Олигосахарид проростков гороха (пизамин): антивитамин пантотеновой кислоты, регулятор роста растений

Смашевский, Николай Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Олигосахарид проростков гороха (пизамин): антивитамин пантотеновой кислоты, регулятор роста растений
ВАК РФ 06.01.09, Растениеводство

Автореферат диссертации по теме "Олигосахарид проростков гороха (пизамин): антивитамин пантотеновой кислоты, регулятор роста растений"

Николай Дмитриевич

ОЛИГОСАХАРИД ПРОРОСТКОВ ГОРОХА (ПИЗАМИН): АНТИВИТАМИН ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ, РЕГУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ

Специальности 06 01 09 - растениеводство

03.00 12- физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

2 О СЕН 2007

Астрахань - 2007

Работа выполнена на кафедре биологии и экологии растений Астраханского государственного университета

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент HAH Беларуси, зав лабораторией витаминов и коферментов ИФиБ HAH Беларуси Мойсеенок Андрей Георгиевич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Бакташева Надежна Мацаковна,

Калмыцкий государственный университет,

Доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Кабардино-Балкарской Республики, Почетный работник высшего образования России, Академик АМАН Слонов Людин Хачимович, Кабардино-Балкарский государственный университет,

Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Шахмедов Иршат Шакирович, ВНИИ орошаемого овощеводства и бахчеводства РАСХН

Ведущая организация Ставропольский НИИСХ РАСХН

Защита состоится «03» октября 2007 г в /£/ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212 ООО 02 при Астраханском государственном университете, Естественный институт, 414000, г Астрахань, пл Шаумяна, 1

Факс 8(8512)22-82-64 e-mail ei@aspuru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу 414000, г Астрахань, пл Шаумяна 1 Автореферат разослан /¿4Ч/ftf 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

М Ю Пучков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Изучение закономерностей роста растений является основой для разработки новых технологий управления их продуктивностью Рост является интегральным производным всех процессов, протекающих в растительном организме на этапах онтогенеза, которые находятся под контролем эндогенных регу-ляторных систем Познание механизмов регуляции ростовых процессов и раскрытие их связей с другими факторами онтогенеза способствует решению важнейших научно-практических задач целенаправленного изменения роста, морфогенеза и развития растений

Рост как показатель физиологического состояния растений обладает высокой чувствительностью к изменению внутренних и внешних факторов и, тем самым, наиболее пригоден для определения объема и сроков необходимого вмешательства, в том числе при оценке экологической приспособленности и адаптивных возможностей растений Это особенно важно при разработке современных технологий в генетике, селекции и практике растениеводства (Смирнов, 1970, Ватыгин, 1986, Шевелуха, 1992)

Спектр биологически активных веществ, молекулярно-биологических и биохимических механизмов, способных включаться в реализацию программ роста, развития и реализации защитных реакций растительной клетки весьма разнообразен К таким соединениям до недавнего времени были отнесены фитогормоны - ауксины, цитоки-нины, гиббереллины, брассиностероиды и ингибиторы АБК, этилен, фенольные соединения и др Они наиболее изучены и представлены в многочисленных статьях, обзорах и монографиях (Кораблева, Метлицкий, 1973, Чайлахян, 1975, Гуськов, 1975, Процко, Сытник, 1979, Hess, Dieter, 1973, Кефели, 1978,1992)

В последнее 20-летие открыты и изучаются растительные олигосахариды, фрагменты распада полисахаридов клеточной стенки, обладающие широким спектром ре-гуляторных функций в растениях (Albersheim, Darvill, 1992, Усов, 1993) Олигосахариды подавляют рост, стимулируемый ауксинами, прорастание семян, улучшают процессы фотосинтеза, ускоряют транспорт питательных веществ, увеличивают биомассу растений, улучшают развитие корневой системы, способствуют эмбриогенезу и морфогенезу в трансплантатах растительных тканей, повышают устойчивость к стрессовым ситуациям (Fry, Aldington, Hartelington et al, 1983, York, Darvill, 1992, Долгих, Шайкин, Усов и др 1988) Такой широкий спектр биологического действия позволяет сделать заключение, что олигосахариды действуют как сигнальные молекулы, участвующие в регуляции различных функций растительного организма

Один из представителей регуляторных фитоолигосахаридов является предметом наших исследований на протяжении более 30 лет Выделенный ингибитор роста дрожжей из проростков гороха идентифицирован как олигосахарид с новыми биологическими свойствами, ранее неизвестными для олигосахаридов, с антивитаминным действием в отношении одного из самых распространенных витаминов группы В в живых организмах - пантотеновой кислоты (ПК, витамин В5) В процессе экспериментальных исследований этому новому антивитаминному фактору нами было дано условное название пизамин. Изучение его биологических свойств, роли в регуляции метаболических и ростовых процессов и механизма действия в растительном организме имеет большое значение для познания разнообразия биологически активных веществ растений и получения новых знаний о функциях фитоолигосахаридов в растительном организме Изучение пизамина, как антивитамина ПК, обостряет внимание

и к проблеме участия витаминов группы В и, в частности, коферментной формы ПК-кофермента ацетилирования (КоА), в жизнедеятельности растений

Невозможно представить рост, морфогенез в растении без образования de novo многочисленных органических веществ или возникающих в результате распада сложных биополимерных и комплексных соединений и усвоения их структурных компонентов в процессе роста. Эти процессы протекают при участии специфических ферментов, катализирующих ход пластического и энергетического метаболизма, лежащего в основе роста. Активность значительной части таких ферментов определяется коферментом, в структуре которого присутствуют витамины группы В, в чем и проявляется биологическая каталитическая функция витаминов в живом организме Поэтому наряду с фито-гормонами, специфичными индуктивными регуляторами роста следует рассматривать и витамины (коферменты) как регуляторы роста метаболических путей В этой связи В И Кефели (1981) отнес витамины к негормональным факторам роста растений, убедительно доказывая участие витаминов в каталитических реакциях, усиливающих ростовые процессы, в том числе активируемые фитогормонами Влияние витаминов на ростовые процессы довольно детально изучено, что отражено в ранних обзорных работах (Чайлахян, 1958, Овчаров, 1969, Карабанов, 1977, Oertl, 1987)

Витамины, как предшественники коферментов, являются эндогенными регуляторами роста и развития растений, функции которых, как и фитогормонов, регулируются в растительном организме различными путями, в том числе ингибированием активности, что необходимо для сбалансированности и оптимизации метаболизма В этом плане они подчиняются универсальной системе саморегулирования - стимулятор/ингибитор, что предполагает наличие антивитаминных факторов Обнаружение, выделение и изучение антивитаминов (антикоферментов) является важной задачей для познания роли витаминов в жизненных процессах растений, закономерностей их роста и путей направленного его управления

Антивитаминные факторы широко распространены в растениях и идентифицированы практически для всех витаминов Но их обнаружение, как правило, не связывалось с физиологией растительного организма и выявлялось по действию на животных, у которых при поедании растительной пищи наблюдались признаки типичного авитаминоза, устраняемые добавлением витаминов (Mellanby, 1930,1949, Weits, 1952, Weswig, Freed, Haag, 1946, Kodichek, 1949, Bar, 1954, Костов, Гахниян, 1964, Островский, 1973)

Можно утверждать, что роль природных антивитаминных факторов в росте растений до настоящего времени практически не изучена.

Следует отметить, что образование антивитаминных факторов присуще не только высшим растениям, но и животным и низшим организмам (Hanka, Berg, Kelly, 1966, Островский, 1973) Это может служить доказательством особой роли этих веществ, причастных к фундаментальным механизмам регуляции метаболизма. Поэтому изучение природы образования, структуры и механизма действия, значение их в реализации функции коферментов и ростовых процессах растений имеет важнейшее значение для различных направлений и проблем биологии высших растений и животных

В первую очередь возникает вопрос о значении антивитаминов в растительном организме как возможных регуляторов функций витаминов (коферментов) в обмене веществ, росте и развитии и вероятных путей осуществления целенаправленного вмешательства в эти процессы

Ответ на данный вопрос получен путем всестороннего изучения природного антивитаминного фактора ПК, выделенного из проростков гороха, который до настоя-

щего времени, как высокоспецифичный антивитамин, является единственным представителем фитоолигосахаридов, образуемых в растении Это раскрывает малоизученную сторону процессов регуляции закономерностей роста и развития растений с участием антивитаминного фактора, что и определило цель наших исследований

Данное направление исследований заслуживает особого внимания, поскольку большинство растительных организмов синтезирует необходимые вещества самостоятельно В то же время существует значительное количество примеров из фито-фармации, когда весьма эффективно эксплуатируется антивитаминный механизм действующей лекарственной субстанции из растений Таким образом, витамины являются предшественниками как «протеидизированных» коферментов (флавопротеи-ды, пиридоксалевые ферменты), так и «свободно диссоциированных» (КоА, NAD, NAD®) в ближайшем окружении энзимов, взаимодействующих с активными центрами каталитических биополимеров

Цель исследований - изучить природу, биологические свойства и механизм действия антивитаминного фактора пантотеновой кислоты (ПК), витамина В5 олигосахарид-ной природы (пизамина), выделенного из проростков гороха (Pisum sativum L), как природного негормонального регулятора ростовых процессов растений

Реализация поставленной цели достигалась выполнением следующих задач исследования

1 Разработать технологию выделения и очистки пизамина из проростков гороха, изучить его физико-химические свойства и определить химическую природу

2 Разработать метод анализа и изучить динамику образования пизамина в онтогенезе растений гороха, условия его синтеза и накопления в органах проростков

3 Изучить влияние содержания и динамики накопления эндогенного пизамина и его соотношения с различными формами ПК в растении на характер роста проростков гороха, динамику активности окислительных ферментов и процесса дыхания в онтогенезе органов проростков гороха.

4 Изучить антивитаминное действие экзогенного пизамина на ростовые процессы в растениях, взаимоотношение с фитогормонами в процессе роста растяжением и некоторые метаболические процессы в растении

5 Изучить специфичность, механизм антивитаминного действия пизамина в растительном и животном организмах как антивитамина пантотеновой кислоты, в том числе воздействие на биосинтез ее коферментной формы - КоА

6 Установить характер особенностей и специфичности антивитаминного действия пизамина на рост, физиологические и биохимические процессы дрожжевых грибов и других микробных организмов

7 Используя дрожжевые грибы как тестовую культуру, исследовать особенности взаимодействия пизамина с метаболитами, антиметаболитами, производными ПК и другими антивитаминными факторами

Научная новизна. Впервые выделен новый природный антивитамин ПК из высшего растения (Pisum sativum L ), который идентифицирован как олигосахарид с условным названием «пизамин»

Изучена динамика образования и накопления пизамина в растительном организме в онтогенезе, условия его биосинтеза, связь с дифференцированным и ритмичным изменением роста системы корень/стебель и междоузлий проростков гороха.

Впервые получены экспериментальные данные об антивитаминном действии пизамина в растительном и животном организмах Установлен механизм антивитамин-

ного действия как неконкурентного антагониста ПК, снижающего биологическую активность коферментной формы витамина - КоА

Впервые показано участие пизамина как негормонального и, преимущественно, метаболического регулятора ростовых процессов в высшем растении, снижающего активность связанных форм ПК (предшественников КоА и КоА), не влияющего на биологический синтез витамина.

Установлены особенности характера и специфичности взаимодействия пизамина как антивитамина ПК с метаболитами и антиметаболитами с протеиногенными аминокислотами, природными и синтетическими производными ПК и КоА Выявлены соединения, инактивирующие и усиливающие действие пизамина, его синергизм в антибиотическом действии с другими антивитаминными факторами

Показано взаимодействие антивитаминного фактора с фитогормонами 0-индолилуксусной и гибберелловой кислотами в регуляции ростовых процессов растений

Установлена последовательная адаптация дрожжевых грибов к антивитамину с приобретением ими полной резистентности к пизамину, закрепляемой генетически и сохраняемой в свойствах дрожжей неопределенно длительное время Тем самым констатируется получение мутантного штамма, который обладает повышенной интенсивностью роста, сокращенным лаг-периодом, с активированным синтезом белка и высокой бродильной активностью

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Выделение, очистка, физико-химические свойства и химическая природа пизамина - природного антивитамина пантотеновой кислоты

2 Условия образования, динамика накопления и распределения пизамина в онтогенезе растений гороха (Pisum sativum L)

3 Зависимость характера роста органов проростков гороха от содержания эндогенного пизамина, различных форм пантотеновой кислоты и активности окислительных ферментов

4 Характер действия экзогенного пизамина, как негормонального регулятора, на ростовые и некоторые метаболические процессы растений

5 Видовая специфичность и механизм действия пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты в растительном и животном организмах, реализуемая на уровне биохимических функций КоА

6 Особенности антивитаминного действия пизамина на рост дрожжевых грибов и изменение их физиолого-биохимических и морфологических свойств

7 Специфичность взаимодействий пизамина с метаболитами и антиметаболитами в культурах дрожжевых грибов

Теоретическая и практическая значимость. Установлено присутствие в проростках Pisum sativum L нового биологически активного вещества, антивитамина важнейшего витамина группы В — ПК, подавляющего каталитические функции КоА в метаболических и ростовых процессах растений, животных и других организмов

Результатами проведенных исследований расширено представление о регуля-торных функциях фитоолигосахаридов как негормональных регуляторов роста через модуляцию метаболических процессов

Установлено участие пизамина, антивитамина ПК, в подавлении роста междоузлий растяжением в проростках гороха и регуляции соотношения роста системы «корень - стебель», как фактора, задерживающего рост стебля и обеспечения приоритетного роста корня проростков

Установлен механизм антивитаминного взаимодействия пизамина с ПК (КоА) в

регуляции ростовых процессов в растении, заключающийся в нарушении каталитической функции коферментной формы витамина - КоА

Установлена связь динамики накопления пизамина с изменением аминокислотного и белкового обмена в процессе роста междоузлий растяжением и переходом клетки от интенсивного роста растяжением к замедлению и прекращению роста.

Разработана модель ПК-недостаточности в экспериментах на животных с использованием препарата пизамина

Олигосахарид из Pisum sativum, как высокоактивное вещество с антивитаминным действием, может служить основой для получения синтетических аналогов и использования их в качестве антибиотических веществ, в частности, для борьбы с грибными болезнями растений

Обосновано использование устойчивых к пизамину адаптированных дрожжевых культур для количественного определения ПК в биологическом материале, в котором может присутствовать антивитаминный фактор

Доказана возможность использования высокой специфичности пизамина к организмам, не синтезирующим витамин, в качестве теста при установлении потребности в экзогенной пантотеновой кислоте различных микроорганизмов

Личный вклад автора. Диссертация включает экспериментальные материалы исследований, проведенных автором лично или под его руководством Автор непосредственно участвовал в разработке научно-теоретического обоснования направлений исследований, в постановке конкретных исследовательских задач, разработке методов и подходов их экспериментального решения и анализа Выяснение механизмов антивитаминного действия витамина осуществлено частично в Институте биохимии НАН Беларуси (акад Ю М Островский, член-корр А Г Мойсеенок), а идентификация олигосахаридной природы пизамина проведена в Институте органической химии им И Д Зелинского РАН (под руководством проф А И Усова)

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Астраханского государственного педагогического института (1973-1977, 1991, 1994-1996), научных конференциях Астраханского государственного педагогического университета (1997, 1999, 2000), Третьем всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), 4-м Гродненском симпозиуме «Химия, биологические функции и применение пантотеновой кислоты» (Гродно, 1977), Республиканской конференции «Витамины и фитогормоны в растениеводстве» (Вильнюс, 1981), Втором координационном совещании преподавателей педагогических институтов (Орел, 1981), симпозиуме «Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов (Иркутск, 1983), VII Гродненском симпозиуме «Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника)» (Гродно, 1983), совещании физиологов растений пединститутов РСФСР (секция II «Рост растений и его регуляция», Пенза, 1984), Республиканской научной конференции «Витамины и фитогормоны в растениеводстве» (секция 1 «Реализация генетической программы в ответе организмов на фитогормоны и витамины и в мутагенезе», Вильнюс, 1986), семинаре-совещании физиологов растений педагогических институтов (Вологда, 1990), семинаре-совещании физиологов растений педагогических институтов и университетов (Смоленск, 1993), Всероссийской научной конференции «Астраханский край история и современность (Астра-хань, 1997), Международной научно-практической конференции по пасленовым культурам (Астрахань, 2003), IX Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006)

Результаты исследований опубликованы в журналах «Прикладная биохимия и микробиология», «Микробиология», «Физиология растений», «Биологические науки», «Вестник Московского областного университета» (серия «Естественные науки»), «Южно-российский вестник геологии, географии и глобальной энергии», «Естественные науки», «Весщ Акадэмп навук БССР» (сер бшлаичных навук), а также в сборниках научных работ «Регуляция роста растений», «Рост растений и пути его регулирования», «Рост растений и его гормональная регуляция»

Публикации. Всего опубликовано 65 работ, в том числе по теме диссертации 45, из них 10 - в ведущих рецензируемых журналах, 19 - в центральных рецензируемых журналах и 16 - в материалах симпозиумов и конференций

Структура и объем диссертации. Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, 9 глав основного текста (включая обзоры литературы, результаты и обсуждение собственных исследований), выводов, научно-практических рекомендаций, библиографического списка и приложения

Общий объем диссертации (320 страниц компьютерного текста) включает 84 таблицы, 45 рисунков, 3 фотографии Список литературы включает 399 публикаций, в том числе 198 иностранных источника.

Перечень используемых сокращений

ПК - пантотеновая кислота Б — биотин

КоА - кофермент ацетилирования /З-ИУК - /З-индолилуксусная кислота ГК - гибберелловая кислота ГомоПК - гомопантотеновая кислота БАВ — биологически активные вещества ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

Г-вН - глутатион восстановленный Г-8-8-Г - глутатион оксиленный 4-ФПК - 4-фосфопантотеновая кислота ПАБК - парааминобензойная кислота АБК - абсцизовая кислота ЭДС - электродвижущая сила НК - нуклеиновые кислот ПВК - пировиноградная кислота

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Природные биологически активные вещества в системе регуляции роста растений

В процессе эволюции в каждом живом организме, растительном или животном, сформировалась генетически детерминированная система саморегулирования и самоконтроля жизненных процессов. Появление ингибирующих систем физиологических и биохимических реакций рассматривается как эволюционный аспект формирования системы гормональной и метаболической регуляции (Кефели, Комизерко, Турецкая и др, 1972), познание которой позволяет реализовать направленное управление процессами роста и развития

С биологической точки зрения процессы стимуляции или ингибирования метаболических путей составляют систему, обеспечивающую защитные реакции организма и, тем самым, самосохранения вида. Стимулирование или ингибирование ферментативных реакций способствует приспособлению как к более благоприятным, так и к неблагоприятным условиям среды, что повышает адаптацию растений к более полному и эффективному использованию условий жизнедеятельности в онтогенезе

В зависимости от процесса и фазы онтогенеза в качестве стимулятора или ингибитора могут выступать как гормоны различной природы, так и негормональные фак-

торы Высшие растения обладают сложной системой синтеза фитогормонов, в регуляции которых участвуют ограничивающие факторы, снижающие содержание ауксинов, гиббереллинов, цитокининов до микроколичеств, обеспечивающих максимальный физиологический эффект Образование таких ограничений на пути биосинтеза фитогормонов создает своего рода блокировку, предотвращающую накопление фитогормонов в растениях в избыточных количествах

Сочетание нескольких классов физиологически активных веществ в растительном организме, реализованных путем взаимодействия «стимулятор - ингибитор», носит универсальный характер, лежащий в основе механизма регуляции роста растений (Кефели, Турецкая,1%5) Такой баланс в значительной степени обеспечивает формирование гомеостаза растительного организма, его гармоничный рост и развитие (Коф, Борисова, Аскогенова, 1990) в условиях быстро меняющихся условий внешней среды Фитогормоны, являясь специфическими регуляторами ростовых процессов, нуждаются для реализации их действия в продуктах обмена веществ, атрагируя их к месту своего действия В то же время они оказывают влияние и на другие процессы, такие как увеличение синтеза белка, других биополимеров, активируют ферменты энергетического и пластического обмена, оптимизируют процессы синтеза хлорофилла и др (Гамбург, 1976, Кулаева, 1977)

Так как рост является интегральным производным всего комплекса метаболических циклов в растении, то его интенсивность, характер, формообразовательные процессы, новообразование клеток и клеточных структур неразрывно связаны с ходом и направленностью метаболических путей Поэтому наряду с фитогормонами, специфическими индуктивными регуляторами роста следует рассматривать и потенциальные катализаторы - витамины, микроэлементы, биологически активные соединения, действующие преимущественно через ферментативное звено метаболизма и обеспечивающие энергетику и пластику клеточных структур

Антивитаминами могут быть различные по химической природе вещества, которые способны препятствовать синтезу или биологическому действию витаминов, вызывать инактивацию и разрушение витаминов, вступать необратимо в комплексные соединения с ними или конкурировать за субстрат (Wnght, 1947) Наличие природных антивитаминов установлено практически для всех известных витаминов Причем образование антивитаминов присуще как высшим растениям, животным, так и низшим организмам Роль растительных антивитаминов в жизненных процессах растений не изучена.

В недавнее время из растений были выделены и были хорошо изучены новые высокоактивные вещества, близкие по химической структуре стероидным гормонам животных - брассиностероиды (БС) Они обладают чрезвычайно высокой биологической активностью, проявляя стимулирующий эффект в концентрации Ю~10 М и ниже Ростосги-мулирующее действие БС на целые растения, изолированные органы, их отрезки обусловлено активацией клеточного деления и растяжения (Mandava, 1988, Mussig, 2005, Rao, Vardhini, Sujatha et al, 2002, цит по Авальбаева, Юлдашев, Шакирова, 2006)

В 1980-х гг были открыты новые биологически активные вещества, структурные компоненты полисахаридов растительной клеточной стенки - олигосахариды, высоко активные эндогенные регуляторы клетки Установленный широкий спектр биологического действия позволил сделать заключение, что они участвуют как сигнальные молекулы в регуляции различных функций растительного организма. Фитоолигосахари-ды могут обладать и самостоятельным специфическим действием Об этом свидетельствуют данные о широком и разнообразном их действии не только на рост, но и метаболизм растений Они стимулируют прорастание семян, улучшают процесс фотосин-

теза, ускоряют транспорт питательных веществ, увеличивают биомассу растений, улучшают развитие корневой системы, увеличивают площадь листьев, повышают устойчивость растений к стрессовым ситуациям, что и определяет характер роста растений Олигосахариды взаимодействуют с клетками-акцепторами (мишенями), это вызывает каскад ответных реакций, активирующих сотни генов (Fry, Aldington, Hether-mgton et al, 1983, Darvill, 1992, Усов, 1993)

2. Материалы и методы исследования

Особенности диссертационной работы в соответствии с экспериментальными задачами предусматривали проведение исследований по двум основным направлениям общий подход, используемый в пределах всей работы, и модели отдельных экспериментов, предназначенных для решения конкретных вопросов Поэтому частные методики отдельных экспериментов или используемые в относительно небольших по объему экспериментах включены в разделы глав совместно с описанием проводимых экспериментов и анализом полученных результатов

Материал для изолирования пизамина и изучения его активности в клеточном соке органов растений и проростков гороха. Использовали 14-15-дневные этиолированные проростки гороха Pisum sativum L сортов Красноуфимский 70, Рамонский 77 Семена элитной репродукции урожая предыдущего года получали непосредственно из селекционных станций Проростки выращивали на протяжении 14-15 <уг во влажных опилках, в темноте, при температуре 22-25 °С, целиком измельчали и отжимали сок, который нагревали до 80 °С, выдерживали при этой температуре в течение 15 мин, отделяли от осажденных белковых веществ и использовали для извлечения из него пизамина. Для изучения биологической активности сока или определения количественного содержания антивитамина в органах растений и проростков (корень, междоузлие, листья, семядоли), после гомогенизации отжатый ручным прессом сок доводили до кипения и после охлаждения отделяли от осадка центрифугированием

Объекты исследования и биотесты. В качестве объектов исследования и биотестов использовали интактные растения, проростки и изолированные междоузлия проростков гороха посевного (Pisum sativum L ), колеоптили пшеницы (Tnticum vulgare L ) сорта Альбидум-43, изолированные семядоли огурца (Cucumis sativum L ) и кабачка (Cucurbita pepo), изолированные корни люцерны (Medikago sativa L ) сорта 08YP11 Prelous и кукурузы (Zea mays indentata Sturt), изолированные суспензионные культуры тканей диоскореи дельтовидной (Diochorea deltoidea) и женьшеня настоящего (Panax Gigzeng С А Меу), а также дрожжевые грибы различных видов, отличающихся по способности синтезировать витамины группы В, в частности, ПК и биотин При изучении особенностей, специфичности биологического действия пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты в качестве тестовой культуры были использованы дрожжи сахаромицеты, которые, с нашей точки зрения, оптимально подходили для изучения пизамина

Дрожжевые клетки имеют много общего с растительными клеткам В растениях и дрожжах обнаружены родственные группы белков (Agarwal, Katiyar-Agarwal, 2002) Дрожжи проявляют высокую, стабильную, специфичную и быструю реакцию на пи-замин Для этих микроорганизмов детально изучена трофика, витаминная потребность, что весьма важно при исследовании биологических свойств пизамина как антивитамина ПК Основной дрожжевой культурой, которая постоянно использовалась нами во всех опытах, служили дрожжевые грибы Saccharomyces cerevisiae краснодарской расы, а также, в ряде случаев, Saccharomycodes Ludwigu ВКМ-1167, нуждающие-

ся для нормального роста в экзогенной ПК, причем первые способны ее синтезировать из пантоевой кислоты и /3-аланина (Ahmad, 1953), вторые используют только готовую молекулу витамина, т е не обладают пантотенатсинтетазной активностью Кроме того, в разных по цели и характеру экспериментах использовали и другие дрожжевые культуры с различной витаминной потребностью, которые были получены из отдела типовых культур Московского института микробиологии РАН, которые под держивались нами пересевами на сусло-агаре в лабораторных условиях Их виды и физиологические свойства рассматриваются в соответствующих разделах работы

Хранение и стандартизация дрожжевых культур для проведения микробиологических исследований. Нами разработан метод длительного хранения и сохранения идентичности инокуляционного материала дрожжей, независимо от сроков проведения экспериментов, в стеклянных незапаянных ампулах, в 10%-м растворе сахарозы (Филиппов, Смашевский, 1968) В таких ампулах дрожжи после 5 лег хранения имели не менее 90 % жизнеспособных клеток, полную идентичность исходной культуре по физиологическим и морфологическим признакам, а при высеве на питательные среды характеризовались активным ростом Перед опытом дрожжи, хранящиеся в ампулах, активировали и синхронизировали Для этого дрожжи извлекали вместе с раствором стерильной пипеткой и переносили в 10 мл стерильной инокуляционной среды, состоящей из макроэлементов стандартной среды с добавлением 20 г сахарозы и 28 мл пивного сусла на 1 л дистиллированной воды В такой среде дрожжи быстро вступали в фазу роста при температуре 28 °С Через 36-48 ч после прекращения роста их декантировали из раствора и трижды промывали стерильным раствором, содержащим только макроэлементы, в котором дрожжи оставлялись на 24 ч для синхронизации, т е до перехода всех клеток дрожжей в одинаковое функцинальное состояние, обедненное в отношении витаминов и других органических соединений Это позволяло использовать во всех опытах инокуляционный материал одного возраста, однотипной морфологической и физиологической фазы при вступлении к размножению При инокуляции во всех опытах в питательную среду вносили одинаковое количество дрожжей - 2,5 мкг сырого веса на 1 л среды Общий объем культуральной среды в опытах составлял 2 мл на пробирку

Стандартная синтетическая питательная среда для выращивания дрожжей в экспериментах и технология ее приготовления Все опыты с дрожжевыми культурами проводили на жидкой стандартной синтетической питательной среде, за основу которой была взята среда, описанная В В Филипповым (1958), содержащая (NH4)2S04 - 3,0 г, КН2Р04- 2,5 г, MgS04 - 1 г, ZnS04 7Н20 - 1,0 г, CuS04 7Н20 -0,1 г, FeS04 7Н20 - 0,850 г, сахароза (пищевая) - 20 г, аспарагин - 1,0 г, тиамин -4,0 мг, инозит - 10,0 мг, пиридоксин - 1,0 мг, Са-пантотенат - 0,5 мг, биотин -2,0 мкг, дистиллированная вода - до 500 мл При добавлении в питательную опытную среду пизамина и других компонентов общий объем среды составлял 1000 мл Панто-теновую кислоту использовали в виде кальциевой соли (Са-пантотенат), в тексте везде использовали термин «пантотеновая кислота» и, в сокращении, ПК

Из питательной среды исключались вещества с ингибирующим действием или инактивирующие пизамин Поскольку пизамин изучался как антивитамин ПК, среда должна быть свободной от веществ, заменяющих витамин Таким веществом является /3-аланин, который не только должен быть исключен, но и устранена его возможность образования в среде при ее обработке Как известно, эта аминокислота может образовываться при автоклавировании аспарагина с солями аммония (Betz, 1962) Также нами было установлено, что автоклавирование раствора аспарагина с компонентами среды в по-

следующем вызывает подавление роста дрожжей Поэтому раствор аспарагина стерилизовали отдельно от среды Также изолированно от среды стерилизовали и раствор сахарозы для исключения возможности ее карамелизации Стерилизацию всех компонентов среды проводили при температуре 115 °С в течение 20 мин в автоклаве Для растворов пизамина использовали холодную стерилизацию путем фильтрования через бактериальный стерильный микрофильтр с размером пор 0,1-0,3 мк под вакуумом

Дрожжевая методика определения биологического действия пюамина. Активность и характер действия пизамина определяли по ростовой реакции дрожжей, которая выражалась в сухом весе биомассы в определенном объеме среды (мкг/мл), а также в процентах торможения к контролю При стимулировании роста, процент стимулирования учитывался со знаком «+» Инкубация опытов продолжалась 24 ч при 28 °С В зависимости от условий опыта инкубационный период увеличивали до 48, 72, 96 и 120 ч Количество нарастания массы дрожжей определяли турбидиметрически с помощью фотоколориметрии и сухой вес биомассы определяли по калибровочным кривым для каждого вида дрожжей Как правило, повторность всех микробиологических опытов была 5- кратной

Способ остановки и фиксации роста дрожжевых культур для определения роста в постинкубационный период Для прерывания роста дрожжей после инкубационного периода и сохранения неизменным уровня массы дрожжей во всех вариантах на весь период от начала его определения, мы использовали разработанный нами простой и эффективный способ фиксации роста дрожжей добавлением в постинкубационный период 10 % раствора щавелевой кислоты (Смашевский, 1976) Добавление в культуральную синтетическую среду с растущими дрожжами по 0,05 и 0,1 мл на пробирку, с объемом среды 2 мл, 10%-й щавелевой кислоты, что составляло конечную концентрацию щавелевой кислоты 1,25 и 2,5 мг/мл, полностью прекращало дальнейший рост дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae краснодарской расы на всех этапах инкубационного периода (через 12,15,18 и 21 ч)

Количественное определение пизамина и ПК в растительном материале проводили с использованием дрожжевых вышеупомянутых тест-микроорганизмов и калибровочных кривых, отражающих уровень роста дрожжей при определенном строго фиксированном содержании пизамина или ПК

Методы статистической обработки опытов и определения достоверности результатов. Повторность всех микробиологических опытов 5-кратная, другие опыты проводили в 3-5-кратной повторности, с повторением опытов от 2 до 3 раз Статистическая обработка включала вычисление средней арифметической (X), стандартной ошибки (о), коэффициента вариации (cv, %), ошибки репрезентации (Мх) и точности опыта (Р, %), а также стандартной ошибки и доверительных интервалов средних арифметических величин, коэффициенты достоверности различий определяли с помощью таблицы Р Б Стрелкова (1966) и по Н.А Плохинскому (1970) Для статистической обработки также был использован компьютерный вариант программы Microsoft Excel описательной статистики (с уровнем надежности 95 %), результаты которой положены в основу определения достоверности всех проведенных опытов Точность опытов проходит по первому порогу безошибочного прогноза и полностью соответствует допустимому пределу р = 5 %

3. Выделение и химическая идентификация пизамина

Детальное и объективное изучение как природных, так и синтетических БАВ может быть успешным только в случае их выделения в очищенном виде, в котором

нет не только биологически активных, но и химических, примесей Изучение недостаточно очищенного экстракта из растительного материала, хотя обладающего высокой биологической активностью, может приводить к серьезным ошибкам в оценке истинного характера действия исследуемых веществ Поэтому была поставлена цель разработки технологии выделения и очистки пизамина с дальнейшей его химической идентификацией

Технология выделения и очистки пизамина. При изучении свойств пизамина в экстрактах и растительном материале было установлено, что он сохраняет биологические свойства при высушивании в условиях t = 40 °С Вещество не адсорбируется на влажной окиси алюминия, но адсорбируется и связывается на активированном древесном угле, совершенно не смывается с него водой и полностью элюируется 80%-м этанолом Электрофоретические исследования показали, что пизамин имеет отрицательный заряд и перемещается в электрическом поле к аноду, при этом свободно проникает через целлофановую мембрану и полностью задерживается растительным пергаментом Последнее обстоятельство позволило создать трехкамерный прибор из органического стекла, в котором между вышеупомянутыми мембранами, в средней камере, удалось изолировать пизамин из сока и сконцентрировать его электродиализом в дистиллированной воде Важным моментом оказалось то, что пизамин при бумажной хроматографии концентрированного экстракта с использованием в качестве растворителя бутанола, насыщенного водой, остается на старте, тогда как все примеси, в том числе и стимулирующая рост дрожжей фракция, устраняются с растворителем Используя различные системы растворителей для тонкослойной разделительной хроматографии на силуфоловых пластинках (Silufol UF 254), было установлено, что наиболее четкое разделение пизамина от имеющихся примесей получено в системе растворителя изопропанол - вода (5 3), где он компактно располагался в зоне Rf 0,52-0,54, тогда как примеси, окрашиваемые раствором йода, перемещаются с фронтом растворителя выше Rf 0,64 На основании выявленных свойств пизамина была разработана и использована технология выделения и очистки пизамина до индивидуального (гомогенного) вещества, которая заключалась в следующем:

1. Сок этиолированных 14—15-дневных проростков гороха подвергали эяекгро-диализу в трехкамерном электродиализаторе с соотношением камер по направлению к аноду 112 (0,5 0,5 1л) Со стороны катода устанавливалась мембрана из целлофана, со стороны анода - растительный пергамент марки Б В камеру на катоде помещали сок, в остальные, дистиллированную воду Для создания первоначальной ЭДС в камеры с дистиллированной водой добавляли несколько капель 1 н H2S04 Плотность тока составляла 14 мА на 1 см2, электроды платиновые Как указано выше, пизамин концентрируется в растворе между мембранами

2. Фильтрация элекгродиализаха (раствор между мембранами) через слой дезактивированной (влажной) окиси алюминия для очистки от пигментов и других примесей

3. Адсорбция пизамина из очищенного электродиализата фильтрованием через активированный мелкодисперсный уголь, уплотненный в воронке Бюхнера под вакуумом, промывка угля дистиллированной водой до нейтральной реакции, после чего осуществлялась элюция пизамина с угля 80%-м раствором этанола.

4. Упаривание спиртового элюата при 30°С под вакуумом до густого сиропа, который представлял весовой концентрат пизамина.

5. Разделение пизамина на колонке (высота 20 см и диаметр 1,5 см) из измельченной уплотненной хроматографической или фильтровальной бумаги н-бутанолом, насыщенного водой Пизамин полностью остается на старте (верхняя часть колонки),

примеси и биостимулятор, по своему биологическому действию идентичный ПК, устраняются растворителем

6 Содержимое верхней части колонки с пизамином, окрашенное в бурый цвет, извлекали, высушивали на воздухе до исчезновения запаха бутанола, растворяли в дистиллированной воде и фильтровали через бумажный фильтр Водный элюат упаривали при 30 °С в струе воздуха и высушивали над СаС12 до сухой стекловидной массы, легко растираемой в гомогенный порошок

7. На заключительном этапе использовали разделительную тонкослойную хроматографию сухого остатка пизамина на силуфоловых пластинках с растворителем изопропанол - вода (5 3) Последовательно проводили снятие зоны Rf пиз амина, элю-цию небольшим количеством дистиллированной воды, фильтрование через бумажный фильтр и высушивание фильтрата на воздухе Пизамин получался в виде субстанции слегка желтоватого цвета, стекловидной консистенции В стандартных условиях выделения активность торможения роста тестовой культуры дрожжей составляла величину 1,0 мкг/мл (1 мг /л)

Физико-химические свойства пизамина и его идентификация. Получение очищенного пизамина в сухом виде дало возможность провести изучение его физико-химических свойств, осуществить спектрофотометрические и хроматографические анализы для установления его состава и химической идентификации

Пизамин совершенно не растворим в органических растворителях (этаноле, метаноле, ацетоне, хлороформе, бензоле, эфире, толуоле, пиридине, бутаноле), хорошо растворим в воде, в диметилсульфоксиде, трифторуксусной кислоте При растворении в диметисульфоксиде его биологическая активность полностью теряется, но сохраняется полностью в воде и трифторуксусной кислоте Проведенные исследования в лаборатории гетероциклических соединений ГНУ «Государственный НИИ витаминов» (под руководством доктора хим наук В И Гунара) показали, что вещество не кристаллизуется, температура плавления находится в пределах 150-155 °С, причем этапы плавления гетерогенны и могут быть охарактеризованы следующими признаками 100 °С - увеличение, набухание вещества в капилляре, 130 °С — появление в массе субстанции воздушных пузырьков, что указывает на сплавление массы, 140 °С - резкое вспенивание, вспучивание и увеличение объема, 151 °С — плавление по всей массе и 155 °С- истечение субстанции по стенкам капилляра.

Водный раствор пизамина (10 мг/мл) оптически активен, имея угол вращения вправо [à]20 D +60° (С 1, Н20) Поглощение спектра в УФ (в диапазоне от 200 до 300 нм) максимумов не имеет, кривая плавно снижается Характер поглощения не изменяется при увеличении концентрации Указанные признаки свидетельствуют об отсутствии в пизамине ароматических компонентов и других циклических структур

Наличие карбоксильных групп было обнаружено как химически, так и путем образования эфирных производных Этиловый эфир пизамина, в отличие от исходного пизамина, приобретал растворимость в ацетоне, хлороформе, пиридине, эфирная связь подтверждена ИК-спектроскопией Образование эфирной связи приводит к потере биологической активности Химический состав исходного пизамина включает С - 38,6 %, H - 5,99 %, а этиловый эфир пизамина С - 38,42 %, H - 6,5 % Несмотря на то, что нерастворимость пизамина в органических растворах затрудняла это определение, использование приема уплотненной таблетки дало возможность установить в ИК-спектре наличие следующих группировок СН2, ОН, СООН Установленные свойства пизамина в целом характерны для углеводных соединений Принадлежность

пизамина к углеводам была в последующем подтверждена, вещество оказалось растворимым олигосахаридом

В Институте органической химии им И Д Зелинского РАН сотрудниками лаборатории под руководством доктора химических наук, профессора А И Усова методами ГЖХ и хроматографией продуктов метанолиза установлено, что пизамин содержит остатки моносахаров арабинозы (3,3 %), рибозы (7,8 %), ксилозы (11,3 %), маннозы (2,8 %), галактозы (10,7 %), глюкозы (36,4 %) и галакгуроновой кислоты (27,6 %)

Таким образом, пизамин имеет углеводную химическую природу и является биологически активным олигосахаридом Класс этих биологически активных соединений в настоящее время относят к новым регуляторам роста растений с сигнальными функциями в растительных клетках, получивших название олигосахаринов (York, Darvill, Albersheim, 1984, Усов, 1993) Структура и биологическое действие этого класса веществ имеет прямое отношение к изучаемому нами ингибитору По химической природе рострегулирукяцие олигосахариды представляют собой продукты эн-зиматического распада пектина и гемицеллюлозы клеточных стенок, содержат от 7 до 15 моносахаров (галактозы, глюкозы, арабинозы, ксилозы, фукозы, рамнозы, галакгуроновой и глюкуроновой кислот), растворимых в воде и нерастворимых в спирте (Keith, 1985, Darsset, 1985), что полностью совпадает со свойствами и структурными компонентами выделенного нами препарата пизамина

Наличие пизамина в совершенно равных количествах присуще всем видам рода Pisum

При использовании разработанной технологии выделения и получения концентрата из растительного материала в проростках сои, фасоли, кукурузы и сахарной свеклы обнаружен ингибитор роста дрожжей, вероятно близкий по природе и биологическому действию пизамина (Смашевский, Дулин, 1971)

Установление еще одной рострегулирующей функции олигосахаридов, реализующейся посредством ангивитаминного действия в отношении ПК, затрагивает вопросы не только уникальных регуляторных способностей олигосахаридов, но и кофермент-образующих витаминов, раскрывая их участие в модуляции не только ключевых метаболических, но и ростовых процессов, где они могут взаимодействовать через рецепторные и сигнальные механизмы с фитогормонами Изучению биологических функций этого антивитаминного фактора и посвящена наша экспериментальная работа.

4. Синтез, динамика накопления и распределения пизамина в онтогенезе растений гороха

Одним из ключевых вопросов при изучении природных БАВ растительных организмов является выяснение их биосинтеза, динамики накопления и распределения в растении Только в этом случае можно понять их участие и значение в системе регуляции того или иного физиологического процесса. Проявление действия регуляторно-го фактора возможно в условиях его накопления в достаточном (эффективном) количестве, либо при готовности клетки или ее рецепторных механизмов для его восприятия Нами установлено, что действие очищенного препарата пизамина совершенно идентично действию клеточного сока проростков гороха на дрожжевые организмы Это дало возможность использовать сок и экстракты из растений, а также и очищенный препарат для изучения биологических свойств пизамина, с помощью дрожжевых культур Как показывают результаты физиологических экспериментов, пизамин является естественным и нормальным продуктом метаболизма в растениях гороха.

Присутствие пизамина (активация его биосинтеза) выявляется только с началом ростовых процессов Таким образом, эта субстанция присуща только для растущего органа, полностью исчезает при потере им жизнеспособности Его концентрация в листьях снижается по мере старения и пожелтения и полностью отсутствует в желтых листьях Пизамин не выявлен в сухих семенах и появляется только через 24 ч после их увлажнения, когда в семени появляются признаки проклевывания корешка, увеличиваясь количественно во времени до 72 ч Содержание антивитамина в органах 72-часовых проростков, уже дифференцированных на корень и стебелек» оказалось различным Особенно проявляется эта разница в содержании пизамина в роке различных органов проростка по мере роста. У 10-дневных проростков наибольшая активность подавления роста дрожжей проявлялась у сока из эпикотиля и второго междоузлия, обладающих наименее активным ростом, тогда как в третьем и четвертом с интенсивным ростом содержание ингибитора снижается, а в пятом, только начавшем рост, ингибитор вовсе не обнаружен

Пизамин не поступает в стебель из семядолей при прорастании, он не образуется при автолизе семядолей ферментными экстрактами из проросших семядолей, не обнаружен в экссудате декапитированных над корневой шейкой проростков В то же время олигосахарид образуется в изолированных культурах корней и изолированных зародышах гороха, на синтетической питательной среде, лишенных притока пластических веществ из семядолей Это свидетельствует о том, что образование пизамина происходит de novo в процессе роста на определенном этапе онтогенеза растительных клеток, где он и проявляет действие, не транспортируясь по растению Это предполагает, что он образуется, как ингибитор роста, во всех растущих частях проростка, хотя и в разных количествах Наблюдается тесная обратная связь между содержанием пизамина в соке междоузлий с их линейным ростом Чем больше подавление роста дрожжей пизаминсодержащим соком, тем короче междоузлие и его продолжительность роста и наоборот Однако образование и накопление пизамина связано не с характером роста междоузлий, а, наоборот, их характер, скорость и продолжительность роста, конечные линейные размеры являются следствием начала биосинтеза и интенсивности накопления в них пизамина.

Влияние условий на образование пизамина в проростках гороха. Свет и качество света влияют на количественное содержание пизамина в проростках, но это не сказывается на характере распределения его в различных частях и органах проростка, рост которых четко коррелирует с его содержанием Как следует из табл 1, наибольшее содержание пизамина накапливается в эпикотиле, существенно меньшее его количество образуется во всех вышележащих междоузлиях, причем значительно больше на свету, чем в темноте Причем наблюдалось наименьшее количество в третьем междоузлии Такой же характер накопления и в темноте, что соответствует и линейным размерам междоузлий На свету длина эпикотиля составляла 12,2 мм, второго междоузлия — 17,8 мм, третьего — 47,0 мм, в темноте, соответственно, 23,3, 41,5, 83,0 мм На образование пизамина влияет качество света монохроматический красный свет способствует накоплению пизамина, как и естественный белый, тогда как синий свет давал тот же эффект снижения, что и темнота. Это характерно и для других ингибиторов роста, у которых белый свет (Ангелова, 1982, Tsurumi, Noguchi, Hashumoto, 1990) и красный свет (Muu-, Zhuling, 1983) способствуют увеличению их накопления в междоузлиях других растений

Таблица 1 Влияние света на количественное содержание пизамина в междоузлиях 10-дневных проростков гороха

Междоузлие Содержание пизамина, мкг/мл

На свету В темноте

Эпикотиль 15,40 ± 0,62 10,02 ±0,15

2-е междоузлие 8,41 ±0,23 0,60 ±0,01

3-е междоузлие 1,00 ±0,02 0,45 ± 0,01

Удаление семядолей, корней, листьев и точек роста у проростков приводило к снижению роста проростка в целом за счет уменьшения длины междоузлий, но существенного влияния на содержание пизамина в эпикотиле и других междоузлиях не обнаружено Можно полагать, что снижение ростовой активности по сравнению с контролем связано с изменением трофического и гормонального статуса. Удаление листьев снижает содержание гибберелли-нов, а точек роста - еще и ауксинов, семядолей - пластических веществ Пизамин образуется во всех частях проростка Его появление и количественное содержание определено фазой роста клетки и специфично для разных органов проростка

Влияние ингибиторов транскрипции, трансляции и дыхания на образование пизамина. Исходя из факта образования пизамина в проростках гороха de novo и его олигосахаридной природы, можно предположить, что он может быть фрагментом распада полисахаридных полимеров клеточной оболочки Это может происходить с участием специфических ферментов, которые образуются на определенном этапе онтогенеза развивающегося органа или растения в целом посредством экспрессии генетического кода, несущего информацию биосинтеза белка-фермента, инициирующего образование пизамина

Для разрешения этого вопроса мы использовали метод ингибиторного анализа, применив ингибиторы синтеза белка (трансляции) хлорамфеникол (0,5 мг/л), цикло-гексимид (4,0 мг/л) и актиномицин D (4,0 мг/л) - ингибитор синтеза РНК (транскрипции), замачивая семена в растворах ингибиторов в течение 24 ч Хлорамфеникол, как ингибитор трансляции, подавляющий сборку белка на полисомах, полностью прекращал образование и накопление пизамина в органах проростков гороха (рис 1) и тестируемый сок вместо торможения несколько стимулировал рост дрожжей В контроле, напротив, сок корня и, особенно, стебля подавлял рост дрожжей, что подтверждало высокий уровень накопления пизамина. Подавлять образование пизамина хлорамфеникол мог только через уменьшение синтеза специфического белка-фермента, ответственного за его образование Подтверждением этому является тот факт, что циклогексимид также ингибировал биосинтез пизамина. Однако актиномицин D, ингибитор синтеза РНК, вызывая, в сравнении с циклогексимидом, более интенсивное подавление роста корня и стебля, совершенно не влиял на образование пизамина, содержание которого в соке проростков в данном варианте эксперимента, было таким же, как и в контрольных образцах растений Полученные данные позволяют утверждать, что образование пизамина зависит от специфического белка-фермента и ини-

0 01 0,02 0 03 0 04 0 05 Внесен сок мл/мл

- Корень ( контроль) Стебель (контроль)

- Корень(хлорамфеникол Сгебель(хлорамфеникол)

Рис 1 Подавление хлорамфениколом образования и накопления пизамина у 5-дневных проростков гороха, выраженное в росте дрожжей

циированный механизм образования пизамина актиномицином не подавляется, хотя общеизвестно, что он ингибирует формообразовательные процессы в растениях, что и согласуется с нашими данными

Можно с уверенностью предположить, что подавление образования ингибитора олигосахаридной природы циклогексимидом и хлорамфениколом обусловлено прекращением образования ферментов глюканаз, участвующих в катаболизме клеточных полисахаридов с образованием фрагментов при растяжении клеточных стенок (Stone, Clarke, 1992) Результатом этого ингибирования является резкое падение образования пизамина.

Можно допустить, что индукция включения образования пизамина обусловлена эндогенной ситуацией различного генеза, индуцирующей экспрессию генетического кода, несущего информацию специфического белка-фермента, идентичного или родственного глюконазам, образующего пизамин при определенных физиологических условиях

Снижение образования пизамина было отмечено под действием дыхательных ядов 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) и фтористого натрия (NaF) на модели 5-дневных проростков гороха. Ингибирующее действие экстракта из семядолей на рост дрожжей устранялось полностью или частично в корне При испытанных концентрациях инактивация ингибитора в стебле не обнаружена. Это свидетельствует о его высоком содержании в стебле, способного полностью подавлять рост, но, в целом, служит подтверждением связи образования пизамина с метаболическими процессами в клетке

Любые факторы, снижающие активность или содержание пизамина в среде или соке из растений, способствуют проявлению стимулирующего действия находящейся в них ПК Это указывает, что пизамин блокирует биологические функции как эндогенной, так и экзогенной ПК

5. Особенности роста междоузлий проростков гороха в связи с содержанием в них эндогенного пизамина, пантотеновой кислоты, динамики содержания аминокислот и белка и активности окислительных ферментов

Несмотря на длительный период накопления сведений о природных антивитаминных факторах в растительных организмах, сведения об их действии и физиологическом значении в высшем растении в доступных источниках не обнаружены Настоящее исследование практически единственное, направленное на установление участия природного антивитамина ПК в ростовых процессах и метаболизме высших растений

В начале данного этапа исследований было изучено влияние накопления пизамина на характер ростовых взаимоотношений системы «корень - стебель» и роста междоузлий проростков гороха. В предварительных исследованиях установлен дифференцированный рост корня и стебля после прорастания семян проростков гороха, являющегося общей закономерностью практически у всех растений, при котором первоначально и корень растет быстрее и, после его формирования, вступает в интенсивный рост стебель

Этому вопросу уделяется большое внимание, но в основном для уже вегетирующих растений Целый ряд исследователей (Mougo, Whittington, 1970, Jackson, 1993, Кудояро-ва, Веселое, Усманов, 1999, Полевой, 2002, Высоцкая, 2005, Коф, Виноградов, Ооржак, 2006) объясняют этот феномен перераспределением питательных ресурсов в пользу корня, стрессовой ситуацией в среде (недостаток питания или воды, присутствие экологически неблагоприятных факторов) как адаптацию, направленную на оптимизацию ресур-

сов, в значительной мере предопределенную гормональной транслокацией и генетической детерминированностью и другими причинами

На основании полученных нами данных можно полагать, что пизамин воздействует как один из важнейших эффекторов на регуляцию (формирование) соотношения роста системы «корень - стебель» после прорастания семян растения, воздействуя на ход метаболических процессов, в том числе во взаимодействии с другими биологически активными веществами

Установлено, что у проростков гороха вначале появляется и интенсивно растет корень, и только на вторые сутки появляется эпикотиль и второе междоузлие, но их появление не влияет на рост корня, так как их линейный рост подавлен и быстро завершается В этих междоузлиях, как было показано, уже в начальном периоде их появления накапливается в больших количествах ингибитор пизамин И только на 3-4-е сут роста появляется 3-е междоузлие, при этом рост корня замедляется, но он к этому времени достигает длины 24-25 см с широкой сетью боковых корней В третьем междоузлии резко снижено накопление пизамина, и рост его характеризуется высокой интенсивностью, превышающей линейные размеры предыдущих в 3-4 раза (рис 2) Такой характер ростовых взаимоотношений между ростом корня и стебля в самом раннем периоде онтогенеза обеспечивает формирование корневой системы, способной обеспечить растущий проросток при переходе на автотрофный способ питания необходимым количеством воды, минеральных веществ, а также БАВ, синтезируемых в корне

Отмечена четкая ритмичность последовательности приростов корня и стебля, чередование ускорения и замедления роста через равные промежутки времени При замедлении прироста корня следует усиление роста стебля, и наоборот Ритмичность взаимоотношений роста особенно наглядно проявляется в росте междоузлий Каждое последующее после его появления характеризуется чередованием периодов интенсивного роста и замедления Следует отметить, что при замедлении одного из сопряженного междоузлия, другое ускоряет рост, интенсивный рост последующего начинается с прекращения роста предыдущего

Детерминированный рост органов проростков корня, стебля и междоузлий, ритмичность их ростовых процессов обусловлены не только изменением известных гормональных соотношений, но и, как следует из наших экспериментов, содержанием антивитамина пизамина, совершенно определенно в динамике образования соответствующего характеру их роста.

Дифференцированность линейного роста междоузлий проявляется не только в различии размеров, но и в скорости и продолжительности роста Это различие сохраняется и на свету, и в темноте Эпикотиль и второе междоузлие всегда имеют укороченные размеры, они быстро завершают рост, на их узлах отсутствуют морфологически развитые листья, тогда как последующие междоузлия отличаются резким увеличением линейных размеров В темновых условиях все без исключения междоузлия увеличиваются в размерах, но сохраняют дифференцированность линейного роста.

Время наблюдений ( суг) —•—Длина корня ■ Высота стебля

—л— Приросты корня х Приросты стебля

Рис 2 Динамика роста корня и стебля в онтогенезе проростков гороха

Тем не менее, соотношение размеров междоузлий к общей длине проростков в обоих случаях практически одинаково Это указывает на то, что характер роста междоузлий контролируется эндогенными факторами на уровне целого организма и носит закономерный и строго определенный характер Действие света включает иные механизмы, которые одинаково влияют на рост всех междоузлий, не затрагивая другие, помимо рассматриваемого, регуляторные механизмы Это предположительно может бы связано с взаимодействием освещения с геномом, контролирующего длину междоузлий локусом 1е (ЫоггоЫо, весит, 1984) Нами установлено, что на свету усиливается синтез пизамина, а в темноте - снижается, что и обеспечивает уменьшение или увеличение длины междоузлий

Количественное определение пизамина в междоузлиях 12-дневных проростков высокорослого гороха показало исключительно точную корреляцию между содержанием в них пизамина и скоростью роста и линейными размерами (рис 3) Эксперименты подтверждают, что чем выше содержание пизамина, тем короче междоузлие Совершенно аналогичное распределение обнаружено в междоузлиях карликового гороха. Это позволяет сделать обобщение, что рост растения связан с изменением уровня и динамики ростовых процессов в онтогенезе как органов, так и целого растения, основанных на эндогенном механизме саморегулирования, реализуемого на генетическом уровне контроля клеточного цикла Локализация и активность пизамина в междоузлиях проростков гороха, по всей вероятности, детерминирована в соответствии с онтогенетической программой роста междоузлий Это соответствует полученным результатам изучения содержания и динамики накопления пизамина в междоузлиях в зависимости от этапов их роста. В начале роста, когда клетки междоузлия вышли из эмбриональной фазы роста, ингибитор отсутствует, на что указывает наиболее эффективное стимулирование соком тестовой культуры дрожжей Но уже на этапе интенсивного роста растяжения проростков у этого междоузлия отмечается начало накопления ингибитора, а в фазу замедления роста тормозящее действие пизамина возрастает и при его полном прекращении, эффект торможения максимален

Таким образом, чем быстрее и в бблыпих количествах образуется и накапливается пизамин в растущем междоузлии, тем раньше наступает ограничение его роста и тем оно имеет меньшие линейные размеры при завершении Скорость роста, его продолжительность и линейные размеры междоузлий являются следствием начала, интенсивности и количества накопления пизамина в проростках

Ритмичность роста корня, стебля, междоузлий и динамики накопления в них пизамина, которые стабильны и эквивалентны как на свету, так и в темноте, указывает на закономерность этих процессов Выявленная закономерность является следствием функционирования стабильной системы, состоящей го регуляторных факторов, находящихся под генетическим контролем Рост вышележащего междоузлия начинается только тогда, когда в предыдущем ростовые процессы затухают и достигает максимума, когда в нем они прекращаются При достижении максимального роста в клетках происходит выключение механизмов линейного роста растяжением и включение

Межд оузлие

■ Содержание пизамина —*—Длина междоузлий в мм

Рис 3 Зависимость роста междоузлий гороха Ришт ¡апуит от содержания в них пизамина

механизмов дифференцировки, а в это время в последующем междоузлии происходит другой процесс - включение механизмов интенсивного роста.

Участие пизамина как антивитамина ПК в ростовых процессах позволяет считать его эндогенным регулятором, действующим в клетке в качестве эффектора универсальной метаболической системы КоА и многочисленных производных ацил-Б-КоА К настоящему времени физиологический и метаболический эффекты олигосахаридов с антивитаминными свойствами не описаны Этот факт нами впервые установлен для пизамина, относящегося к классу фитоолигосахаридов

Зависимость роста междоузлий проростков гороха от содержания и соотношения в них эндогенных пизамина и ПК. В связи с тем, что ПК проявляет биологические функции только в биотрансформированной форме, а именно в составе КоА или фосфопантотеинпротеидов (Белозерский, 1973, Мойсеенок, Кочурко, Гуринович и др, 1977), было изучено соотношение эндогенного пизамина в междоузлиях проростков гороха с содержанием биологически активных форм ПК в междоузлиях с различным характером их роста. Определение содержания свободной и связанной ПК микробиологическим методом и методом ГЖ хроматографии показало, что их содержание совершенно адекватно характеру роста междоузлий и содержанию в них антивитаминного фактора. В слаборасгущих междоузлиях, эпикотиле и 2-м междоузлии с ранним и интенсивным накоплением антивитамина преобладает свободная (нетрансформиро-ванная) форма витамина, которая не включена в процесс биосинтеза КоА, тогда как в 3-м и последующих - 4-м и 5-м - с низким содержанием пизамина и отличающихся интенсивным ростом преобладает связанная (фосфорилирован-ные предшественники КоА, КоА, ацил-КоА) Определение содержания свободной и связанной ПК показало, что их соотношение совершенно адекватно характеру роста междоузлий и содержанию в них антивитаминного фактора. В слаборасгущих междоузлиях, эпикотиле с ранним и интенсивным накоплением антивитамина преобладает свободная форма витамина, тогда как в 3-м и последующих 4-м и 5-м, с низким содержанием пизамина, преобладает связанная форма Однако, общее содержание витамина в междоузлиях, независимо от их характера роста и содержания пизамина было почти одинаковым и даже несколько превышало средний уровень в междоузлиях с ограниченным ростом (рис 4) Это вполне объяснимо, так как пизамин не влияет на синтез витамина, но способен блокировать её включение в связанные (фосфорилированные) формы Это согласуется с нашими данными по нарушению утилизации дрожжами ПК в присутствии пизамина, снижению содержания связанной формы витамина и КоА в тканях животных и интенсивному выделение ими с мочой свободной ПК

Следовательно, подавление линейного роста междоузлий пизамином связано не с подавлением синтеза витамина, а блокадой его связанной (фосфорилированной) активной формы, что может тормозить биосинтез КоА и протекание важнейших метаболических процессов и, как итоговое следствие, подавляет рост растяжением Вероятно, создание условий повышения содержания КоА в растительной клетке может служить

8 8 81

I ъ

И ^

В 5

Эпик 2 3 4 5 Междоузлие Пантотеновая кислота

—•—обчия

■ свободная — л— Связанная

Рис 4 Содержание различных форм ПК в междоузлиях с различным характером роста

эффективным путем повышения активности ростовых процессов

Влияние эндогенного пизамина на динамку содержания аминокислот и белка в междоузлиях в связи с характером их роста. Ряд исследователей пытались объяснить механизм и причины перехода интенсивного роста проростков к замедлению и прекращению (Burstrom, 1974, Norcho-cote, 1972, Broughton, 1969, Walton, Soofi, 1969, Гамбург, Мальцева, Ковульский, 1969, Walbot, 1972) Однако не выявлено конкретной причины прекращения роста растяжением Метаболические, не гормональные пути, объясняющие характер роста клеток растяжением, находят применение в пояснении детерминированных ростовых процессов Общепринято мнение, что динамика образования нуклеиновых кислот всегда связана с динамикой белкового и аминокислотного обмена, что коррелирует с динамикой роста междоузлий Учитывая, что пизамин связан с биосинтезом и функцией КоА, участвующего в катализе аминокислотного и белкового обмена, была изучена возможность этой связи с характером роста междоузлий

Установлено, что большинство свободных протеиногенных аминокислот (изолей-цин, о-аминоадипиновая, фенил-аланин, лейцин, метионин, серии, ск-аланин) в эпикотиле и 2-м междоузлии с ограниченным ростом, резко изменяют количественное содержание в зависимости от динамики накопления пизамина в междоузлиях и характером их роста. При максимальном накоплении в них пизамина выявлено достоверно меньше указанных аминокислот, чем в 3-м и 4-м с интенсивным и пролонгированным ростом В первом случае их содержание составило, соответственно, от 4,5 до 84,5 мкМ (в зависимости от вида аминокислоты), во втором - от 27,0 до 132,8 мкМ Причем в суточном возрасте оно было выше, чем в более позднем и стадии прекращения роста. Особенно это четко выражено в эпикотиле и 2-м междоузлии Так, например, гистидин в эпикотиле в суточном возрасте содержался в количестве 37,5 мкМ, а в 14-дневном возрасте - 0, во 2-м и 3-м междоузлии - 40,2 и 2,8 мкМ, соответственно Следует подчеркнуть, что цистин, который инакгивирует антивитаминное действие пизамина, в эпикотиле и 2-м междоузлии отсутствовал вовсе

Во всех междоузлиях, хотя и на разном уровне, в начале интенсивного роста при низком содержании пизамина наблюдается повышенное содержание большинства протеиногенных аминокислот, а, при замедлении и прекращении роста, при повышении содержания пизамина содержание аминокислот снижалось вплоть до полного исчезновения Это указывает на то, что накопление в междоузлиях пизамина может служить фактором управления пластики клетки, подавляющего аминокислотный и белковый обмен, индуцирующего переход клеток в фазу дифференциации и прекращения роста. Это подтверждается в наших опытах с изучением динамики содержания общего белка в зависимости от интенсивности этапа роста междоузлия (табл 2) Во всех междоузлиях выявлена совершенно идентичная тенденция падения содержания белка от начала роста растяжением до его прекращения В начале роста накопление протеинов высокое, при замедлении роста - пониженное и наиболее низкое при отсутствии роста. Можно полагать, что переход к замедлению и прекращению растяжения клеточных стенок междоузлий может быть следствием метаболической переориентации биохимических процессов в клетке, связанной с биосинтезом и утилизацией аминокислотных остатков и торможением белкового обмена, в котором может участвовать пизамин непосредственно или опосредованно через КоА-зависимые процессы биотрансформации аминокислот в энергетических и структурных целях

Следует подчеркнуть, что динамика накопления пизамина в междоузлиях совершенно идентична динамике содержания белка на различных фазах роста междоузлий растяжением, имеющую обратную пропорциональную зависимость Это может

быть предпосылкой накопления энзиматических и транспортных белков для обеспечения дальнейшего роста и развития растения

Активность окислительных ферментов и дыхания в связи с динамикой содержания эндогенного пизамина и ростом междоузлий проростков гороха. Уровень активности каталазы был совершенно одинаков во всех междоузлиях вне зависимости от их местоположения на стебле, продолжительности роста и конечных линейных размеров У разных междоузлий, но одного суточного возраста, активность каталазы также одинакова (рис 5), однако она максимальна у растений молодого возраста, испытывающих определенные стрессовые нагрузки Активность фермента закономерно снижалась с возрастом междоузлия одинаково во всех междоузлиях и это снижение не зависело от накопления пизамина.

В то же время активность пе-роксидазы четко была связана с характером роста междоузлий В эпи-котиле со слабым и кратковременным ростом, высоким содержанием пизамина, активность фермента сохранялась стабильно на высоком уровне за период наблюдения до 12 суток В междоузлиях с интенсив-

Таблица 2

Динамика содержания общего белка в междоузлиях проростков гороха на различных этапах роста

Междоуз- Этапы роста Содержание общего белка

мгна 1 г сырого веса мг на 1 г сухого веса

лие междоузлий

Эпикотиль Интенсивный рост Замедление роста Рост закончен 2,285 2,677 1,896 154,36 149,35 102,61

2-е междоузлие Начало роста Интенсивный рост Замедление роста Окончание роста 3,552 2,921 2,668 1,997 190,94 157,07 148,44 107,35

Роста нет 1588 87,8

3-е междо- Начало роста 3,002 159,91

узлие Интенсивный рост Замедление роста Роста нет 1,451 1,456 1,062 80,59 80,87 59,00

4-е междоузлие Начало роста Интенсивный рост Завершение роста Роста нет 3,655 1,814 1,024 0,979 175,18 76,78 62,42 59,16

* I Ü 4 3 2 1 О

ным и продолжительным ростом, активность фермента резко снижалась с переходом к интенсивному росту на 4-6 сутки Однако в суточном возрасте у всех междо-узлий активность была такой же высокой, как и у эпикотиля (рис 6) Таким образом, выявляется взаимосвязь между содержанием пизамина и динамикой активности пероксидазы, что согласуется с данными о влиянии пизамина на активность пероксидазы in vitro

(Смашевский, 1976)

Как известно высокая пероксидазная активность характерна для стадии интенсивной дифференцировки клеток и тканей Фермент катализирует процессы лигнифи-кации клеточных стенок, окисление ИУК, что приводит к прекращению роста клеток (Запрометов, 1977, Cross, 1977, Thope, Than Van, Gaspar, 1978, Паду, 1995, Максимов, Черепанова, 2006)

Междоузлие Возраст междоузлия в сутках □ 1 в2 В4 В6 аэ

Рис 5 Изменение активности каталазы в междоузлиях проростков гороха в процессе роста

Не обнаружено связи между содержанием пизамина в междоузлиях и динамикой его накопления с интенсивностью дыхания ингактных междоузлий проростков гороха. Установлено закономерное изменение интенсивности дыхания в онтогенезе междоузлий только от фазы роста. Изменение интенсивности дыхания было совершенно одинаково для всех междоузлий, находящихся в одинаковой фазе роста, независимо от продолжительности фаз роста, конечной линейной величины и содержания в них пизамина

6. Антивитаминное действие экзогенного пизамина на ростовые и некоторые метаболические процессы высших растений

Влияние пизамина на рост изолированных культур корней и тканей различных растений. Важнейшим моментом изучения пизамина, как антивитамина пантотеновой кислоты, обнаруженного в растительном организме, является выяснение его биологического действия при экзогенном воздействии на ростовые процессы высших растений, что может быть в дальнейшем использовано в технологиях управления ростовыми процессами растений

Действие экзогенного пизамина исследовалось на изолированных культурах корней и тканей, выращиваемых на синтетической питательной среде с контролируемым химическим составом. Использовали изолированные корни кукурузы (Zea mais), полученные в нашей лаборатории, и изолированные культуры корней люцерны (Medirago satica L, сорт 08УР11), полученные из Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН (г Москва) Изолированные корни показали высокую чувствительность к действию пизамина У кукурузы линейный рост подавлялся при концентрации 60 мкг/мл на 54,4 %, а люцерны при 10 мкг/мл на 63,4 % Наблюдалось не только подавление роста, но и изменение морфологической структуры В частности, у корней кукурузы наблюдали разрастание объема клеток апекса корня, разрыхление в нем ткани, подавление фазы растяжения Закладка боковых корней люцерны наблюдалась на расстоянии 2-3 мм от точки роста, а весь корень имел укороченный и утолщенный вид

Кроме того, пизамин оказывал заметное подавление митотического деления растительных клеток Добавление пизамина в синтетические среды вызывало значитель-

Междоузлие Возраст междоузлий в сутках

а2о4пбв8вюо12

Рис 6 Изменение активности пероксидазы в междоузлиях проростков гороха в зависимости от характера их роста

эгоо сырой вес / сухой вес 0,15

и 2800 / 0.1*

S моо / 0,12

i¿ S гооо (/ l/ 0,10

s § IS00 f <£• 0,0В

«S О О 1200 / J/""^ /г 0,01

ее 2 800 , S / л1* 0,0»

400 о,ог

0 0

0 ÍL Т 13 ¿IOS 7 13 21 Продолжительность инкубации в сутках

Рис 7 Влияние пизамина на рост суспензионной культуры ткани женьшеня 1 - контроль, 2 - пизамин 250 мкг/мл, 3 - пизамин 500 мкг/мл

ное подавление митотического деления клеток апикальной меристемы кончиков корней лука, выращиваемого на 1 % растворе сахарозы с внесением пизамина в количестве 250 и 500 мкг/мл Количество делящихся клеток уменьшалось в 2-2,5 раза. Подавление клеточного деления пизамином особенно убедительно продемонстрировано на суспензированных изолированных культурах клеток диоскореи дельтовидной (Dioskorea deltoids) и женьшеня (Panax Gighzeng С А Меу), выращиваемых на среде, приготовленной по Мурасиге и Скугу (Murashige, Skoog, 1962) В опытном варианте при содержании пизамина 50 мкг/мл на 3-6 сутки наблюдалась задержка роста ткани диоскореи После 9 суток происходило возобновление роста и к 13-м суткам сухой вес клеток достигал контроля Наблюдалась задержка лаг-фазы, что характерно и для реакции дрожжей (см разд 8)

Изолированная ткань женьшеня была менее чувствительна. Устойчивое выраженное подавление нарастания клеточной массы было достигнуто при концентрации в 250-500 мкг/мл пизамина и характер роста отличался от диоскореи (рис 7) В данных концентрациях слабое нарастание массы клеток еще сохранялось до 10 суток, после чего полностью прекращалось К 21 суткам появлялись изменения агрегатного состояния клеточной массы с образованием плотных конгломератов, интенсивное пожелтение и потемнение ткани, особенно в варианте с внесением 500 мкг/мл пизамина Результаты этих исследований свидетельствуют, что пизамин может подавлять ростовые процессы в растении и через механизмы, обеспечивающие клеточное деление Однако более выраженная специфичность действия пизамина на процессы роста проявляется через подавление фазы растяжения

Влияние экзогенного пизамина на рост клеток растяжением и характер его взаимодействия с фитогормонами jS-ИУК и ГК. Изучение влияния экзогенного пизамина на рост в фазе растяжения проводилось на 3-м изолированном, наиболее интенсивно растущем междоузлии 7-ми дневных проростков гороха (Pisum sativum L) сорта Рамонский 77, вступившего в фазу роста клеток только растяжением, а также на декапитированных колеоптилях 3-х дневных проростков пшеницы (Trincum vulgare L) сорта Альбидум 43, которые растут только за счет растяжения клеток Так как фаза роста клеток растяжением в растении стимулируется фитогормонами 0-ИУК и ГК, а пизамин ее подавляет, то фитогормоны изучались для дополнительного выяснения механизмов ингибиторной активности пизамина

Добавление в раствор пизамина, в котором находились междоузлия и колеоп-тили, в количестве 500 мкг/мл вызывало подавление роста междоузлий на 64,8 %, а декапитированного колеоптиля на 71,3 %, что, безусловно, связано с подавлением пизамином роста растяжением Добавление ГК в количестве 40 мкг/мл не восстанавливало рост междоузлия и ,частично, эпикотиля, тогда как внесение 0,05 мкг/мл инкубационной среды /3-ИУК полностью восстанавливало рост и междоузлия и колеоптиля Этот факт подтверждается еще тем, что использование в опыте недекапитирован-ных колеоптилей показало, что они совершенно не реагировали на действие пизамина Это объяснимо, так как в верхушке колеоптиля синтезируется 0-ИУК, поступающая в него базипетально и снимающая действие пизамина в зоне растяжения

Неадекватное действие фитогормонов на активность пизамина в подавлении фазы роста растяжением указывает, что взаимодействие их с пизамином не однотипно с интактным растением Предполагается, что пизамин как антиметаболит, действует подавляющим образом на клеточный метаболизм, при котором действие фитогормонов ограничено Иначе говоря, неспецифичность взаимодействия пизамина с фитогормонами вероятнее всего связана с подавлением метаболических процессов, на фо-

не которых осуществляется реализация функций ГК и JS-ИУК Субстратзависимые биосинтезы могут бьггь лимитирующими в проявлении функций фитогормонов (Zazimalova, Napier, 2003)

Как оказалось, пизамин тормозит рост междоузлий у интактных проростков гороха В опытах с нанесением экзогенного пизамина в виде 1 % ланолиновой пасты на узлы проростков вызывало подавление роста междоузлий, кроме уже закончивших рост эпикотиля и второго междоузлия, и, особенно, подавление усиливалось при удалении листьев Удаление листьев при их появлении на узлах междоузлий также снижало рост междоузлий, по всей вероятности, связанного с устранением источника поступления в них ГК Нанесение экзогенной ГК в виде 0,25 % ланолиновой пасты стимулировало рост интактных проростков, при этом восстанавливался рост после дефолиации, но не влияло на рост эпикотиля и 2-го междоузлия с максимальным содержанием пизамина. Таким образом, рост междоузлий обусловлен развитием на них листьев, как источника ГК, и концентрацией пизамина в междоузлиях Можно полагать, что пизамин снимает действие ГК, вызывая ограничение роста междоузлий

/З-ИУК в условиях вариантов этого эксперимента оказалась не эффективной Влияние экзогенного пизамина на синтез хлорофилла, фотосинтетическую активность и процесс дыхания растений. Содержание хлорофилла в междоузлиях проростка гороха полностью коррелирует с содержанием в них пизамина, точно так же как и линейный рост При прорастании семян гороха на свету в образующихся эпикотиле и 2-м междоузлии активно синтезируется хлорофилл Однако по мере накопления в них пизамина происходит постепенное исчезновение зеленой окраски Внесение экзогенного пизамина в раствор с зеленеющими на свету изолированными семядолями огурца и кабачка также снижает в них содержание хлорофилла, пропорционально повышению концентрации антивитамина. Это, несомненно, свидетельствует о подавлении синтеза хлорофилла. Этот факт нами был использован для окончательного подтверждения антивитаминного действия пизамина, связанного с подавлением каталитических функций КоА Как известно, синтез хлорофилла имеет прямую зависимость от КоА, участвующего в образовании предшественника 5-аминолевуле-новой кислоты, преобразуемой в протохлорофиллид, который за счет энергии света превращается в хлорофилл а (Тарчевский, 1977) Хлорофилл а образуется из предшественников в биохимической темновой фазе, а его позеленение идет на свету, не зависимо от синтетических процессов Таким же образом и хлорофилл б образуется из готовой молекулы хлорофилла а (Шлык, Фрадкин, Рудой, 1974) При освещении изолированных зеленеющих семядолей огурца в течение 24 ч без антивитамина содержание хлорофилла составило 17,42 мг/л, а при освещении на протяжении 5 ч с последующим 19-часовым периодом темноты - только 7,186 мг/л В присутствии 300 мкг/мл пизамина в первом случае содержание составило 13,467 мг/л, а во втором световом режиме, так же как и в контроле, - 7,874 мг/л Содержание хлорофиллов а и б составило на непрерывном свете в контроле 50,9 и 49,1 %, соответственно, а в присутствии пизамина - 51,6 и 40,4 %, т е несмотря на снижение общего содержания, соотношение форм не изменяется При освещении (5 ч) с последующей темнотой (19 ч) содержание в контроле хлорофилла составило 79,4 %, а хлорофилла б - 20,65 %, а в присутствии пизамина (300 мкг/мл), соответственно, 80,4 и 19,6 % Это убедительно доказывает антивитаминное действие только на процесс биосинтеза предшественников хлорофилла путем подавления функции КоА в биохимической фазе синтеза хлорофилла а, но совершенно не влияет на превращение хлорофилла на свету, так же как и на преобразование его в хлорофилл б

Таким образом, подтверждена связь антиметаболического действия антивитамина ПК с функциями КоА При названной концентрации (300 мкг/мл) пизамин подавляет метаболические процессы и фотосинтеза, снижая усвоение и накопление углерода в листьях фасоли на 83,8 %, а также аэробное дыхание, где КоА является ключевым кофактором, участвующим в инициации этого цикла, катализируя окислительное декарбоксилиро-вание а-кетокислот, цитратсинтетазную и АТФ-цитратлиазную реакции Наблюдалось устойчивое подавление интенсивности дыхания листьев фасоли, контролируемое снижением поглощения кислорода, которое сохранялось в течение всего периода эксперимента (рис 8)

7. Видовая специфичность и механизм действия пизамнна как антивитамина ПК в растительном и животном организмах

Антивитаминное действие пизамина в растительном организме Изучение антивитаминных эффектов пизамина и его взаимодействия с ПК на интактном растении технически затруднено, поэтому исследование влияния ПК на ингибирующее действие пизамина на ростовые процессы было проведено на изолированных культурах корней люцерны Как следует из результатов экспериментов, в растительном организме пизамин проявляет специфические свойства антивитамина ПК (табл 3)

Внесение пизамина в культуральную среду в количестве 50 мкг/мл подавляло рост на 25,8 %, что полностью нивелировалось эквимолярными концентрациями ПК и

|3-аланина. Однако концентрация /2-алани-на, равная 40 мкг/мл, эквимолярная 100 мкг/мл ПК, тормозила рост корней до 63,7 % Предупреждение ингибирую-щего эффекта пизамина /8-аланином в культуре изолированных корней люцерны вероятно обусловлена его превращением в ПК Он в растительной клетке легко конденсируется с пантоевой кислотой в пантотенатсинтетазной реакции с образованием витамина. Поэтому 0-аланин полностью заменяет ПК и для дрожжей, и для растений, устраняя дефект функции КоА-БН, вызванный пизамином Аспарагин в данных условиях усиливает антагонизм между пизамином, ПК и (3-аланином, как это показано и для дрожжей Эквимолярные концентрации ПК и /3-аланина также совершенно одинаково стимулируют рост дрожжей и инактивируют пизамин (табл 4)

минуты

-•-Контроль

— а- Пизамин 300 мкг/мл

Рис 8 Подавление пизамином интенсивности дыхания листьев фасоли

Таблица 3

Инактивация ингибирующего действия пизамина на рост изолированных корней люцерны ПК и /3-аланином

Варианты опыта Длина главного корня, мм % торможения или стимуляции

Контроль 122,1 ± 7,89 0

Пизамин 50 мкг/мл 90,6 ±5,05 25,8 %

Пизамин + ПК 5 кг/мл 110,5 ±13,8 9,5

Пизамин + ПК 50 мкг/мд 113,6 ±9,97 6,9

Пизамин + ПК 100 мкг/мл 147,0 ±5,90 +20,4

Пизамин + Алании 2 мкг/мл 123,3 ± 1,95 +0,98

Пизамин + /3-Алании 20 мкг/мл 129,5 ±3,85 +6,61

Пизамин + /3-Алании 40 мкг/мл 44,3 ± 1,59 63,7

Примечание «+ «- стимулирование ростовых процессов.

Таблица 4 Полученные результаты с ис-

Влияние эквимолярных концентраций ПК и /3-аланина пользованием Р-аланина на изоли-на рост дрожжей 5 сегеушае и инактивацию пиэамина рованной культуре корней люцерны и тестовой культуре 8 вегвушае доказывают, что пиззмин не влияет на биосинтез ПК и его действие связано с влиянием на процессы, происходящие с участием кофер-ментной формы витамина Это дополнительно подтверждается инак-тивирующим действием 4-ФПК (фосфопантотеновая кислота) эффектов пизамина, которая является продуктом фосфорилирования витамина перед включением её в цикл биосинтеза КоА (Мойсеенок, Гуринович, Омельянчик и др, 2004) 4'-ФПК может заменить недостающий витамин для дрожжей в сегеушае и в Ыущп, но не влияет на рост С иЫк Однако ее витаминная активность для тест-культур различна Для получения одинакового ростового эффекта дрожжей в сегеух81ае 4-ФПК следует использовать в 250 раз большей концентрации ПК (Са-пантотенат), а для в 1и£1да§п -активность 4'-ФПК, по нашему мнению, связана с меньшей мембранной проницаемостью, характерной для фосфорных эфиров биомолекул Этот предшественник КоА снижает антивитаминное действие пизамина, что свидетельствует об их одинаковом механизме предотвращения инактивации БН-групп кофермента или его биосинтеза

При увеличении содержания пизамина эффективность витамина снижается, так же как и при его постоянной концентрации и увеличении концентраций витамина Это указывает, что взаимодействие пизамина с ПК носит неконкурентный характер, и между ними нет прямой антагонистической связи Подтверждением служит определение индекса торможения, как для ПК, так и для 4'-ФПК, который с увеличением витамина снижается Малая величина индекса торможения (от 0,5 до 31,0) указывает на высокую биологическую активность пизамина Аспарагин специфично усиливает антагонизм, снижая индекс торможения в 2 раза во всех случаях использованных концентраций ПК

Антивитаминное действие пизамина в животном организме Совместные исследования с сотрудниками Института биохимии АН БССР показали, что продолжительное введение животным пизамина вызывает типичные симптомы пантотенового авитаминоза, равно как и синтетические и природные антивитамины ПК Антивитаминное действие пизамина изучалось в сравнении с пантоилтаурином (ПЛТ), гомоПК (ГПК), гомопантетеином (ГПТ), ы-метилпантотеновой кислотой (МПК) с использованием половозрелых белых мышей Осуществляли 10-кратное введение антивитаминов и пизамина подкожно в дозе 0,1 г/кг живого веса и оценивали воздействие на показатели обеспеченности животного организма ПК Пизамин, как и другие антивитамины, значительно снижал вес животных, что сопровождалось возрастанием содержания свободной ПК в печени, снижением общего уровня активности КоА-зависимой оксокетоглугаратдегидрогеназы, активности КоА в печени Уровень активности кофермента уменьшался также в почках Как и другие антивитамины, пизамин увеличивал общее содержание липидов в печени, удельную активность триглицеридов и холестерина в печени (Хомич, Мойсеенок, Шейбак, 1977) Это являлось следствием пантотеновой недостаточности, вызванное действием пизамина и других антивитаминов ПК В случае одноразового подкожного введения пизамина развивался дефицит витамина (Майсяёнак, Смашэусю, Андрасюк и др, 1975), которое наблюдали у белых крыс - самцов после введении олигосахарида пизамина подкожно в дозе

Вариант опыта Сухой вес дрожжей, мкг/мл

Пантотенат, М /3-аланин, М

0 9 1СГ6 0 910*

Контроль 10 1178 10 1197

Пизамин, 5 мкг / мл 0 565 0 602

0,1 г/кг массы Через 2 ч после одноразовой инъекции пизамина выявлен ряд сдвигов в биохимических показателях, связанных с обменом ПК Это резкое увеличение выделения свободной формы витамина с мочой (опыт 95,6 ± 19 мг, контроль - 35,8 ± 12 мг, р = 0,05), что не было обусловлено увеличением диуреза, уменьшение общего уровня витамина в печени и почках, а также свободной формы витамина в печени и мозге Наблюдалось снижение активности КоА и его предшественников в печени Активность дегидрогеназы 2-оксо-глутаровой кислоты, тесно связанной с обеспеченностью организма КоА, снижалась в почечной ткани более чем в 2 раза Аналогичным образом снижалась активность дегидрогеназы 2-оксоглутарата в сердце (контроль 418 ± 59, опыт 243 ±13 мкМ восстановленного ферроцианида 1 мг бежа (р < 0,02) В почечной ткани повышался уровень витамина В12, что являлось симптомом специфической пантотеновой недостаточности и оценивалось как наиболее чувствительный функциональный тест на недостаточность ПК

Введение пизамина давало статистически достоверное увеличение кобаламинов в печени и почках на 55,5 и 84,0 %, соответственно, по сравнению с контрольными крысами, находящимися на обычном рационе вивария Одной из особенностей проявления антивитаминного действия пизамина при введении животным является снижение активности 2-оксо-глутаратдегидрогеназы в миокарде и почках, что вероятно связано с резким снижением протеидизации липоевой кислоты (Савчиц, 1977), пропорционально связанной в мультиферментных комплексах дегидрогеназ а-кетокислот с КоА Одновременная инъекция пизамина в дозе 0,1 г/кг и 835-липоевой кислоты в дозе 1 мг/кг массы тела при подсчете радиоактивности обнаружило увеличение липоевой кислоты в крови, жировой ткани и особенно (более чем в 4 раза) в скелетных мышцах Это служит подтверждением способности пизамина нарушать ферментативную активность КоА и КоА-зависимых ферментативных систем В результате наблюдается экспрессия апоферментных белков, детектируемых липоевой кислотой Это может быть прямым свидетельством, что в основе механизма антивитаминного действия пизамина лежит взаимодействие его с КоА-БН

Еще одним подтверждением этому служат результаты опытов по исследованию влияния пизамина на интенсивность окислительного декарбоксилирования 2-оксо-кислот в тканях животных (Омельянчик, 1983) Как указано выше, фрагменты данного мультиферментного комплекса функционально и структурно связаны с КоА и липоевой кислотой Через 24 ч после однократного введения подкожно пизамина (0,1 г/кг) крысам-самцам наблюдали угнетение окисления 2-оксоглутарата в тканях печени на 57 %, сердца - 42 % и почек - 61 %, что значительно превосходило ингибирующий эффект других испытанных антиметаболитов КоА Это несомненно может свидетельствовать о падении в тканях уровня активного КоА или его функциональной инактивации (секвестирование) Этот факт был отмечен и в опытах при прямом определении активности КоА в тканях животных по количеству ацетилированой ПАБК, которая снижалась за 60 мин на 10,44 % в тканях печени и 13,15 % - в почках

Пиза мин, мг

—■—Ацетклирование ПАБКмкг/ч Торможение %

Рис 9 Подавление ацетилирующей активности КоА пизамином в модельной системе

Таблица 5 Инактивация коферменюм А подавляющего действия пизамина на реакции ацетилирования и образования эфира

Также прямое изучения влияния пизамина in vitro на реакции ацетилирования ПАБК с использованием N-ацетиларилами-нотрансацетилазы подтвердило подавление этой реакции в тканях животных Пизамин весьма эффективно ингибирует активность КоА в системе ацетилирования ПАБК, что обнаружило прямую зависимость от концентрации пизамина (рис 9) С другой стороны, возрастающие концентрации KoA-SH при стабильном уровне содержания пизамина снижали его подавляющее действие на реакции трансацеггалирования и образование продукта в виде ацеггил-ПАБК (табл 5)

Таким образом, пизамин осуществляет прямое подавление каталитических функций КоА К тому же пизамин способствует ускорению окисления восстановленной формы КоА кислородом воздуха, что зарегистрировано полярографически По механизму антивитаминного действия пизамин (олигосахарид проростков гороха) можно считать ингибитором КоА, инактивирующим (секвестирующим) его свободную форму

_ I Содержа-Содержа- ние „ ™е 1 пизамина, КоА, мкг мг % торможения коферментом А подавляющего действия пизамина

100 5 48,5

200 5 33,0

300 5 23,0

400 5 18,0

8. Антивитаминное действия пизамина на дрожжевые и микробные организмы и изменение их функциональных, метаболических и цитоморфологических признаков

Характер и особенности биохимического и физиологического действия пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты было изучено с использованием в качестве тест-организма различные культуры дрожжей

Проведенные исследования на 10 видах дрожжевых культур, полученных из Института микробиологии РАН, с различной витаминной потребностью в экзогенных витаминах группы В, показало, что действие пизамина имело прямую зависимость от потребности дрожжей в экзогенной ПК Пизамин в разнообразных экспериментах специфично проявлял антивитаминное действие, подавляя рост дрожжей, нуждающихся в экзогенной пантотеновой кислоте, и, в частности, составивших первую группу, к которым относятся дрожжи сахаромицеты Saccharomyces vim, S cerevisiae, S carlsbergensis и Saccharomycodes ludvign, и практически не влиял на дрожжи, нуждающиеся только в биотине Candida pulchernmma, С utilis 74 и Endomyces magnusn Не отмечено существенного подавления пизамином роста дрожжей, синтезирующих самостоятельно ПК и биотин, в частности, Candida utilis 708, С utilis 724, Endomyces magnusn и Debanomyces Klocken

Ни в одной из этих групп не наблюдалось одинаковой реакции дрожжей на действие пизамина. В каждой из них выделялись дрожжи, которые были более или менее чувствительны к антивитамину, или среди абсолютно устойчивых выявлены дрожжи, которые только при высоких концентрациях ингибитора снижали рост Такую реакцию дрожжей можно объяснить индивидуальными особенностями (полиморфизмом) биохимических и физиологических процессов Ранее нами было показано (Смашев-ский, 1970), что порог чувствительности различных дрожжей к пизамину различен Все дрожжи, независимо от их потребности в экзогенной ПК, проявляли чувствительность к действию пизамина с разницей концентрационного порога от 10 до 300

раз Если не синтезирующие ПК дрожжевые клетки подавлялись антивитамином в пределах его концентрации 1-2 мкг/мл среды, то синтезирующие витамин, в зависимости от вида дрожжей, - от 10 до 320 мкг/мл Это может свидетельствовать в пользу допущения, что пизамин не подавляя биологический синтез ПК, взаимодействует с её готовой молекулой или коферментной формой в ферментативных реакциях у разных дрожжей по отличающимся биохимическим механизмам, что обусловливает различную метаболическую устойчивость клеток к его антиметаболитному действию Подтверждением этому являются результаты экспериментов на дрожжах Torulopsis candida 18, синтезирующих ПК, но характеризующихся высокой чувствительностью к ингибитору Однако подавление роста дрожжей пизамином настолько специфично относительно их потребности в экзогенной ПК, что пизаминобусловленное ингиби-рование может использоваться в качестве своеобразного теста выявления микроорганизмов с потребностью в экзогенном витамине

Ни один из исследованных 17 видов бактериальных культур не подавлялись антивитамином, начиная с концентрации 1 1000, за исключением патогенной культуры гриба вертициллиознош увядания растений, а именно, двух штаммов Verticillium dachlia Я-121 и У-112, для которых диапазон ингибирования равнялся от 50 до 300 мкг/мл, тогда как рост Ascochita pisi - патогенного гриба растений гороха - не только не подавлялся, но стимулировался в присутствии указанных концентраций пизамина.

Активность антибиотического действия пизамина зависела не только от потребности дрожжей в экзогенной ПК, но и от ряда других факторов Ингибиторная активность снижается при увеличении количества вносимого инокулята, и, особенно, при продлении инкубационного периода. Если при концентрациях 5 и 10 мкг/мл пизамина рост при инокуляции среды дрожжами в количестве 2,5 мкг/мл сырых дрожжей полностью подавлялся, то при 70 мкг/мл ингибирование снижалось, а при 350 мкг/мл - практически отсутствовало Продление инкубационного времени способствовало началу роста дрожжей после периода полного подавления, который завершался также быстро, как и у дрожжей, растущих на среде без пизамина, после завершения лаг-периода. Независимо от количества внесенного инокулята, пизамин во всех случаях (в одной и той же концентрации) одинаково задерживает лаг-период развития тест-кулыуры, после которого начавшийся рост переходит в логарифмическую фазу в соответствии с количеством внесенного инокулята, но степень подавления роста дрожжей была аналогичной, как и при минимальном внесении инокулята.

Начало и интенсивное нарастание роста дрожжей после длительного подавления высокими концентрациями пизамина не является следствием его разрушения, связывания или накопления в среде веществ, инактивирующих ингибитор На это указывает факт снижения чувствительности дрожжей и начало их роста после глубокого и длительного подавления олигосахаридом Это обусловлено механизмами резистентности дрожжевой клетки, у которой происходят физиолого-биохимичеекие изменения, приводящие к адаптации к химическому стрессу, вызванного действием пизамина - антиметаболита кофер-мента, катализирующего важнейшие метаболити-ческие пути

Адаптация дрожжей к пизамину. Наблюдение за размножением дрожжевой клетки в висячей капле под микроскопом, выделенной из исходной культуры, выращенной на среде с содержанием 5 мкг/мл пизамина (опыт) и без ингибитора (контроль), показало, что в контроле начинается почкование, и в среднем через каждые 56 мин при комнатной температуре происходит образование одной дочерней клетки В опыте наблюдалось увеличение объема клетки, и только через 15 ч 30 мин начинается первое почкование материнской клетки В течение 24 ч на образование дочерней

клетки уходило 170 мин, а через 36 ч эксперимента новые дочерние клетки образовывались за то же время, как и в контрольном варианте Ускорение почкования наблюдалось у молодых, вновь возникающих клеток Чем отдаленнее их генерация от исходной материнской, тем быстрее у них шел процесс почкования в присутствии антивитамина. Следовательно, развивался процесс адаптации Это подтвердилось получением полностью адаптированной и нечувствительной к ингибирующему действию пизамина культуры дрожжей При последовательных их пересевах, выращенных в средах с возрастающими дозами пизамина, после потери чувствительности к предыдущей концентрации, уже к седьмому пассажу их резистентность была в 200 раз выше относительно исходной культуры Резистентность к пизамину оказалась генетически устойчивой При пересевах на стандартной питательной среде с полным исключением контакта с пизамином резистентность дрожжевых клеток к антивитамину полностью сохранялась

Полученная из одной клетки адаптированная культура при поддержании культуры пересевами на сусло-агаре, сохраняла полную устойчивость болееЮ лег Следовательно, функциональная перестройка метаболических механизмов, подверженных влиянию пизамина носит глубокий и генетически детерминированный характер Таким же путем были получены адаптированные (резистентные к пизамину) культуры и других видов сахаромицетов Можно предположить, что в процессе действия пизамина произошло образование биохимического мутантного штамма дрожжей, в котором биотрансформация ПК в коферментную форму оказалась модулированной альтернативными механизмами или последние обеспечили функциональную активность ПК (Мойсеенок, 1996) Однако должен быть рассмотрен вопрос возможности биосинтеза ПК дрожжами в случае развития и закрепления устойчивости к антивитамину

Специальные эксперименты показали, что, приобретая устойчивость к антивитамину, дрожжи полностью сохранили потребность в экзогенном витамине ПК одинаково стимулировала рост как адаптированных, так и неадаптированных дрожжей, те адаптация не связана с уменьшением потребности микроорганизма в ПК Это убедительно доказывает, что пизамин не влияет на процесс биосинтеза ПК, однако содержание свободной формы ПК у неадаптированных дрожжей был стабильно выше, чем у адаптированных Это может быть объяснено не снижением содержания ПК в клетках адаптированных дрожжей, а, скорее всего, биотрансформацией в продукты биосинтеза КоА и сам КоА, менее подверженных деградации и активно участвующих в метаболизме Сохранение адаптированными дрожжами полной потребности в экзогенной ПК на фоне потери чувствительности к действию пизамина, оказалось важным свойством этих дрожжей, которое дает возможность использовать их в аналитических целях для количественного определения ПК в биологическом материале, в котором может присутствовать антивитаминный фактор ПК Это свойство адаптированных дрожжей было использовано нами в наших исследованиях для количественного определения ПК в растительном материале

Функционально-биохимические изменения у дрожжей, индуцированные адаптацией к пизамину. При исследовании процесса развития адаптации дрожжей к пизамину были выявлены устойчивые физиолого-биохимические изменения У адаптированных дрожжей на 4 ч раньше завершается лаг-период, и они раньше вступают в логарифмическую интенсивную фазу роста (рис 10) При повышенной интенсивности роста и более раннем переходе в стационарную фазу, общий уровень биомассы тест-культуры оказался почти равным по массе неадаптированных дрожжей в стационарной фазе Бродильные свойства у адаптированных дрожжей оказались активнее в 4,5 раза.

Адаптированные дрожжи вызывали всплывание мучнистого шарика в среднем через 21 мин, тогда как исходные дрожжи - только через 90 мин, что весьма практично отличает адаптированную культуру хлебопекарных дрожжей ЗасИаготусев сегеушае от ее исходной культуры Это может быть использовано для получения дрожжей с повышенными бродильными свойствами в отношении хлебопекарных и, вероятно, винных дрожжей

Адаптированные дрожжи, выращенные в совершено одинаковых условиях с неадаптированными, характеризуются повышенным содержанием общего белка в 1 г сухого веса клеток (превышение на 36,57 %) Причем у неадаптированных дрожжей эти признаки появляются в присутствии пизамина после возобновления роста при продлении инкубационного периода, в том числе при однократном с ним контакте

Повышение содержания белка индуцируется присутствием в среде пизамина и не зависит от его концентрации Этот феномен наблюдается только у дрожжей, чувствительных к ингибитору Изменение белковообразовательной функции у дрожжей под действием пизамина указывает на глубокие изменения в обмене веществ, которые могут быть следствием как белковосинтетической функции, так и процесса утилизации белковой массы В наших экспериментах определялись общие белки, без их качественного и функционального анализа. Поэтому представляется затруднительным ответ на вопрос, за счет каких белков идет увеличение их содержания Мы предполагаем, что происходит увеличение активных белков-ферментов, на что указывает повышение у дрожжей бродильной активность и активности каталазы (Н202-мегаболизирующей)

Под действием пизамина у адаптированных дрожжей происходит накопление БАВ, стимулирующих рост дрожжей Водный экстракт из исходных дрожжей практически не стимулировал рост дрожжей при добавлении его в среду тест-культуры, тогда как полученный из адаптированных клеток резко усиливал рост, возрастающий пропорционально концентрации вносимого экстракта, стимулируя рост дрожжей почти в 3 раза. В то же время водный экстракт из адаптированных дрожжей весьма эффективно инактивировал и действие пизамина в тест-культуре дрожжей Посредством метода бумажной хроматографии из экстракта дрожжей, выращиваемых в присутствии пизамина, была получена хроматограмма предполагаемых активаторов На ней было обнаружено два активных вещества, вызывающих практически полную инактивацию пизамина, которые по сравнению с неадаптированными дрожжами, накапливаются в дрожжевой культуре в значительно больших количествах Одно из этих веществ было нами идентифицировано как трипептидом-глутатионом, который является основным естественным антиоксидантом, синтезируемым дрожжами, защищающим клетки от окислительного стресса, что может быть ведущим механизмом адаптации дрожжей к действию пизамина. Под действием последнего изменения в метаболизме и физиологических процессах дрожжевых клеток сопровождаются морфологическими и цитологическими изменениями При низких концентрациях антивитамина, в момент задержки роста, наблюдается резкое увеличение размеров клеток, в цитоплазме возникают плотные темные гранулы, а после почкования дочерние клетки не отделяются от материнских и образуют конгломераты С повышением концентрации антиметаболита в клет-

Инкубация в ч

—•— Неадаптированные - - Адаптированные

Рис 10 Сравнительная интенсивность роста дрожжей, адаптированных и неадаптированных к пизамину

ках появляются признаки деградации компонентов цитоплазмы, которые при максимальных концентрациях пизамина вызывают у подавляющего числа клеток потерю типичных морфологических признаков клетки теряют округлость, становятся угловатыми, разрушаются клеточные стенки, такие клетки отмирают

9. Особенности взаимодействия пизамина с метаболитами и антиметаболитами в культурах дрожжевых организмов

Биохимическая трансформация органических веществ в процессе метаболизма катализируется специфическими ферментами, у значительного числа которых кофер-ментами являются определенные витамины группы В Поэтому функции витаминов традиционно рассматривают как участников ферментативного катализа, обеспечивающих разнообразные биохимические реакции С этих позиций, механизм действия антивитаминов следует рассматривать как подавление специфических ингибиторов функций соответствующих коферментов и коферментзависимых энзимов Так как пи-замин в реализации активности, безусловно, специфичен к ПК и, тем самым, к проявлению функций КоА, он может затрагивать самый широкий спектр метаболических процессов, реализуемых с участием КоА или оказывать на них коферментное действие Можно также предположить, что пизамин при взаимодействии с синтетическими и природными антивитаминами ПК или антивитаминами других витаминов, метаболически связанными с ПК, может выступать в качестве синергиста. В этой связи было изучено взаимодействие пизамина с метаболитами и антиметаболитами, причастными к биосинтезу коферментных форм ПК, что позволяло раскрыть дополнительные механизмы реализации антивитаминного действия пизамина

Выращивание дрожжей на альтернативных источниках азотного питания в присутствии пизамина показало различное их взаимодействие с ингибитором, несмотря на идентичную аминную форму азота Гидролизаг казеина и глутаминовая кислота, присутствующие в среде, полностью нивелировали действие пизамина, тогда как мочевина и особенно аспарагин усиливали его тормозящее действие на рост дрожжей В частности, аспарагин резко усиливает действие пизамина на рост дрожжей в сегеушае (рис 11) и совершенно он был нейтрален в культуре в Мущи, что указывает на высокую специфичность эффекта аспарагина в культурах дрожжей, различающихся характером метаболизма витаминных факторов Аспарагин усиливает подавление роста дрожжей пизамином только в присутствии ПК Примечательно, что ПК, как незаменимый витамин для дрожжей, способствует этому усилению Очевидно, что между витамином и антивитамином усиливается антагонизм, потенцируемый третьим метаболитом Без аспарагина ПК при концентрации 1 мкг/мл полностью инактивировала эффект 2,5 мкг/мл антивитамина, тогда как при содержании аспарагина 0,2 мг/мл наблюдалось полное подавление роста во всех изученных концентрациях ПК Такое взаимодействие аспарагина с ПК и ее антивитаминным фактором зарегистрировано впервые Поэтому в последующем указан-

Содержание пизамина мкг/мл

-•-без аспарагина

—•— С аспэрагином

Рис 11 Усиление аспарагином тормозящего действия пизамина в культуре дрожжей Э сегеугаае

ный феномен подвергся детальному изучению, включая исследование взаимоотношения пизамина с другими метаболитами на фоне аспарагина

На среде без аспарагина биотин (Б) снижает биологическую активность пизамина (рис 12, 13) и степень торможения роста тест-культуры и зависит как от содержания антивитамина, так и Б Чем ниже концентрация антивитамина и выше Б, тем интенсивнее рост дрожжей Однако с повышением содержания пизамина эффективность доз Б снижается Особенно это четко просматривается на среде с аспарагином, где при содержании 6 и 8 мкг/мл пизамина, все испытанные дозы Б были совершенно не эффективны в его инактивации При этом подтверждена способность замены аспарагином отсутствующего Б Очевидно, Б вызывает снижение биологической активности пизамина, но этот эффект, вероятнее всего, носит косвенный характер

01 0,2 0 3

Биотин, ммкг/мл

—пиэамин о мкг/мл

- -» - 2 мкг/мд

- д - А мкг/мл

- к- б мкг/мл е в ммкг/мл.

Рис 13 Влияние различных концентраций

пизамина на рост дрожжей Б сегеушае при различных уровнях содержания биотина на среде с аспарагином Несомненно, что одно и то же вещество не может быть антивитамином двух разных по биологическим функциям и механизмам биоактивности витаминов и это является общепризнанным постулатом (Островский, 1983) Вероятнее всего, рассматриваемое действие Б опосредовано как при его взаимодействии с пизамином, так и при утилизации аспарагина. Пизамин снижает активность (блокирует) КоА и Б (в форме биотинсодержащих карбоксилаз) не вступает в каталитические реакции, что приводит к усилению подавления роста дрожжей Это подтверждают и результаты изучения взаимодействия пизамина с ПК на фоне аспарагина, которые только внешне схожи с результатами торможения тест-культур с Б (рис 14, 15) В основе их действия лежат иные механизмы Во-первых, ПК значительно более эффективна в инактиваци пизамина на среде без аспарагина. Во-вторых, антагонизм между ПК и её антивитамином во много раз выше, чем с Б В-третьих, аепарагин резко повышает эффективность ПК в стимулировании роста дрожжей Из этого следует, что пизамин в инакгивирующем действии на дрожжи непосредственно связан только с функциями ПК как предшественника КоА Аепарагин усиливает, потенцируя снижение уровня активной формы КоА (КоА-вН) В этом и заключается природа взаимодействия пизамина с ПК и Б, как на среде без аспарагина, так и с аспарагином, когда точкой приложения эффекторов являются только ацил-КоА-производные, участвующие в энергопродукции и построении фосфолипидных комплексов мембран Б проявляет каталитические функции в комплексе с КоА биотинил-КоА-сингетаза, биотин-

«а о х

01 0,2 0,3

Биотин, ммкг/мл

—♦—ПизаминО мкг/мл, —■— 2 мкг/мл,

— £х -4 мкг/мл

— X— 6 мкг/мл, е - 8 мкг/мл,

Рис 12 Влияние различных концентраций пизамина на рост дрожжей в сегеугаае при различных уровнях содержания биотина на среде без аспарагина

[пропионил-КоА-каррбоксилаза-(гидролизующая АТФ)]-синтетаза, биогин-[мешл-кротонил-КоА-карбоксилаза]-синтетаза (Мойсеенок, Копелевич, Шейбак и др, 1989) Поэтому его каталитические функции будут проявляться в биотин-КоА-зависимых реакциях только в присутствии активного КоА, содержание которого зависит от количества ПК и степени ее биотрансформации в КоА Поэтому биологическая активность Б будет снижаться как при недостатке ПК, так и при снижении количества активного КоА Так как пизамин снижает уровень активного КоА, а аспарапш способствует этому снижению, то снижается и ход каталитических реакций, связанных с обоими витаминами и их кофер-ментыми формами

Панготешвая кислота, мкг / мл

- ГЬзамин 0 мкг/мл

- -«— 2 мкг/мл, --д -4мкг/мл

— к- 6 мкг/мл'

Рис 14 Влияние различных концентраций

пизамина на рост дрожжей Б сегеушае при разных уровнях пантотеновой кислоты на среде без аспарагина

1000 900 800 700

боо

1 500 & ! 400

8 ¡г зоо

5 ®

200

100

0 0 5 1 1 б 2 2,5 3

Панготеновая кислота, мкг/ мл

—«—Пизамин 0 мкг/мл —♦- —2 мкг/мл — Д -А МКГ/МЛ Ж 6 МКГ/МЛ

Рис 15 Влияние различных концентраций

пизамина на рост дрожжей Э сегеушае при разных уровнях пантотеновой кислоты на среде с аспарагином

Взаимодействие пизамина с протеиногенными аминокислотами в культуре дрожжей ЗассЬаготусеэ сегеушае. Участие КоА в синтезе аминокислот и их метаболизме, а также инактивация пизамина на средах, обогащенных аминокислотами источниками азота - пептоном и гидролизатом казеина, определило необходимость изучения взаимодействия протеиногенных аминокислот с пщамином в культуре дрожжей Б сеге-уцвше Как и в предыдущих экспериментах, на фоне внесения в среду аспарагина ни одна из испытанных аминокислот не стимулировала роста дрожжей, тогда как аспарагин сохранял высокую активность в присутствии всех аминокислот, повышая ростовую эффективность ПК Исключение составила глутаминовая кислота, при внесении которой рост дрожжей проявлял зависимость от аминокислоты, независимо от содержания аспарагина Характер взаимодействия протеиногенных аминокислот с пизамином проявился достаточно определенно на среде без аспарагина. По этому признаку они могут быть разделены на 3 группы 1) усиливающие антагонизм между антивитамином и ПК, подобно аспарагину и в равной ему степени, однако, совместно с аспарагином их действие не проявляется (аспарагиновая кислота, /3-фенил-а-аланин, норвалин, валин, а-аланин, триптофан, (3-фенил-/3-аланин, норлейцин, серин, треонин, слабо и почти одинаково глицин и цитрулин), 2) нейтральные в отношении взаимодействия пизамина и ПК (лизин и аргинин), 3) инактивируют действие антивитамина (цистеин, цисгин, метионин, а также глутаминовая кислота и лейцин, инактивирующие полностью пизамин и в присутствии аспарагина) При этом глутаминовая кислота устраняла тормозящее действие пизамина

только в присутствии аспарагина. Инактивацию пизамина серосодержащими аминокислотами, которые активно взаимопревращаются, можно объяснить тем, что они имеют непосредственную связь с синтезом КоА и глутагиона, являясь донорами SH-rpyim ко-фермента (Brown, 1960, Ogata, 1974)

Как известно, в процессе биосинтеза КоА ПК конъюгируется с цистеином, который при последующем декарбоксилировании формирует активную SH кофермента (Daniel, 1961) В этой связи можно допустить, что аминокислотные предшественники КоА - метионин, цистеин и цистин (Aiyar, Sreemvasan, 1962), как и ПК инакгивируют пизамин по механизму восполнения активной формы KoA-SH или депонируя ацили-рованную (секвестированную) форму кофермента (Мойсеенок, 1998), абсорбируя секвестирующий радикал (ацил)

Детальное изучение взаимоотношения пизамина с серосодержащими аминокислотами показало, что степень инактивации действия антивитамина зависит от уровня концентрации аминокислот С повышением концентрации последних степень инакти-ваци усиливается, причем, эффективность их более высокая для дрожжей S ludwign, менее чувствительных к пизамину, чем S cerevisiae Среди указанных аминокислот метионин проявил более высокую эффективность Так, полная инактивация пизамина при содержании его в среде 5 мкг/мл в культуре дрожжей S cerevisiae наступает при концентрации метионина 10 мкг/мл, т е при соотношении 1 2, тогда как цистеином и цистином - при 50 мкг/мл, т е при соотношении 110

Замена ПК /3-аланином, её предшественником в биосинтезе и составной частью витамина, в эквимолярном количестве, не только обеспечило практически одинаковый рост дрожжей, но и степень инакгиваци пизамина серосодержащими аминокислотами (табл 5) Это свидетельствует о том, что пизамин, будучи антивитамином ПК, совер-

Таблица5 шенно не влияет на ее синтез Инактивация пизамина аминокислотами в присутствии пан- ферментной системой пантоте-тотеновой кислоты ( ПК ), /3-аланина и аспарагина натсинтетазы (Мойсеенок,

1977), а взаимодействует с готовой молекулой витамина, но это взаимодействие не носит конкурентного характера

(Смашевский, 1965) Возможное основное место приложения антивитаминного действия, как уже отмечалось, следует искать в нарушении пизамином или биосинтеза КоА или реакций обмена веществ, связанных с КоА, так как ПК проявляет биологическое действие только в его составе или его некоторых предшественников (фосфопантегеин, дефосфо-КоА) Однако, как установлено в последние годы, редокс-статус (-SH/-SS) систем глутатиона и КоА взаимосвязан и определяет течение ряда ключевых энзимагических реакций (Мойсеенок, 2003) Каталитические функции КоА связаны с SH-группой, а инактивация пизамина аминокислотами, содержащих эту группу, не уменьшает доминирующую роль функционального состояния сульфгидрильной группы кофермента.

Это вызвало необходимость изучения характера действия на рост дрожжей серосодержащих предшественников КоА и их взаимовлияния на ингибиторные свойства

Питательная среда Аминокислота Сухой вес дрожжей S cerevisiae, мкг/мл

50 мкг/мл Без Пизамин, 5,0 мкг/мл

пизамина

Метионин 1288 1135

СПК, Цистеин 1318 556

9 Ю-6 M Цистин 1233 331

Без аминокислот 1225 2

Метионин 1288 1531

С /3-аланином Цистеин 1294 1028

9 Ю-6 M Цистин 1175 645

Без аминокислот 1180 2

8-бензоил-пантетеин, мг/мя Сухой вес дрожжей, мкг/мл

5 сетшае | Я шЫп%п ( С uU.Ua

Содержание пизамина мкг / мл

0 5 0 20 0 150

0 1 5 0 0 346 246

6,25 324 45 144 98 320 174

12,5 185 54 138 106 232 174

25,0 191 37 135 93 186 153

50,0 91 8 111 16 141 138

пизамина Оказалось что естественный предшественник в биосинтезе КоА вН-пальмитоилпантетеин (компонент биомембран) (Мойсеенок, 1980, 81уэЬепко\, Ка-коугека, Моиеепок е1 а1, 1995), на среде с ПК в культуре дрожжей в сегеушае, совершенно не влиял на ингибиторную активность пизамина Другой аналог пантетеина 8-бензоилпантетеин (в-бензольная группировка введена для защиты сульфгидрильной группы), напротив, в высокой концентрации ингибировал рост дрожжей и усиливал ингиби- Таблица 6

рующее действие пизамина, т е Влияние 8-бензоилпантетеина и пизамина

на рост различных дрожжей на среде без ПК проявлял с ним синергическии к «г г«

эффект На среде без ПК он оказался способным к замене витамина в низких концентрациях и для дрожжей 8 сегеушае и для 8 ЬкКущи, но не стимулировал рост С иЫ«, не нуждающихся в экзогенном витамине В то же время 8-бензоилпантетеин сохранял ингибирующее действие при повышении его концентраций от 6,25 до 50 мкг/мл, у всех трех исследованных тест-культур, проявляя синергизм с пизамином (табл 6) Аналогично, как было показано ранее (Смашевский, 1970), и цисге-ин, инактивирующий пизамин, также ингибирует рост дрожжей в присутствии ПК и проявляет синергизм с пизамином Тормозящее действие на рост дрожжей вН-содержащих соединений цистеина и 8-беюоилпантетеина может быть обусловлено снижением уровня активного КоА путем образования смешанных дисульфидных форм, блокирующих функциональные сульфгидрильные группы кофермента, образуя неактивные или резервные соединения (Островский, Мойсеенок, Мажуль и др, 1973) Такие ти-ол-дисульфидные превращения равным образом характерны для фосфопанштеина, де-фосфо-КоА и КоА, а смешанный дисульфид КоА с глутатионом относится к природным соединениям, депонирующим до 10 % внутриклеточного кофермента (Мойсеенок, 2003) Это послужило поводом для изучения взаимоотношение пизамина с другими соединениями, содержащими сульфгидрильные группы /З-Меркаптоэтиламин, продукт трансформации цистеина, предшественник и компонент КоА, несущий в нем ЭН-группу, тормозит рост дрожжей Особенно интенсивно он подавляет рост не нуждающихся в экзогенном витамине С иЫю, несколько слабее - Б 1шЬу1§п и в значительно меньшей степени - в сегеушае При этом синергизм с пизамином наблюдается только в культурах в сегеушае и 8 КкЬ/щч В культуре С ийИв, не зависящей от экзогенной ПАК, действие пизамина практически не наблюдалось Можно сделать вывод, что у этих дрожжей, подверженных ингибирующему действию (3-меркапто-этиламина, эффект пизамина не проявляется, поскольку /З-меркаггтоэтиламин связывает свободные вН-группы КоА, образуя дисульфид, который не способен взаимодействовать с олигосахаридом (пизамином)

Таким образом, метаболические предшественники и составные части КоА, содержащие тиогруппы, проявляют различное действие как на рост дрожжей, так и при взаимодействии с пизамином Есть все основания полагать, что КоА проявляет специфические каталитические функции, будучи связан с белком-носителем или в составе специфических ферментативных систем (Мойсеенок, 1996, Гуринович, 2003) Предшественники кофермента этой связи не имеют, проявляют коферменгные функции в меньшей

мере, и при избытке вступают не специфично в реакции взаимодействия с КоА, образуя дисульфиды или конкурируя за субстрат или другие компоненты реакций Поэтому действие этих соединений связано со свойствами самих пантогенатсодержащих соединений, а не только свойствами тиогрупп, входящих в эти соединения Возможно, решающим фактором является биодоступность Это убедительно доказывается тем, что ксенобиоти-ческое производное - унитиол, содержащий две сульфгидрильные группы, не связанный метаболически с КоА, - совершенно не влияет ни на рост дрожжей, ни на активность пизамина.

Инактивация глутатионом антивитаминного действия пизамина. Установлено, что глутатион (Г-SH) является внутренним фактором клеток дрожжей трипептид-ной природы (производное L-глутаминовой кислоты, L-цистеина и глицина), инакти-вирующий антиметаболитное действие пизамина, причем его содержание повышается у дрожжей после адаптации к пизамину Среди водорастворимых антиоксидантов Г-SH занимает центральное место, являясь ключевым элементом системы антиоксидантов небелковой природы, тиоловая группа которого защищает клетки от окисления (Hager, 1975) Достаточно давно известна метаболическая связь Г-SH с ПК (Иванов, 1966) Г-SH полностью инактивирует подавляющее действие пизамина на рост дрожжей в культуре S cerevisiae и S ludwigii, нуждающихся в экзогенной ПК и не влияет у С utilis, не нуждающейся в экзогенном витамине Сам же Г-SH не оказывает действия на рост дрожжей Г-SH полностью устраняет антивитаминное действие у дрожжей S cerevisiae независимо от присутствия аспарагина, тогда как в культуре S ludwigii, у которой ас-парагин инактивировал пизамин, действие Г-SH не проявлялось Окисленный глутатион (T-S-S-Г) действовал идентично восстановленному (рис 16)

Г-SH является самым эффективным из всех испытанных тиосоединений в инактивации антивитаминного действия пизамина Он способен нейтрализовать самые высокие дозы олигосахарида, которые в обычных условиях эксперимента подавляют рост дрожжей необратимо Однако это действие Г-SH также имеет ограничения При использовании максимальных доз пизамина полной инактивации не наблюдается, и с повышением концентрации антивитамина, эффективность Г-SH снижается Полная инактивация отмечена при концентрации пизамина от 5 до 10 мкг/мл и глутатиона 10-20 мкг/мл, т е в соотношении 1 2, близкого к конкурентным взаимоотношениям Это указывает на возможность непосредственного взаимодействия Г-SH с олигосаха-ридом Действие Г-SH указывает на связь инактивирующего эффекта пизамина с функционально активными сульфгидрильными группами Так как Г-SH является наиболее эффективным природным антиоксидантом, присутствующим в клетках в мил-лимолярных количествах, можно полагать, что действие пизамина обусловлено влиянием на SH-группы КоА

Взаимодействие пизамина с антивитаминными факторами пантотеновой кислоты и биотина. Совместное внесение пизамина с сорбиновой кислотой, образующей труднометаболизируемый сорбил-КоА, приводит к значительному усилению

О 2 5 5

Глутатион мкг / мл

г-вн

- -»— г-э-э-н

-л-Г-вН + пиэами 7 5 мкг/мл

— X — 1 З-З-Н + пизамин 7 5 мкг/мл

Рис 16 Инактивация восстановленным (Г-ЭН) и окисленным (Г-З-Э-Н) глутатионом тормозящего действия пизамина в культуре дрожжей в сегеушае

активности подавления роста дрожжей как S cerevisiae, так и S ludwigu Сорбиновая кислота рассматривается в качестве антагониста КоА (Hugushi, Harada, 1969) и, подобно пизамину, снижает биологическую активность КоА Если каждый в отдельности указанный антивитамин в испытанных концентрациях не вызывал полного подавления роста дрожжей, то при совместном внесении этих компонентов, в тех же концентрациях, подавление роста было полным Выявлены некоторые отличия пизамин подавляет более интенсивно рост S cerevisiae, а сорбиновая кислота - S ludvign, но совместное их действие на обе культуры идентично

Несколько иной характер взаимодействия вьивлен между пизамином и салициловой кислотой в экспериментах на дрожжах S ludwigu, не способных синтезировать ПК ни при каких условиях Салициловая кислота подавляет синтез ПК (Ivanovics, 1942), и при внесении пизамина синергизм между ними не наблюдается Аналогичным образом действие сорбиновой кислоты не проявляется на фоне салициловой кислоты Изучением трех потенциальных антивитаминных факторов ПК в сочетании пизамина с салициловой кислотой и гомоПК с салициловой кислотой, которые резко отличаются по механизму действия (гомоПК конкурентный антагонист витамина, салициловая кислота ингибитор его синтеза, пизамин инактивирует КоА) в культуре дрожжей S cerevisiae, не обнаружили синергизма. Установлено, что действие пизамина и его активность не зависели от гомоПК, а эффект салициловой кислоты устранялся возрастающими дозами гомоПК

Отчетливый синергизм выявлен в действии пизамина с синтетическими и природными антивитаминами биотина (Б) Как указано выше, Б связан во многих ключевых биохимических реакциях с ПК (Waite, Wakil, 1941), в частности, показана связь и между синтезом ПК и Б (Филиппов, 1962) Синтетические антивитамины биотина ЭДБ (этилдестиобиотин) и 6-ОГК (6-(2-оксогексагидро-4-пиримидил)гексановая кислота) (Фабричный, Шалавина, Кострова, 1972) и пизамин были исследованы в концентрациях, вызывающих неполное подавление роста дрожжей Их совместное применение вызывало полное подавление, проявляя синергизм действия и падение концентрационного порога антивитаминного действия, характерного для каждого исследуемого соединения Аналогично проявлялись взаимоотношения между пизамином и природным антивитамином Б - авидином, где обнаружена высокая степень синергизма. Если пизамин подавлял рост тест-культуры дрожжей на 50 %, а авидин - на 75 %, то в случае совместного внесения рост микроорганизма подавлялся полностью

Проведенные исследования показали тесную связь биологического действия пизамина с сульфгидрильными соединениями и антиметаболитами, влияющих на биосинтез ПК, КоА и Б, который тоже является тиолсодержащим соедингением Это позволяет заключить, что пизамин, проявляя антиметаболитный характер действия в отношении ПК и КоА, может затрагивать и другие стороны обмена веществ, в частности, биотинзависимые ферментативные реакции Вероятно, он проявляет полифункциональное действие, что характерно для многих природных соединений, в том числе и олигосахаринов, к которым относится и пизамин

Исследования антивитаминного действия пизамина с использованием дрожжевых организмов, как специфических тестовых культур, имеющих большое сходство с растительной клеткой (Agarwal, Katiyar-Agarwal, 2002), позволяет полагать, что идентифицированный олигосахарид обладает аналогичным биологическим действием и в высших растениях, где он и образуется для выполнения регуляторных функций через процессы метаболизма и физиологические системы

Обобщение результатов исследований позволяет сформулировать положение о

том, что природный антивитаминный фактор проростков гороха (пизамин), идентифицированный как олигосахарид, относится к классу эндогенных регуляторов роста растений Механизм действия пизамина включает классические признаки антивитамина и включает ингибирование трансформации форм ПК (фосфорилирование), инактивацию активного КоА путем окисления его в дисульфидную форму и секвестрование (выключение) из КоА-зависимых ферментативных реакций Это дополняет и расширяет спектр биологического действия фитоолигосахаридов новыми, ранее не описанными свойствами, проявляемыми в растительном и животном организмах Физиологическим следствием внутриклеточного накопления пизамина является регуляция ростовых процессов в растении, реализуемых преимущественно путем растяжения

На основании совокупности экспериментальных данных правомерно считать идентифицированный олигосахарид эндогенным регулятором роста, действующим как модулятор метаболизма через коферментные функции КоА в ферментативных реакциях, влияющих на ростовые процессы в растениях в т ч на цикл Кребса и биосинтез хлорофилла. Важнейшим из физиологических функций пизамина, ярко выраженного в растительном организме, является задержка роста растяжением после прорастания семян, эпикотиля и 2-го междоузлия и, вероятно, переориентация притока пластических веществ к корню для обеспечения его первоначального приоритетного роста. По характеру этого влияния на ростовые процессы растения действие пизамина можно рассматривать как морфактивное

Выводы

1 Из проростков гороха Pisum sativum L получен препарат нового антивитаминного фактора ПК, которому дано условное название пизамин Разработана технология количественного определения и выделения пизамина на основе электродиализа и хроматографии до степени очистки, позволяющей исследовать состав антивитамина. Пизамин обладает высокой биологической активностью в подавлении роста дрожжей (1 мг/л), превышающей по активности природные и синтетические антивитамины ПК и Б По физико-химическим свойствам он идентифицирован как олигосхарид, в состав которого входят арабиноза (3,3 %), рибоза (7,8 %), ксилоза (11,3 %), манноза (2,8 %), галактоза (10,7 %), глюкоза (36,4%) и галактуроновая кислота (27,6 %)

2 Пизамин является естественным продуктом метаболизма в растении, образуется de novo с началом ростовых процессов В эпикотиле и 2-м междоузлиях, имеющих кратковременный рост и укороченные линейные размеры, содержится в высокой концентрации, а в интенсивно растущих 3-м и последующих содержание пизамина снижается Ингибитор образуется на определенном этапе онтогенеза в клетках, не передвигается по растению и представляет собой продукт ферментативного гидролиза определенных полисахаридов клеточной стенки, что обусловлено индукцией генетического кода (экспрессия гена), ответственного за образование специфического белка-фермента, участвующего в образовании пизамина. Образование антивитамина увеличивается на свету под воздействием красного света и снижается в темноте и под влиянием синего света, что характерно для ростовых ингибиторов

3 Пизамин является эндогенным регулятором роста междоузлий стебля гороха, действуя на фазе растяжения Соотношение роста системы корень/стебель коррелирует с динамикой и количеством накопления в проростках пизамина, который быстро и в больших количествах накапливается в эпикотиле и 2-ом междоузлии, ограничивая их рост, способствуя направленности потока пластических веществ на обеспечение при-

оритегного роста корня Начало интенсивного роста 3-го и последующих междоузлий, с низким содержанием пизамина, совпадает с прекращение интенсивного роста корня в длину и началом интенсивного роста стебля, т е пизамин проявляет морфактивное действие в росте вегетативных органов в начальный период онтогенеза. Ритмичность характера роста и ростовых взаимодействий междоузлий также определяется динамикой накопления в них пизамина, равно как и линейный рост и конечная длина междоузлий проростков гороха. Во всех междоузлиях в начале и при интенсивном росте пизамин почти не обнаруживается, а при замедлении и завершении его количество возрастает, при отсутствии роста его количество максимально Линейный рост междоузлий коррелирует с соотношением содержания в них эндогенного пизамина и количеством свободной и метаболизированной (связанной) ПК

4 Переход междоузлий от интенсивного роста к замедлению обусловлен динамикой накопления пизамина, изменением метаболических процессов, связанных с обменом про-теиногенных аминокислот и общего белка и активности окислительных ферментов В начале и на этапе интенсивного роста в междоузлиях при низкой концентрации антивитамина наблюдается повышенное содержание большинства аминокислот и белка, с увеличением концентрации антивитамина при замедлении и прекращении роста растяжением, их содержание снижается или даже исчезает Выявлена связь между содержанием пизамина, активностью пероксидазы и интенсивностью роста междоузлий Высокий уровень пизамина в эпикотиле и 2-м междоузлии соответствует стабильно высокому уровню активности пероксидазы, а у интенсивно растущих - 3-м и последующих - с низкой концентрацией пизамина, активность фермента резко снижается

5 Экзогенно внесенный пизамин подавляет рост растяжением отрезков 3-го междоузлия проростков гороха и колеоптиля пшеницы, рост которых происходит только за счет фазы растяжения Ингибирующее действие антивитамина в междоузлии устраняется внесением в среду /3-ИУК, а колеоптиля - гибберелловой кислоты Это указывает на неспецифичность взаимодействия антивитамина и фитогормонов, для которых он не является антагонистом Подавление роста изолированных корней кукурузы и люцерны так же связано с уменьшением зоны растяжения Нанесение экзогенного пизамина на узлы интактных проростков гороха вызывает подавление роста растяжением всех растущих междоузлий, которое усиливалось удалением с междоузлий развивающихся листьев Рост восстанавливался ГК, тогда как /2-ИУК была не эффективна. Вместе с тем пизамин подавляет митотическое деление клеток апикальной меристемы корней лука и рост изолированных суспензионных культур диоскореи и женьшеня, нарастающих только за счет клеточного деления

6 Антиметаболитное действие пизамина, реализуемое в системе биосинтеза и коферментной активности КоА, подтверждается ингибированием образования хлорофилла в зеленеющих изолированных семядолях огурца и кабачка, обусловленного подавлением этапа биосинтеза предшественников хлорофилла. Для антивитаминного фактора свойственно подавление процессов фотосинтеза и дыхания

7 Пизамин вызывает вторичную недостаточность ПК (КоА) у высших растений и животных Он подавляет рост изолированных корней люцерны и кукурузы, что предотвращается ПК и /?-аланином У подопытных животных (белые мыши и крысы) при серийном и однократном введении пизамина в дозе 0,1 г/кг проявляются типичные симптомы пантотеновой недостаточности снижение общего содержания КоА, его ацетилирующей активности, активности КоА-зависимых ферментов, а также повышенное выделение ПК с мочой

8 Механизм антивитаминного действия пизамина связан с нарушением каталитиче-

ских функций КоА путем инактивации активной сульфгидрильной группы и ее секвестрования, что приводит к нарушению КоА-зависимых процессов метаболизма Прямое действие пизамина на N-ацетилтрансферазную реакцию КоА in vitro приводит к подавлению ацетилирования ПАБК Пизамин ускоряет процесс окисление КоА in vitro кислородом воздуха, что указывает на реакцию дисульфидообразования

9 На дрожжевых тест-культурах пизамин проявляет специфичное антивитаминное действие в отношении ПК Антивитамин подавляет рост дрожжевых культур, нуждающихся в экзогенном витамине, в концентрации 1 мг/л и не действует на организмы, синтезирующие витамин, не нуждающиеся в экзогенной пантотеновой кислоте Пизамин не оказывает влияния на синтез ПК, воздействуя на образование связанных (фосфорилированных) форм витамина и инактивирует (секвестирует) кофер-ментную форму - КоА ^-Алании, составная часть и предшественник синтеза ПК в культуре дрожжей S cerevisiae, полностью заменяет для дрожжей витамин и, в равной степени с ним, инактивирует пизамин

10 После 7 генераций дрожжей, на среде с возрастающим количеством пизамина, они повышают устойчивость к антивитамину в 200 раз, которая закрепляется генетически и сохраняется неизменной без контакта с антивитамином неопределенно долго Адаптированные дрожжи обладают сокращенным лаг-периодом, интенсивным ростом, повышенной бродильной активностью, повышенной способностью синтезировать белок, накоплением БАВ, стимулирующих рост дрожжей, а также внутриклеточного глутатиона, инактивирующего пизамин Обладая полной устойчивостью к пизамину, дрожжи полностью сохраняют потребность в экзогенной ПК, что дает возможность использовать их для количественного определения ПК в растительном материале в присутствии ингибитора

11 Антивитаминное действие пизамина проявляется только в присутствии ПК, те подавляется рост дрожжей, специфически стимулируемый витамином Антагонизм пизамина с ПК не носит конкурентного характера, индекс торможения не постоянней Выявлено усиление антагонизма между пизамином и ПК аспарагином, причем, ПК его потенцирует Антагонизм усиливается также аминокислотами, действие которых не проявляется в присутствии аспарагина. Снижают или полностью инактивиру-ют действие антивитамина серосодержащие аминокислоты (метионин, цистеин и цистин), являющиеся субстратами для синтеза КоА и глутатиона, а также лейцин и глутаминовая кислота. Наиболее эффективно инактивирует действие пизамина глута-тион - природный внутриклеточный антиоксидант

12 Предшественники КоА, содержащие SH-группы S-пальмитилпантетеин, S-бензоилпантетеин, меркаптоэтиламин, проявляют синергический эффект с пизамином в подавлении роста дрожжей Высокий уровень синергизма в инакгивировании роста дрожжей проявляет пизамин с природными и синтетическими антивитаминами ПК и Б, с обоюдным усилением их антивитаминного действия

Научно-практические рекомендации

1 С целью повышения продуктивности растений предлагается использовать препарат витамина СаПК (кальциевая соль ПК) и, в том числе в сочетании с другими биологически активными веществами, в концентрации 20-40 мг/л, для предпосевной обработки семян, опрыскивания растений в ранний период онтогенеза и вегетации, повышающих уровень коферментных форм витамина, способствующих повышению активности метаболических и ростовых процессов

2 При использовании БАВ для обработки сельскохозяйственных растений необходимо учитывать их возможный характер взаимодействия с эндогенным антивитаминным фактором, в результате которого возможно проявление усиления или ослабления активности олигосахарида в растущем растении

3 Целесообразно использование морфакгивного действия пизамина как ингибитора роста междоузлий для обработки им растений в раннем периоде онтогенеза в целях формирования компактного габитуса надземной части с укороченными междоузлиями и повышения устойчивости растения к полеганию

4 Пизамин перспективен в применении для защиты растений от патогенных грибов и как модель для синтеза веществ, подавляющих их жизнедеятельность

5 Обосновано применение пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты для получения экспериментального авитаминоза в растительном и животном организмах для выяснения роли ПК в биохимических и ростовых процессах

6 Рекомендуется использовать пизамин для получения дрожжевых культур с повышенной ростовой активностью, сокращенным лаг-периодом, повышенным содержанием белка и с повышенной интенсивностью брожения для совершенствования технологий в производстве хлебопекарных, кормовых и винных дрожжей

7 Для аналитических целей рекомендуется использовать устойчивые адаптированные дрожжевые культуры для определения пантотеновой кислоты в растительном материале, в котором может присутствовать антивитаминный фактор, а также применять ингибирующий эффект пизамина в качестве теста при выявлении потребности различных микроорганизмов в экзогенной пантотеновой кислоте

Список основных опубликованных работ по теме диссертапции

Статьи в ведущих рецензируемых журналах

1 Смашевский Н Д Стимуляция роста дрожжей /3-аланином и пантотеновой кислотой в присутствии аспарагина / Н Д Смашевский // Прикладная биохимия и микробиология - 1967 -Т 3, вып 1 - С 55-58

2 Смашевский Н Д Антивитаминное действие Б-, Ь- и ВЬ-гомопантотеновой кислоты на дрожжевые организмы / Н Д Смашевский, В М Копелевич, Т Д Мариева идр //Прикладная биохимия и микробиология -1973 -Т 9, вып 5 - С 650-663

3 Смашевский Н Д Влияние цистеина на рост дрожжей / Н Д Смашевский //Прикладная биохимия и микробиология - 1975 -Т 11, вып 2 - С 167-171

4 Смашевский Н Д Способ остановки и фиксации роста дрожжевых культур в постинкубационный период / Н Д Смашевский // Прикладная биохимия и микробиология -1976 -т 12,вып 45 -С 609-621

5 Смашевский Н Д Изучение биологического действия аминоаналогов пантотеновой и пантоевой кислот на дрожжевые организмы / Н Д Смашевский, В М Ко-

пелевич, JI H Буланова, В И Гунар // Прикладная биохимия и микробиология -1981 -Т 17, вып 4 - С 533-536

6 Смашевский H Д Синергизм антивигаминных факторов ПК и биотина в подавлении роста дрожжей / H Д Смашевский // Микробиология - 1983 - Т 52, вып 1 -С 73-77

7 Смашевский H Д Антивитаминное действие D-гомопантотеновой кислоты на высшие растения / H Д Смашевский, В M Копелевич, В И Гунар // Физиология растений -1986 -Т 33, вып 6 - С 1138-1143

8 Смашевский H Д Дифференцированность и ритмичность роста корень/стебель и междоузлий проростков гороха в связи с содержанием в них олигосахарида пизамина антивитамина пантотеновой кислоты / H Д Смашевский // Южно-Российский вестник Геология, география и глобальная энергия - 2006 -№9 (22) - С 115-123

9 Смашевский H Д Влияние эндогенного пизамина на содержание свободной и связанной ПК в междоузлиях проростков гороха с различной интенсивностью и характером роста / H Д Смашевский В С Слышенков II Вестник Московского областного университета. Сер Естественные науки - M Изд-во МГОУ, 2006 - С 97-105

10 Майсяенак А Г Антывггамшныя уласщвасщ тзамшу (прыроднага фактару з пасяуного гароху) у адносшах да пантатэнавай кюлаты у белых пацукоу / А Г Майсяенак, М. Д. Смашэуоп, Г У Андрасюк и др // Весщ академп навук БССР Сер бшлапчных навук - 1975 - № 3 - С 68-72

Статьи в рецензируемых журналах

11 Смашевский, H Д Изолирование антивитамина из проростков гороха / H Д Смашевский // Ученые записки Хабаровского гос пед института. Биологические и химические науки -Хабаровск, 1964 - Т 9 - С 79-85

12 Смашевский, H Д Пизамин - антивитамин пантотеновой кислоты из Pisum sativum и его действие на рост дрожжей Saccharomyces cerevisiae / H Д Смашевский // Вопросы ботаники и физиологии растений / Хабаровский гос пед институт - Хабаровск, 1965 - С 3-16

13 Смашевский, H Д Синтез и динамика пизамина в растении гороха / H Д Смашевский // Вопросы ботаники и физиологи растений / Хабаровский гос пед пинстшут - Хабаровск, 1965 -С 17-26

14 Смашевский, H Д Природный антивитамин пантотеновой кислоты / H Д Смашевский // Биологические науки - 1966 - № 1 - С 182-186

15 Смашевский, H Д Стимулятор роста с пантотеновой активностью из свеклы и кукурузы/НД Смашевский//Биологические науки -1967 -№ 12 - С 103-108

16 Смашевский, H Д Инактивация природного антивитамина пантотеновой кислоты пизамина аминокислотами и возможный механизм его действия / H Д Смашевский // Биологические науки - 1968 - № 9 - С 80-84

17 Смашевский, H Д Механизм адаптации дрожжей к пизамину / H Д Смашевский // Ученые записки Хабаровского педагогического института. Сер Химико-биологическая -Хабаровск, 1968 -Т 13 - С 5-11

18 Смашевский, H Д Стимулятор роста дрожжей, выделенный из проростков гороха / H Д Смашевский // Ученые записки Хабаровского педагогического института. Сер Химико-биологическая - Хабаровск, 1968 - Т 13 -С. 12-18

19 Филиппов, В В Длительное хранение культур дрожжевых организмов / В В Филлипов, Н. Д. Смашевский // Ученые записки Владимирского гос пед института. Сер Ботаника. - Владимир, 1968 -Вып 1 -С 177-179

20 Смашевский, Н Д Действие пизамина на дрожжевые организмы, синтезирующие и не синтезирующие пантотеновую кислоту / Н Д Смашевский // Биологические науки - 1970 -№ 12 - С 87-91

21 Смашевский, Н Д Ингибитор роста дрожжей в экстракте из проростков фасоли / Н Д Смашевский, А Ф Дулин // Ученые записки Хабаровского педагогического института. Сер Естественные науки -1971 -Т 34 - С 80-89

22 Копелевич, В М Исследование в области переносчиков ацильных групп XI Синтез производных пантотеновой кислоты, содержащих т-аминомасляную кислоту / В М Копелевич, Г С Евдокимова, Н. Д. Смашевский // Журнал общей химии -1974 -Т 14 - С 1174-1176

23 Смашевский, Н Д Влияние пизамина на активность каталазы и пероксидазы растений / Н Д Смашевский // Рост растений и пути его регулирования / МОПИ им НК Крупской -М, 1976 -С 112-119

24 Смашевский, Н Д Подавление пизамином ростовых процессов растений / Н Д Смашевский // Рост растений и его регулирование / МОПИ им Н К Крупской М, 1976 - С 120-125

25 Смашевский, Н Д Физиологические свойства ингибитора из проростков гороха /Н Д Смашевский // Рост растений и пути его регулирования / МОПИ им Н К Крупской -М, 1981 - С 94-102

26 Смашевский, Н Д Влияние салициловой кислоты на рост и обмен веществ в проростах дыни / Н Д Смашевский // Рост растений и пути его регулирования /МОПИим НК Крупской -М 1982 - С 84-91

27 Смашевский, Н Д Связь между интенсивностью роста междоузлий и активностью окислительных ферментов и дыхания в онтогенезе проростков гороха / Н Д Смашевский, Л П Ионова // Рост растений и его гормональная регуляция межвуз сб -М, 1989 - С 92-97

28 Смашевский, Н Д Влияние витаминов и их сочетаний с фитогормонами на рост и метаболизм томатов / Н Д Смашевский, Л П Ионова // Регуляторы роста растений межвуз сб научн трудов -М МОПИ им НК Крупской, 1990 - С 98-103

29 Смашевский, Н Д Влияние сочетаний витаминов и фитогормонов на структуру фотосинтетического аппарата и продуктивность овощных культур /Н Д Смашевский//Естественные науки -2003 -№6 - С 41-44

Материалы симпозиумов и конференций

30 Островский, Ю М Природные антивитаминные факторы /ЮМ Островский, А Г Мойсеенок, Н. Д. Смашевский и др // Материалы всесоюзного биохими-мическогосъезда тез докладов -Рига Знание, 1974 - С 252-253

31 Смашевский, Н Д Синергизм действия природных и синтетических антивитаминов пантотеновой кислоты и биотина / Н Д Смашевский // Химия, биохимические функции и применение пантотеновой кислоты мат-лы 4-го Гродненского симпозиума - Минск Наука и техника, 1977 - С 126-127

32 Смашевский, Н Д Природный антивитамин пантотеновой кислоты и его физиологическое действие / Н Д Смашевский, В М Копелевич // Химия, биохимические функции и применение пантотеновой кислоты мат-лы 4-го Гродненского симпозиума. - Минск Наука и техника, 1977 - С 127-129

33 Хомич, Т И Характеристика показателей связанных с обеспеченностью организма животных пантотеновой кислотой при парентеральном введении антиметаболитов витамина В3 / Т И Хомич, А Г Мойсеенок, В М Шейбах, Р В Шатаненок,

А В Савич, Т Т Крылова, Н. Д. Смашевский и др // Химия, биохимические функции и применение пантотеновой кислоты мат-лы IV Гродненского симпозиума. -Минск Наука и техника, 1977 - С 162-164

34 Смашевский, Н Д Взаимодействие пизамина, природного антивитамина пантотеновой кислоты и гиббереллина в процессе роста проростков гороха / Н Д Смашевский // Витамины и фитогормоны в растениеводстве докл республиканской конференции (27-28 августа 1981 г ) - Вильнюс, 1981 - С 35

35 Смашевский, Н Д К вопросу о механизме действия пизамин - природного антивитамина фактора пантотеновой кислоты / Н Д Смашевский // Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов мат-лы симпозиума.-Иркутск, 1983 -С 159-160

36 Слышенков, В С Соотношение пантотеновой кислоты и пизамина в органах растения гороха в различные периоды роста /ВС Слышенков, Н. Д. Смашевский // Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника) мат-лы 7-го Гродненского симпозиума (28-29 сентября 1983 г) - Гродно, 1983 - С 46-47

37 Смашевский, Н Д Пизамин, антивитаминный фактор пантотеновой кислоты, как регулятор роста / Н Д Смашевский // Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника) мат-лы 7-го Гродненского симпозиума (28-29 сентября 1983 г) -Гродно, 1983 - С 47-48

38 Смашевский, Н Д Влияние антивитаминного фактора пантотеновой кислоты из проростков гороха на некоторые метаболические процессы растений / Н Д Смашевский // Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника) мат-лы 7-го Гродненского симпозиума (28-29 сентября 1983 г) - Гродно, 1983 -С 83-84

39 Смашевский, Н Д Роль эндогенных пантотеновой кислоты и фитогормонов в регуляции темпов роста междоузлий проростков гороха / Н Д Смашевский II Витамины и фитогормоны в растениеводстве мат-лы республиканской научной конференции «Реализация генетической программы в ответе организма на фитогормоны, витамины и в мутагенезе» (9-10 октября) - Вильнюс, 1986 - С 26-27

40 Смашевский, Н Д Химическая природа и биологическое действие ингибитора из проростков гороха / Н Д Смашевский // Материалы семинара-совещания физиологов растений пединститутов и университетов России (27 сентября - 1 октября 1993 г) - Смоленск, 1993 - С 33

41 Смашевский, Н Д Влияние антивитаминов биотина и пантотеновой кислоты на рост и физиологические процессы растений / Н Д Смашевский, В Яковлева // Материалы научной конференции АГПИ (23 апреля 1996 г ) - Астрахань, 1996 - С 41

42 Смашевский, Н Д Изменение содержания аминокислот и белка в междоузлиях проростков гороха в связи с их характером и интенсивностью роста / Н Д Смашевский // Материалы научной конференции А ГПУ (27 апреля 1997 г) Ботаника. -Астрахань, 1997 - С 66

43 Смашевский, Н Д Влияние сочетаний витаминов и фитогормонов на рост, метаболизм и продуктивность томатов / Н Д Смашевский // Материалы международной научно-практической конференции по паслёновым культурам (10-12 августа 2003 г) - Астрахань, ИД «Астраханский университет», 2004 - С 125-130

44 Смашевский, Н Д Специфичность усиления аспарагином подавления роста дрожжей пизамином, природным антивитамином пантотеновой кислоты / Н Д Смашевский // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря мат-лы IX

Междунар науч конф (10-11 октября 2006 г) - Астрахань ИД «Астраханский университет», 2006 - С 212-215

45 Смашевский, Н Д Характер взаимодействия пизамина с пантотеновой кислотой и биотином на фоне аспарагина в культуре дрожжей БассЬаготусез сегеушае / Н Д Смашевский // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря мат-лы IX Междунар науч конф (10-11 октября 2006 г) - Астрахань ИД «Астраханский университет», 2006 -С 216-218

Подписано в печать 6 08 2007 г Заказ № 1207 Тираж 100 экз

_Уч-изд л 3,0 Уел печ л 2,8_

Издательский дом «Астраханский университет»

414056, г Астрахань, ул Татищева, 20 тел/факс (8512) 54-01-89, тел (8512)54-01-87

Содержание диссертации, доктора сельскохозяйственных наук, Смашевский, Николай Дмитриевич

Введение

Глава 1. Природные биологически активные вещества в системе регуляции роста растений.

Глава 2. Материал и методы исследований . 31.

2.1 Материал для изолирования пизамина и изучения его активности в клеточном соке органов растений и проростков гороха.

2.2 Объекты исследования и биотесты

2.3 Хранение и стандартизация дрожжевых культур для проведения микробиологических исследований.

2.4 Стандартная синтетическая питательная среда для выращивания дрожжей в экспериментах и технология её приготовления.

2.5 Дрожжевая методика определения биологического действия пизамина

2.6 Способ остановки и фиксации роста дрожжевых культур для точного и сравнимого определения роста в постинкубационный период.

2.7 Количественное определение пизамина и пантотеновой кислоты в растительном материале.

2.8 Методы статистической обработки опытов и определения достоверности результатов.

Результаты исследований и их обсуждение

Глава 3. Выделение и химическая идентификация пизамина.

3.1 Технология выделения и очистки пизамина

3.2 Физико-химические свойства пизамина и его идентификация

3.3 Пизамин - представитель олигосахаридов, регуляторных биологически активных веществ растительных организмов с антивитаминным действием

3.4 Распространенность антивитаминного фактора пантотеновой кислоты в растительных организмах.

Глава 4. Синтез, динамика накопления и распределения пизамина в онтогенезе растений гороха.

4.1 Идентичность действия клеточного сока из проростков гороха с чистым препаратом пизамина в действии на рост тестовой культуры дрожжей

4.2 Динамика образования, и распределение содержания пизамина в онтогенезе органов проростков гороха.

4.3 Влияние условий на образование пизамина в проростках гороха.

4.3.1 Влияние света на образование и накопление пизамина в проростках гороха.

4.3.2 Роль органов проростков гороха в образовании и содержании пизамина в растении

4.3. 3. Влияние ингибиторов трансляции, транскрипции и дыхания на образование пизамина

Глава 5. Особенности роста междоузлий проростков гороха в связи с содержанием в них эндогенного пизамина, пантотеновой кислоты, динамики содержания аминокислот и белка, и активности окислительных ферментов.

5.1 Антивитамины в высшем растении.

5 2. Влияние накопления пизамина на характер ростовых взаимоотношений системы корень/стебель и роста междоузлий проростков гороха.

5.3 Дифференцированный рост междоузлий проростков гороха и содержание в них пизамина

5.4 Влияние содержания и динамики накопления эндогенного пизамина на характер роста междоузлий в онтогенезе проростков гороха.

5.5 Зависимость роста междоузлий проростков гороха от содержания и соотношения в них эндогенных пизамина и пантотеновой кислоты.

5.5.1 Активность пантотеновой кислоты в междоузлиях проростков гороха в зависимости от содержания пизамина и интенсивности их роста

5.6 Влияние эндогенного пизамина на динамику содержания аминокислот и общего белка в междоузлиях в связи сих характером роста.

5.7 Активность окислительных ферментов и дыхания в связи с динамикой содержания эндогенного пизамина и ростом междоузлий.

5.7.1 Активность каталазы и пероксидазы в онтогенезе междоузлий с различной интенсивностью роста в проростках гороха и содержания в них эндогенного пизамина

5.7.2 Динамика интенсивности дыхания в онтогенезе междоузлий проростков гороха в зависимости от их характера роста и накопления в них пизамина

Глава 6. Антивитаминное действие экзогенного пизамина на ростовые и некоторые метаболические процессы высших растений.

6.1 Влияние пизамина на рост изолированных культур корней и тканей различных растений.

6.2 Влияние экзогенного пизамина на рост клеток растяжением и характер его взаимодействия с фитогормонами (3-ИУК и ГК.

6.3. Влияние экзогенного пизамина и гибберелловой кислоты на рост междоузлий проростков гороха на фоне их дефолиации

6.4 Влияние пизамина на синтез хлорофилла, фотосинтетическую активность и процесс дыхания растений.

Глава 7. Видовая специфичность и механизм действия пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты в растительном и животном организмах

7.1 Инактивация ингибирующего действия пизамина на рост изолированных корней пантотеновой кислотой и (3-аланином

7.2 Сравнительная активность пантотеновой кислоты и Р-аланина в инактивации пизамина.

7.3 Влияние 4-фосфопантотеновой кислоты на рост различных дрожжей и инактивацию пизамина

7.4 Неконкурентный характер антивитаминного действия пизамина с пантотеновой кислотой

7.5 Антивитаминное действие пизамина в животном организме.

7.6 Механизм антивитаминного действия пизамина

7.6.1 Подавление пизамином ацетилирующей активности КоА

7.6.2 Ускорение пизамином окисления КоА кислородом воздуха

Глава 8. Антивитаминное действия пизамина на дрожжи и микробные организмы и изменение их функциональных, метаболических и цитоморфогических признаков.

8.1 Первые сведения о характере биологического действия пизамина, как ингибитора роста дрожжей, обнаруженного в проростах гороха.

8.2 Влияние пизамина на рост дрожжевых грибов с различной потребностью в экзогенных витаминах

8.2.1 Влияние пизамина на рост фитопатогенных грибов и бактерий

8.3 Особенности антивитаминного действия пизамина на дрожжевые организмы

8.3.1 Влияние количества вносимого инокулята и продления инкубационного периода на активность пизамина в подавлении роста дрожжей

8.3.2 Изменение активности пизамина в подавлении роста дрожжей при вне-сени его в различное время инкубационного периода.

8.4 Адаптация дрожжей к пизамину.

8.4.1 Особенности процесса адаптации дрожжей к пизамину

8.4.2 Получение адаптированных к пизамину различных видов дрожжей.

8.5 Функционально-биохимические изменения у дрожжей индуцированные адаптацией к пизамину

8.5.1 Сравнительная интенсивность роста дрожжей адаптированных и не адаптированных к пизамину

8.5.2 Повышение содержания общего белка у дрожжей, адаптированных к пизамину

8.5.3 Повышенние активности каталазы и интенсивности брожения у дрожжей, адаптированных к пизамину или выросших при контакте с ним в среде.

8.5.4 Повышение содержания биологически активных веществ в клетках дрожжей, адаптированных к пизамину.

8.5.5 Глутатион как фактор, содержащийся в клетках дрожжей, инактививирующий действие пизамина.

8.6 Цитолого-морфологические изменения у дрожжей под действием пизамина

8.7 Сравнительная биологическая активность пизамина с другими антивитаминными факторами и антиметаболитами

Глава 9. Особенности взаимодействия пизамина с метаболитами и антиметаболитами в культурах дрожжевых организмов

9.1 Специфичность усиления аспарагином ингибирующего действия пизамина на рост дрожжей

9.2 Характер действия пизамина на рост дрожжей в присутствии аспарагина при различных концентрациях пантотеновой кислоты и биотина

9.3 Взаимоотношение пизамина с протеиногенными аминокислотами в культуре дрожжей БассЬаготусез сегеу1з1ае.

9.4 Взаимодействие пизамина с метаболитами и предшественниками биосинтеза КоА, содержащих 8Н-группы

9.5 Инактивация глутатионом антивитаминного действия пизамина

9.6 Взаимодействие пизамина с другими антивитаминными факторами пантотеновой кислоты и биотина

9.6.1 Взаимодействие пизамина с сорбиновой, салициловой и гомопантотено-вой кислотами, природными антивитаминными факторами пантотеновой кислоты

9.6.2. Взаимодействие пизамина с антивитаминами биотина

Выводы

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Олигосахарид проростков гороха (пизамин): антивитамин пантотеновой кислоты, регулятор роста растений"

Проблема роста и развития растений и пути управления этим процессом всегда была и будет центральной проблемой растениеводства. Познание сложных механизмов закономерностей роста и развития с тем, чтобы на основе этих знаний в агрономической практике создавать наиболее благоприятные условия для выращивания сельскохозяйственных растений и повышения их продуктивности.

Процесс роста - результат согласованного протекания разнообразных фи-зиолого-биохимических реакций, требующих сложной системы регулирования. Процессы роста находятся под контролем природных регуляторов фитогормонов и ингибиторов, на основе чего было развито представление об участии природных ингибиторов роста наряду с фитогормонами. Ингибиторы это комплекс веществ различной химической природы и механизма действия, взаимодействующими с различными стимулирующими факторами фитогормонами, витаминами, ферментами. Поэтому ингибиторы роста являются такими же равноправными компонентами регуляторного комплекса растений. Принимая участие в контроле интенсивности разнообразных биохимических процессов, они дают возможность реализации активности всех других эндогенных регуляторов.

Природные ингибиторы роста признаны как класс регуляторов с четкой шкалой физиологических функций. Ингибиторы различной химической природы оказывают влияние на рост и формообразовательные процессы в прорастании семян, в покое растений, взаимодействуют в регуляции функций фитогормонов, устойчивости растений к болезням и неблагоприятным условиям среды.

Изучение системы регуляции жизнедеятельности растений - основное направление исследований в современной биологии сельскохозяйственных растений. Все виды метаболической и физиологической активности клеток находятся под контролем организма, обусловленного комплексом регуляторных веществ. Чтобы правильно и эффективно использовать регуляторы роста, надо хорошо знать их механизм действия. Трудности этой работы заключаются в том, что растение обеспечивает себя всеми необходимыми регуляторами. Получить растение с недостаточностью того или иного вещества практически невозможно без применения специальных мер. Такой мерой может быть применение специфических ингибиторов, которые бы раскрывали механизм действия стимулирующих факторов. Поиск таких веществ имеет важное значение ещё и в том, что эффективные ингибиторы могут быть использованы для регуляции определенных фаз роста растений и как перспективные химические аналоги для производства новых биологически активных веществ.

С ростом научного прогресса в сельском хозяйстве возрастает роль внедрения в производство новых технологий, боле рациональных путей управления процессами роста, развития и продуктивности сельскохозяйственных растений. Особое внимание обращено на использование различных регуляторов роста и метаболизма, которые в ничтожно малых количествах оказывают огромное влияние на жизнедеятельность растительного организма и могут служить радикальным средством в улучшении физиологических процессов

Актуальность исследований

Изучение закономерностей роста растений является основой для разработки новых технологий управления их продуктивностью. Рост является интегральным производным всех процессов, протекающих в растительном организме на этапах онтогенеза, которые находятся под контролем эндогенных регуляторных систем. Познание внутренних механизмов регуляции ростовых процессов и раскрытие их связей с другими процессами будет способствовать решению важнейших задач растениеводства.

Рост как показатель физиологического состояния растений обладает высокой чувствительностью к изменению внутренних и внешних факторов и, тем самым, наиболее пригоден для определения объема и сроков необходимого вмешательства, в том числе при оценке экологической приспособленности и адаптивных возможностей растений. Это особенно важно при разработке современных технологий в генетике, селекции и практике растениеводства (Смирнов, 1970; Батыгин, 1986; Шевелуха, 1992).

Проблема направленной регуляции процессами роста и развития растений, а также процессами метаболизма в настоящее время стала важнейшей проблемой современной физиологии и биохимии сельскохозяйственных растений.

Спектр биологически активных веществ способных включаться в реализацию программ роста, развития и индикации защитных реакций растительной клетки весьма широк и разнообразен. К таким соединениям до недавнего времени были отнесены ауксины, цитокинины, гиббереллины, брассиностероиды и ингибиторы АБК, этилен, фенольные соединения и др. Они наиболее изучены и представлены в многочисленных статьях, обзорах и монографиях (Кораблева, Метлицкий,1973; Кефели, Чайлахян, 1975; Гуськов, 1975; Процко, Сытник,1979; Hess Dieter, 1973; Кефели 1978,1992,)

В последнее время открыты и изучаются растительные олигосахариды, компоненты клеточной стенки, обладающие широким спектром регуляторных функций в растениях (Albersheim, Darvill, 1992; Усов, 1993).

Олигосахариды подавляют рост, стимулируемый ауксинами, прорастание семян, улучшают процессы фотосинтеза, ускоряют транспорт питательных веществ, увеличивают биомассу растений, улучшают развитие корневой системы, способствуют эмбриогенезу и морфогенезу в трансплантатах растительных тканей, повышают устойчивость к стрессовым ситуациям ( Fry, Aldington, Hartelington et al, 1983; York, Darvill, 1992; Долгих, Шайкин, Усов и др. 1988). Такой широкий спектр биологического действия позволил сделать заключение, что олигосахариды участвуют как сигнальные молекулы, участвующие в регуляции различных функций растительного организма. Не раскрытые механизмы действия фитоолигосаха-ридов изучают ученые разных стран.

Нами также внесен определенный вклад в изучение фитоолигосахаридов. Выделенный и изучаемый нами ингибитор роста дрожжей из проростков гороха, идентифицирован как олигосахарид, с новыми биологическими свойствами, до сих пор неизвестными для олигосахаридов, с антивитаминным действием в отношении одного из самых распространенных витаминов группы В живых организмов, пан-тотеновой кислоты (ПК). Этому новому антивитаминному фактору нами было дано условное название пизамин.

Изучение его биологических свойств, значения в регуляции метаболических и ростовых процессов и механизма действия в растении имеет важное значение в расширении знаний о функциях олигосахаридов в растительном организме. Изучение пизамина, как антивитамина ПК, обостряет внимание к проблеме участия витаминов группы В, и, в частности коферментной формы ПК - кофермента аце-тилирования (КоА), в жизнедеятельности растений.

Невозможно представить рост, морфогенез в растении без образования de novo многочисленных и разнообразных органических веществ, или образуемых в результате распада сложных комплексных соединений и их усвоения в процессе роста. Эти процессы протекают при непосредственном участии специфических ферментов, катализирующих ход метаболизма, лежащего в основе роста. В большей части таких ферментов их активность определяется коферментом, которым для различных ферментов являются витамины группы В, в чем и проявляется биологическая каталитическая функция витаминов в живом организме. Поэтому наряду с фитогормонами, специфичными индуктивными регуляторами роста, следует рассматривать и витамины, как регуляторы роста через метаболизм, и возможного взаимодействия их дуг с другом. В связи с чем В.И Кефели (1981) отнес витамины к негормональным факторам роста растений, показав участие витаминов в каталитических реакциях, усиливающих ростовые процессы, активируемые фитогормонами. Влияние витаминов на ростовые процессы довольно изучено, что отражено в обзорных работах (Чайлахян, 1958; Овчаров, 1969; Карабанов, 1977; Oertl, 1987).

Витамины как предшественники коферментов являются эндогенными регуляторами роста и развития растений, регуляторные функции которых, как и фито-гормонов, должны регулироваться в растительном организме различными путями ингибирования активности, необходимой для сбалансированности и оптимальности протекаемых процессов. В этом плане они подчиняются универсальной системе саморегулирования - стимулятор/ингибитор. То есть, у витаминов должны быть антивитамины. Обнаружение, выделение и изучение антивитаминов (анти-коферментов) является важной задачей для познания роли витаминов в жизненных процессах растений, закономерностей роста и путей направленного его управления.

Антивитаминные факторы широко распространены в растениях и идентифицированы практически для всех витаминов. Но их обнаружение, как правило, не связывалось с физиологией растительного организма и выявлялось по действию на животных, у которых при поедании растительной пищи, наблюдались признаки типичного авитаминоза, устраняемые добавлением витаминов (Mellanby,1930; 1949, Weits; 1952, Hilda Druce, Callow, 1934; Harrison, Mellanby,1939; Weswig, Freed, Haag, 1946; Kodichek, 1949; Bär, 1954 ;Костов, Гахниян, 1961; Островский, 1973).

Следует отметить, что образование антивитаминных факторов присуще не только высшим растениям, но и животным и низшим организмам (Hanka, Berg, Kelly, 1966; György, Rose, Eakin et al. 19421; Green, Carlson, Evans, 1942). Это может служить доказательством особой роли этих веществ, причастных к фундаментальным механизмам рагуляции метаболизма. Поэтому изучение природы образования, структуры и механизма действия, значение их в реализации функций ко-ферментов и ростовых процессов растений, имеет важнейшее значение для различных направлений и проблем биологии высших растений и животных.

Прежде всего, возникает вопрос о значении антивитаминов в растительном организме, как возможных регуляторов функций витаминов (коферментов) в обмене веществ, росте и развитии и возможных путей осуществления целенапра-ленного вмешательства в эти процессы.

Ответ на данный вопрос получен путем всестороннего изучения природного антивитаминного фактора ПК, выделенного из проростков гороха, который до настоящего времени, как высокоспецифичный антивитамин, является единственным представителем фитоолигосахаридов, образуемых в растении. Это раскрывает малоизученную сторону процессов регуляции и закономерностей роста и развития растений с участием антивитаминного фактора, что и определило цель наших исследований.

Это направление исследований заслуживает особого внимания, поскольку большинство растительных организмов синтезирует необходимые вещества самостоятельно. В то же время существует значительное количество примеров из фи-тофармации, когда весьма эффективно эксплуатируется антивитаминный механизм действующей лекарственной субстанции из растений. Таким образом, витамины являются предшественниками как «протеидизированных» коферментов (флавопротеиды, пиридоксалевые ферменты), так и «свободно диссоциированных» (КоА, NAD, NAD<P) в ближайшем окружении энзимов, взаимодействующих с активными центрами каталитических биополимеров.

Цель исследований - изучить природу , биологические свойства и механизм действия антивитаминого фактора пантотеновой кислоты (ПК), витамина В5 олигосахаридной природы (пизамин), выделенного из проростков гороха (Pisum sativum L.), как природного негормонального регулятора ростовых процессов растений.

Реализация поставленной цели достигалась выполнением следующих задач исследования:

1. Разработать технологию выделения и очистки, изучить физико-химические свойства и определить химическую природу пизамина из проростков гороха.

2. Разработать метод анализа и изучить динамику образования пизамина в онтогенезе растений гороха, условия его синтеза и накопления в органах проростков.

3. Изучить влияние содержания и динамики накопления эндогенного пизамина и его соотношения с различными формами ПК в растении на характер роста проростков гороха, динамику активности окислительных ферментов и процесса дыхания в онтогенезе органов проростков гороха.

4. Изучить антивитаминное действие экзогенного пизамина на ростовые процессы в растениях, взаимоотношение с фитогормонами в процессе роста растяжением и некоторые метаболические процессы в растении.

5. Изучить специфичность, механизм антивитаминного действия пизамина в растительном и животном организмах, как антивитамина пантотеновой кислоты, в т.ч. воздействие на биосинтез ее коферментной формы - КоА.

6. Установить характер особенностей и специфичности антивитаминного действия пизамина на рост, физиологические и биохимические процессы дрожжевых грибов и других микробных организмов.

7. Используя дрожжевые грибы как тестовую культуру, исследовать особенности взаимодействия пизамина с метаболитами, антиметаболитами, производными ПК и другими антивитаминными факторами.

Научная новизна. Впервые выделен новый природный антивитамин ПК из высшего растения (Pisum sativum L.), который идентифицирован как олигосаха-рид, с условным названием «пизамин».

Впервые получены экспериментальные данные об антивитаминном действии пизамина в растительном, животном организмах. Установлен механизм антивитаминного действия как неконкурентного антагониста ПК, снижающего биологическую активность коферментной формы витамина - КоА.

Впервые показано участие пизамина как негормонального, и, преимущественно, метаболического регулятора ростовых процессов в высшем растении, снижающего активность связанных форм ПК (предшественников КоА и КоА ), не влияющего на биологический синтез витамина.

Установлены особенности характера и специфичности взаимодействия пизамина, как антивитамина ПК с метаболитами и антиметаболитами: с протеино-генными аминокислотами, природными и синтетическими производными ПК и КоА. Выявлены соединения, инактивирующие и усиливающие действие пизамина, его синергизм в антибиотическом действии с другими антивитаминными факторами.

Показано взаимодействие антивитаминного фактора с фитогормонами (3-индолилуксусной и гибберелловой кислотами в регуляции ростовых процессов растений.

Установлена последовательная адаптация дрожжевых грибов к антивитамину с приобретением ими полной резистентности к пизамину, закрепляемой генетически и сохраняемой в свойствах дрожжей неопределенно длительное время. Тем самым констатируется получение мутантного штамма, который обладает повышенной интенсивностью роста, сокращенным лаг-периодом, с активированным синтезом белка и высокой бродильной активностью

Основные положения выносимые на защиту

1. Выделение, очистка, физико-химические свойства и химическая природа пиза-мина, природного антивитамина пантотеновой кислоты.

2. Условия образования, динамика накопления и распределения пизамина в онтогенезе растений гороха ( Pisum sativum L.).

3. Зависимость характера роста органов проростков гороха от содержания эндогенного пизамина, различных форм пантотеновой кислоты и активности окислительных ферментов.

4. Характер действия экзогенного пизамина, как негормонального регулятора, на ростовые и некоторые метаболические процессы растений.

5. Видовая специфичность и механизм действия пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты в растительном и животном организмах, реализуемая на уровне биохимических функций КоА.

6. Особенности антивитаминного действия пизамина на рост дрожжевых грибов и изменение их физиолого-биохимических и морфологических свойств.

7. Специфичность взаимодействий пизамина с метаболитами и антиметаболитами в культурах дрожжевых грибов.

Теоретическая и практическая значимость

Установлено присутствие в проростках Pisum sativum нового биологически активного вещества, антивитамина важнейшего витамина группы В - ПК, подавляющего каталитические функции КоА в метаболических и ростовых процессах растений, животных и других организмов.

Результатами проведенных исследований расширено представление о регу-ляторных функциях фитоолигосахаридов, как негормональных регуляторов роста через модуляцию метаболических процессов.

Установлено участие пизамина, антивитамина ПК, в подавлении роста междоузлий растяжением в проростках гороха и регуляции соотношения роста системы корень/стебель, как фактора, задерживающего рост стебля и обеспечения приоритетного роста корня проростков.

Установлен механизм антивитаминного взаимодействия пизамина с ПК

КоА) в регуляции ростовых процессов в растении, заключающийся в нарушении каталитической функции коферментной формы витамина - КоА.

Разработана модель ПК-недостаточности в экспериментах на животных, с использованием препарата пизамина.

Олигосахарид из Pisum sativum как высокоактивное вещество с антивитаминным действием может служить основой для получения синтетических аналогов и использования их в качестве антибиотических веществ, в частности, для борьбы с грибными болезнями растений.

Доказана возможность использования высокой специфичности пизамина к организмам не синтезирующим витамин в качестве теста при установлении потребности в экзогенной пантотеновой кислоте различных микроорганизмов.

Личный вклад автора. Диссертация основана на экспериментальных материалах исследований лично проведенных автором или под его руководством. Автор непосредственно участвовал в разработке научно-теоретического обоснования направлений исследований, в постановке исследовательских задач, разработке методов и подходов их экспериментального решения и анализа. Выяснение механизмов антивитаминноого действия витамина осуществлено частично в Институте биохимии НАН Беларуси (акад. Ю.М.Островский, чл.-корр. А.Г.Мойсеенок), а идентификация олигосахаридной природы пизамина проведена в Институте органической химии им. И.Д. Зелинского РАН (под руководством проф. А.И.Усова).

Третьем всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), 4-том Гродненском симпозиуме «Химия, биологические функции и применение ПК» (Гродно, 1977), Республиканской конференция «Витамины и фитогормоны в растениеводстве» (Вильнюс, 1981), Втором координационном совещании преподавателей педагогических институтов (Орел. 1981). Симпозиуме «Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников кофер-ментов (Иркутск, 1983),VII Гродненском симпозиуме «Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника) (Гродно, 1983)), Совещании физиологов растений пединститутов РСФСР, Секция II «Рост растение и его регуляция» (Пенза, 1984),Республиканской научной конференция «Витамины и фитогормоны в растениеводстве» Секция 1. «Реализация генетической программы в ответе организмов на фитогормоны и витамины и в мутагенезе» (Вильнюс 1986), Семинаре-совещании физиологов растений педагогических институтов (Вологда, 1990), Семинаре-совещании физиологов растений педагогических институтов и универси-тетов(Смоленск, 1993), Всероссийской научной конференции «Астраханский край: история и современность (Астрахань,1997.), Международной научнопрактичес-кой конференция по пасленовым культурам (Астрахань, 2003), IX Международной научной конференции «Зколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря(Астрахань, 2006).

Результаты исследований опубликованы в журналах «Прикладная биохимия и микробиология», «Микробиология», «Физиология растений». «Биологические науки», Вестник Московского областного университета. Серия «Естественные науки», «Южнороссийский вестник геология, география, и глобальная энергетика», «Естественные науки» «Весщ Академ 11 навук БССР, Сер. Б1ялапчных навук», В сборниках «Регуляция роста растений», «Рост растений и пути его регулирования» , «Рост растений и его гормональная регуляция»

Публикации. Всего опубликовано 66 работ, в том числе по теме диссертации 45, из них 10 в ведущих рецензируемых журналах, 19 в центральных рецензируемых журналах, и 16 в материалах симпозиумов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, 9 глав основного текста (включая обзоры лите

Заключение Диссертация по теме "Растениеводство", Смашевский, Николай Дмитриевич

ВЫВОДЫ

1. Из проростков гороха Pisum sativum L. получен препарат нового антивитаминного фактора ПК, которому дано условное название «пизамин». Разработана технология количественного определения и выделения пизамина на основе электродиализа и хроматографии до степени очистки, позволяющей исследовать состав антивитамина. Пизамин обладает высокой биологической активностью в подавлении роста дрожжей (1 мг/л), превышающей по активности природные и синтетические антивитамины ПК и Б. По физико-химическим свойствам он идентифицирован как олигосхарид, в состав которого входят арабиноза (3,3 %), рибоза (7,8 %), ксилоза (11,3 %), манноза (2,8 %), галактоза (10,7 %), глюкоза (36,4%) и галакту-роновая кислота (27,6 %).

2. Пизамин является естественным продуктом метаболизма в растении, образуется de novo с началом ростовых процессов. В эпикотиле и 2-м междоузлиях, имеющих кратковременный рост и укороченные линейные размеры, содержится в высокой концентрации, а в интенсивно растущих 3-ми последующих - содержание пизамина снижается. Ингибитор образуется на определенном этапе онтогенеза в клетках, не передвигается по растению и представляет собой продукт ферментативного гидролиза определенных полисахаридов клеточной стенки, что обусловлено индукцией генетического кода (экспрессия гена), ответственного за образование специфического белка-фермента, участвующего в образовании пизамина. Образование антивитамина увеличивается на свету под воздействием красного света и снижается в темноте и под влиянием синего света, что характерно для ростовых ингибиторов.

3. Пизамин является эндогенным регулятором роста междоузлий стебля гороха, действуя на фазе растяжения. Соотношение роста системы корень/стебель коррелирует с динамикой и количеством накопления в проростках пизамина, который быстро и в больших количествах накапливается в эпикотиле и 2-ом междоузлии, ограничивая их рост, способствуя направленности потока пластических веществ на обеспечение приоритетного роста корня. Начало интенсивного роста 3-го и последующих междоузлий, с низким содержанием пизамина, совпадает с прекращение интенсивного роста корня в длину и началом интенсивного роста стебля, т.е пизамин проявляет морфактивное действие в росте вегетативных органов в начальный период онтогенеза. Ритмичность характера роста и ростовых взаимодействий междоузлий также определяется динамикой накопления в них пизамина, равно как и линейный рост и конечная длина междоузлий проростков гороха. Во всех междоузлиях в начале и при интенсивном росте пизамин почти не обнаруживается, а при замедлении и завершении его количество возрастает, при отсутствии роста его количество максимально. Линейный рост междоузлий коррелирует с соотношением содержания в них эндогенного пизамина и количеством свободной и метаболизи-рованной (связанной) ПК.

4. Переход междоузлий от интенсивного роста к замедлению обусловлен динамикой накопления пизамина, изменением метаболических процессов, связанных с обменом протеиногенных аминокислот и общего белка и активности окислительных ферментов. В начале и на этапе интенсивного роста в междоузлиях при низкой концентрации антивитамина наблюдается повышенное содержание большинства аминокислот и белка, с увеличением концентрации антивитамина при замедлении и прекращении роста растяжением, их содержание снижается или даже исчезает. Выявлена связь между содержанием пизамина, активностью пероксидазы и интенсивностью роста междоузлий. Высокий уровень пизамина в эпикотиле и 2-м междоузлии соответствует стабильно высокому уровню активности пероксидазы, а у интенсивно растущих, 3-ми последующих, с низкой концентрацией пизамина, активность фермента резко снижается.

5. Экзогенно внесенный пизамин подавляет рост растяжением отрезков 3-го междоузлия проростков гороха и колеоптиля пшеницы, рост которых происходит только за счет фазы растяжения. Ингибирующее действие антивитамина в междоузлии устраняется внесением в среду Р-ИУК, а колеоптиля - гибберелловой кислоты. Это указывает на неспецифичность взаимодействия антивитамина и фито-гормонов, для которых он не является антагонистом. Подавление роста изолированных корней кукурузы и люцерны так же связано с уменьшением зоны растяжения. Нанесение экзогенного пизамина на узлы интактных проростков гороха вызывает подавление роста растяжением всех растущих междоузлий, которое усиливалось удалением с междоузлий развивающихся листьев. Рост восстанавливался ГК, тогда как (3-ИУК была не эффективна. Вместе с тем пизамин подавляет ми-тотическое деление клеток апикальной меристемы корней лука и рост изолированных суспензионных культур диоскореи и женьшеня, нарастающих только за счет клеточного деления.

6. Антиметаболитное действие пизамина, реализуемое в системе биосинтеза и ко-ферментной активности КоА, подтверждается ингибированием образования хлорофилла, в зеленеющих изолированных семядолях огурца и кабачка, обусловленного подавлением этапа биосинтеза предшественников хлорофилла. Для антивитаминного фактора свойственно подавление процессов фотосинтеза и дыхания.

7. Пизамин вызывает вторичную недостаточность ПК (КоА) у высших растений и животных. Он подавляет рост изолированных корней люцерны и кукурузы, что предотвращается ПК и (З-аланином. У подопытных животных (белые мыши и крысы) при серийном и однократном введении пизамина в дозе 0,1 г/кг проявляются типичные симптомы пантотеновой недостаточности: снижение общего содержания КоА, его ацетилирующей активности, активности КоА-зависимых ферментов, а также повышенное выделение ПК с мочой.

8. Механизм антивитаминного действия пизамина связан с нарушением каталитических функций КоА путем инактивации активной сульфгидрильной группы и ее секвестрования, что приводит к нарушению КоА-зависимых процессов метаболизма. Прямое действие пизамина на N-ацетилтрансферазную реакцию in vitro приводит к падению ацетилирования ПАБК, концентрации КоА. Пизамин ускоряет процесс окисление КоА in vitro кислородом воздуха, что указывает на реакцию ди-сульфидообразования.

9. На дрожжевых тест-культурах пизамин проявляет специфичное антивитаминное действие в отношении ПК. Антивитамин подавляет рост дрожжевых культур, нуждающихся в экзогенном витамине, в концентрации 1 мг/л и не действует на организмы, синтезирующие витамин, не нуждающиеся в экзогенной пантотеновой кислоте. Пизамин не оказывает влияния на синтез ПК, воздействуя на образование связанных (фосфорилированных) форм витамина и инактивирует (секвестирует) коферментную форму - КоА. (З-Аланин, составная часть и предшественник синтеза ПК в культуре дрожжей Б. сегеу181ае, полностью заменяет для дрожжей витамин и, в равной степени с ним, инактивирует пизамин.

10. После 7 генераций дрожжей, на среде с возрастающим количеством пизамина, они повышают устойчивость к антивитамину в 200 раз, которая закрепляется генетически и сохраняется неизменной без контакта с антивитамином неопределенно долго. Адаптированные дрожжи обладают сокращенным лаг-периодом, интенсивным ростом, повышенной бродильной активностью, повышенной способностью синтезировать белок, накоплением БАВ, стимулирующих рост дрожжей, а также внутриклеточного глутатиона, инактивирующего пизамин. Обладая полной устойчивостью к пизамину, дрожжи полностью сохраняют потребность в экзогенной ПК, что дает возможность использовать их для количественного определения ПК в растительном материале в присутствии ингибитора.

11. Антивитаминное действие пизамина проявляется только в присутствии ПК, т.е подавляется рост дрожжей, специфически стимулируемый витамином. Антагонизм пизамина с ПК не носит конкурентного характера, индекс торможения не постоянней. Выявлено усиление антагонизма между пизамином и ПК аспараги-ном, причем, ПК его потенцирует. Антагонизм усиливается также аминокислотами, действие которых не проявляется в присутствии аспарагина. Снижают или полностью инактивируют действие антивитамина серосодержащие аминокислоты (метионин, цистеин и цистин), являющиеся субстратами для синтеза КоА и глутатиона, а также лейцин и глутаминовая кислота. Наиболее эффективно инактивирует действие пизамина глутатион - природный внутриклеточный антиоксидант.

12. Предшественники КоА, содержащие БН-группы: Э-пальмитилпантетеин, Б-бензоилпантетеин, меркаптоэтиламин, проявляют синергический эффект с пизамином в подавлении роста дрожжей. Высокий уровень синергизма в инактивиро-вании роста дрожжей проявляет пизамин с природными и синтетическими антивитаминами ПК и Б, с обоюдным усилением их антивитаминного действия.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью повышения продуктивности растений предлагается использовать препарат витамина СаПК (кальциевая соль ПК) и, в т. ч. в сочетании с другими биологически активными веществами, в концентрации 20-40 мг/л, для предпосевной обработки семян, опрыскивания растений в ранний период онтогенеза и вегетации, повышающих уровень коферментных форм витамина, способствующих повышению активности метаболических и ростовых процессов.

2. При использовании БАВ для обработки сельскохозяйственных растений необходимо учитывать их возможный характер взаимодействия с эндогенным антивитаминным фактором, в результате которого возможно проявление усиления или ослабления активности олигосахарида в растущем растении.

3. Целесообразно использование морфактивного действия пизамина, как ингибитора роста междоузлий, для обработки им растений в раннем периоде онтогенеза в целях формирования компактного габитуса надземной части с укороченными междоузлиями и повышения устойчивости растения к полеганию.

4. Пизамин перспективен к применению для защиты растений от патогенных грибов и как модель для синтеза веществ, подавляющих их жизнедеятельность.

5. Обосновано применение пизамина, как антивитамина пантотеновой кислоты, для получения экспериментального авитаминоза в растительном и животном организмах для выяснения роли ПК в биохимических и ростовых процессах.

6. Рекомендуется использовать пизамин для получения дрожжевых культур с повышенной ростовой активностью, сокращенным лаг-периодом, повышенным содержанием белка и с повышенной интенсивностью брожения для совершенствования технологий в производстве хлебопекарных, кормовых и винных дрожжей.

7. Для аналитических целей рекомендуется использовать устойчивые адаптированные дрожжевые культуры для определения пантотеновой кислоты в растительном материале, в котором может присутствовать антивитаминный фактор, а также применять ингибирующий эффект пизамина в качестве теста при выявлении потребности различных микроорганизмов в экзогенной пантотеновой кислоте.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Смашевский, Николай Дмитриевич, Астрахань

1. Авалбаев А.Н. Физиологическое действие брассиностероидов на растения /А.Н Авалбаев, P.A. Юлдашев, Ф.М. Шакирова // Успехи соврем, биол. -2006. № 2. - С.192-200.

2. Авдеева Т.А., Андреева А.Ф. Влияние условий фосфорного пиания на фотосинтез и активность карбоксилирующих ферментов бобов и кукурузы /Т.А. Адеева, Т.Ф. Андреева // Физиология растений. 1974. - Т. 21. - вып. 5. - С. 909-914.

3. Агностикова В.Н. Определение природных гиббереллинов в растительных тканях /В.Н. Агностикова //Рост растений и природные регуляторы. М.:, «Наука». - 1977. - С. 89-105.

4. Аликов Х.К. Фотоколориметрический метод определения содержания углерода в листьях мокрым сжиганием в хромовой смеси /Х.К. Аликов. Методы комп-лексного изучения фотосинтеза. Ленинград. 1973. - вып. 2. -С. 6-14.

5. Ангелова Иорданка. Съдържание на ендогенни ауксини и АБК в порстъци от грах при отглеждане на светло и на тъемно / Иорданка Ангелова. Физиолог. (НРБ). -1982. т. 8. - № 4. -С. 17-22.

6. Ауксины и цитокинины в развитии растений (Последние достичения в исследованиях фитогормонов) /Второй международный симпозиум (Прага, Чехия, 7-12 июля 2005 г.) // Физиология растений 2006 - Т. 53. - № 2.- С. 309-319.

7. Барышева Т.С. Влияние циклогексимида на синтез полисахаридов и активность гликозидаз клеточной стенки при закаливании /Т.С Барышева, O.A. Заботина, А.И. Заботин. //Физиология растений.-1999. Т.46.- № 3 -С. 633-638.

8. Батыгин Н.Ф. Онтогенез высших растений /Н.Ф. Батыгин.- М.: Агропромиздат. 1986.

9. Березовский М. Химия витаминов /В.М. Березовский //М.:«Пищевая промыш-ленность. 1973. - 632 с.

10. Ю.Борисова Т.А. Влияние 2,4-динитрофенола на потребление кислорода растущими клетками колеоптилей пшеницы /Т.А. Борисова, В.Н. Жолкевич //Физиология равстений 1980. - Т.27. - № 3 - С. 626-630.

11. П.Бочаров С.Н. Изменчивость дрожжей при длительном пребывания в растворе сахарозы /С.Н.Бочаров. // Тр. Ин-та генетики АН СССР.- 1955 № 22 - С .208-217.

12. Бояркин Л.И. Быстрый метод определения активности пероксидазы /Л.И.Бояркин //Биохимия. 1951. - Т. 16. - № 4. - С. 352-357.

13. Браунштейн А.Е. Витамины группы В и процессы обмена аминокислот /А.Е.Браунштейн //Укр. биохим. журнал. 1955. - Т. 27. - № 4. - С. 421443.

14. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза /Р.Г. Бутенко. -М.: «Наука». -1964. -.272 с.

15. БюнингЭ. Риммы физиологических процессов / Э.Бюнинг.М.:-1961

16. Витамины и фитогормоны в растениеводстве /Тез.докл. республиканской научной конференции «Реализация генетической программы в ответе организмов на фитогормоны и витамина и в мутагенезе» Секция 1. Вильнюс, 9-10 октября 1986 г.- Вильнюс. -1986. С.3-34.

17. Вулли Д. Учение об антиметаболитах /Д.Вулли. М.: И.Л. — 1954. - 862 с.

18. Высоцкая Л.Б. Механизм координации ростового ответа проростков пшеницы при нарушении соотношения побег/корень /Л.Б. Высоцкая //Физиолгия растений. -2005. т.52. - № 5 - С. 763-768.

19. ГамбургК.З.Фитогормоны и клетки /К.З.Гамбург. -М.:«Наука».-1970- 103с.

20. Гамбург К.З. Биохимия ауксинов и его действие на клетки растений /К.З. Гамбург. Новосибирск. -1976. - 272 с.

21. Гамбург К.З. Влияние гибереллина на содержание нуклеиновых кислот в междоузлиях проростков гороха/3. Гамбург, В.Н. Мальцева. Г.И. Кобыль-ский //Физиология растений.-1965.- № 12 С. 146-151.

22. Гамбург К.З Роль ауксина в регуляции деления клеток. /К.З. Гамбург, Л.М. Ошарова, Н.А. Кондратьева //Рост и гормональная регуляция жизнедеятельности растений. Иркутск. - 1974. - С. 103-104.

23. Гиббереллины и их действие на растения /Под редак. М.Х. Чайлахяна. Раздел П.Физиологическое действие гиббереллинов. -М.: Из-во АН СССР. 1963. -391 с.-С.87-95.

24. Гродзинский A.M. Краткий справочник по физиологии растений /A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский.-Киев. «Наукова думка».- 1964 .- 388 С.

25. Гриневич В.П. Взаимодействие дисульфидных производных тиамина с биологически активными производными и дисульфидами: Автореф. дис. канд. наук. Минск. -1976. 21 с.

26. Гусева А.Р. Определение КоА в высших растениях методом ацетилирования амида сульфаниловой кислоты /А.Р.Гусева, А.Р.Борыхина //Биохимия-1958. Т, 23. - вып. 2. - С. 291-295.

27. Гуськов А.В. О механизме действия ауксинов на процессы органогенеза растений /А.В.Гуськов //Усп. соврем, биологии. -1975. т.80. -вып.1(4). -С.128-141.

28. Гуринович В.А. Биотрансформация и протеидизация призводных панто-теновой кислоты в печени животных. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Гродно.-2003.- 24 с.

29. Детари Л. Биоритмы /Л.Детари, В.Карцаги. -М.: «Мир». 1984.

30. Долгих Ю.И. Полисахаридный фрагмент ксилоглюкана как регулятор морфогенеза у растений /Ю.И.Долгих, У.Ю.Шайкина, А.И Усов и др. // Докл РАН. -1998. Т. 360. - С. 417-419.

31. Денисова Г.М О динамике эндогенных регуляторов роста в органах формирующегося проростка люпина узколистного /Г.М.Денисова, Т.А. Дмитриева, В.Е. Викторова //Физиология ростовых процессов. МОПИ им. Н.К.Крупской. -М.: -1980. С. 41-48.

32. Еникеев А.Г. Изучение функций растительных ацил-КоА связывающих белков методами генетичеаской инженерии /А.Г. Еникеев, У.О. Мишутина, P.C. Паков-ская // Вест. Башкирского ун-та.- 2001.- № 2(11).-С. 7-9.

33. А.Г.Еникеев. Влияние структуры генетического вектора на физиологические последствия трансформации рапса (.Brassica napus L.) геномом acd/AT. Еникеев,У.О. Мишутина //Физиология растений-2005. Т. 52.-№5-С. 751-754.

34. Жолкевич Н.В. Роль листьев Cucumis sativum и содержание фитогормонов при почвенной засухе /Н.В. Жолкевич, Н. Пустовойтова //Физиология растений. -1993. Т. 40. - С. 676-680.

35. Зорин В.Э, Железосодержащий кофермент А в акцепторе углекислоты при фотосинтезе /В.Э. Зорин, Е.А. Бойченко //Физиология растений-1967.- Т. 14. -№ 5. -С.843-848.

36. Зеленёва И.В. Влияние хлорамфеникола на активность ферментов в корне проростков кукурузы /И.В. Зеленева, Е.В. Савостьянова //Физиол. и биохим. культурных растений. -1983. -Т. 15. -№ 6. С. 558-561.

37. Иванов H.H. Методы физиологии и биохимии растений /H.H. Иванов.-М.,-Л.,-1946.-494 с.

38. Иерусалимский Н.Д. Изменение физиологических потребностей Bac.idosus под влиянием стрептомицина /Н.Д. Иерусалимский, Е.В. Гришенкова, Л.А. Шев-ченко //Микробиология. -1962. Т.31. -№ 6. -С. 995-1001.

39. Иерусалимский Н.Д. Изменение некоторых физиологических потребностей дрожжей в результате адаптации к стрептомицину /Н.Д. Иерусалимский, Л.А.Шевченко, Е.В.Гришенков //Микробиология-1963 Т.32- № 1. -С. 13-16.

40. Иванов В.Б. Клеточные основы роста растений /В.Б. Иванов Москва. «Наука». -1974. - 222 с.

41. Иванов В.Б. Разделение оксиаминокислот и определение их конфигурации при помощи газожидкостной хрматографии / В.Б. Иванов // Докл. АН СССР.-1965.-Т.165. № 5.- С. 1184-1187.

42. Иванова H.H. О каталитических функциях пероксидазы хлоропластов H.H. Ива-нова, Б.А. Рубин, М.Я. Давыдова //Докл. АН СССР.-1970.- Т.90.- №1.-С. 216-217.

43. ИмшенецкийА.А. Адаптация дрожжей к ядам. /A.A. Имшенецкий, К.З. Перова //Микробиология-1955 Т. 24 .- № 2 - С. 147-150.

44. Карабанов И.А. Витамины и фитогормоны в жизни растений /И.А. Карабанов. Минск.: «Урожай».- 1977. 112 с.

45. Карасевич Ю. Торможение синтеза пантотеновой кислоты некоторыми аминокислотами у дрожжей Тоги1орз1з с1аШ1а /Ю. Карасевич, Л.П. Волкова, Э.Г. Кениг //Докл. АН СССР. -1964. Т. 158. -№ 1. - С. 212-213.

46. Кефели В.И. Участие природных ауксинов и ингибиторов в росте растений /В.И. Кефели, Р.X. Турецкая//Агрохимия.-1965. № 1.-С. 119-131

47. Кефели В.И. Взаимодействие фитогормонов и природных ингибиторов при росте растений /В.И. Кефели //Физиология растений. -1971. Т. 18. - вып. 3. - С. 614-630.

48. Кефели В. И. Фенольные соединения и рост растений / В. И. Кефели // Материалы 2-го Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям, 17-21 мая 1971 г. В Алма-Ате. Из-во «Наука», Казахской ССР, Алма-Ата 1971-С. 41-45.

49. Кефели В.И. Природные ингибиторы как факторы роста/В.И.Кефели //Фито-гормональная регуляция роста и развития растений: Материалы симпозиума. Киев, «Наукова Думка». -1985. С. 110-116

50. Кефели В.И. Природные ингибиторы и фитогормоны /В.И. Кефели. -Москва, «Наука». -1974. 253 с.

51. Кефели В.И. Эволюционный аспект формирования системы гормональной регуляции /В.И. Кефели, Е.И. Камизерко, Р.Х. Турецкая и др. //Иммунитет и покой растений. -М.: «Наука». 1972. - С. 200-212.

52. Кефели В.И. Активность фитогормонов и природных ингибиторов в мутантах гороха, различающихся по высоте стебля /В.И. Кефели, В.Н. Ложникова, Л.П.Хлопенкова и др. //Изв. АН СССР. Сер. Биол. -1973. № 5- С.681-687.

53. КефелиВ.И. Рост растений/В.И. Кефели. -М.: «Колос». -1973. -120 с

54. Кефели В.И. Новые тенденции в учении о регуляторах роста растений /В.И Кефели, Р.Х Чайлахян //Успехи соврем, биол. -1975.-Т.80 вып. 1(4). -С. 116-127.

55. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста основные физиологические аспекты действия /В.И. Кефели. Р.Х. Турецкая //Рост растений и природные регуляторы. «Наука». -1977. - С. 234-245.

56. Кефели В. И. Рост растений и природные регуляторы / В. И. Кефели // Физиология растений. 1978. - Т. 25. - выс. 5. - С. 975-978.

57. Кефели В.И. Первичные механизмы интеграции и рост растительного организма /В.И. Кефели //Физиология и биох. культурных растений.-1978-Т.10. -№ 1. С. 18-25.

58. Кефели В.И. Витамины и некоторые другие представители негорманальных регуляторов роста растений /В.И.Кефели //Прикладная биох. и микробиология. -1981. Т.17. -№1. С. 5-24.

59. Кефели В.И. Физиологичемкие основы конструирования габитуса растениц /В.И. Кефели. М,: «Наука». 1994. - 269 с.

60. Копелевич В.М. Природные и синтетические производные пантотеновой кислоты /В.М. Копелевич, В.И. Гунар //Химия природных соединений. -1988. -№4. -С.477-492.

61. Кораблева Н.П. Влияние регуляторов роста на синтез нуклеиновых кислот в растениях /Н.П. Кораблева, JI.B. Метлицкий //Успехи соврем, биол. -1973. -т. 76.-№3(6). -С. 431-446.

62. Костов В. Изследование антибактериального действие на някои витамин Р-подобни вещества /В. Костов, Р. Гахниян //Изв. Микробиол. ин-т., Бъелг АН. -1061.- кн. 16.-С. 25-30.

63. Коф Э.М. О флавоноидном комплексе зеленого и этиолированного гороха (Pisum sativum L.) / Э.М. Коф, А.Н. Лама. В.И. Кефели // Докд. АН СССР. -1976. -Т. 228. -№ 2. С.505-508.

64. Коф Э.М. Скорость роста побега и корня у интактных растений листовых мутантов гороха / Э.М. Коф, O.A. Виноградова, З.В. Ооржак и др.// Физиологиярастений-2006. Т. 54.- № 1.- С. 128-138.

65. Кох Э.М. Роль фитогормонов в вегетативном и генеративном развитии растений /Э.М. Кох, ТА.Борисова, H.A. Аскогенская // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. Природные и синтетические регуляторы роста. М.: -1990. -С. 41-61

66. Красильников Н.Л. Бактерицидность растительного сока. /Н.Л. Красильников, А.И. Кореняко //Рефераты научно-исследовательских институтов. Отдел биологические науки, за 1945 г. -1947.

67. Коновалов С.А. Питательная ценность различных азотистых соединений для дрожжей. /С.А Коновалов //Микробиология. -1949. T.XVIII. - вып. 3. - С. 250-253.

68. Кирилова Э.Н. Соотношение ауксинов и ингибиторов роста в органах яблони при закладке цветочных почек /Э.Н. Кирилова, М. Руссу, Г.Т. Балтуш //Изд. АН МССР. Сер. биол. и химич. наука. -1987. № 1. - С. 19-22.

69. Коновалов. С.А (а). Избирательная способность дрожжей к потреблению азота различных аминокислот /С.А. Коновалов. //Микробиология. -1949. Т. XVIII.-вып .4.-С. 351-355.

70. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей /С.А. Коновалов. -М.: «Пищепром издат.» -1962. 269 с.

71. Кретович В.Л. Основы биохимии растений /В.Л. Кретович. -М.: Высшая школа.-1972.-445 с.

72. Крокер К.У. Физиология семян /К.У. Крокер, Л. Бартон, М., Л.: Из-во ИЛ. -1955.-399 с.

73. Кудоярова Г.Р. Гормональная регуляция соотношения биомассы побегов/корней при стрессе /Г.Р Кудоярова, С.Ю. Веселов, И.Ю. Усманов //Журнал общей биологии. -1999. Т. 6. - С. 649-654.

74. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М.: Наука.1979. 264 с.

75. Кулакова И.А. О влиянии ауксинов и кинетина на рост целого растения гороха и его изолированных частей /И.А. Кулакова, Г.Н. Фирсанова. //Рост растений и пути его регулирования. МОПИ им. Н.К.Крупской .- 1976. С. 70-75.

76. Кулаева О.Н. Цитокинины и их физиологические действия /О.Н.Кулаева //Успехи современной биологии. -1967. -Т. 63. № 23. - С. 28-53.

77. Кулаева О.Н. О механизме действия цитокининов / О.Н. Кулаева. Рост растений и природные регуляторы . М.:- 1977- с. 216-234.

78. Леопольд А. Рост и развитие растений / А.Леопольд. Из-во « Мир». -М. -1968. -494 с.

79. Либерт Э.Физиология растений /Э. Либерт. Из-во «Мир».-Москва-1976-580 с.

80. Ложникова В.Н, Определение природных гиббереллинов, ингибиторов роста, дефолиантов и гербицидов /В.Н. Ложникова, Л.И. Хлопенкова, М.Х. Чайлахян. М.: «Наука», 1973. - С. 50-58.

81. Лобырева Л.Б. Влияние цистеина на дыхание и активность некоторых дегидрогеназ дрожжей Candida utilis 295 /Л.Б. Лобырева, Е.Л. Рубан. //Изв. АН СССР. Сер. биологическая, 1971. - №2. - С. 298-301.

82. Ложникова В.Н. Регуляция роста высокорослой и карликовой форм гороха и содержание абсцизовой кислоты /В.Н. Ложникова, Н.Д. Дудко, К.К. Сидоров и др. //Докл. АНСССР. -1987. Т. 293. -№ 4. -С. 1017-1022.

83. Майстер А. Биохимия аминокислот /А. Майстер. М.: Из-во "Иностранная литература", 1961. -530 с.

84. Максимов И.В. Про-/антиоксидантная система и устойчивость растений к патогенам /И.И. Максимов, Е.А. Черепанов // Успехи современной биологии.- 2006.-Т. 126. № 3. - с. 250-261.

85. Мейсель М.Н. Морфологические и физиологические изменения клетки под влиянием витамина В} /М.Н. Мейсель //Докл. АНСССР.-1941.- Т. 29.- № 2.-С. 127-129.

86. Мейсель М.Н. Биологический синтез пантотеновой кислоты из ß-аланина и некоторых его производных /М.Н. Мейсель, H.A. Помощникова, Н.П.Трофимова //Биохимия. -1949. Т. 14. -№ 4. - С. 361-371.

87. Мейсель М.Н. Функциональная морфология дрожжевых организмов. М.-Л.: Изд. АН СССР.- 1950.

88. Мейсель М.Н. Витамины и микроорганизмы. /М.Н.Мейсель.-Успехи биол. химии, 1951. сб. 1. С. 390-422.

89. Мойсеенок А.Г. Антивинамины и антиметаболитные факторы в биохимии КоА/А.Г.Мойсеенок.//Антивитаминыв регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника. Тезисы докладов 7-го Гродненского симпозиума 28-29 сентября 1983 г. Гродно. 1983. - С. 76-77.

90. Мойсеенок А.Г. Производные пантотеновой кислоты. Разработка новых витаминных и фармакотерапевтических средств /А.Г.Мойсеенок, В.М. Копелевич, В.М.Шейбак, и др.//Под ред. В.И.Гунара, П.И.Лукиенко. -Минск 1989. - «Наука и техника». -216 с.

91. Мойсеенок. А.Г. Кинетика образования пантолактона из пантонатов и его колличественого определения /А.Г. Мойсеенок, B.C. Слышенков, A.B. Лысенков. //Химия природных соединений. 1984. - № 1. — С. 93-95.

92. Мойсеенок А.Г. Общий анализ взаимоотношений между тиамином, пантотеновой, липоевой кислотами и витамином Вп П Материалы 3-го Гродненского симпозиума. Межвитаминные взаимоотношения. Гродно. -1975.- С. 108-110.

93. Мойсеенок А.Г. Определение активного кофермента ацетилирования и его предшественников в тканях животных / А.Г. Мойсеенок // Тез. докл. 1-го республиканского съезда врачей-лаборантов. Минск. -1975. С. 216-218.

94. Мойсеенок А.Г. Пантотеновая кислота (Биохимия и применение витамина) / А.Г. Мойсеенок. Минск. - «Наука и техника». - 1980. - 264 с.

95. Мойсеенок А.Г. Количественное газохроматографическое определение панто-лактона / А.Г. Мойсеенок, B.C. Слышенков, Е.В. Сунозова и др. // Вопросы мед. хи-мии. 1984 . - Т. 30 . - № 1 .- С. 126-128.

96. Мойсеенок А.Г. Биосинтез Ко А в метаболическиой активностьи призводных пантотеновой кислоты.Автореферат дис.докт. биол. наук. Москва, 1996, 47 с.

97. Мойсеенок А.Г. Биосинтез кофермента А универсальный механизм сопряжения экзогенности и множественности функций пантотеновой кислоты /А.Г. Мойсеенко, В.А. Гуринович, С.Н. Омельянчик, и др. //Укр. биохим. журн.- 2004. -76. - № 4. - С. 68-81.

98. Муромцев Г.С. Гиббереллины и рост растений /Г.С. Муромцев, P.M. Коренеева,Н.М. Герасимова // Рост растентий и природные регуляторы. -Москва. «Наука»-1077. С. 193-216.

99. Николаева М.Г. Роль фитогормонов в процессах созревания и прорастания семян /М.Г. Николаева //В сб. Рост и гормональная регуляция жизнедеятельности растений. -Иркутск, 1974. - С. 187-206.

100. Овчаров К.Е Значение калия и света для синтеза тиамина в растении и роль последнего в обмене веществ растительного организма /К.Е Овчаров // Труды института физиологии растений им. К.А. Тимирязева. -1951. -Т. 7. -вып. 2.-С. 242-251

101. Овчаров К.Е. Авитаминоз и гипервитаминоз у растений /К.Е.Овчаров // Рост растений. Изд. Львовского университета - 1959. - С. 308-312.

102. Овчаров К.Е. Витамины растений / К.Е Овчаров. М.: «Колос». -1964247 с.

103. Овчаров К.Е. Значение витаминов в жизни растений /К.Е. Овчаров // Сельскохозяйственная биология 1968 - Т. 3. - № 2. - С. 176-183.

104. Овчаров К. Витамины растений. / К.Е. Овчаров Изд.2-е - М.: «Колос».-1969.-328 с.

105. Одинцова E.H. Микробиологические методы определения витаминов /E.H. Одинцова // Издательство АН СССР. М.: 1959.- 379 с.

106. Островский Ю.М. Антивитамины в экспериментальной и лечебной практике. / Ю.М. Островский. Минск.: Наука и технрика - 1973.- 176 с.

107. Островский Ю.М. Механизм межвитаминных взаимоотношений (тиамин, пиридоксин, пантотеновая и никотиновая кислоты) /Ю.М. Островский, .Г. Мой-сеенок. А.Г. Мажуль и др. Минск.: «Наука и техника». -1973. 142 с.

108. Островский Ю.М. Природные антивитаминые факторы /Ю.М. Островский, А.Г. Мойсеенок, Н.Д. Смашевский и др. //Тезисы симп. докладов 3-го Всесоюзного Биохимического съезда. Рига, октябрь, 1974г. Из-во «Знание». Рига.-1974. -С. 252-253.

109. Островский Ю.М. Антивитамины, пути и перспективы использования /Ю.М. Островский //Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника). Тезисы докл. 7-го Гродненского симпозиума 28-29 сентября 1983 г. -Гродно. -1983. С. 37-38.

110. Паду Э.Х. Свойства пероксидазы фениладенин-аммиак-лиазы при образовании и лигнификации клеточной стенки пшеницы /Э.Х. Паду // Физиология астений. -1995. Т. 42. - № 3. - С. 408-415.

111. Плохинский H.A. Биометрия /H.A. Плохинский .- 2-е издание. Издательство Московского университета.- 1970. 367 с.

112. Поле П. Изменение роста и пероксидазой активности у Inetum africanum /П.Поле, Ф. Миалундана, Н. Славный //Физиология растений. -1988. -Т. 30.-вып. 5.-С. 791-794.

113. Полевой В.В. Физиология целостности растительного организма /В. Полевой // Физиология растений. -2002.- Т.48.- № 4 .- С.631-643.

114. Процко Р.Ф. К вопросу о факторах эндогенной регуляции гормональной активности растений/ Р.Ф. Процко, K.M. Сытник // В сб. Метаболизм и механизм действия фитогормонов- Иркутск 1979 - С. 28-36.

115. Пумпянская Л.В. О хранении колекции микроорганизмов /Л.В.Пумпянская //Бюл. научно-технической информации по с.х. микробиологии. -I960. Т.8. -№11.-С. 3-5.

116. Ракитин В.Ю. Ингибирование олигосахаридом синтеза этилена и стимуляция соматического эмбриогенеза в культуре клеток хлопчатника /В.Ю. Ракитин, Ю.И. Долгих, Е.Ю. Шайкина и др. //Физиология растений. -2001.- Т.48. -№ 5. -С.728-732.

117. Раскевич В.А. Об активности каталазы и пероксидазы в растения, обработанных гиббереллином /В .А. Раскевич //Физиология растений. -1964-Т. П.-вып. 3.-С.584-587.

118. Розанов А.Я. Витамины /А.Я. Розанов, вып. IX Киев. - 1976. - С. 34-42.

119. Рыжков В.Л. Методы антиметаболитов в биологии /В.Л. Рыжков. //Природа. -1956.-№12,-с. 20-26.

120. Рост растений /Под редакцией проф. С.О Гребинского. Издательство Львовского университета. 1959. - С. 289-312.

121. Рубин Б.А. Физиология и биохимия дыхания растений /Б.А.Рубин, М.Е. Ладыгина. Из-во Московского университета. -1974. 511 с.

122. Рункова Л.В. Исследование ауксинов методом биотестов /Л.В. Рункова //В кн. «Рост растений и природные регуляторы. М.: «Наука». -1977. С. 52-65.

123. Саламатова Т.С. Физиология растительной клетки. /Т.С. Саламатова. Ленинград.: Изд-во Ленингадского унивеситета. 1983 . - 232 с.

124. Самукава К. Метаболизм аминокислот у высших растений. Изменение количества свободных аминокислот в процессе роста листа у растений риса /К. Самукава, М. Ямагути // Физиология растений. 1975. - Т. 22 - № 2 .- с. 295-299.

125. Ситник K.M., Богданова Т.Л. Муссатенко АЛ. Вшьш аминокислоты стебла у св'язку с його функциональним навантаженням. /K.M. Ситник, Т.Л. Богданова, Л. I. Мусатенко // Укр. бот. журнал. 1987 . - Т. 44. - в. 4. - С. 82-88.

126. Смашевский Н.Д. Изолирование антивитамина из проростков гороха /Н.Д. Смашевский //Ученые записки (биологические и химические науки). -Хабаровск. -1964. Т. XI. - С. 79-85.

127. Смашевский Н.Д. Пизамин антивитамин пантотеновой кислоты из Pisum sativum и его действия на дрожжи Sacchazomyces cerevisiae /Н.Д.Смашевский //Вопросы батаники и физиологии растений. Хабаровский гос. пединститут. -Хабаровск. -1965. - С. 3-16.

128. Смашевский Н.Д. Синтез и динамика пизамина в растении гороха. /Н.Д Смашевский //В сб. Вопросы ботаник и физиологии растений. Хабаровский гос. пед. институт. -Хабаровск. 1965. - С. 17-26.

129. Смашевский Н.Д. Природный антивитамин ПК /Н.Д. Смашевский //Биологические науки. 1966. - № 1. -С. 182-186.

130. Смашевский Н.Д. Стимуляция роста различных дрожжей р-аланином и пантотеновой кислотой в присутствии аспарагжна /Н.Д. Смашевский //Прикладная биохимия и микробиология. 1967. - Т. 3. — выт. 1. - С. 55-58.

131. Смашевский Н.Д. Инактивация природного антивитамина пантотеновой кислоты пизамина аминокислотами и возможный механизм его действия /Н.Д. Смашевский //Биологические науки. 1968. - № 9. - С. 80-84.

132. Смашевский Н.Д. Стимуляторы роста с пантотеновой активностью из свеклы и кукурузы /Н.Д. Смашевский //Биологические науки-1967. № 12 - С .103108

133. Смашевский Н.Д. Механизм адаптации дрожжей к пизамину. /Н.Д.Сма-шевский //Учен .зап. (серия химико-биологическая). Хабаровский госуд. пединститут. -Хабаровск. -1968. т.ХШ. - С. 5-11.

134. Смашевский Н.Д.(б). Стимулятор роста дрожжей, выделенный из проростков гороха /Н.Д. Смашевский //Учен. зап. Хабаровского пед. ин-та (серия химико-биологическая). -Хабаровск. 1968. - Т .XIII. - С. 12-18.

135. Смашевский Н.Д.Действие пизамина на дрожжевые организмы, синтезирующие и не синтезирующие пантотеновую кислоту /Н.Д. Смашевский //Биологические науки. 1970. -№ 12. - С.87-91.

136. Смашевский Н.Д. Антивитаминное действие D,-DL-h L-гомопантоте-новой кислоты на дрожжевые организмы /Н.Д. Смашевский, В.М Копелевич, Т.Д. Мариева и др. //Прикладная биохимия и микробиология.-1973. Т. IX. вып. 5.-С. 659-663.

137. Смашевский Н.Д. Влияние цистеина на рост дрожжей. /Н.Д. Смашевский //Прикладная биохимия и микробиология. 1975. - Т.XI. - вып. 2 . - С. 167171.

138. Смашевский Н.Д.(а) Способ остановки и фиксации роста дрожжевых культур в постинкубационный период /Н.Д. Смашевский. //Прикладная биохимия и микробиология. -1976. Т. XII. вып. 4. - С. 619-621.

139. Смашевский Н.Д.(б) Подавление пизамином ростовых процессов растений /Н.Д.Смашевский // Рост растений и пути его регулирования. Сб. трудов МОПИ им. Н.К.Крупской. Москва. - 1976. - С. 120-125.

140. Смашевский Н.Д.(в). Влияние пизамина на активность каталазы и пероксидазы растений. /Н.Д. Смашевский //В сб. Рост растений и пути его регулирования. -МОПИ им. Н.К.Крупской. Москва. -1976. С. 112-119.

141. Смашевский Н.Д. Физиологические свойства ингибитора роста из проростков гороха /Н.Д. Смашевский //Рост растений и пути его регулирования. Межвуз. сборн. научных трудов. -Москва. -1981. -С.94-102.

142. Смашевский Н.Д. Влияние салициловой кислоты на рост и обмен веществ в проростках дыни / Н.Д. Смашевский // Фитогормоны и их действие на рост. М. 1982.-С. 84-91.

143. Смашевский Н.Д. Антивитаминное действие D-гомопантотеновой кислоты на высшие растения /Н.Д. Смашевский, В.М. Копелевич, В.И. Гунар //Физиология растений. -1986. Т. 33. - вып. 6. - С. 1138-1143.

144. Смашевский Н.Д. Влияние сочетаний витаминов и фитогормонов на структуру фотосинтетического аппарата и продуктивность овощных культур. /Н.Д.Смашевский //Естественные науки. Астрахань. Из-во АГУ. -2003. № 6.- С 41-44.

145. Смашевский Н.Д. Влияние витаминов и их сочетаний с фитогормонами на рост и метаболизм томатов. / Н.Д. Смашевский, Л.П. Ионова. // Регуляторы роста растений. Межвузовский сборник научных трудов. -М.; МОПИ им. Н.К.Крупской. -1990. С. 98-103.

146. Слышенков B.C. Газохроматографический метод определения пантоевой кислоты в витамин содержащих препаратах /B.C. Слышенков, А.Г.Мойсе-енок //Хим. Фарм. Журнал. 1983. -№ 12. - С. 1513-1515.

147. Смирнов A.M. О сравнительной доступности различных соединений азота для изолированных корней люцерны, выращиваемых в стерильных условиях /A.M. Смирнов, Хуан Хун-шу //Известия АН СССР. Серия Биологическая, --1981. .№6.- С. 878-887.

148. Смирнов A.M. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре / A.M. Смирнов. М.: «Наука», -1970, 452 с.

149. Согур (Конопская) JI.H. влияние удаления корневой системы или эпикотиля на содержание цитокининов в проростках гороха /JI.H. Согур (Конопская), К.З. Гамбург //Физиол. Растений. -1979. -Т. 26. № 3. - С. 632-634.

150. Стрелков Р.Б. Методы вычисления стандартной ошибки и доверительных интервалов средних величин с помощью таблицы / Р.Б. Стрелков Сухуми.: «Алашар».- 1966. - 22 с.

151. Сытинская О.Н. Модификация метода определения сульфаниламидов в приложении к исследованиям и содержания КоА и ацетилирующей способности тканей /О.Н. Сытинская //Вопросы мед. химии.-1956- Т.2.-№ 33.-С. 214-221.

152. Сищиков Д.В. Функцюнування глутатюн залежноТ антиоксидантно! системи у гороха, coi та кукурузи за дй сполук кадмпо / Д.В. Сищиков, В.М. Гришков //Физиология и биохимия культурных растений. -2004. т. 36. - № 6. - С. 503-510.

153. Сухоруков К. Образование и распространение биоса / К. Сухоруков, Е. Клинг, Д.Клячко// Доклады АН СССР. 1935. - Т. 1. - № 7/8. - С. 524-529.

154. Тарчевский И.А. Основы фотосинтеза /И.А.Тарчевский. -М.: «Высшая школа». -1977. 253 с.

155. Теруан Т. Взаимодействие витаминов- М.- 1969. 372 с.

156. Титов А.Ф. Изопероксидазы растений / А.Ф. Титов //Успехи современной, биологии. 1975. - Т. 80. - вып. 4. - С. 102-115.

157. Турецкая Р.Х. Передвижение ауксинов в растениях / Р.Х. Турецкая, И. Кефели //Успехи современно биологии. 1968. - Т.бб.-вып I (4).- С. 102120.

158. Удовенко Г.В. Механизм адаптации растений к стрессам /Г.В. Удовенко //Физиология и биохимия культурных растений.- 1979. Т. 11.- вып. 2-С. 99-107.

159. Уоринг Ф. Рост растений и дифференцировка /Ф. Уоринг, И. Филлипс. Москва «Мир». -1984. С. 181-182.

160. Усов А.И. Олигосахариды новый класс сигнальных молекул в растениях /А.И.Усов //Успехи химии. -1993. -Т. 62. - С. 1119-1143

161. Утно Л.Я. Микробиологический метод определения пантотеновой кислоты в животных тканях / Л.Я. Утно // Прикладная биохимия и микробиология-1970.- Т. 6.-№3.- С. 342-344.

162. Уэбб JI. Ингибиторы ферментов и метаболизма /Л. Уэбб. Издат. «Мир». Москва. 1966. -862 с.

163. Фатеева М.В. Определение степени выживаемости дрожжей после хранения под вазелиновым маслом. /М.В. Фатеева //Микробиология. 1967. - Т. 36. -№ 2. -С. 350-353.

164. Филиппов В.В. Антивитаминное действие растительных экстрактов /В.В. Филиппов //Биохимия. -1958. Т. 23. - вып. 3. - С. 461-470.

165. Филиппов В.В. (а). Распределение биотина и ПК в репродуктивных органах растений / В.В Филиппов // Бюллетень Главного ботанического сада АН СССР.-1958. вып. 24. - С. 38-44.

166. Филиппов В.В. Биотин в растительных и животном организмах /В.В. Филиппов. М.: Из-во АН СССР. 1962. -232 с.

167. Филиппов В.В, Смашевский Н.Д. Длительное хранение культур дрожжевых организмов /В.В. Филиппов, Н.Д. Смашевский //Учен. зап. Сер. Ботаника. Владимирский гос. пед.институт. Владимир, 1968. - вып. 1. - С. 177-178.

168. Хавкин Э.Е. Рост и клеточная дифференцировка растений / Э.Е. Хавкин, H.H. Варакина, A.A. Пешкова. М.: Наука- 1967.- 44 с.

169. Холодный Н.Г. Влияние фитогормонов на изменчивость микроорганизмов /Н.Г. Холодный, К.И. Бельтюкова. //Микробиология. -1939. Т. 8. - № 1 -С. 1-7.

170. Чайлахян М.Х. Влияние витаминов на рост и развитие высших растений. / М.Х.Чайлахян //Природа. -1958. № 7. - С. 67-72.

171. Челенджер Ф. Некоторые вопросы химии серосодержащих органических соединений /Ф. Челенджер. М.: -1963. 247 с .

172. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе / B.C. Шевелуха-М.: «Колос». 1992. - 599 с.

173. Шлык А. Л. Фотохимические аспекты системы центров биосинтеза хлорофилла. / А.Л. Шлык, Л.И. Фрадкин, А.Б. Рудой. //Тез. симпозиальных докладов, 3-й Всесоюзный биохимический съезд. Рига, «Знание», -1974. -С. 161-162.

174. Шпигельман С. Адаптация у микроорганизмов /С. Шпигельман, Х.О. Хальва-рсон.-М.: -ИЛ 1956.

175. Шулындин А.Ф. Ускоренный способ изготовления препаратов для определения числа хромосом /А.Ф. Шуклындин, В.Н. Чередниченко // Селекция и семе-новодство. 1966. -№ 6 - С. 44-47.

176. Ясумори X. Влияние циклогексимида на рост мицелия Wlomerlla cingulata и Colletotrichum lagenarium /Ясумори X //Ann. Phytopathol. Soc. japan. V.25. № 2. -P. 103. Реферат РЖБ. -1961 г. Т. 8 В42.

177. Abiko Y. Pantothenic acid an d related compounds. Boochtmicaol studies. Growth response of Lactobacillus arabinosus 15-5 to d-pantothenic acids and 4(-phosphate /Y.Abiko, M. Shimuzu //Chem. Pharm. Bull. ( Tokyo), 1967.- V.5.- № 6 . p. 884-886.

178. Agarwal Manu. Plant HsplOO proteins: Structure, function and regulation /Agarwal Manu, Katiyar-Agarwal Surekhal, Grover Anil //Plaut Sei КЭ. -2002. -V.163. -№3. P. 397-405.

179. Aiyar A.S. Studies on bisynthesis of coenzyme A in vitro by rat tissues /A.S. Aiyar, A. Sreenivasan//Indian J. Med-1962.-V. 50. P. 95-99.

180. Albersheim P. Oligosaccharins / P. Alberchein, A.G. Darvill //Sei. Amer. -1985. -V.253. P. 44-50.

181. Albersheim P. Oligosaccharins: Regulatory Molecules /Р. Albersheim, A. Darvill //Accounts Chem. Res. -1992. V.25. - P. 77-83.

182. Allan Norris E. Mechanism of penicillin-erytromicin Synergy on antibiotik resists Staphylococcus aureus. / E. Allan Norris, K. Epp Janet. //Antimicrob. Agents and Shemother. -1978. V .13. -№ 5. - P. 849-853.

183. Atkin.G.E. Accelerated analysys of amino acids /G.E. Atkin, W. Ferdinand //Anal. Biochem. -1970. V.38. - p. 313-320.

184. Augar C. Xiloglucan Oligosaccharide to Ingibit Auxin-Stimulated Growth /C.Augar, K.Sacai, H. Ogawa et al.// Plant Physiol. -1992. V. 99. - P. 80-185.

185. Bangerth.F. Response of Cytokinin Concentration in the Xilem Exudate of Bean (Phaseolus vulgaris L.) Plants to Decapitation and Auxin Treatment and Relationship to Apical Domince. / F. Bangertu. // Planta. -1994. V.194. - P. 439-442.

186. Bär F. Antivitaminvirkung von Pflanzenstoffen /F. Bär // Planta Med. 954.- V. 2- №1. - P. 23-28.

187. Barssett Hilde. Separation of acids polysaccharides from Ulmus glabra Huds on Mono PiM. / Hilde Barssett, Smestad. Berit Paulsen. /J. Chromogr. 1985. -V.329.-№2.-P. 315-320.

188. Barthon Henri. Correlations intercroissancens dans und serie organique end devel-opement / Henri Barthon Roger Buis // C. r. Acad. Sei. -1079. D289. -№11.-P. 789-793

189. Beck E. Regulation of the Shoot/Root Ration by Cytokinins in Utrica dioica: Opinion. / E. Beck. //Plant Soil. -1996. V .185. - P. 3-12.

190. Beryl Z.B. Wild yeast in Pitcing yeast / Z.B. Beryl, B. Brody //J. Jnst. Brew. -1958.-№64.-P. 304-307.

191. Betz.A. Peptide des ß-alanins als Ersatz fur die freie Aminosäure bei pantothensäure bedürftigen Hefezellen und ihr verhalten gegenüber dem ß-alanin-Antagonisten Asparagin /A. Betz //Arch.Microbiol. -1962. -V.44. № 3. - P. 253-258.

192. Boller T. Ethilene and the Regulation of Antifungal Hydrolases in Plant /Boller T. //Oxf. Surv. Plant Mol. Cell Biol. -1993. Y.5. - P. 145-176.

193. Bowles D.J. Defense-Related Proteins in Higher Plant / D.J. Bowles //Annu. Rev. Biochem. 1990. - V.59. - P. 873-907.

194. Branca C. Competitive inhibition of the Auxin-Induced Elongation by a-1.4-D oligogalacturonides In Pea Stem Segments. / C. Branca. G. de Lorenzo, F. Corvone. //Physiol. Plant. 1988. - V.72. - P. 499-504.

195. Broughton W.J. Relations between DNA, RNA and protein syntnesis and the cellular basis of the growth response in gibberellic acid-treated pea internodes / W.J. Bronghton //Ann Bot. -1969. V.33. - P. 227-243.

196. Bruce Hilda M. LXXV. Cereals and rickets. The role of inositolhexaphosphoric acid /Yilda M. Bruce , K. Callow //Biochem. J.- 1934 V. 28.- P. 517-527.

197. Brown G.M. Biosintesis of Watersoluble vitamins and Beriveel Coenzymes /G.M. Brown. // Physiol. Revbs. -1960. V.40. - P. 331-368.

198. Burstrom G. Patters of Syntheses during Internodal Growth of Pisum stems /G. Bustrom //Z. Pflanzenphysiol.-l974.- Bd. 74.- P. 1-13.

199. CarpitaN. The Cell Wall /N.Carpita, M. McCann //Biochemistry and Molecular Biology of Plant. / B. Eds. Buchanan, W.Gruissem, P. Jones. Beltsville : Am.Soc. Plant Physiol. -2000. P. 52-108.

200. Catalfamo J.L. Effect of gibberellic acid and ethylene on peroxidase in pea internodes /J.L.Catalfamo, J.H.Feinberg, G.W.Smith //J.Exp.Bot.-1978. V. 29. -№ 109.-P. 347-357.

201. Chaudchuri D.K. Purification of antitiamine factor from rice-bran/ D.K Chaudchuri //Sei. and Cult.-1964.- V.30.-№ 2.- P. 97-98

202. Cheldelin V.N. Pantothenic acid studies. I. Growth effect of pantothenic acid analogs / V.N. Cheldelin, C.A. Schink // J. Amer. Chem. Soc. 1947. - V. 69. -P. 2625-2630.

203. Coolbangh R.C. Sitic of Gibberellin Biosynthes in Pea Seedlings /R.C. Coolbangh //Plant. Physiol. 1985. - V. 78. - № 3. - P. 655-657.

204. Coursen B.W. Effect of the antibiotic, cicloheximid, on the metabolism and growth of Saccharomyces cerevisial / B.W. Coursen, H.D. Sisler // Amer J. Bot. -1960.-V.47.-№7.-P. 541-549.

205. Cruickshank I.A.M. Studies on phytoalexins. III.The isolation assey and general properties of a phytoalexin from Pisum sativum L./ I.A.M. Cruickshank, Dawn R. Perrin. //Austral. J. Biol. Sei. -1961. -V. 14. -№ 3.- P. 336-348.

206. Cruickshank I.A.M. Studies on phytoalexins. VIII. The effect of some further factors on the formation, stability and localization of Pisatin in vivo. /LA.M.Cruickshank,Dawn R. Perrin// Austral. J. Biol. Sci.-1965.-V.18.- № 4P. 817-828.

207. Dagis J. Gebundene Bios-Wuchsstoff in Boltns edulis. /J. Dagis, P. Blusmanas. //Ber.deutsche botan. Ges.-1943.- V. 61 .-№ 2.-P .49-53

208. Daniel Louise J. Inhibitors of vitamins of the complecs B /Louise. J.Daniel //Nutr. Abstr. and Revs.-l961 -V.31№ 1.- P. 1-13.

209. Darvill.A. Oligosaccharins. Oligosaccharides that Regulate Growth, Divelopment and Defence Responses in Plauts / A. Darvill, C. Augur, C. Bergmann et al. //Glicobiology- 1992-V.2.-P. 181-198.

210. De Agazion M. Study of a soluble protein fraction related to IAA-treatment in pia internodes /M. De Agazion, M.A. Toponi // Z. Pflanzenphysiol.-1979.-V. 92. -№ 3.-P. 241-248.

211. Decker K. Die aktivierte Essigsaure. Das Coensyme A and Seine Acylde-rivate in Stoffwechel der Zelle./K. Decker // Stuttgart.- 1959.- 307 p.

212. DenchevA. Interaction between peroxidase an IAA-oxidase in the cource of growth and differentiation of plant sells / A. Denchev, D. Klisurska. //Physiol. Veg.-1982. V.20.- № 3 - P. 385-394.

213. Dillon.T. Enzymatic Hydrolysis of 1.3-Linked Polyglucans /T.Dillon,P. O'Colla. //Chem. Ind. N.Y 1951. - V.51.-P. 111-123.

214. Dinning. J.S. A biochemical besis for the interlationship of pantothenie acid and methionine / J.S. Dinning, R. Niatrons, P.L Day //J. nutrition .- 1955.-V. 56.- № 3.-P. 431-435.

215. Dopigo Berta. Characterisation and legalization of the cell wall autolysis substrate in Pisum sativum epicotyls / Berta Dopigo, Emilia Labragor, Gregorio Nicolas //Plant Sci. (Shaunon) -1986.-V. 44.- № 3. P. 155-162.

216. Drell W. Inhibition of lactic acid bacteria by analogus of pantothenic acid /W.Drell, M.S. Dunn // J. Amer. Chem. Soc. 1948.- P. 2057-2061.

217. Eakin R.E. A constituent of raw egg white capable of inactivating biotin in vitro. R.E. Eakin, E.E. Snell, R.J. Williams. //J. Biol. Chem. -1940.- V. 163 .- P. 801802.

218. Eakin R.E. Ihe concentration and assay of avidin, the injury-produsing protein in raw egg white / R.E. Eakin, E.E. Snell, R.J. Williams. //J. Biol. Chem.-1941. -V. 140-№2.-P. 535-543.

219. Elliot A.M The influence of pantothenic acid on growth the of protozoa /A.M. Elliot // Biol. Bull. ( Wood's Holl).- 1935. № 68. - P. 82-85.

220. Faik A. An Arabidopsis Gene Encoding an a-Xylosyltransferase Involvted in Xyloglucan Biosinthesis /A. Faik, N.J. Price, N.Y Raikhel et al. //PNAS USA.-2002. -V.99. P. 7797-7802.

221. Ferry M.E. Soluble cell wall Polysaccharides Released from Pea stems by centrifugation. Effect of auxin /M.E .Feriy, R.Z Jones, B.A Donner //Plant Physiol 1981. - V. 68 - № 3 - P. 531-537.

222. Firn Richard D. Ashby's Law of Requiste variety and Its Applicability to hormonalcontrol /RichardD.Firn //Austr. J. Plant.Physiol -1985. -V. 12.-№ 6.-P .685-687.

223. Frenkel E.P. Effekt of vitamin B12 depivation on the in vivo levels of coenzyme A intermediates associated with propionate metabolizm /E.P. Frenkel, P.L. Kitchens, L.B. Hersh, et. al //J. Biol. Chem.-1974.- 349.- P. 6984-6991.

224. Fiy S.C. The Growth Plant Cell Wall: Chemical and Metabolic Analysis / S.C. Fry // Longman Sei. Technic.-1988. 3 33 p.

225. Fry S.C. Oligosaccharides as Signals and Substrate in the Plant Cell Wall / S.C. Fry, S. Aldington, P.R. Hetherington et al. //Plant Physiol-1993.-V. 103.-P. 1-5.

226. Gardiner M.G. Peroxidase changes during the cessation of elongation in Pisum sativum stems /M.G. Gardiner, R.Clelland /Phytochemistry.-1974.-V. 13. № 7. -P. 1095-1098.

227. Giles K. W. The effect of gibberellic acid and light on RNA, DNA and growth of the basal internodes of dwarf and tall peas /W.Giles, A. Myers //Phytochemisty. -1966. -№5. P. 193-196.

228. Gojal A.K. Effects of gibberellin on activity of IAA oxidase and catalase et erly seedling steige in some rice varieties / A.K. Gojal, B.D. Daijal //Indian J. Plant Physiol.-1982 V. 24.- № 2.- P. 158-161.

229. Grant A.B. Antivitamin D Facto / A.B. Grant //Nature-1951.-№4279.- P. 789790.

230. Green R.G. The inactivation of vitamin Bi in diets containing whole fish /R.G. Freen, W.E. Carlson, C.A. Evans. // J. Nutrit.- 1942 -V.23. P. 165-174.

231. Gross G.G. Recent advances in the chemistry and biochemistry of lignin. /G.G. Gross //In: Biochemistry of plant phenolic. Recent advances in phytoche-mistry. New-York. London: plenum press.-1979.-V. 12. - P. 221.

232. Gubler C.J. Studies on the Functions of Thiamine /C.J. Gubler // J. Biol. Chem-1961.-V. 236.-№ 12- p. 3112-3120.

233. Gyorgy P. Egg-white injury as the result of nonabsorbtion or inactivation of biotin / R. Gyorgy, C.S. Rose, R.E. Eakin et al. //Science-1941 V.93 - № 2420. - P. 477-478.

234. Gyorgy P. The liberation of biotin from the avidin-biotin complex (AB). / P. Gyorgy, C.S. Rose //Proc. Soc. Exptl. Biol. a. ed.-1943. V.53. - № 1-P. 55-61.

235. Hager A. Die reversiblen, lichtabhängigen Xanthophyllumwandlungen in clo-roplasten / A. Hager //Ber Desch. bot. Ges. 1975- № 88. - P. 27-44.

236. Hanka L.J. Naturally occurning antimetabolite antibiotic related to biotin. / L.J. Hanka, M.C. Bergy, R.B. Kelly. //Sciense.-1966. -№ 3757. P. 1667-1668.

237. Harris J.S. On the mode action on the sulfonamides. II. The specific antagonism between methionine and sulfonamides in Escherichia coli. / J.S.Haris, H.I Kohn. //J.Pharmacol, and. Exp. Thorap. 1941. - № 73. - P.383-400

238. Harrison D.C. CCYIII. Phytic acid and the rickets producin action of cereals / D.C. Harrison, E. Mellanby//Biochem.J. -1039. - № 33.- P. 1660- 1663

239. Hartelius V. Antivitamin effect of sulfanilamid on Saccharomyces cerevisiae. / V. Hartelius, K. Rohoit. //Comt. rend. trav. Lab. Carlsbergen. Ser. physic-ol -1946. V. 24. - № 12 - P. 141-155.

240. Hartelius V. Erwiderung auf die vorstehende Mitteilung /V. Hartelius //Planta. -1940 V.30 - №.4 - P. 692-693.

241. Hasegawa Koji. Light growth inhibition and growth ingibitors in Sacurajima radish seedlings /Koji Hasegawa, Kensuke Miyamoto // Plant and Cell Physiol-1978. V.19. -№ 6-P. 1077-1083.

242. Hasegawa Koji. Raphanusl A : a new growth inhibitor of light growth radish seedlings /Koji Hasegawa, Kensuke Miyamoto //Plant and Sell Physiol-1980.-1980.-V.21.- №2.-P. 363-366.

243. Hasegawa K. Isolation and identification of a new growth ingibitor rapasusamin from redish seedlings and its role in growth /K. Hasegawa, S. Shiihara, T. Jwagwa et al. 1982. V. 70. - № 2. - P. 626-628.

244. Hess Dieter. Phytohormone interzelluläre Regulation bei höheren Pflanzen / Dieter Hess. //Naturwiss. Rdsch-1973 - V. 26 .- № 7. - S. 284-293.

245. Higushi Kioishi. Studies on sorbic acid: VIII. On the remancable inhibition of bakers yeast respiration with co-existence of sorbic acid and thiamine / Kioishi Higushi, Kioishi Harada //Vitamins (Kyoto). -1969, reed. 1970.-V. 40. № 6. -P. 420-423.

246. Hilker D.M. Antitiamine factor in blueberries /D.M. Hilker // Internat Z. Vitavi-forsch. -1968. V.38. - № 3-4. - S. 387-391.

247. Hoagland M.B. Biosintesis of coenzyme A from phosphopantetheine and of pantetheine from pantothenate /M.B. Hoagland, D. Novelli. //J.Biol.Chem!954. -№ 207. P. 767-777.

248. Hyghes R.K. Modulation of Elicitor-Induced Chitianase and ß-1.3-Glucanase Activity by Hormones in Phaseolus vulgaris /R.K Hyghes, A.G. Dickerson. //Plant Cell Physiol -1991. V. 32. - P. 853-861.

249. Ivanovics G. Das salicylat-ion als spesifischer Hemmungsstoff der Biosynthece der Pantothensäure / G. Ivanovics //Z. Physiol. Chem.-1942. V. 176. - P. 33-55.

250. Jaenike L. The Enzymes. V.3. 3. Prosthetic Groups and Cofactors / L. Jaenike, F.Li-nen //. N.Y.- L 1960. - P. 19-23.

251. Jackson M. Are Plants Hormones Involved in Root to Shoot communication? M Jackson //Advanced in Botanical Research. -1993. V. 19. - P. 103-187.

252. Jons R.L. Organs of gibberellin synthesis in light-growth sunflower plants / R.L Jons, I.D Phyllips //Plant Physiol. -1966. № 41. - P. 1381-1386.

253. Katsu Noriko. Qvantitative and qualititive changes in cell wall boosening in Lactuca sativa hypocotyls /Noriko Katsu, Sciichiro Kamiska. //Physiol. Plant. -1983.- V. 58 .- № 1-P. 33-40.

254. Kefeli V.I. Non-hormonal stimulators and inhibitors of plant growth and development /V.I. Kefeli, W.V. Dashek //Biol. Rev. Cambridge Phil. Soc-1984. -V 59.-№3-P. 273-288.

255. Keith Roberts. Oligosaccharide floral messages? /Roberts Keith //Nature. -1985.-V.314.-№ 6012-P. 581.

256. Kiem Tran Thanh Van. Manipulation of the morphogenetic pathways of tobacc explants by Oligossaccharins / Tran Thanh Van Kiem, P.Toubart, A. Consson et al. //Nature.-l 985.-V. 314 № 6012. - P. 615-617.

257. Kigel Jamme. GA and IAA interaction controling internode growth in decapitatedplantsof Phaseolus /Jaimms Kigel //Bot.Gaz—1981- V. 142.- №1.-P. 7-12.

258. Kigel Jamme. The role of the leaves in the regulation of internode elongation in Phaseolus Vulgaris / Jamme Kigel //Physiol, plant -1980 V. 49.- № 2.- P. 161168.

259. King T.E. Pantothenic acid studies. IV. Propionic acid and P-alanin utilization. /T.E King, V.H.Cheldelin //J. Biol. Chem.-1948.-V.174.-№ 1. P. 73-179.

260. Klis Trans M. Glicosylated seryl residues in wall peotein of elongation pea stems /Trans M Klis // Plant. Physiol/ 1976. - № 2.- P. 224-226

261. Knudsen J. Role of Acy CoA Binding Protein in AcylCoA Transport, Metabolism and Cell Signaling / M.V. Jensen, J.K. Hansen, N.J. Faergeman, et al // Mol. Cell. Biochim. -1999.-V.192.-P. 95-103.

262. Kodandaramaiah J. Effect of B group vitamins on the endogenous cytokinin levels of cluster bean (Cyamopsis tetragonoloba, Taub. C.V. PNB) / J. Kodandaramaiah, C.Venkataramaiah , P.G Rao, et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. India. -1984.-B 54-№2 -P. 95-98.

263. Kodicek E. Anti-B-vitamins / E.Kodicek // Brit. J. Nutritit.-1949.-№ 2 P.373-395.

264. Koike M. Mammalian a-keto acid degydrogenase complexes. /M. Koike // J. Vitaminol. 1968 . -V. 14. - Suppl. P. 86-96.

265. Komoto Nobuo. Isolation of acidic growth intibitors in dwarf peas /Nobuo Komoto, Susumi Ikegami, Saburo Tamura //Agr. and Biol. Chem.-1972.-V. 36. -№ 13 P. 2547-2553.

266. Koser S.A. Aspartic Acid as a Partial substitute for the Growthstimulatind Effect of Biotin on Torula cremoris / S.A. Koser, M.H. Wright, A. Dorfman //Proc. Soc. Exper. Biol. Med-1942 V. 51. - № 2,- P. 204-205.

267. Kosower N.S. The glutathione status of cell /N.S. Kosower, E.M. Kosower //Intl. Rev. Cytology-1978. -V. 54 P. 109-156.

268. Kuiper D. Effect of internal and Extremal Citocinin concentrations on Root Growth and Soot / Root Ration of Plantago majaor ssp. pluosperma of Different NutrientConditions /D. Kuiper,J. Schuit, PJ.C. Kuiper //Plant Soil-1988-V. 111.-p. 231-236.

269. Kuraishi H. Unbalanced growth in yeast due to biotin and pantothenic acid deficiency /H. Kuraishi //Sci. Repts. Tohoku Univ., cer. 4.-1959 V. 25.- № 3-P. 247-261.

270. Kuraishi H. Unbalanced Growth in yeast / H. Kuraishi //J.Gen. and Appl. Microbiol-I960 V. 6.-№ 2- P. 129-131.

271. Labavitch J.M. Relationship between promotion of xyloglucan metabolism and induction of elongation by indolacetic acid. / J.M. Labavitch, P.M. Ray. //Plant Physiol.-1974. -V. 54. № 4 - P. 499-512.

272. Landy M. Increased synthesis of p-aminobenzoic acid associated with the development of sulfoamide resistance in Staphilococcus aureus / M. Lady, N. Lazkum, E. Oswald //Science 1943.- V. 97. № 2516. - P. 265-267.

273. Levintow L. The synthesis of coenzyme A from pantetheine preparation and properties pantetheine cinase / L. Levintow, G. Noveolli // J. Biol. Chem.- 1954. -№ 207.- P. 761-766/

274. Lichtenfeld C. Protein degradaton in germinating legume seads. / C. Lichtenfeld, R. Mantenffel, G. Scholz // Arh. Acad. Wiss. DDR. Abt. Math. Naturwiss. Techn.- 1981.-№5 P. 133-152.

275. Li Kuanyn. The glutation-glutaredoxin sistem in Rhodobacter Capsulatus: Part of a complex against oxidative stress /Li Kuanyn, Hein Silke, Zou Wenxin ot al. //Bacteriol-2004. -V. 186-№20 -P .6806-6808.

276. Lo Shiavo. Modulation of Auxin-binding Proteins in cell Suspension. LDiiferential Respenses of carrot Embrio Culures /Lo Shivo, F. Filippini. //Plant Physiol -1991- V. 97. -P. 60-64.

277. Lobazewski Jerry. Peroksydazy roslinne / Jerry. Lobazewski //Wiad. Bot. 1981. -V. 25-№ 1.-P.29-44.

278. Louis R. Untersuchungen über die Biosyntese einiger wasserböshicher vitamine der ß-Gruppe in besonder der Pantothensäure /R. Louis //Mittelungen naturforsch gesellschaff. Bern-1951-1952.-№ 10.- P. 1- 68. (pub. 1953).

279. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr et al. //J. Biol. Chem 1951V. 193. - P. 265-275.

280. Maas W.K. Pantothenate studies. II. Evidence from Mutants fo interference by Salicylate wich Pantoate Synthesis /W.K. Maas. //J. Bacteriol.-1952.-№ 63. -P 227-231.

281. Marre E. Metabolic reactions to auxins. I. Effecte of auxin on glutathione and growth / E. Marre, O.Arrigoni //Physiol. Plantarum-1977- V. 10.- P. 289-301.

282. Mellanby E The rickets-produsing and anti-calsifyng action of phytate / E. Mel-lanby //J. of Physyol-1949.-V. 109 .-№ 3-4-P. 488-533.

283. Mellanby E. The relation of diet to health and diseas / E. Mellanby //Brit. Med. J, -1930.-V.l.-№3613 -P.677-681.

284. Meiler E. Biosynthesis of 5-aminolevulinic acid: two pathways in higher plants. IE. Meiler, M.L. Gassman. //Plant. Sei. Lett-1982 V. 22 - № 1- P. 23-29

285. Miller C.O. Kinetin a cell division factor from desoxyribonucleic acid /C.O. Miller, F. Skoog, M. Saltza et al. // J. Amer. Chem. Soc. 1955, - V. 77. - P. 1392.

286. Millet В. Morphogenese rythmecchezlls végétaux /В. Millet, G. Manacher //Bull. Soc.bot. France-1979.-actualitesbotanigues P. 51-74.

287. Millet Bernard. Analye des îythmes de croissance de la féve (vicia feba L). /BernardMillet //Thèse doct seinanur. Fac.Sci. Univ. Besancon-1970. 132 p.

288. Millet Bernard. La croissance des entrenoends de La 3âve (vicia faba L.var. «The Sutton»): aspects morphologiques et physioloques /Bernard Millet //Physiol. Veget-1974.- V.12 № 3.- P. 435-448.

289. Moat A.G. The amino acid nutrition of yeast in relationship to biotin deficiency / A.G. Moat, C.K. Emmon //J.Bacteriol.-1954. Y.68 №> 6 - P. 687-690.

290. Morrison J.M. Lignin-carbohydrate complexes from Libium Pereune /J.M. Morrison//Phytochemistry-1974-V. 13.-P. 1161-1165.

291. Mougo J.H. Genetic Analisis of Root Growth in Wheat /J.H. Mougo, W.J. Whit-tington //JAmer. Sei-1970-V. 74. P. 329-338.

292. Moureal К. Die Wirkung von Actidion auf Saccharomyces cerevisiac var ellipsoidens /К. Moureal. //Angev. Bot-1961. -V. 35.- № l.-P. 24-60.

293. Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol, plantarum 1962 — V. 15. -P. 473-497.

294. Muir Robert M. Effect of light in the control of growth by auxin and its inhibitors in the sunflower /Robert M. Muir, JJLZhuling //Physiol, plant- 1983- V. 57. -№ 4.-P.407-410.

295. Neidhardt F. Properties of a bacterial mutant lacking amino acid control of RNA Synthesis /F. Neidhardt //Biochem. and Biophys. Acta -1963 № 68.-. P. 365379.

296. Nielsen N. Ubere die Antiwushsstoffe der Pantothensäure und des ß-Alanins /N. Nielsen, V. Hartelius, G. Jhansen //Compt. rend. trav. Lab. Carlsberg. cer. physiol. -1944 V. 24 - № 316 - S. 39-54.

297. Nielsen N. Ergängende Untersuchungen über die wachsstofïwirkung der Aminosäuren auf Hefe /N. Nielsen. //Biochem. Z-1941 V. 307. - S. 187-193.

298. Nishizawa G. The antagonistic action of homopantothenic acid against pantothenic acid /G. Nishizawa, F. Matsusaki //J.Vitaminol-1969 V. 15.-№ 1- p. 8-25.

299. Norchcote D.H. Chemistry of the plant cell wall / D.H. Norchcote //Ann. Rev. Plant Physiol.-1972.- V. 23 P. 113-132.

300. Nozzollilo Constance. Elongation of the First Internode of the Pea Seedling durin Etiolation /Constance Nozzollilo, Silvie Seruin //Plant Physiol -1984. -V.75.-P. 808-812.

301. Okuda K. Utilisation and metabilism of vitamin Bj2 in pantothenic acid deficiency in rat / K. Okuda // Vitamins. 1956. - V. 11. - № 46. - P. 542-546.

302. Oertl J.J. Exogenous application of vitamins as regulators to growth and development of plants.-a review. /J J. Oertl. //Z. Pflauzenernahr. and Bodenk. -. 1987. -V. 150. -Jfe 6. -P.375-391.

303. Ogata K. Studies on the production of coenzyme A / K. Ogata // Vitamins-1974.-V. 48 P. 27-40.

304. Pavlova Z.N. Activiti of a Pentasaccharide Fragment of Xiloghian /Z.N. Pavlova, O.F. Ash, Vnuchkova et al. // Plant Sei 1992 - V. 85 - P. 131-143.

305. Phynney B.O. Handbuch der Pflanzenphysiologie / B.O. Phynny Bd. XIV-1961.- S.14.

306. Pierpoint W.S. The effect of some pantothenate derivativer on growth and coenzyme A synthesis in bactria / W.S. Piierpoint, D.E. Hugnes, J. Baddiley, et al. //Biochem. J. 1955. - V. 61. - P. 199-205.

307. Pittillo R.F. Potentiation of inhibitor action through determination of reversing metabolites. /R.F. Pittilo, J.W. Foster. //J. Bacteriol-1954.- V. 57. № 1 -P. 53-57

308. Porshe T. Utilizarea acidului uric de cätre Saccharomyces cerevisiaè ca unica sursä de azot /T. Porshe //Studii si cercetäri stiinte Chim. Acad. RPR. Baza Timi-sara-1961-V. 8.-№ 1-2.-P. 181-183.

309. Potts W.C. Internode lengthin in Pisum. l.The effect of the Le/le gene difference on endogenons gibberellin-like substances. /W.C. Potts, J.B. Reid, I.C. Murfet. //Physiol.Plant-1982-v. 55-P. 323-328.

310. Prévost Marie-Fracoise. Rythme d'allongement des articles de Tabernaemontana crassa Benth.(apocynacéae) / Marie-Fracoise Prévost //Candollea.-l 972.- V.27. -№ 2. -P.219-227.

311. Reid J.B. Internode length in Pisum. Do the internode length genes affect growthin derk-growth plants? /J.B. Reid //Plant. Physiol.- 1983.- V. 72. P .559-563.

312. Rippel K. (a) Über Begriff und Wessen der Bodenmüdigkeit /FL Rippel //Phytopatholog. Z.- 1936.-V. 9. P. 507-512.

313. Rippel K. (6) Über den Nachweis von Teilungswuchsstoffen mittels Saccharomyces cerevisial de Testorganismus. fK. Rippel. //Ber. deutsch, bot. Ges-1936.-№54.- P. 48-490

314. Rippel K. (b) Über Teilungs und Streck ungswuchsstoffe. /K. Rippel. //Planta (Berl). 1936. - V. 26 - P.164-466.

315. Rippel K. (a) Zur Frage der pflanslichen Zelltenlungs und Zellstreckungshormonen /K. Rippel. //Pinta (Berl). -1937. V. 26.-№ 5.- S. 812-814

316. Rippel K. (6) Zur Methodic des quantitative Nachweises von Zellteilungshormonen mittels Saccharomyces cerevisiae /K.Rippel //Planta. 1937. — V. 27. - №4.- P.381-391.

317. Rippel K. Wachstumshormonende Wirkstoffe oder gebendene (inactivirte) Wuchsstoffe? fK. Rippel //Ber. Deutsche, bot. Ges.-1943. V. 61 - № 4-S. 123-125.

318. Rogers L.L. Biochemical transformation as determined by competetive analogue metabolite growth inhibitions. IV. Prevention by biotin synthesis by 2-oxo-4imidosolidine caproic acid /L.L. Rogers, G. Shive //J. Biol. Chem.-1947.-V. 169. -P. 57-61.

319. Roustan J.P, Latche A, Fallot J. Control of Carrot Somatic Embriogenesis by AgNC>3 an Inhibitor of Ethylene Action: Effect of Arginine Decarboxylase Activity /J.P. Roustan, A. Latche, J. Fallot//Plant Sei -1990.- 67. P. 95-98.

320. Sharp J.K. Purification and Partial characterization of a ß-glucan fragment that alisits phytoalexin accumulation in soybean /J.K. Sharp, B. Valent, P. Albersheim //J. Biol. Chem-1984. V. 259. - № 18. - P. 11312-11320.

321. Sharp R.E. ABA, Ethylene and the control of Shoot and Root Growth under water stress/ R.E. Sharp //J. Exp. Bot, 2002.-V. 53.-. P .33-37.

322. Slyshenkov Y.S. Pantothenic acid and its derivatives protect ehrlich ascites tumor cells against lipid peroxidation / Y.S. Slyshenkov, M. Rakowska, A.G. Moiseenok, et al. II Free Radic. Biol. Med.-1995. -V. 19. -№ 6. C. 767-772.

323. Smith G.M. Enzymatic regulation of chloramphenicol (Chloromycetin) IG.M Smith, C. Worell //Arch. Biochem. 1949. V.24. - № 4.- P. 216-223.

324. Smith G.M. The decomposition of Chloromycetin (chloramphenicol) by microorganisms./G.M.Smith, C. Worell. //Arch. Biochem.-1950. V. 28 .- № 2-p.232-241.

325. Snell E. E. Synthese von Pantetheine / E.E. Snell, G.M. Brown, V.Y. Peters, et al. // J.Amer. Chem. Soc. 1950 - Y. 72. - P. 5349-5350.

326. Snell E.E. Growth factor fo bacteral. IV.Fractionation ond propertis of an accessory for lactic acid bacteria /E.E. Snell, F.M. Strong, W.H. Peterson. //Biochem J. -1937.- V. 31P. 1187-1195.

327. Staron T. Sur Taction antibiotiquede l'a-amino-y-butyryllactone extraite du pois IT. Staron ,C. Allard, X.W Dat. //C. r. Acad. sci.-1964, V. 259. № 18-P. 3114-3117.

328. Steward T.C. Acrilamide Gel Electrophoresis of soluble plant proteins: A study on pea seedlings in relation to development /T.C. Steward, R.F. Lindon, I.T. Barber //Amer. J. Bot.-1955. -№ 52- P. 155-164.

329. Stoddart J.L. In corporation of kuranoic acid into gibberellins by chloroplast preparations of Brassica oleracea. / J.L. Stoddart //Phytochemistry. 1989.- V. 8. -№ 5.-P.831-837.

330. Stone B.A. Chemistry and Biologi of (l-3)-ß-Glucans /B.A. Stone, A.E. Clarke //La Trobe University Press Bundoora (Australia). -1992.-517 p.

331. Szorady I. Die klinische Bedeutung der Pantothensäure unter beonderer Berücksichtigung der Kinderlieilkiude /1. Szorady. // Szeged. 1967 -120 p.

332. Teplova I. Changes in ABA and IAA content in the Roots and Shoots of Wheat Seedlings ander Nitrogen Deficiensy H. Teplova, S. Veselova, G. Kudoyarova.

333. Root Demographies and Their Efficiencies in Sustainable Agriculture, Grasslands and Forest Ecosystems. Ed. Box. J.E. Dodrecht. Kluwer. -1998. -P. 631-635.

334. Thorpe T. Isoperoxidases in epidermal layers of tobacco and changes during organ formation in vitro /T.Thorpe.Tran Than Van, M.T.Gaspar //Physiol. Plant. -1978 V. 44. - № 4. - P. 388-394.

335. Trensch J. Primery Responses of Root and Leaf Elongation to Water Deficits in the Atmosphere and Soil Solution /J. Trensch //.J. Exp. Bot.-1997.v.48 P. 985999.

336. Tsuji K. Liquid nitrogen preservation of Saccharomyces cerevisiae and its use in a rapid biological assay of pantothenic acid /K.Tsuji //Appl. Microbiol.-1966. V 14-№3- P. 462.

337. Tsurumi Seiji. Absence of red Light-induced stimulation of growth in the hook of etiolated dwarf pea seedlings / Seiji Tsurumi, Hisashi Noguchi, Tohru Hashu-moto. //Plant and Cell Phusiol.-l990. V. 31. - № 5.- P. 721-724.

338. Wadehra D.V. The ingibition of Thermomonospora by Heat sterilized lactoze broth / D.V. Vadehra, W.D. Bellamy // Boiotechnol. Lett. -1983-V. 5.- № 1.- P. 63-66.

339. Van den Berg B.M. Compared studies of cationic peroxidase from peanut and anionic peroxidase from petunia /B.M.Van den Berg, P.N.Chilber, P.B. Van Hugstee//PlantCellRepts-1983. V.2 -№6. - P. 304-307.

340. Vogeli-Lange R. Eidence for Role of (3-1.3-Gluganase in Dicot Seed Germination /R.Vogeli-Lange, C. Frundt, C.M. Hart et al. //Plant J -1994. V. 5 - P. 273-278.

341. Vivino J. Sulfonamide resistent strains of Staphilococcus ; clinical significanse / J.Vivino, W. Spink // Proc. SOc. exp. Biol. Med. 1942. - V. 50. - № 2.- P. 336-338/

342. Watkin J.E. Identity of natural "cofactor" of bracken thiaminae /J.E. Watkin, A.J. Thomas, W.C. Evans // Biochem. J.-1953. V. 54. - № 2 P. XIII.

343. Waite M. Studies on the Mechanism of acetyl coenzyme A carboxylase. I. Effect of isocitrate on the transcarboxylation step of acetyl coenzyme A carboxylase / M. Waite, S. Wakil //J. Biol. Chem. -1963. V. 238. - № 1. - P. 77-79.

344. Walbot V. Role of RNA Synthesis mid tRNA and labeling during ealy development of Phaseolus /V. Walbot //Planta. -1972. -V. 108 .- P. 161-171.

345. Walton D.C. Germination of Phaseolus vulgaris. III. The role of nucleic acid and protein synthesis in initiation of axis elongation / D.C. Walton, G.S.Soofi //Plant and Cell Physiol-1969. № 10. - P. 307-315.

346. Wareiny P.F. Growth and defferentiation in plants /P.F.Wareind //Pergamon Press—1981. -343p.

347. Wayner D.D. The relative contributous of vitamin E, urat, ascorbate and proteins to the peroxyl radical-trappin antioxidant activity of human bload plasma /D.D. Wayner, M. Burton, G.W. Ingoldetal // Biochem Biophys acta-1987.-V. 924.-P.408-419.

348. Weits J. A Factor in Hey inhibitory the Action of vitamin D /J. Weits //Nature. -1952 V. 170. - № 4334. - P. 891- 893

349. Weswig P.H. Antivitamine activity of plant materials. /P.H. Weswig, A.M. Freed, J.K. Haag // J. Biol. Chem -1946.-V. 165 P. 737-738.

350. Whifften Alma J. The prodaction assay and antibiotic from Streptomyces griseus /Alma J. Whifften// J. Bacteriol-1948 V. 56. -№3.~ P. 283-291.

351. Wieland Theodor. Verfolgung des Schicksals radoakiver Pantothensaure in Microorganismen mit Hilfer der Papierelektroforese /Theodor Wieland, Walter Maul, EnstFridrich Moller //Biochem. Z.-1955.-V. 327 № 2 S. 85-92.

352. Williams R.J. Growth promoting nutrilites of yeasts /RJ.Williams //Biol. rev. -1941- V.16- № 1 -P. 49-80.

353. Williams RJ. The chemistry and biochemistry of pantothenic acid / R.J. Williams //Adwances enzymol. -1943. ~№3. P. 253-287.

354. William RJ. "Pantothenic acid", a growth deterrmant of universal diological accurence / R.J. Williams, C.M. Liman, J.H.Goodycar et al. // Jour. Amer. Chem. Soc. 1933. -V. 55. - P. 2912-2927.

355. Williams RJ. The use of fractional electrolysis in the fractionation of the bios of «Wildiers» /RJ. William, J.H. Truesdail //J.Amer.Chem. Soc.1931, №53, P.4171-4173

356. Williams RJ. The vitamin reguirement of yeast. /RJ. Williams // J. Biol. Chem. -1919 № 38. - P. 465-486.

357. Williams RJ. Pantothenic acid as a nutritive for green plants / RJ.Williams, E. Rhorman // Plant pHysiol. 1935 № 10. - P. 554-559

358. Woolley D.W. Phenyl pantothenone, an antagonist of pantothenic acid /D.W. Wolley, M.L. Collyer//J. Biol. Chem-1945. -V. 159 P.263-271.

359. Wooley D.W. Reversal of the acion of phenyl pantothenate by certain amino acid /D.W. Wooly //J. Biol. Chem-1946 № 163 P .481-486.

360. Wright L.D. The signiticanc of the Antivitamins in Nutrition /L.D. Wright //J. Amer. Diet. Assoc-1947 V. 23.4-P. 289-298.

361. Yamashita S. A now antiyeas substance cerevioecidin, produced by streptomycete /S.Yamashita, T. Sawazaki, M. Kawasaki//J. Antibitics.-1955-A 8.- № 2. -P .42-43.

362. York W.S. Inhibition of 2.4-dichlorphenoxyacetic Acid-Stimulated Elongation of Pea Stems Segments by a Xiloglucan oligosaccharide /W.S. York, A.G. Darwill, P.A. Albershem // Plant Physiol 1984.- V. 75 - P. 295-297.

363. Yoshito Nishizawa. The antagonistic action of homopantothenic acid against Pantothenic acid / NishizawaYoshito, Matsuzaki Tumio /J.Vitaminol.-1969.-V. 5. P. 8-25.

364. Youner M. Lipid peroxidion as a consequence of glutathion depletion in rataud mouse liver /M. Youner, C.P. Siegers //Res Commun Phathol. Pharacol.—1980.-V.27. P. 119-128.

365. Zazimalova E. Point of regulation of auxin action /E. Zazimalova, P.M. Napier //Plant Cell Repts. -2003 . V. 21. - P. 625-634.

Информация о работе

Смашевский, Николай Дмитриевич
доктора сельскохозяйственных наук
Астрахань, 2007
ВАК 06.01.09

Диссертация

Олигосахарид проростков гороха (пизамин): антивитамин пантотеновой кислоты, регулятор роста растений - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы