Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие эндогенных олигосахаридов в адаптации ростков озимой пшеницы к низким положительным температурам

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие эндогенных олигосахаридов в адаптации ростков озимой пшеницы к низким положительным температурам"

На правах рукописи

РГ6 од

7" ¿яг гооэ

Аюпова Дина Анваровна

УЧАСТИЕ ЭНДОГЕННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ В АДАПТАЦИИ ОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ К НИЗКИМ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ

ТЕМПЕРАТУРАМ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2000

Работа выполнена в лаборатории биохимии клеточной стенки Казанского института биохимии и биофизики Казанского Научного Центра Российской Академии Наук

Научный руководитель кандидат биологических наук,

с.н.с. O.A. Заботина

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

В.Д. Щербухнн

доктор биологических наук, профессор Л.П. Хохлова

Ведущая организация Институт Физиологии растений

им. К.А.Тимирязева РАН, Москва

Защита состоится "f?" цаЗ> 2000 г. в час на заседании специализированного совета К 002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН (420503, г.Казань, а/я 30, ул.Лобачевского, 2/31)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского физико-технического института КНЦ РАН

Автореферат разослан " ff " аьрел-Я, 2000г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

/7№ /'29&.6У1(?

A.B. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В конце 1970х гг. впервые были обнаружены биологически активные олигосахаридные фрагменты клеточной стенки, названные олигосахаринами, и высказана идея о том, что они могут являться регуляторными молекулами растений (Элберсгейм, Дарвилл, 1985). Последующие вслед за этим многочисленные работы показали, что олигосахарины обладают широким спектром биологического действия, оказывая влияние на рост, морфогенез, дифференциров-ку растений (Aldington, Fry, 1993). Подробно изучено их участие во взаимодействиях растение-патоген (Cote, Hahn, 1994 ). Интенсивная метаболизация полисахаридов клеточной стенки в ходе активного роста, созревания и в стрессовых условиях дает основания предполагать наличие и функционирование олигосахаринов в растительном организме. Однако в определенной степени "искусственный " путь получения большинства известных на данном этапе исследований олигосахаринов (щелочной, кислотный или ферментативный гидролиз полисахаридов клеточной стенки) оставлял этот вопрос открытым. Важным шагом на пути развития представлений об олигосахаринах как регуляторных молекулах явилась работа, в ходе которой впервые были выделены образующиеся в растительных тканях in vivo оли-госахариды, влияющие на рост и ризогенез (Заботина и др., 1995), однако, и в ней их физиологическая значимость в жизнедеятельности растений осталась невыясненной.

В последнее время обоснована вовлеченность клеточной стенки в формирование гипотермического синдрома, показана метаболизация гемицеллюлоз, изменение их моносахаридного состава и кратковременная активация локализованных в клеточной стенке гликозидаз в первые часы действия низких положительных температур (Zabotin et al.,1998). Тем не менее, данные об участии в низкотемпературной адаптации растений регуляторных олигосахаридов, возникновение которых вполне вероятно в результате протекания отмеченных выше процессов, отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в обнаружении и идентификации олигосахаридов, участвующих в процессе адаптации расте-

ний к низким положительным температурам. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация и очистка олигосахаридов, вовлеченных в процесс низкотемпературной адаптации.

2. Изучение динамики эндогенного содержания олигосахаридов в первые часы гипотермии.

3. Изучение влияния олигосахаридов на формирование морозостойкого состояния проростков озимой пшеницы.

4. Изучение зависимости эффекта действия олигосахаридов от функционирования белок-синтезирующей системы.

Научная новизна работы. Впервые обнаружена и охарактеризована эндогенная олигосахаридная фракция, повышающая морозостойкость растений, а также продемонстрировано ее участие в процессе низкотемпературной адаптации. Показано, что динамика эндогенного содержания этих олигосахаридов в корнях проростков озимой пшеницы в первые сутки гипотермии характеризуется одновершинной кривой с максимумом на 6ч охлаждения. Внесение олигосахаридной фракции в среду выращивания проростков пшеницы до начала или не позднее первых суток закаливания (2°С, 7 сут) приводило к существенному (более 30%) увеличению их морозостойкости. Одновременная обработка проростков олигосахаридами и акти-номицином Б или циклогексимидом, ингибирующими формирование морозостойкости, восстанавливала способность проростков к закаливанию. Согласно моноса-харидному анализу активные олигосахариды представлены фрагментами гемицел-люлоз (наиболее вероятно ксилоглюкана) со степенью полимеризации 12.

Теоретическая и прикладная значимость работы. Результаты проведенного исследования вносят вклад в развитие представлений об олигосахаринах как эндогенных регуляторных молекулах растений и расширяют спектр адаптивных процессов, в формирование которых они вовлечены. Дальнейшее изучение особенностей их действия может иметь значение для углубленного понимания механизмов формирования устойчивости растений к низкотемпературному воздействию. Наблюдаемое повышение морозостойкости озимой пшеницы под влиянием обнару-

женных олигосахаридов представляет интерес для практического применения в области сельского хозяйства.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме «The extracellular matrix of plant: molecular, cellular and developmental biology» (США, 1996), на II-ой Республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996), на 1-ой Всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению (Санкт-Петербург, 1996), на 8-м Международном симпозиуме по сахаридам (Словакия, 1997), на Международной конференции «Stress and inorganic nitrogen assimilation» (Москва, 1998), на 8-м Международном конгрессе по клеточной стенке (Великобритания, 1998), на 8-м Международном конгрессе Шотландской Группы по Клеточной Стенке (Шотландия, 1998), на 2-ой Международной конференции «Progress in Plant Sciences: from plant breeding to growth regulators» (Венгрия, 1998), на Н(Х)-м съезде Русского ботанического общества «Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI в.» (Санкт-Петербург, 1998), на Ш-м Всероссийском совещании «Лесохимия и органический синтез» (Сыктывкар, 1998), на Всероссийской молодежной научной конференции «Растение и почва: проблемы агрохимии, агрофизики и фитофизиологии» (Санкт-Петербург, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела результатов исследования и раздела обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 9 таблиц. Список литературы состоит из 261 наименований, из них 59 отечественных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. Олигосахариды выделяли из корней 5-6 дневных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта "Казанская-84", выращенных на водопроводной воде при 23-25°С (12 ч фотопериод, освещенность 20 Вт/м ). Опытную часть проростков помещали в климатическую камеру ( +2°С) при том же

световом режиме на 3, 6, 12 и 24 ч, а контрольную часть проростков оставляли при 23-25°С. После окончания низкотемпературной экспозиции у растений отделяли корни, промывали их дистиллированной водой, фиксировали при 100°С 30 мин в сушильном шкафу, досушивали до постоянного веса при 40°С и размалывали на механической мельнице до порошкообразного состояния.

Выделение олигосахаридных фракций. Основные этапы выделения представлены на Рис.1. Подробнее метод описан в работе (Заботина и др., 1995; гаЫЛта е1 а1., 1996).

РАСТИТЕЛЬНЫМ МАТЕРИАЛ

J хлороформ: этанол экстракция: 70% этанол

50 мМфосфатный буфер

ВОДОРАСТВОРИМЫЙ ЭКСТРАКТ ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

и, DOWEX- 50W(pHб.0 50мМФБ)

* DOWEX-SOW (UMNaCl)

уи DOWEX- 50W(10мМHCL, pH2.2, 2° С)

ДЭАЭ-цгллюлоза, (10mMKH4CL)

_DOWEX MSA -1 (WMMNHJCL)

ОБЩАЯ ФРАКЦИЯ НЕЙТРАЛЬНЫХ УГЛЕВОДОВ

Гель-проникающая хроматография TSKHW-55 (O.lMNaCl) Гель-проникающая хроматография V Bio-gel Р-4 (60 V, Н20)

->

Высоко эффективная анионообменная хроматография У DIONEX DX500 ->

^Определение! влияния фракций на морозостойкость проростков

пшеницы ч._^

БИОАКТИВНЫЙ ОЛИГОСАХАРИДНЫЙ ФРАГМЕНТ ксилоза 48.3%; глюкоза 39.7%; галактоза 6.5%; арабиноза 5.6%

Рис. 1. Схема выделения и очистки активного олигосахаридного фрагмента из тканей корней проростков пшеницы.

Очистка активной олигосахаридной фракции. Активную олигосахаридную фракцию наносили на Bio-gel Р-4 (Fine) ("Bio-Rad ", США) и элюировали дистиллированной водой (60°С, скорость потока - 0.2 мл/мин). Выявленную после тестирова-

ния на способность изменять морозостойкость активную подфракцию разделяли далее методом высокоэффективной анионообменной хроматографии (ВЭАОХ) на системе DIONEX DX500 ("Sunnyvale", США) с пульс-амперометрическим детектированием. Для разделения олигосахаридов использовали линейный градиент 1М ацетата натрия (NaOAc) в 100 тМ гидроксиде натрия (NaOH) от 10 до 15 %. Для анализа получаемых фракций методом ВЭАОХ использовали колонку CarboPac РА100 (4x250 мм), снабженную CarboPac РА100 (4x50 мм) предколонкой. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. Анализ проводили при линейном градиенте 1М NaOAc в 100 mM NaOH: 0-35 мин - от 0 до 20 % , 35-40 мин - от 20 до 50 %, 40-50 мин - от 50 до 100 %. После каждого анализа колонку промывали 1М NaOAc в течение 5 мин и уравновешивали 100 rnM NaOH в течение 15 мин. Анализ моносахаридного состава олигосахаридных фракций проводили по методу De Ruiter с соавт. (1991). Водный раствор олигосахаридных фракций высушивали и гидролизовали 2М трифторуксусной кислотой (C2HF3O2) в течение 1 ч при 121 °С, после чего кислоту испаряли досуха в потоке воздуха. Водный раствор полученных после гидролиза продуктов анализировали методом ВЭАОХ с пульс-амперометрическим детектированием на системе Dionex ("Sunnyvale", США). Разделение проводили на колонке CarboPac РА 1 (4x250 мм) снабженной предколонкой CarboPac РА 1 ( 4x50 мм ) в 15 мМ NaOH в течение 20 мин. После каждого анализа колонку промывали 1М NaOAc в ЮОмМ NaOH (10 мин) и уравновешивали 15 MMNaOH в течение 25 мин.

Содержание белков определяли по методу Лоури (Dawson et al., 1986), фенолов -методом Фолина-Чикольте (Singleton, Rossi, 1965), Сахаров - орсинол-сернокислотным методом (Chaplin, Kennedy,1988).

Обработка активных фракций гидролитическими ферментами. Обрабатываемые фракции (200 мкг в 1 мл 5 мМ калий-фосфатного буфера, рН 5) инкубировали со смесью гликозидаз из Trichoderma viride (Maxazyme С., Gist Brocades, Нидерланды) при 40°С в течение 5 часов или с 50 мкг проназы В («Calbiochem», La Jolla, США) в течение 30 мин при температуре 35 °С. Параллельно в тех же условиях инкубировали раствор такого же количества фермента ( для добавления в кон-

трольную среду). Ферменты инактивкровали нагреванием на водяной бане в течение 10 мин.

Определение влияния олигосахаридов на морозостойкость проростков пшеницы. Тестируемые фракции и ингибиторы биосинтеза РНК белка вносили в среду выращивания 4-5 дневных проростков озимой пшеницы сорта "Казанская 84" как указано па рисунках и в таблицах. После закаливания (2°С, 7 сут) изменение их морозостойкости оценивали по методу (Guy, Haskell, 1987), основанному на измерении выхода электролитов. Для этого 0.5 г листьев каждого образца промораживали при ряде температур в течение часа, после чего инкубировали 1ч с 10 мл дистиллированной воды на качалке и замеряли выход электролитов. За нулевой уровень принимали значение выхода электролитов в образцах без промораживания. 100% выход электролитов измеряли после автоклавирования образцов. Опыты по тестированию на физиологическую активность проводили 2-6 раз; каждый опыт в тестах на морозостойкость имел трехкратную биологическую повтор-ность, на рисунках и таблицах представлены средние значения всех экспериментов и их стандартные ошибки. Достоверность разницы между контрольным и опытными вариантами определяли с вычислением критерия Стьюдента (Лакин, 1980).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Обнаружение эндогенных олигосахаридов. вовлеченных в формирование морозостойкости проростков пшеницы В ранее проведенных исследованиях по изучению вклада компонентов клеточной стенки в формирование морозостойкого состояния проростков озимой пшеницы (Заботин и др.,1995) было отмечено накопление растворимых олигосахаридов на 6ч воздействия низких положительных температур. Для выделения этих олигосахаридов с целью идентификации и изучения их роли в процессе низкотемпературной адаптации был использован разработанный нами метод (Заботина и др., 1995, Zabotina et al., 1996), позволяющий получать содержащиеся в тканях растений нейтральные олигосахариды в той форме, в какой они действительно могут существовать в растении in vivo. Все условия многоступенчатой хроматографии, на кото-

рой основана методика, были подобраны таким образом, чтобы сохранить целостность выделяемых фрагментов. Растворимые углеводы выделяли из корней проростков озимой пшеницы, выращенных при 25 °С (контрольные) и из корней проростков, подвергнутых низкотемпературной (2°С, 6ч) экспозиции (опытные). Из всего спектра полученных фракций повышающими морозостойкость проростков свойствами обладала лишь та фракция, содержание которой резко возрастало при охлаждении (рис.2; рис.ЗА). Следует отметить, что этот эффект проявлялся только на фоне действия низких положительных температур (рис.ЗБ).

Небольшие примеси белков и фенолов в составе активной олигосахаридной фракции (2.8 % от общего количества анализируемых веществ) придали принципиальное значение испытаниям ее после обработки проназой и смесью пектиназ с гемицеллюлазами. Эффект действия олигосахаридной фракции, обработанной проназой или нагреванием, на морозостойкость проростков сохранялся. Обработка выделенной фракции гликозидазами приводила к полной потере ее активности, что одновременно исключало вклад фенольных соединений в наблюдаемый эффект и, несомненно, подтверждало углеводную природу ее активного компонента (табл.1).

Таблица 1

Влияние активной олигосахаридной фракции (ОС) на морозостойкость проростков озимой пшеницы после обработки проназой, нагреванием и смесью гликозидаз

вариант морозостойкость, %

2°С, 7 сут 140.0 ±1.8

+ОС 176.4 ±1.9 * *

+ ОС после обработки проназой 172.7 ± 5.4 *

+ ннактивированная проназа 146.3 ±2.7

+ОС после инкубации на кипящей водяной бане (10 мин) 175.5 ±2.8 *

+ОС после обработки гликозидазами 131.5 ±0.7

+ инактивированные гликозидазы 134.5 ±0.7

Примечание. За 100% принято значение ЬТ5о для незакаленных проростков озимой пшеницы (5.5 °С ± 0.4). Фракцию (5 мкг/мл) добавляли за сутки до закаливания. Статистическая достоверность различий по сравнению с контролем: * Р< 0.05; * * Р< 0.02

100 I 80

и .

Я- 60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 192021 222324 25 262728 2930 31 32 33 34 35

номер фракции

-0-№

-а

Рис.2. Гель-хроматография углеводов из фосфатного экстракта корней проростков озимой пшеницы на колонке ТвК Н\У-55 (1x90 см).

Элюент - 0.1М №С1, фракции собирали по 1 мл и объединяли как указано на рисунке. У0 - выход синего декстрана, 5 Ш - выход декстрана с молекулярной массой 5 кБ, V, -выход глюкозы. Содержание Сахаров определяли орсинол-сернокислотным методом. N1 - углеводы из растений, выращенных при 25°С, - углеводы из растений, подвергнутых действию низких положительных температур (+2°С, 6ч).

А

В

2 С,7сут +№1+и1 +М2Ц2 +№3+И3 +№4+1_14

25'С +М1+1Л1 +N12+112 +№3+и3 +N14+114

40

20

Рис.3. Влияние углеводных фракций на морозостойкость проростков озимой пшеницы.

А-морозостойкость после закаливания (2°С, 7 сут). Фракции добавляли за сутки до закаливания. В - морозостойкость без проведения закаливания. Фракции (5 мкг/мл) добавляли за сутки до определения морозостойкости. Светлые столбики - фракции выделены из корней проростков озимой пшеницы, выращенных при 25°С, заштрихованные столбики -фракции выделены из корней проростков, подвергнутых низкотемпературному воздействию (2°С, 6ч). За 100% принято значение ЬТго для незакаленных и необработанных оли-госахаридами растений (-5.6°С ± 0.3). Статистическая достоверность различий по сравнению с контролем: * Р< 0.05; * * Р< 0.02.

2.2.Характеристика функционирования полученных активных олигосахаридов

в ходе формирования морозостойкого состояния

Максимальное обогащение активной олигосахаридной фракцией достигалось на 6ч низкотемпературного воздействия, снижалось на треть к 12ч и почти вдвое к концу суток закалки (рис.4).

время охлаждения,ч

Рис.4. Гель-хроматография олигосахаридов ( фракция 1д 4) из корней проростков озимой пшеницы, подвергнутых охлаждению (2°С) различной длительности, на колонке ТвК Н\У-5 5 (1 х90 см).

На рисунке представлена часть хроматограмм, полученных как описано в пояснении к рис.2.

Результаты проверки стимулирующей активности олигосахаридной фракции, выделенной в соответствующие моменты действия низких положительных температур, выявили аналогичную закономерность в изменении уровня ее эффекта (табл.2). Следовательно, на ряду с явным присутствием неактивных олигосахарид-

ных фрагментов в смеси, доля активных в ней также максимальна к 6ч охлаждения. Быстрый всплеск содержания олигосахаридов при действии закаливающих

температур может быть одной из начальных стадий, необходимых для последующих инициации и усиления адаптационных процессов в клетке. Внесение фракции в среду выращивания проростков за сутки до закаливания приводит к ощутимому

(более 30%) увеличению морозостойкости проростков за более короткий срок (рис.5). По-видимому экзогенные сахара быстро поглощаются корнями, поскольку изменение времени прединкубации фактически не влияет на их эффективность (рис.6). В то же время, если введение активных олигосахаридов осуществлялось по ходу развития адаптации, то достоверное возрастание морозостойкости проростков наступало лишь в случае внесения их не позднее первых суток закаливания (рис.7).

Таблица 2

Активность олигосахаридной фракции, выделенной из корней проростков озимой пшеницы, подвергнутых охлаждению (2°С) различной длительности_

время охлаждения, ч Ы50, °С

3 -9.7 ±0.1

6 -12.3 ±0.3*

12 -11.1+0.1 *

24 -9.9 ±0.1

Примечание. Фракции (5 мкг/мл) добавляли в среду выращивания проростков за сутки до закаливания (2°С, 7 сут). ¡Лизакаленных необработанных проростков: -9.6 °С ± 0.1. Статистическая достоверность различий по сравнению с контролем: *Р< 0.05

□2*С И2СЮС

время закаливания, дни

Рис.5. Влияние олигосахаридной фракции (ОС) на морозостойкость проростков озимой пшеницы в процессе закаливания при 2°С.

Фракцию (5мкг/мл ) вносили в среду выращивания за сутки до начала закаливания. За 100% принято значение ЬЛ^о для незакаленных проростков (- 5.2 °С ± 0.2). Статистическая достоверность различий по сравнению с контрольным вариантом: * Р< 0.05; ♦*Р<0.02.

+0С за 18 ч +0С за 1.5 ч без ОС

7 3 1

Время закалки, дни

Рис.б.Влияние олигосахарндной фракции (ОС) на морозостойкость проростков в зависимости от времени предобработки проростков.

Фракцию (5 мкг/мл) вносили в среду выращивания за указанное количество времени до закалки. 100% значение 1Л"5о для незакаленных проростков (5.2°С± 0.2)

Рис.7. Влияние олигосахарндной фракции (ОС) на морозостойкость проростков при добавлении в среду выращивания в ходе закаливания.

Од - внесение (5 мкг/мл) одновременно с началом закаливания, 1д - на 1й, Зд - на Зй день закаливания. За 100% принято значение ЬТ50 для незакаленных проростков пшеницы (5.8 °С± 0.2).

При более поздней обработке, ближе к моменту завершения закаливания, их влияние практически исчезало, что позволяет рассматривать их как регуляторные компоненты начальных этапов низкотемпературной адаптации.

Вопрос о механизме восприятия и трансформации низкотемпературного сигнала в клетках растений до настоящего момента изучен слабо. Тем не менее, становится все более очевидным, что такие регуляторные молекулы, как фосфоинози-тольные мессенджеры (Bukolova et al.,1994), Са2+ (Knight et al.,1996), цАМФ (Нарекая, 1993; Тарчевский и др., 1999), абсцизовая кислота (Четверикова, 1999) опосредуют дифференциальную экспрессию генов устойчивости, направленную на перестройку практически всех метаболических путей и обеспечивающую адаптацию растений к действию низких положительных температур. Между тем следует отметить, что то немногое, что известно о начальных этапах ответных реакций растительных клеток на действие наиболее изученной группы олигосахаринов - олигога-лактуронидов, свидетельствует о запуске ими системы вторичных посредников в

цепочке событий, ведущих к активации защитных генов при патогенной атаке (John et al.,1997). Под действием олигосахаридных элиситоров отмечены кратковременная деполяризация мембраны (Mathiue et al., 1991), повышение уровня внутриклеточного Са2+ (Knight et al., 1991; Messiaen, Van Cutsem, 1994) и цАМФ (Bolwell, 1992; Cooke et al., 1994). В то же время необходимо отметить, что для олигосаха-ринов, регулирующих рост и морфогенез, возможны другие механизмы действия, в том числе активация некоторых ферментов по пути постранскрипционной или посттрансляционной модификации (Dinand et at., 1997).

Для выяснения взаимоотношения белок-синтезирующей системы и эффекта повышения морозостойкости под действием обнаруженных нами олигосахаридов был использован подход с применением ингибиторов синтеза РНК и белка. Проростки, обработанные актиномицином D или циклогексимидом, теряли способность к развитию морозостойкости, что согласуется с результатами других исследователей (Трунова, Зверева, 1977; Титов, 1985). Одновременное введение в среду выращивания проростков олигосахаридов вместе с актиномицином D или циклогексимидом полностью восстанавливало способность проростков к низкотемпературной адаптации и приводило к успешному завершению закаливания (табл.3, табл.4). Подобный эффект наблюдался на проростках пшеницы при внесении в среду их выращивания циклогексимида с АБК (Критенко, Титов, 1990) . Вовлеченность этого гормона в процесс акклимации подтверждается повышением его эндогенного содержания при охлаждении (Таланова и др., 1991; Kosakivska et al., 1994; Janowiak, Dorffling, 1997) и увеличением морозостойкости растений после экзогенной обработки АБК (Rikin et al., 1979; Dallaire et al., 1994; Четверикова, 1999)

Таблица 3

Эффект совместного действия олигосахаридной фракции (ОС) и актиномицина Б на морозостойкость проростков озимой пшеницы_

вариант морозостойкость, %

контроль (2°С, 7 сут) 131.2 ± 2.1

актиномицин D (35 мкМ) 106.210.9

актиномицин D + ОС (5 мкг/мл) 133.9 ± 3.1

Примечание. Вещества вносили в среду выращивания проростков за 18ч до закаливания. За 100% принято значение ЬТ50 для незакаленных проростков (-5.5 °С ± 0.2)

Таблица 4

Эффект совместного действия олигосахаридной фракции (ОС) и циклогексимида на морозостойкость проростков озимой пшеницы

вариант морозоустойчивость, %

контроль (2°С, 7 сут) 155.4 ±9.5

циклогексимид (4мкМ) 101.5 ±1.5

циклогексимид + ОС (5 мкг/мл) 155.4 ± 13.4

Примечание. Вещества вносили в среду выращивания за 18ч до закаливания. За 100% принято значение Ы50 для незакаленных проростков (-5.5 °С ± 0.2)

Возможно охарактеризованные нами олигосахариды, согласно предложенной Элберсгейм,ом и Дарвиллом (1985) гипотезе, являются медиаторами более тонких запускаемых этим гормоном процессов, связанных именно с низкотемпературной адаптацией. Тогда проявление эффекта олигосахаридов только на фоне действия низких положительных температур может указывать на то, что они подключаются на более поздних этапах регуляторной цепочки, запускаемой охлаждением. Кратковременный всплеск образования этих олигосахаридов и эффективность их действия лишь на ранних этапах формирования морозостойкого состояния проростков свидетельствует в пользу предположения об их посреднической функции.

2.3. Состав активного компонента олигосахаридной фракции и его вероятное происхождение

Увеличение повышающего морозостойкость эффекта активной олигосахаридной фракции, извлеченной из корней проростков пшеницы в разные моменты охлаждения, при добавлении в среду выращивания растений в одной и той же концентрации свидетельствует об увеличении доли активных фрагментов в тестируемой фракции среди остальных присутствующих олигомеров. Для выделения и идентификации активного компонента олигосахаридной фракции было предпринято дальнейшее ее разделение методами гель-хроматографии и высокоэффективной анионообменной хроматографии (на системе ОЮ1ЧЕХ 0X500). Из рис.8, где с по-

мощью метода аналитической ВЭАОХ показана степень гетерогенности активной олигосахаридной фракции на каждом этапе последовательного хроматографическо-го разделения (TSK HW-55 Bio-gel Р-4 -> DIONEX DX500), видно увеличение степени очистки активного компонента. Сохранение уровня проявляемого фракцией стимулирующего эффекта на морозостойкость проростков при снижении на порядок тестируемой концентрации после каждого этапа очистки также подтверждает увеличение доли активного компонента во фракции. Компонентный состав олигосахаридной фракции, заключающей в себе активность после последнего этапа разделения (ВЭАОХ), представлена фактически одним пиком. Остальные присутствующие во фракции пики можно отнести к примесям неорганической природы и моносахаров, судя по профилям элюции используемых элюентов и смеси стандартных Сахаров. Степень полимеризации активного фрагмента, исходя из данных разделения стандартных гидролизатов галактана, составляет 12. Следовательно согласно экспериментально полученной кривой «доза-эффект», выделенная олигоса-харидная фракция максимально активна в концентрации 0.05 мкг/мл, что соответствует приблизительно 10"8 M олигосахаридов в среде выращивания проростков. -В табл.5 представлены данные о моносахаридном составе активной фракции

в молярных процентах от общей суммы нейтральных олигосахаридов. Видно, что

основными ее компонентами являются ксилоза и глюкоза, в небольшом количестве

присутствуют галактоза и арабиноза.

Таблица S

Моносахаридный состав активного компонента олигосахаридной фракции, мол. %

арабиноза галактоза глюкоза ксилоза

5.59 ±0.38 6.48 ± 0.42 39.73 ±1.65 48.30 ±1.52

Соотношение моносахаров во фракции позволяет предположить ксилоглю-кановое происхождение активного олигосахаридного фрагмента, хотя имеющихся данных о брутго-составе недостаточно, чтобы утверждать это однозначно. Тем не менее, гемицеллюлозная природа фракции не вызывает сомнения. Наблюдаемые

значительные перестройки гемицеллюлоз, кратковременный всплеск активности некоторых локализованных в клеточной стенке гликозидаз на 3-5 час гипотермии (Заботин и др., 1995), свидетельствуют в пользу того, что обнаруженные нами активные олигосахариды, максимальное содержание которых приходится на 6ч охлаждения, образуются скорее всего в результате частичного ферментативного гидролиза гемицеллюлоз клеточной стенки, чем каким-либо иным путем.

время удерживания, мин

Рис.8. Степень гетерогенности активной олигосахаридной фракции на каждом этапе ее последовательного хроматографического разделения (Т8К Н\*/-55, ВюОе1 Р-4, Оюпех 0X500).

Аналитическая ВЭАОХ фракции. Колонка СагЬоРас РА 100 (4x250мм). Скорость элию-рования 1 мл/мин. Линейный градиент 1М ацетата натрия в 100 мМ гидроксиде натрия: 0-35мин - от 20 до 50%; 40-50мин - от 50 до 100%. Углеводы регистрировали на выходе пульс-амперометрическим детектором (ПАД).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени не возникает сомнений, что некоторые олигомерные фрагменты полисахаридов клеточной стенки, олигосахарины, обладают широким спектром биологического воздействия на растения, однако вопрос об их функционировании in vivo, несмотря на принципиальное значение для дальнейшего развития всей концепции об олигосахаринах как регуляторных молекулах растений, до сих пор оставался мало изученным и спорным.

В ходе представленной работы были впервые обнаружены эндогенные олигосахарины с неизвестным ранее эффектом - повышением морозостойкости растений, а также показано их участие в адаптации проростков озимой пшеницы к низким положительным температурам. Импульсный, в сравнении с длительностью первой фазы закаливания (5-7 суток), характер динамики эндогенного содержания обнаруженных олигосахаридов (одновершинная кривая с максимумом на 6ч гипотермии), проявление эффекта действия только при предобработке или обработке проростков на ранних стадиях этого процесса (не позднее первых суток ) позволяют сделать вывод об их регуляторной роли в формировании морозостойкого состояния подобно таким известным регуляторам, как АБК, Са2+ , цАМФ. Вероятнее всего, эффект олигосахаридов не связан с дифференциальной экспрессией генов, так как одновременное внесении их с ингибиторами биосинтеза РНК и белка в среду выращивания проростков, восстанавливало адаптивные свойства растений. Гемицеллюлозная (наиболее вероятно ксилоглюкановая) природа, корреляция динамики эндогенного содержания фрагмента с динамикой изменений, которые претерпевает гемицеллюлозная фракция в первые часы охлаждения, и с наблюдаемым в этот период всплеском активности некоторых локализованных в клеточной стенке гликозидаз свидетельствуют в пользу образования их в результате частичного гидролиза полимеров клеточной стенки.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружена и охарактеризована олигосахаридная фракция, вовлеченная в процесс формирования морозостойкого состояния проростков озимой пшеницы.

2. Впервые изучена динамика эндогенного содержания олигосахаридной фракции в первые сутки формирования морозостойкого состояния, которая характеризуется одновершинной кривой с максимумом на 6ч гипотермии. Такой кратковременный всплеск эндогенного содержания характерен для сигнальных молекул.

3. Показано, что максимальное увеличение морозостойкости (более 30%) достигается при внесении олигосахаридной фракции в среду выращивания проростков в концентрации 10 "8М.

4. Установлено, что олигосахариды участвуют в формировании морозостойкости на самых начальных этапах. Эффект олигосахаридов наблюдали только при предобработке проростков или при добавлении не позднее первых суток закаливания.

5. Поскольку одновременное внесение в среду выращивания проростков олигосахаридов с ингибиторами биосинтеза РНК и белка, полностью подавляющих закаливание, восстанавливало способность растений к формированию морозостойкого состояния, эффект олигосахаридов, вероятно, связан скорее с постгрансля-ционными процессами, чем с дифференциальной экспрессией генома.

6. Моносахаридный анализ показал, что активный компонент обнаруженной олигосахаридной фракции содержит более 90% глюкозы и ксилозы в соотношении примерно равным 1:1 и представляет собой, наиболее вероятно, фрагмент кси-логлюкана со степенью полимеризации 12.

7. Впервые продемонстрирована физиологическая значимость олигосахаридов как эндогенных регуляторов. Предполагается, что олигосахариды, являясь продуктами обмена полисахаридов клеточной стенки, активно вовлечены в процесс низкотемпературной адаптации и участвуют в реализации пока не установленных, но существенных стадий этого процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заботина О.А., Гурьянов О.П., Аюпова Д.А., Белдман Г., Вораген А.Г., Лозовая В.В. Выделение олигосахаридов из побегов гороха и их физиологическая активность // Физиология растений. 1995. Т 42. N3. С.416-422.

2. Zabotina О.А., Gurjanov O.P., Ayupova D.A., Beldman G., Voragen A.G.J., Lozovaya V.V. Biologically active soluble oligosaccharides from pea stem tissues // Plant Cell Reports. 1996. V.15. P.954-957

3. Zabotina O.A., Ayupova D.A., Larskaya I.A., Zabotin A.I., Lozovaya V.V., Beldman G., Voragen A.G.J. Oligosaccharides appeared during first hours of low temperature acclimation increase wheat seedling capability of adaptation // Abstr. of Keystone Symp. "The extracellular martix of plant: molecular, cellar and developmental biology". Tamaron, Colorado, USA, 1996.P.32.

4. Zabotina O.A., Ayupova D.A., Larskaya I.A., Nikolaeva O.G., Petrovicheva G.A., Zabotin A.I. Participation of oligosaccharides in low temperature adaptation // Abstr. of Intern. Conf. "Stress and inorganic nitrogen assimilation". Moscow, 1996. P.12.

5. Николаева О.Г., Аюпова Д.А., Петровичева Г.А. Олигосахаридные фрагменты, влияющие на адаптационную способность проростков озимой пшеницы к низким температурам // Тез. докл. II Республиканской научной конференции молодых ученых. Казань, 1996. С.63.

6. Заботин А.И., Барышева Т.С., Заботина О.А, Ларская И.А., Аюпова Д.А., Петровичева Г.А.. Вовлеченность клеточной стенки озимой пшеницы в низкотемпературную акклимацию // Труды 1-ой всероссийской конф. по ботаническому ресур-соведению. Санкт-Петербург, 1996. С. 189.

7. Zabotina О., Gurjanov О., Ibragimova N., Ayupova D., Larskaya I., Nikolaeva O., Lozovaya V., Zabotin A., Beldman G., Voragen A. Effect of oligosaccharines on morfogénesis and adaptation // Programme and Abstr. of the 8th Bratislava symp. on saccharides. Smolenice, Slovakia, 1997. P. 38-39.

8. Заботина O.A., Аюпова Д.А., Ларская И.А., Николаева О.Г., Петровичева Г.А., Заботин А.И. Физиологически активные олигосахариды, накапливающиеся в корнях озимой пшеницы в ходе низкотемпературной адаптации // Физиология

растений. 1998. Т.45. Вьш.2. С.262-269.

9. Zabotina О.А.., Ayupova D., Gurjanov О., Ibragimova N., Nikolaeva О., Zabotin A., Beldman G., Voragen A. Participation of plant oligosaccharides in the process of organogenesis and adaptation // Abstr. of 8th Cell Wall Meet.. Norwich, 1998. (9.22).

10. Ayupova D.A., .Zabotin A.I., Zabotina O.A. Effect of plant polysaccharides on winter wheat seedlings frost resistance // Abstr. of 8th Cell Wall Meet., Norwich, 1998.(9. 28).

11. Zabotina O.A., Ayupova D.A., Barisheva T.S., Zabotin A.I., Beldman G., Voragen A.F.J. Participation of structural polysaccharides in the process of low temperature acclimation of winter wheat seedlings // Programm and abstr. 8th Scottish Cell Wall Group Meeting. Dundee, 1998. P.8.

12.Ayupova D.A., Larskaya I.A., .Zabotin A.I., .Nikolaeva O.G., Zabotina O.A. Participation of oligosaccharides from winter wheat tissues in the formation of the low temperature adaptaion // Book of Abstr. of 2nd conf. on «Progress in Plant Sciences: from plant breeding to growth regulation». Mosonmagyarovar,Hungary,1998. P.31.

13.Аюпова Д.А, Заботина O.A., Николаева О.Г., Ларская И.А., Заботин А.И. Биологические активные олигосахариды, влияющие на формирование морозостойкости проростков озимой пшеницы //Тез. Докл. Н(Х) съезда Русского ботанического общества «Проблемы ботаники на рубеже ХХ-ХХ1в.». Санкт-Петербург, 1998. Т.1. С.146.

14. Аюпова Д.А., Ларская И.А., Заботина О.А., Лозовая В.В. Выделение и исследование олигосахаридов растений, вовлеченных в процесс адаптации к низким положительным температурам // Тез. Докл. III Всероссийского совещания «Лесохимия и органический синтез». Сыктывкар, 1998. С.14.

15. Аюпова Д.А., Заботина О.А. Олигосахариды, повышающие морозоустойчивость растений // Тез. Докл. Всероссийской молодежной научной конференции «Растение и почва: проблемы агрохимии, агрофизики и фитофизиологии». Санкт-Петербург, 1999. С.22-23.

16. Заботина О.А., Аюпова Д.А., Заботин А.И. Характеристика функционирования олигосахаридов, вовлеченных в реакцию адаптации проростков к низкой температуре // Физиология растений. 2000 ( в печати )