Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическая активность ксилоглюкановых олигосахаридов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность ксилоглюкановых олигосахаридов"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСХН

_____На правах рукописи

'о ОД

ПАВЛОВА Зинаида Николаевна

1 и ЯНЗ 1993

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КСИЛОГЛЮКАНОВЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ

03.00.23 — биотехнология, 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена <во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии.

Научный руководитель — доктор биологических наук, академик РАСХН Г. С. Муромцев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор О. Л. Озерецковская; кандидат биологических наук В. А. Аветисов.

Ведущая организация — Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Защита .состоится.......... 1996 г.

в .... часов на заседании специализированного совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Автореферат разослан......... 1995 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

Ученый секретарь специализированного совета — к. б. н.

Меликова С. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одними из перспективных объектов исследования сельскохозяйственной биотехнологии являются регуляторы роста и средства защиты растений. Однако применение регуляторов роста, в большинстве своем синтетических, создает экологические проблемы. Задача современной биотехнологии - помочь сельскому хозяйству получить вкологически чистые продукты, сохранив при атом высокие урожаи. Один из путей решения етой задачи - создание новых высокоэф$ективных, вкологически безопасных регуляторов роста и средств защиты растений. Скрининг веществ природного происхождения на биологическую активность составляет первоочередной этап в создании новых регуляторов роста.

В последнее время внимание исследователей все больше привлекают олигосахариды - фрагменты полисахаридов .грибной и растительной клеточной стенки. Работы американского Центра исследования сложных углеводов доказывают, что, по всей вероятности, в растительных организмах олигосахариды выполняют функции молекул-посредников в процессах межклеточной коммуникации, регулируя рост, развитие и выживание в неблагоприятных условиях. К настоящему времени известно пять групп биологически активных олигосахаридов (олигосахаринов, ОС), получаемых из грибного мицелия, суспензионной культуры растительных клеток или химическим синтезом: олигоглюкозиды ß-глюкана и олигомеры хитина (хитозана) из грибной клеточной стенки, липоолигосахариды, продуцируемые Rhtzobivm, и две группы растительных ОС - пектиновые и ксилоглюкановые (КОС) (Darvill et al., 1992). ОС характеризуются высокой биологической активностью при очень низких концентрациях, на 2-3 порядка ниже, чем для известных фитогормонов. Они индуцируют у растений целый ряд защитных реакций против фитопатогенов: образование фитоалексинов, ингибиторов протеиназ, ß-глеканазы, хитиназы, а также синтез каллозы и лигнина (Darvill et al., 1934; Ryan, 1987; ¿Ibersheim et al., 1992).

Характерной чертой растительных ОС является участие в

Список сокращений: ОС - олигосахарины; КОС - ксилоглмкановые олигосахарины; КГЗ, КГ5, КГ7 > КГ9 - три-, пента-, гепта-. понасахаршаше фрагменты ксилоглюкана; COI - фукозиллактоза; 2,4-Д

- дихлорфеноксиуксусная кислота; ИУК - индолилуксусная кислота, ФК

- фузикокцин; ГК - гиббереллин; б-БАП - б-бензиламинопурин;

регуляции процессов роста и развития растений. Так, пектиновые ОС индуцируют в культуре експлантов из цветоножки растений табака образование цветков или вегетативных побегов, ингибируют корнеобразование (Tran Thanh Van et al.t 1985; Eberhard et al., 1989; Mohnen et al., 1990), а также индуцированное ауксином растяжение сегментов этиолированных стеблей гороха (Branoa et al., 1988). Ксилоглюкановы© олигосахариды (КОС) составляют наименее изученную в отношении биологической активности группу ОС. Показан антиауксиновый еффект ' нона- (КГ9) и пентасахаридкого (КГ5) фрагментов ксилоглпкана из клеточной стенки Acer paeudoplatarvus на сегментах стеблей гороха (York et al., 1984{ lioDougall & Pry, 1988) и в культуре изолированных протопластов моркови (finmerling et al., 1990). Отсутствуют сведения о влиянии втой группы ОС на морфогенез, рост и развитие целых растений и их защитные реакции. Поэтому исследование активнооти этой группы ОС является весьма актуальной проблемой и представляет интерес для фундаментальных исследований олигосахаринов как сигнальных молекул и/ для,' ' практических целей агробиотехнологаи. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы - изучить биологическую активность ксилоглимшовых олигооахаридов на растительных объектах различного уровня организации (культура In Vitro, ткани, органы и целые растения). <

Конкретные задачи состояли в исследовании влияния ксилоглтанового . нонасахарида и его три-, - пента- , я гептасахаридного фрагментов, а также трвсахарида фукозиллактозы на: - ■

- ростовые реакции растений, индуцированные ауксином я фу?Икокцином. В ходе исследования изучали также влияние пентасахаридкого фрагмента на ростовые реакции, индуцированные, гнббереллнном и цитокинином.

- амилолитическугэ активность алейроновой ткани эндосперма злаковых.

Далее иоследовали влияние наиболее активных олигооахаридов, пента-. и нонасахарида на:

- процессы каллусо- и морфогенеза в культуре тканей незрелых вародалей.

- рост и развитие интактных растений Arabldopala thaiicma.

- защитные реакции растений (образование фитоалексинов и устойчивость к фитопатогену).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенной работы' изучена новая груша биологически активных соединений. Полученные данные значительно расширяют спектр физиологической активности этой группа олигосахаринов и существующее представление о возможных Функциях группы. КОС в растениях: обнаружено, что они участвуют в регуляции роста растяжением растительной клетки, процессов-каллусо-, морфогенеза и регенерации в культуре in vitro, усиливают . защитные реакции растений против фитопатогенов и влияют на рост и • развитие целых растений. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. . Полученные результаты позволяют предложить ксилогишкановые олигосахарида для создания на их основе екологически безопасных препаратов - регуляторов роста и средств защиты растений. Активность КОС в культуре in vitro может быть использована в клеточных технологиях для регуляции морфогенеза и регенерации. Гесты, использованные для исследования активности КОС, могут быть применены в лабораторном скрининге олигосахаридов И их производных. Экспериментальные данные по активности КОС представляют материал для исследований механизма действия ОС, зависимости структура-активность.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены в 1990 г. на Ш-ей Всесоюзной конференции "Биосинтс i целлюлозы и других компонентов клеточной стешсин (Казань, 1990), а также представлены на IY Международном симпозиуме по регуляторам роста растений (Амстердам, 1991), Международном симпозиуме "Биохимические механизмы, вовлекаемые в регуляцию роста растений (Милан, 1991), на Третьем Съезде ВОФР, (Санкт-Петербург, 1993), на Третьей Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995).

'ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, описания методики, результатов экспериментов и йх обсуждения, заключения, выводов и списка ' литературы, включающего 159 источников, из них 148 - зарубежные.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В опытах использовали ксилоглюкановые • олигосахарида: трисахарид FucGalXyl (КГЗ) и пентасахарид FucGalXylGlOg (КГ5). с:гнтезированкые в КОХ им. Н.Д. Зелинского РАК (проф.Шибаев В.Н.)

(Торгов в др.,1990); гептасахарвд (КГ7) и нонасахарид

РиоОа11у13С1о4 (КГ9), выделенные из ксилоглякана культуралъной хидкоста 20-дневной суспензионное культуры клеток Ыоасогеа бвИо1<Зеа. штеш Ш> М-0,5 в ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (проф. Усов Д.И.); трисахарид ГиоСаХОХо (фухозил-лактоза, ®Л), Олизхий ш отрухтуре х ксилоглюкановым олигосахаридам. полученный из грудного женского молока в институте пищевых веществ РАН (Ямсков И.А. >.

• КГ5

Рис. f. Структура ксшюглинанового нонасахарида и его фрагментов

Растворы олигосахаридов готовил» на дистиллированной или деионигироваиной воде, стерилизовали, пропуская через мембранный фильтр о размером пор 0,2 ик. ~ Ростптелышэ объекты

В качестве растительных объектов была использованы сеиядоли тыквы Cucurbita реро L. о. Грнбовакоя куотовая ллр Зимняя белая, соя Glycine htsplda о. Витязь, апикальные отрезки корней кукурузы Zea щ/а L. с.1 Надавпрянокаят50, легыеитыгирокоталл/огурца Gucmle satlva L. с. Кзягщыаеидоспара »галаня' Hartev& Gatlvwi Heeßen, с. Голозерной! 76, культуре.- тканей , кеэре.лах даро'даавй аадрогвнетическоа ;лянвд пшеницы ТгХНщг : aeattvws,' с. • Аудрос,

проростки салата lactuca sativa L. с. Крупнокочанный, семена пшеницы о. Мироновская 808 и Arabldopsls thaltana.l. Heyn. (1988 г. урожая, раса "Duxon", дикий тип, каф. генетики МГУ). Ростовые реакции, индуцированные фузнкохцнном, ауксином, Цятокининоы в гиббереллином. Семядоли тыквы, апикальные отрезки корней кукурузы, сегменты гипокотилей огурца и проростки салата инкубировали на растворах ©К (2*10-7 или 2*10_бЫ), ИУК (2*10-iM), б-БАП (5*Ю~5М) и ГК (2*10~®М) и олигосахаридов (10~10-10~бМ). Контролем, как правило, служила дистиллированная вода. Определяли прирост массы в мг в расчете на 100 иг . исходной или прирост в длину в мм. Величину прироста выражали в % к контролю или рассчитывали ингибирование роста в % по формуле:

Рфк " РФК+0С

•* 100, где Рк, Р^ и Рфк+ос - масса в мг одной

Рфк " РК

семядоли соответственно в контрольном варианте, вариантах с ФК (ига ИУК) а олигосахарвдами.

Тест на ашлолитическую активность алейронового слоя эндоспериа ячменя. Эвдоспермы ячменя инкубировали на среде, содержащей ацетатный буфер (pH 5,0), CaClg, стрептомицина и олигосахариды. Инкубацию вели на качалке при +25°С, 180 об мин в течение. 24 часов. Амилолитическую активность определяли по убыванию крахмала (Jones &. Varner, 1967).-Реакцию проводили в течение 5 мин при 25°С в присутствии ионов Ca и избытка субстрата (растворимый крахмал, LKB). Измеряли оптическую плотность раствора при 620 нм. Активность амилазы рассчитывали в относительных единицах. Единицу определяли как разницу. оптической плотности Dggo КОНТР°ЛЬНОГО и опытного вариантов, отнесенную к единице времени (мин) и на единицу объема супернатанта (мл): .

- <Dk - V* V0

-:- , где Д, и D. - оптические плотности

Т. * vt К °

контрольного. и опытного вариантов, YQ и V^ - объемы (мл) исходного супернатанта и внесенного в реакционную среду, Т -время реакции'(мин).

Определение. ашиюдатпческсЗ активности в экстракте ацдоспериов. Удалив содержимое' семенной оболочки, кусочки енд'осйерлэв растирали в ступке на холоду .в. ацетатном буфере (pH, 5,0).,,. гомогенат центрхйугировали 10 (яп - при 10 ООО об/шсн и .определяли в

-6- • .... супернатс:гге амилолитическую активность.

Содержание Оедха в инкубационной среде определяли с красителем Cooumassie Brilliant Blue G-25Q №1\&а) по Вреяфорду (Bradford, 1976). Оптическую плотность окрашенного комплекса краситель-белок измеряли при.595 ни.

Морфогенетические эффекты КОС изучали в культуре тканей незрелых зародышей пшеницы*. Изолированные незрелые зародыши пшеницы помещали на среду MS с а-аспарагином, глютамином, 2,4-Д (Внучкова. и др., 1987) и ОС. Инкубацию проводили в темноте при 26°С, а после появления .меристематических зон на - свету. В. процессе инкубации отмечали начало образования каллуса, его рост, время формирования и число меристематиче ских зон и зеленых регенерантов. Влияние КОС на защитные реакции растений изучали в аиотерте на образование фитоалексинов и по реакции. растений на заражение спорами гриба-фитопатогена, Для обнаружения едиситорцой активности КОС использовали здоровые семядоли 8-дн. проростков сои (Hahn et al.,1981, 1992). Растворы олигосахвридов на стерильной деионизированной воде или воду в качестве контроля Наносили ив семядоли в объеме 50 мкл. Чашки инкубировал* в темноте ори 2б°С, высокой влажности в течение 20 часов. Собирали даффузат, содержаний фитоалексин, и после разведения измеряли оптическую плотность яри 285 нм (Д^д^).

Устойчивость н Оитояатогеву оценивали по степени заражения растений пшеницы спорами fUSarlxM culmorwi. Семена пшеницы замачивали 4 часа в растворе КОС (10""^-10~^М), иноку даровала споровой суспензией гриба со- споровой нагрузкой 2000 спор проросток и выращивали в бумажных рулонах на растворе Кнопа в световойкамере (15-часовоа световой день, дневная температура -22°С, ночная - 18°С). Через две недели оценивали степень поражения грибом по 5-балльной шкале! О баллов - отсутствие поражения¡1 балл - отдельные штрихи, некрозов на колеоптиле и корнях; 2 балла -отдельные атрихи некрозов на стебле, корнях и колеоптиле; 3 балла • обширное поражение (некрозы) стебля, корней, колеоптилей; 4 • балла - отмирание растояиЗ (некроз стебля, яорней, колеоптилей); 5 баллов -число неразвившихся проростков (длина колеоптиля от О до 1 см). Определяли твкго массу надземной части проростков. Ояау

* Эта чаоть работы выполнена в лаб. клеточно-инженерных методов селекции с х растений (В.А. Внучкова).

ставила в трехкратной повторности, по 50-80 зёрновок на повторность. Подсчитывали число растений о соответствуй®»! баллом и выражали в % по отношению к общему числу растений' в варианте. Контролем служили зерновки, замоченные в воде й .обработанные споровой суспензией. Второй Контроль - незараженные зерновки, замоченные в воде.

Активность хнтяназы. Семена пшеницы замачивали а растворе пентасахарвда (10~®М) или воде, проращивали в течение 1 или 2-х оуток в темноте, собирали в одном варианте колеоптили, во втором -целые проростки. Навески растирали в охлажденном фосфатном буфере (10 мМ, рН 6,8-7,0), центрифугировали, к супернатанту добавляли • HaNj в конечной концентрации 0,02?. Активность фермента определяли с помощью модифицированного Кривцовым. Г.Г. ' метода (Molano et al.,1977) с реацетилированным меченым хитином в качестве субстрата. Субстрат в форме "капелек" геля вносили в растительный вкстракт. Радиоактивность измеряли с помощью сцинтиляционного счетчика, рассчитывали число регистрируемых импульсов в минуту. Влияние КОС на рост н развитие интактных растений. Семена Arabtctopala проращивали в стерильной культуре на агаровой питательной среде (Brown, 1974) с добавлением КГ5. Растения выращивали в течение 28-30 дней до плодоношения в климокамере при +25°С, постоянном освещении до 15 ООО лкко и влажности (¡0%. В процессе роста отмечали начало появления настоящих ■ листьев, развитие корней, образование розетки, выход цветочной стрелки, момент зацветания и образования стручков.

Статистическая обработка. Все данные обрабатывали статистически, рассчитывая среднюю" арифметическую, ее опибку, стандартное отклонение. На - основе этих параметров определяли критерий . Стыодерта и оценивали- достоверность разницы на 153 или уровнях значимости. На. , рисунка? ■ и графиках представлены данные 1-го характерного опыта' из .серии щи . усредненные денные 3-5 опытов. Аналитическая повторность в onutax не мэкее З-xi 'биологическая -не менее 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ксилоглэканошх олнгосахарздоз нз ростоЕые реакцки, пндуцярсванные 1ШС, СК, ГК п 6-ВАП. В таблице 1 объединены результаты экспериментов по влиязвио КГ9, КГ7, КГ5, КГЗ п М на ростовые реакции отдельных органов растений, индуцированные ИУК и

<6К. Как следует из давних, КГ9 подавлял индуцированный ФК рост семядолей тыква, как а индуцированный ИУК рост . сегментов гияохотялей огурца б концентрационным оптимумом при- В

другой роотовой реакции, индуцируемой Ж (апикальные отреахн .. корней кукурувы), концентрационный оптимум КГ9 составил » КГ®!». Инга Сиру щий аффект КГ9 обычно находился в -пределах 20 - 50% и уменьшался о повышением концентрации. Аналогичный ингибирующий еффект наблюдали я для КГ5 на всех испытанных объектах, но о концентрационным оптимумом на порядок вывии КГЗ в незначительной

Таблица 1. Ингибирование хсилоглюкановыми олигосахаридами и фукэзиллактозой индуцированных ауксином я фузихохциноы ростовых реакций

Тесты ип КГ5 КГ7 КГ9 . «X

На ауксин!

- роот гшокотилей огурца + ... + • +' (10^1)

На фузикокцин:

- растяжение семядолей тыквы: + + (10-8M) .. .+ (10~9M)

' - удлинение " апикальных отр о а + ков (10±7U) ■ - - ■ (10±8Ы)

корней кукурузы ..

(+) . - ингабарупций еффект! (-) - отсутствие, влияния; в

скобках указаны концентрационный оптимумы.

степени подавлял аффект ®К и ИУК и без концентрационного оптимума. КГ? В <М не проявили активности ни в одной ростовой реакции. В то ш время КГ5 не влиял на индуцированный ГК рост кнтактных. Гипокстилей салата, как я на индуцированный б-ВАП рост семядолей тыквы. В отсутствие Ш (ИУК) все олигосахпрвдц в облаотц испытанных концентраций не обладали сколько-нибудь оначзлзой активностью. '

Полученные данные. по антгауксивовой активности, КГ9 в КГ5 шдтБврздают результата американских исследователей (Yorlc et ol.,

■ •■■ -91984: McDougall & Fry. 1989: Augur et al.. 1992)" на сегментах этиолированных стеблей гороха, с тем исключением, что в наших экспериментах- не только КГ9, но и КГ5 имел концентрвционны» оптимум, который был на порядок выше, чем у КГ9.

Таким образом, было доказано, что КГ9, КГ5 и КГЗ в отличив от остальных олигосахаридов подавляют в ростовых реакциях действие не только ИУК, но и ФК. Ингибирущая активность КГ9 и КГ5 характеризуется оптимумом при концентрации соответственно 10 ^-10-8М и Ю-в-Ю-Ч превышение» которой не дает усиления эффекта. При этом олигосахариды. не влияли на ростовые реакции, индуцируемые ГК и б-БАП. Так как в большинстве работ о 00 имеют дело с фракциями олигосахаридов, представлящими собой смеси активных и неактивных молекул, то эксперимент о индивидуальным веществом, синтетическим КГ5, доказал,. что действующим началом пентасахаридной фракции ксилоглйкена , является пентасахарид приведенной выше структуры.

Влияние ксилоглвкановых олагосахарадоэ на ашдолитическую активность алейронового слоя вцдоспвраа ячюня, ь тесте были активны только КГ5 я КГ9, активность КГЭ и ©Л была незначительна и не зависала от концентрации. КГ5 подобно гнббереллину стимулировал амилолитичёскую активность, приведя в накоплению белка в. иякубацко*гкой среда (рио. ?).. -

Рпо.2. Действие пентасаха-рвда ва амилолятическую активность и содержание белка в инкубационной среде изолированных эндоспермов ячменя. О - активность амилазы; □ - содержание белка' (контроль = 1). На оси ординат - амило-литическая активность в относительных единицах; на оси абсцисс - концентрация пентасахарида.

Аналогичных- образом действовал и КГ9. Определение амилолитической активности в екстракте семенных оболочек эндосперма и сравнение о гиббереллином показало, что, вероятнее всего, действие олигооахаридов на амилолитическую активность связано о их . преимущественным влиянием на процесс секреции ц/Или высвобождения ферментов через клеточную стенку (Табл.2). ]

Таблица 2. Влияние гиббереллина ипентасахарида на амилолитическую активность в инкубационной среде и в вкстракте семенных оболочек ендосперыа ячменя

Амилодитическая активность Вариант - ■ ' —- "'•'.'.

';'• .• I ' 'И : .•■'.'■

''•'.' инкубац. среда екстракт

Контроль 0,099 ГК, 10"6!! 4,647 3 10~®М , 5,130 КГ5, Ю-6« 0,639 ЗЮ*6!! 1,160

В скобках даны цифры относительно контроля, принятого за 1.

Таким .образом, олпгосахвриди КГ9 и КГ5 подобно гиббереллину . стимулировали амилолитическую активность ендошерма ячменя, но характер их действия, по всей видимости, связан не с синтезом, а секрецией или высвобозздением амилолитаческих ферментов из клетки.

Влияние ксшюглхкановых олигосахарвдов на каллусообразование н морфогенез в культуре тканей незрелых зародышей ппеняцы. в культуре In vitro вами обнаружены неизвестные ранее свойства КОС. Внесение КГ5 и КГ9 в среду MS вызывало в зависимости от присутствия шв отсутствия ауксина качественные или только количественные изменения. Ауксин (2,4-Д, 2 mç/л) индуцирует каллусо- и морфогенез р культуре незрелых зародышей пшеницы (Внучкова и др., 1987), На етом фоне КГ5 и КГ9 в концентрациа

(1) 0,337 (1)

(46,9) 1,173 (3,48)

(51,в> 0,672 (2,0)

(6,45) 0,294(0,87)

(11,7) 0,257 (0,76)

10_8М усиливали эффект ауксина: каллус развивался раньше, его " масса превышала в 2-4 раза контроль, меристематические зоны и - регенеранты возникали, когда в контроле они еще отсутствовали. Следовательно, олигосахариды и ауксин в отличие от ростовых реакций в данном случае действовали как синергксты. На среде МЭ 'без 2,4-Д КГ5 и КГ9 (10~®Ы) вызывали качественно новый эффект: . мощную индукцию ризогенеза (Тао'л.З).

Таблица 3.

Влияние пентасахарида к нонасахарида на каллусообразование и дкфференцировку а культуре тканей незрелых зародышей пшеницы

Образование:

Исходные среда каллусов меристематич. регенерантов зон корней

• МБ без гормонов * . -

ЙБ + КГ5 (10-8М) »*

МБ + КГ9 (10_8М) **

МБ + 2,4-Д(2мг/л) ++ '.'++• ++ +

Ш + 2,4-Д(2мг/л)+

КГ5 (10_8М) +++ +++ +++ ++

МЗ + 2,4-Д (2мг/л)+

КГ9 (10-8и) +++ +++ ' +++ ++'

* - в каадом варианте посажено ТС5 зародышей. ИЗ - среда Мурасиге-Скуга; 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; КГ5 и КГ9 - пента- и нонасахврид; - отсутствие эффекта; +, ++, +++ -интенсивность образования каллусов, зон и регенерантов. • ** -индукция ризогенеза.

Повыпекиз концентрации олигосахаридов до 1не приводило к усилении еффэкта. Следовательно, КГ5 н КГ9 имели концентрационный -'. оптимум - 1<Г?М»

Приведенные' результаты позволяют заключить, что КГ5 и КГд способны вызывать ' дифференцировку клеток (ризогенез), а, также

усиливать действие ауксина на процессы каллуоо- и морфогенеза в культуре тканей. ^

Влияние пентасахарида на рост и развитие цели . растений

' АгаЫ<Зорз18 ХЬаНопа. В табл. 4 приведены некоторые результаты экспериментов на целых растениях. Из данных следует, что влияние КГ5 прослежизается на протяжении всего онтогенезе от прорастания семян до образования стручков. На ювенильном етапе развития наблюдали ускорение • под действием КГ5 прорастания семян и незначительную стимуляцию роста проростков. КГ5 не изменял число листьев в розетке и положительный геотропизм корня, как не менял и морфологию листьев. На следующем етапе онтогенеза - етапе зрелости - под действием КГ5 отмечали более ранний (на 2-4 дня)

Таблица 4.

Влияние пентасахарида на рост и развитие растений Araütdopsls

Физиологическая Концентрация пентвсахарида, М

реакция 0 Ю"8 ю"7 10"6 ю"5

Прорастание семян: число проросших, % 4-е сутки Y-e сутки CTi-N оо 40 60 80 80 ÜJ-» оо 90 90

Период роста (дай) до: - выхода в стрелку 17-2 14-2 15-2 15-1 13-1

- цветения 24-1 20-3 20±2 21-1 20±1 „

- образования' стручков >30 <зо <30 <30 <30

выход в стрелку и сокращение на несколько дней периода до^ зацветания. КГ5 также ускорял образование стручков. Суммируя полученные на втом объекте дтнные, можно . заключить, что присутствие КГ5 в среде" ускоряет развитие растений АгаЫйорз1з, сокращая вегетативную стадию роста, результатом чего является более раннее зацветание и плодообразование.

Влияние ксилоглшановых олигосахарндов на защитные реакции растений. Образование фитоалексинов. Характерная особенность ОС -

элиситорная активность. В литературе отсутствуют сзедения об элхсаторкой способности группы ксилоглвкановых ОС. Для ее . выявления мы использовали разработанный для этой цели тест на зеленых семядолях сои (Hahn et al-'./ 1981; 1992). Реакция семядолей на обработку КГ5. и КГ9 состояла в увеличении оптической плотности даффузата при 285 нм. На рис. 3 приведена разница оптических плотностей даффузата контрольного и опытных вариантов, что свидетельствует о накоплении во внеклеточной среде фитоалексинов. По мере увеличения концентрации олигосахаридов от 10~^М до 3 10 ^М эффект усиливался. По активности в этом тесте КГ5 и КГ9 примерно равны. Реакция семядолей отмечается, начиная с дозы приблизительно 1 мкг на семядолю (рис. 3).

Рис.3. Влияние пента- и нонахарида на накопление фиюалексинов семядолями сои. 9 - КГ5; 0 - КГ9. На оси абсцисс - доза в мкг на 1 семядолю. На оси орда-нат - разница оптических плотностей (Д285) контроля и опыта.

0.006

5 10 . 15 20 25 30 35 мюусемядоля

Устойчивость к ©атопатогену. Обработка семян пшеницы КГ5 и КГ9 вызывала повышение устойчивости проростков к заражению грибом Р. си1йОПся. В то время как контрольные растения (без обработки КОС) имели все признаки поражения грибом (некротические пятна на стебле или корнях, отмирание йолеоптале, задеркхе роста), обработанные растения 5:мелч вид здоровых или лишь ослабленные признаки заболевания. С возрастанием концентрации КОС происходило перераспределений растений по классам! возрастало число растений с баллом поранения О (здоровые) и уменьшалось о баллами поражения 1 и 2 (рио. 4). Это свидетельствует об усилении под влиянием

%

50 4030-20-10 0

/

0 1 2 А

12. 0 Б

1 2

•С

1 2 0'

Ркс.4. Влияние пентасахарида на поражение проростков пшеницы ^l¡saríuлг си1 топт. А - контроль; В, С, Д - КГ5 соответственно 10~®М, 10"7М, 10~6М. На оси абсцисс - 0,1.2 - баллы поражения; на оси ординат - число растений о определенным баллом поражения в % к общему числу в варианте.

олиго с а х а рядов устойчивости растений к фитопатогену. Одновременно наолюдали компенсации задержки роста проростков, вызванную фитопатогеном. :

Влияние пентасахарида на активность хитиназы. Существенных Изменений в активности хитиназы под влиянием КГ5 не отмечено ни в 2-суточных проростках, ни в надземной части 3-суточных проростков пшеницы.

Таблица 5• Влияние пентасахарида на активность хитиназы в

проростках пшеницы

Радиоактивность надосадочной жидкости (имп/мин)

2-суточные 3-суточные

Вариант проростки колеоптили

контроль 459б±б92 689*87

пенто-д (10~ "6М) 5325-520 594-56

Удельная радиоактивность составляла 2"10 распад мин'мг

■ -.15-

Моано констатировать, что ксилоглюкановые КГ5 и КГ9, подобно остальным классам ОС, обладают способностью усиливать защитные реакции растений: при высоких (>10~%) усиливают образование фятоалексинов; при более низких (>10"^М) повышают устойчивость проростков к фитопатогену.

Результаты исследования активности КОС сведены в табл. Б.

Таблица 6.

Активность ксилоглюкановых олигооахаридов

Эффект

Растит, объект

Олигосахарид, (Г

КГ5

КГ9

йодавление

ОК-индуциро-ванного роста

подавление ' ИУК-индуциро-. ванного роста

индукция ризогенеза

семядоли

тыквы,

корни

кукурузы

гипоко-

ткли

огурца

незрелые зародыши пшеницы

10'

га

ю

ю

,-7

10

г8

10"

10

10

-8

10'

,-8

ускорение образования меристематя-ческих зон и регенерантов

стимуляция емилолитячео-кой активности

рост и развитие интактных раст.

обрагозаякэ

щттщ.т

уезлэгке . • устойчз-

еостп

• незрелые зародыши пиешада

изолированные ендосп-. рмы . ячменя

АгаЬ1йорз1а

семядоли сои

проростки шенахщ, пнфзцироэеи-пае гребем ■

10

Ю-8-! О'6

10~а-10-5

10"5-5"10-4

Ю"8-! О"6

10"

10~а-1о"6

10-5-5Ч0"4

ло-в-ю'6

8

-16- Л..;-

Полученные данные существенно расширяют представление об активности и роли КОС в растениях. Кроме известного уже антиауксинового эффекта, мы обнаружили подавление действия ©К в ростовых реакциях, индукцию ризогенеза и усиление действия ауксина в культуре in vitro, стимуляцию образования фитоалексинов и усиление устойчивости растений к фитопатогену. Наибольшую активность (самые низкие действующие концентрации) КОС проявляли в ростовых реакциях, индуцированных ИУК ФК ив культуре in vitro. Именно здесь наблюдается максимальный аффект при • низкой (10 9-10 ®М) концентрации, превышение которой не приводило к усилению эффекта. Кроме того, в культуре in vitro КОС проявили "собственную", неопосредованную ИУК, активность при концентрации 10~8М.

Известно, что эффект ИУК и ФК в ростовых реакциях определяется в первую очередь их влиянием на рост растяжением. Механизм этого, влияния связан с активацией .протонной помпы, подкислением периплазматического пространства, изменением ионного баланса клетки, результатом чего является разрыхление и растяжение клеточной стенки и, в конечном счете, рост клетки (Marre, "1979;. Cleland, 1980; Полевой, 1991)- Так как характер взаимодействия олигосахаридов с ИУК и ФК одинаков, то принимая во внимание общие черты в механизме действия ИУК и ФК на рост растяжением, можно предполагать, что в ингибирующий аффект КОС в ростовых реакциях вовлечена плазмалемма» Вероятность такого предположения усиливает тот факт, что КОС не ^лияют. на эффект ни ГК, ни 6-БАП в ростовой реакции. Действие цитокининов на рост в отличие от ФК связано с . активацией синтеза РНК и белка (Кулаева и др., 1982), а.влияние ГК к ИУК на рост в длину связано с растяжением клеточной оболочки. Однако изменяя'растяжимость клеточной стенки, ГК и'ИУК по- разному действуют на ее составные, . эластическую и пластическую растяжимость: ГК не влияет на механические характеристики стенки и его действие ■ больше связано с хемореологическими характеристиками; ИУК изменя'ёт именно физико-механические свойства ее (Cosgrove et al., 1939). Такта' образом, принимая во внимание особенности механизма действия на рорт растяжением Бсех испытанных гормонов, можно предполагать, что местом взаимодействия КОС с ИУК и ФК в ростовых реакциях является плазмалемма. Специфическая зависимость действия КОС от концентрации, неактивность близких.по структуре КГ7, КГЗ и ®Л» говорит в ' пользу существования

высокоспецифичного мембранного рецептора, связывающего активные олигосахариды..

Высказано предположение о существовании нескольких путей трансдукции ауксинового сигнала в растениях (Napier & Venís, .1990); Barbler et al., 1992). Анализ литературных данных приводит к выводу, что различные эффекты ауксина, например, ростовой и морфогенетический, осуществляются с помощью различных рецепторов: если для стимуляции ростовой реакции достаточно связывания с мембранным рецептором, то дифференциальная активация генов в ядре ■ при индукции морфогенеза требует комплекса ауксина с цитоплазматическим рецептором. Это в некоторой степени объясняет противоречие между антиауксиновым эффектом КОС в ростовых реакциях и обнаруженным нами в культуре in Vitro синергитическим эффектом ауксина и КОС.

Только в самое последнее время появились работы, доказывающие способность КОС противодействовать инфекции растений,, в частности, вирусом табачного некроза (Sabikova et al., 1994; Slovakova et al., 1994). Немного ранее обнаружена индукция иммунных реакций у картофеля олигосахаридными фракциями из клеточных стенок, . . полученными при действии гидролаз (Озерецкоьская и др.. 1993; Роменская и др. '1994). Предполагается, что индуцирующими свойствами, в данном случае обладали . олигомеры ксилоглюкана. Приведенные здесь эксперименты с индивидуальными веществами доказывают, что, подобно другим группам ОС, КОС, индуцируют защитные -.реакции у растений. 'Устойчивость проростков пшеницы под влиянием КОС усиливалась с повышением их концентрации а образование фитоалексинов происходило при еще более высокой концентрации (>10"^М). Это подтверждает высказанную Озерецковской (1986) идею о том, что индуцировать устойчивость растения к болезни можно, обработав его элиситором, но в концентрациях на 2-3 порядка ниже, чем для образования фитоалексинов. Для индуцируемых КОС защитных реакций в отличие от ростовых, характерно отсутствие оптимальной концентрации: эффект усилизается по ■ мере поветения концентрации;

Прослеживается некоторый, параллелизм в. действии КОС и а-олигогалактуро15идов. в культуре тканей и на защитные реакции: плзю!д концентрации .(<10~7ц) эндогенных КОС и олигогалактуронидов регулируй?' ростовые," я .иорфогенетичесхие реакции растений, а - еиссклэ котдантрацгя (>10"^И), возникапцке в больном растении при

действии собственных ферментов и ферментов патоген», обеспечивают включение защитных реакций, дополняющих защитное действие грибных элиситоров типа (З-гептаглхжозида. Различные концентрационные • диапазоны, в которых осуществляется регуляция КОС роста, развития и стимуляция защитных реакций растений, требуют, вероятно, как и в случае с олигогалактуронидами, (Belllncampl et al., 1994.) существования различных классов рецепторов.

Широкий спектр биологической активности КОС, проявляющейся на различных уровнях организации от клеточного до организменного, свидетельствует о том, что наряду с другими олигосахаринами КОС могут выполнять в растениях функцию регуляторныж молекул в процессах роста, развития и взаимодействия растений с окружающей .средой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель настоящего исследования состояла в исследовании биологической активности ксилоглюкановых олигосахаридов как наименее изученной группы олигосахаринов и как представителей нового класса эндогенных соединений с регуляторной активностью. Из представленных экспериментальных данных следует, что эти олкгосахариды обладают широким.спектром физиологической активности и выполняют в растениях, по всей видимости, вахкые и гораздо более широкие функции. чем это предполагалось . ранее. Ломимо предполагаемого Albersheim'om участия в регуляции роста клетки растяжением, подтвержденного насими данными по взаимодействию КОС с КУК и ФК в ростовых реакциях, нам удалось обнаружить- неизвестные ранее морфогенетические эффекты КОС в культуре Шvitro и ицдукцию защитных реакций растений. ' .

Действующие концентрации КОС в .ростовых реакциях И в культуре тканей совпадают, однако . противоречие между антиауксиновым эффектом КОС. в ростовых реакциях и их синергитическим эффектом с ауксином в культуре- tri Vitro не разрешается, если не допустить существования различных механизмов действия4 ауксина в упомянутых процессах* Ингибирование. КОС роста растяжением, . индуцированного КУК ...и ©К, о больдой- вероятностью вовлекает в эти процессы 'плазмалемму. Усиление действия'ауксина в культуре in vitro под влиянием КОС может . объяснятьЬя', различным механизмом действия ауксина в столь- отличающихся система* .'как отделенные органы и недифференцированная^ '.гормойозависи^ая каллусная ткань. . '■.-,-

Регуляция роста и развития ксилоглюкановыми олигосахаридами с одной стороны, и индукция устойчивости, осуществляющаяся в ином концентрационном диапазоне, с другой, требуют различных классов рецепторов. Отправной же точкой многообразных эффектов КОС, по-видимому, является взаимодействие с плазматической мембраной, в результате которого олигосахаридный сигнал различными путями преобразуется в ростовые, морфогенетические и защитные реакции.

Существование ксилоглюкановых ОС ln vivo, рассматриваемое в связи с приведенными выше экспериментальными и литературными данными, приводит нас к выводу, что КОС . могут являться компонентами регуляторной системы растений, а иерархическую ступень, которую они занимают в системе регуляции, предстоит определить в дальнейших исследованиях.

вывода

1.' Установлено, что ксилоглзокановый нонасахарид КГ9 и его фрагменты КГ5 и КГЗ ингибируют ростовые реакции, индуцируемые ауксином (гипокотили огурца) и фузикокцином (семядоли тыквы и апикальные отрезки корней кукурузы). Влияния КГ7 и фукозиллактозы не обнаружено. Наблвдаются концентрационные оптимумы при действии КГ9 и КГ5г соответственно 10~^-10-8M и Ю^-ЮГ^М; КГЗ действует слабее, концентрационный оптимум отсутствует. При атом КГ5 не влияет на ростовые реакции, индуцированные гиббереллином (интактные гипокотили салата) и цитокинином (семядоли тыквы).

2. Установлено,что КГ5 и КГ9 стимулируют амилолитическую

активность алейронового слоя ендосперма ячменя. Их эффект

' ' —S —б

усиливается о повышением концентрации (10 -10 М) и, вероятней

всего, опосредован их влиянием на процесс секреции и или

высвобождения амилолитических ферментов из клеток алейрона.

Влияния КГ7, КГЗ и ал в атом тесте не обнаруяено.

3. Показано, что в культуре тканей незрелых зародышей пшеница на среде без ауксина КГ9 и КГ5 индуцируют ризогенез; в присутствии' ауксина они усиливают скорость и интенсивность каллучо- и морфогенеза и соответственно регенерации. Для действий КГ9 и КГЗ в культуре ln vltro характерна оптимальная концентрация - 10~®М, ее превмаенае не приводит к усилению вффекта.

4. Обнаружено, что олигосахаридц КГ9 и КГ5 индуцируют защитные реакции растений: при выоокпх концентрациях (>10~®М) -образование фатоалексииов; при более низких (>10~^М)

устойчивость к фитопатогену»

5. Показано влияние КГ5 на рост и развитие Arabldopais tbaliam в онтогенезе: наблюдается укорочение вегетативной стадии

-роста, более раннее зацветание и плодообразование.

6. Анализ экспериментальных данных приводит к выводу, что регуляция роста и развития (ростовые реакции и культура in vitro) и индукция защитных реакций (образование фитоалексинов и устойчивость) ксилоглхжановыми олигосахаридами осуществляются в различных концентрационных диапазонах, и, по-видимому, с помощью различных механизмов.

7. Широкий спектр активности на различных уровнях организации (ткани, отдельные органы, целые растения) и существование in vivo дают основание предполагать, что ксилоглюкановые олигосахариды являются компонентами регуляторной системы растений.

8. Обнаруженные регуляторные свойства ксилоглюкановых олигосахаридов позволяют предложить эту группу олигосахаринов для создания на их основе экологически безопасных регуляторов роста растений и препаратов для защиты растений от фитопатогенов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Павлова З.Н., Бабаков А.В., Муромцев Г.С., Торгов В.И., Нечаев О.А., Усов А.И.,' Шибаев В.Н. Изучение биологической активности синтетических трисахаридного и пентасахаридного фрагментов растительного ксилоглюкана. • Тез. III-ей Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки. Казань, 1990, с.26.

2. Pavlova Z.N., Ash О.А., VnucbJcova V.A., Ifurorotsev G.S. Physiological activity of synthetic xyloglucan fragments. // Abstr. 14th Int. Conf. on Plant Growth Substances. Amsterdam, 1991. P-84. .

3. leonova Т.О., Pavlova Z.N., Danilina E.E., Huromtsev G.S. Studies on activation of growth processes by fusicoccin and its interaction with oligosaccharins and calcium, // Abstr. of Int.. Бутар. "Biochemical mechanisms involved in growth regulation", Milan, 1991. P-84. "

4. Pavlova Z.N., Ash O.A., Vnuchkova V.A., Babakov A.V., Torgov V.I., Nechaev O.A., Usov A.I., Shibaev V.N. Biological activity of a synthetic pentasaccharide fragment of xylcglucan. //

Plant Science, 1992, V. 85, p. 131 — 134.

5. Леонова Т. Г., Павлова 3. Н., Муромцев Г. С. Влияние фузикокцина, кальция и пентасахарида на содержание К+ и рост изолированных семядолей тыквы. Тез. Третьего Съезда ВОФР, Санкт-Петербург, 1993, с. 145.

6. А ш О. А., Л о с к у т о в а Н. А., Павлова 3. Н., Абрамы-чева Н. Ю., Внучкова В. А., Б а б а к о в А. В., Муромцев Г. С., Мельникова Т. Н., Нечаев О. А., Торгов В. И., Усов А. И., Шибаев В. Н. Новые физиологические эффекты олигосахаридных фрагментов растительного ксилоглюкана.//Докл. АН, 1995, Т. 340, № 3, с. 427—429.

7. П а в л о в а 3. Н., Аш О. А., Лоскутов а Н. А., Внучкова В. А., Б а б а к о в А. В., Муромцев Г. С. Биологическая активность ксило. люкановых олигосахаридов.//Тез. III Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1995, с. 31—32.

Объем 1'Л и. л.

Заказ 1229

Тираж 100

Типография издательства МСХА им. К- А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44