпимераза оказалась крайне нестабильной и теряла свою активность в течение 4-5 часов. Удельная активность полученного препарата составила 0.01 ФЕ/мг белка, а степень очистки, которую удалось зафиксировать, составила 0.5 раза. Кт и Vm« Для УДФ-О-галактозы равнялись соответственно 26 микромоль и 0.004 ФЕ/мг белка. Влияния галактозы, галактозо-1-Ф и галактозо-6-Ф ни на одну из изоформ обнаружено не было. Эпимераза не активировалась NAD и не ингибировалась NADH, что аналогично поведению фермента из G. sulphuraria.

СУБСТРАТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ УДФ-0-ГАЛАКТОЗО-4-

ЭПИМЕРАЗЫ ИЗ ПРОРОСТКОВ PISUM SATIVUM УДФ-О-галактозо-4-эпимераза из проростков P. sativum подвергается сильному субстратному иигибированию УДФ-О-галактозой. Для минорной изоформы Ksi составила 0.5 мМ, а для мажорной - 3.6 мМ. Данное явление, по всей видимости, и является одной из возможных причин галактозной токсичности для высших растений. При потреблении клеткой экзогенной галактозы происходит постепенное накопление УДФ-О-галактозы ввиду

шгибирования эпимеразы избытком субстрата. Важность УДФ-Б-галак-гозо-4-эпнмеразы для всего клеточного метаболизма можно проиллюстри-ювать следующим примером: УДФ-Б-галактоза служит потенциальным :убстратом для более чем 40 реакций в организме, а УДФ-Б-глюкоза - для 30 Enzyme Nomenclature, 1992).

6.0

I 5.0 t-

ш 4.0

e

i 3.0

u

0

1 2.0 f-

< 1.0

0.0

10 дней

0.03 0.05 0.1.3

5.90T

5.31

I

i

É

Ш

e

<

4.0 3.0, 2.0 1.0 0.0

- Галактокиназа

- Галактозо-1 -Ф-уридил-

трансфераза , - УДФ-0-галактозо-4-эпимераза

— УДФ-О-глюкозопиро-

фосфорилаза Г - Фссфоглюкомутаза : - Фосфоглкжозоизомераза ' - Фосфоманнозоизомераза : - Фосфомашюзомутаза

- Глюкозо-6-Ф-дегндро-

геназа . 1 - Белек (мг/(г с м))

а е

л

î-

•_> ■

о

25 дней

0.03 0.09 0.11

I

1

g 5.08 Т

h 4.30 rh

1 1 1

I 1 004 0.П гЩ 1

5 7 3 ? 10

Рис. 6. Активность ферментов галактозного метаболизма в гомогенате проростков Pisum sativum (10, 14, 25 дней).

У G. sulphuraria, для которой галактоза не токсична, субстратное ингибирование не обнаружено. Наблюдаемый дисбаланс в системе пулов УДФ-D-галактозы и УДФ-О-глкжозы будет непосредственно отображаться на всём клеточном метаболизме и выражаться в видимых физиологических нарушениях. Ранее было обнаружено, что у галактозо-чувствительных растений свободная галактоза ведёт к аккумуляции галактозо-1-Ф и УДФ-D-галактозы (Roberts R. и др., 1971; Inouhe М. и др., 1987; Loughmann S. и др., 1989). Эти сведения как нельзя лучше подтверждают идею данной работы, что у галактозо-чувствительных объектов ключевым и изначальным моментом токсичности является ингибирование такого стратегически важного в плане всего метаболизма клетки фермента, как УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы, избытком субстрата, формирующегося при поступлении галактозы извне.

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ УДФ-О-ГШОКОЗОПИРО-ФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ ПРОРОСТКОВ PISUM SATIVUM Фермент присутствует в гомогенате с хорошей активностью на различных стадиях прорастания гороха (Рис. 6). При помощи колонки DEAE-фрактогель удалось обнаружить существование двух изоформ УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы, однако нестабильность полученных препаратов не позволила осуществить дальнейшие исследования. Удельная активность изоформ составила 0.65 и 0.13 ФЕ/мг белка (Таблица 6). Ранее другими авторами также были получены два пика ферментативной активности пирофосфорилазы, при этом возможность второго метаболизировать и галактозо-1-Ф привело к ложному выводу о существовании фермента УДФ-О-галактозопирофосфорилазы. Однако, ни охарактеризовать данную пирофосфорилазу, ни изолировать один фермент от другого никому ещё не удавалось (Smart Е. and Pharr D., 1981; Gustafson G. and Gandler J., 1972).

Таблица 6.

Разделение изоформ УДФ-0-галактозо-4-эпимеразы из Pisum sativum.

Этап Объём Актив- Белок Удельная Очистка Выход,

очистки (мл) ность (мг) активность -раз %

(ФЕ) (ФЕ/мг белка)

Гомогенат* 158 267 278 0.96 1 100

DEAE-фрактогель

изоформа I 33 13.2 20.3 0.65 0.68 4.9

изоформа II 9 1.9 15.4 0.12 0.13 0.13

*расчёты приводятся относительно активности обоих изоформ в гомогенате Сведения о способности фермента из гороха (Ray М. and Abdul-Baki А., 1968) и Lilium (Hopper J. and Dickinson D., 1972) к превращению УДФ-О-галактозы и

галактозо-1-Ф, которые, в конечном итоге, его же и ингибируют, подчёркивают роль УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы в схеме развития дальнейших событий галактозиой токсичности после субстратного ингибирования УДФ-В-галактозо-4-эпимеразы. Здесь же следует напомнить, что при неоднократных попытках обнаружить УДФ-Б-галакто-зопирофосфорилазную реакцию в гомогенатах G. sulphuraria и P. sativum, отмечен факт неспецифической активности УДФ-Р-глюкозопирофосфо-рилазы с высокими концентрациями галактозо-1-Ф и УДФ-О-галактозы, на основании чего делается вывод об отсутствии фермента пути Isselbacher -УДФ-О-галактозопирофосфорнлазы у проростков гороха.

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОРТА ГАЛАКТОЗЫ В КЛЕТКИ КОРНЯ PISUM SATIVUM

Экспериментальная проверка гипотезы о возможном затруднении или влиянии галактозы на транспорт углеводов внутрь клетки дала следующие результаты: 1) галактоза быстро транспортируется внутрь клеток (Рис. 76); 2) галактоза не оказывает влияния ни на активирование, ни на ингибирование транспорта глюкозы и фруктозы внутрь клеток (Рис. 7г-ж); 3) уровень метаболизма галактозы также высок, как глюкозы и фруктозы. Соотношение концентраций углеводов вне клетки соответствует их соотношению после транспорта внутрь клетки, то есть, их уровень одинаков (соответственно 5.3, 6.3 и 5.6% общей площади поверхности (Рис. 7ж)) (Рис. 7г-ж). Применение различных комбинаций углеводов и их концентраций позволило установить, что соотношение высот пиков и их площадей соответствует использованным соотношениям концентраций. Никаких антагонистических или синергетичных отношении между углеводами в ходе эксперимента не наблюдалось. Таким образом, проблема галактозной токсичности для высших растений не может быть связана с нарушением механизма транспорта галактозы внутрь клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

УДФ-0-галактозо-4-эпимераза и УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза занимают ключевые позиции не только в галактозном, но и во всём углеводном метаболизме клетки. Их продукты служат предшественниками синтеза галактанов, гликопротеинов, гликолипидов, галактолипидов, олигосахаридов, галактинола, крахмала, сахарозы, пектинов, пентозанов, каллозы, целлюлозы, глюкуроната, рафинозы, стахиозы и многих других компонентов метаболизма. Однако, при экзогенном применении галактозы происходит ингибирование активностей данных ферментов, что, в конечном итоге, приводит к гибели всего организма.

¡2 а) концентрация глюкозы - 12.5 мМ

б) концентрация галактозы - 12.5 мМ

в) концентрация фруктозы - 12.5 мМ

г) концентрация глюкозы -12.5 мМ, галактозы - 12.5 мМ (1:1)

д) концентрация глюкозы -18.8 мМ, галактозы - 6.2 мМ (3:1)

е) концентрация фруктозы -12.5 мМ, галактозы - 12.5 мМ ( 1:1)

ж) концентрация глюкозы -8.3 мМ, галактозы - 8.3 мМ, фруктозы - 8.3 мМ (1:1:1)

Время ретэнции, мин

Ряс. 7. Схема профилей, демонстрирующая транспорт экзогенных углеводов в клетки корня гороха. Различные углеводы, соотношения их концентраций и комбинации были использованы.'

Галактоза, используемая в качестве экзогенного источника углерода, эвышает внутриклеточный пул УДФ-Э-галактозы. УДФ-О-галактозо-4-шмераза у галактозо-чувствительных растений подвергается субстратному 1гибировашпо, что вызывает накопление и аккумуляцию УДФ-О-галактозы и ;тощение пулов УДФ-О-глюкозы, УТФ и фосфата. Далее происходит эдключение фермента УДФ-Б-глюкозопирофосфорилазы, который, заимодейстпуя с УДФ-О-галактозой, приводит к формированию избытка 1лактозо-1-Ф, в свою очередь, метаболизируемым галактозо-1-Ф-эидилтрансферазой, что приводит к формированию новых количеств УДФ--галактозы. Формируется замкнутый цикл, результатом которого является эекращение метаболизма галактозы, аккумуляция галактозо-1-Ф и УДФ-О-шактозы, ингибирующих как поступление субстратов для протекания атаболических реакций, так и биосинтез промежуточных, строительных и шасаюших компонентов, элиминация УТФ и фосфата. Всё это имеет помологические последствия, что выражается в ингибировании роста стебля его скручивании, нарушении синтеза пигментов, прекращении элонгации отокотиля и регенерации чехлика, опадении листьев, и гибели всего организма Знс. 8). Данная схема предлагается впервые и включает в себя как ■сспериментальные данные, полученные в ходе выполнения поставленных гред работой задач, так и сведения, ранее опубликованные другими авторами.

ВЫВОДЫ

1. Токсичность галактозы для высших растений связана с субстратным нгибированием УДФ-В-галактозо-4-эпимеразы УДФ-Б-галактозой, что риводит к замедлению работы данного фермента и прекращению метаболизма алактозы. Данное явление представляет собой регуляторный механизм, так ак позволяет клетке экономно расходовать поступающую при гидролизе афинозы галактозу во время прорастания семян.

2. Показано, что неспецифическая активность УДФ-Б-люкозопирофосфорилазы из красной водоросли и проростков гороха с УДФ->-галактозой и галактозо-1-Ф приводит к накоплению галактозо-производных

последующему усилению ингибирования эпимеразы и данной ирофосфорилазы собственными продуктами галактозного обмена.

3. Обнаружено, что проблема токсичности галактозы не связана с её ранспортом внутрь клеток корня гороха. Данный углевод поглощается так же ыстро, как глюкоза и фруктоза.

4. Впервые из красной термоацидофильной водоросли ОаМхепа и1р'пигаг1а получены в гомогенном состоянии две изоформы УДФ-О-алактозо-4-эпимеразы. Стабильная изоформа имела удельную активность 42 )Е/мг белка, её выход при очистке составил 38 %, а степень очистки - 350.

Нестабильная изоформа, подверженная активации NAD и активированная данным кофактором в ходе очистки, имела удельную активность 246 ФЕ/мг белка, её выход при очистке составил 547 %, а степень очистки - 2050.

5. Из проростков гороха удалось выделить также две изоформы УДФ-D-галактозо-4-эпимеразы, однако очистить их удалось только частично.

6. УДФ-О-глюкозопирофосфорилаза из G. sulphuraria была очищена до гомогенного состояния. Она имела удельную активность 100 ФЕ/мг белка, её выход при очистке составил 10 %, а степень очистки -152.

7. Установлено, что в проростках гороха также имеются две изоформы УДФ-О-глкжозогшрофосфорилазы, которые были частично очищены.

8. У обоих растений отсутствует индукция ферментов галактозного метаболизма, за исключением УДФ-О-глюкозопирофосфорилазы, активность которой возрастает в два раза при выращивании G. sulphuraria на галактозе.

9. У G. sulphuraria и в проростках P. sativum отсутствует активность фермента пути Иссельбахер (Isselbacher ) - УДФ-О-галактозопирофосфори-лазы. Метаболизм галактозы у этих объектов осуществляется через ключевой фермент пути Лелуар (Leloir ) - галактозо-1-Ф-уридилтрансферазу.

1. Prosselkov P. V. UDP-D-galactose 4-epimerase - the key enzyme of plant galactose metabolism //Book of Abstracts: Conference on "Progress in Plant Sciences", 17 - 19 June, 1996, Masoninagyarovar, Hungary. - Masonmagjc.:ovar, 1996.-P. 76.

2. Purification and characterization of UDP-D-galactose 4-epimerase from the red alga Galdieria sulphuraria/P. V. Prosselkov, W. Gross, A. U. Igamberdiev, C. SchnarrenbergerZ/Physiol. Plantarum. - 1998. - Vol. 98, N 2. - P. 753-758.

3. The substrate inhibition of UDP-D-galactose 4-epirnerase as a possible source of galactose toxicity for higher plants/P. V. Prosselkov, W. Gross, A. U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger//Plant Physiology (Suppl.). - 1997. - Vol. 114, N 3. - P. 35.

4. Prosselkov P. V., Igamberdiev A. U. Isoforms of phosphoglucoisomerase from Pisum sativum //Plant Physiology (Suppl.). - 1997. - Vol. 114, N 3. - P. 141.

5. Pyrophosphorylases of Plants/ P. V. Prosselkov, W. Gross, E. S. Vinokurova, A. U. Igamberdiev//Plant Physiology (Suppl.). - 1997. -Vol. 114, N 3. - P. 143-144.

6. Prosselkov P., Gross W., Schnarrenberger C. Galactose liberated from degrading galactans of red algae may be toxic for higher plants //Book of Abstracts: Conference "Bioactive Carbohydrate Polymers", Sundoya, Norway, 13-16

Заказ № S72. от (7.11.1998 г. Tup. 100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

September 1998. - Oslo, 1998. - P. 39.