Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологический синтез олигомеров хитина и их терминально деацетилированных производных с помощью ферментов клубеньковых бактерий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологический синтез олигомеров хитина и их терминально деацетилированных производных с помощью ферментов клубеньковых бактерий"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи &

ЛБППЯНЕН Ирина Викторовна

БИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ОЛИГОМЕРОВ ХИТИНА И ИХ ТЕРМИНАЛЬНО ДЕАЦЕТИЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ С ПОМОЩЬЮ ФЕРМЕНТОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

03.02.03 - Микробиология

03.01.05 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005060058

005060058

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной биологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ) Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург, Пушкин

Научные руководители: доктор биологических наук, академик РАСХН

Тихонович Игорь Анатольевич

кандидат биологических наук Долгих Елена Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Падкина Марина Владимировна (Санкт-Петербургский государственный университет)

доктор биологических наук Анисимова Ирина Николаевна (Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии)

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится " ^ " 2013 г. в '('Т. ч на

заседании объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Биолого-почвенный факультет, ауд. № /33 •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Факс для отзывов: +7 (812) 470-43-62.

Автореферат разослан " " ^¿¿^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е. И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из приоритетных задач современной молекулярной микробиологии является получение высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, синтезирующих разнообразные биологически активные соединения. Развитие этого направления исследования определяется необходимостью перехода от традиционного способа выделения штаммов микроорганизмов с полезными свойствами из природных источников к направленному получению в результате селекции, а также созданию с помощью молекулярных методов микроорганизмов с новыми заданными свойствами. С разработкой новых методических подходов появилась возможность экспрессировать в микроорганизмах новые или измененные гены, которые не могли бы быть получены методами мутагенеза или скрещивания. Микроорганизмы стали использовать как «биологические фабрики» для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусных антигенов и т.п.

В последние годы значительно вырос интерес к изучению, а также практическому использованию олигосахаридов, которые содержат в своем составе аминосахара О-глкжозамин, Э-галактозамин, а также ТЧ-ацетил-О-глюкозамин и Ы-ацетил-О-галактозамин. Это связано с особой ролью таких олигосахаридов в процессах межклеточного взаимодействия, в основе которых лежит узнавание этих соединений поверхностными рецепторами клеток у различных организмов (Ааш е1 а1., 2010; Моигуа е1 а1., 2011). Конъюгированные олигосахариды входят в состав гликопротеинов и гликолипидов, углеводные части которых являются лигандами для многих рецепторов. Свободные олигосахариды также вовлечены в лиганд-рецепторные взаимодействия, выполняя во многих случаях функцию сигнальных молекул, регулирующих биохимические, иммунологические и морфогенетические процессы.

Среди таких олигосахаридов важную роль играют хитоолигосахариды (олигомеры хитина и хитозана), которые находят широкое практическое применение в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве. Известно, что некоторые хитоолигосахариды (ХОС) обладают противовоспалительным, антибактериальным и противоопухолевым действием. Олигомеры хитозана (п = 10 - 30) используются в качестве носителей для транспортировки белков, ДНК и лекарственных соединений через мембрану. Кроме того, ХОС способны индуцировать защитные реакции при взаимодействии с растениями (являются сигнальными молекулами - элиситорами), а также обладают ростстимулирующим действием. Применение этих соединений и их модифицированных аналогов для развития устойчивости растений к фитопатогенам и стимуляции роста является перспективным направлением в практике защиты растений. При этом ХОС не токсичны в высоких концентрациях и легко утилизируются, что делает их применение предпочтительным по сравнению с химическими соединениями. Основной проблемой при изучении функций олигосахаридов, а также практическом использовании является невозможность выделить их в интактном виде и достаточном количестве из биологического материала. Это диктует необходимость разработки новых подходов для получения этих соединений.

Одним из возможных подходов для получения этих соединений может явиться биологический синтез в клетках микроорганизмов, основанный на создании штаммов — продуцентов. Это определяется тем, что химический и ферментативный гидролиз полимеров хитина и хитозана малоэффективен для получения ХОС с необходимой степенью полимеризации и ацетилирования, так как в результате этого процесса получают смесь соединений с неопределенной структурой, что предполагает дальнейшие очистку и анализ структуры этих соединений. Из-за сложности и низкой эффективности химического синтеза, нецелесообразным является синтез олигосахаридов даже с небольшим количеством мономеров (Кочетков, 2000; Kiyota, 2006). Ферментативный синтез ХОС может обладать рядом преимуществ, в частности, он позволит решать такие проблемы синтеза ХОС как региоспецифичность (формирование олигомеров, состоящих только из одного типа аномеров) и стереоспецифичность (образование только p-l-4-гликозидной связи между мономерами), что позволяет получать соединения со строго определенной структурой. Для биосинтеза преимущественно используют ферменты гликозилтрансферазы, контролирующие образование гликозидной связи в результате трансгликозилирования, при этом донорами гликозильных остатков могут быть нуклеозиды и фосфаты Сахаров. Основные трудности при проведении ферментативного синтеза связаны со сложностью выделения ферментов из природных источников, поэтому гетерологичная экспрессия гликозилтрансфераз в клетках микроорганизмов может решить проблему биосинтеза ХОС.

В связи с этим основной целью нашей работы являлась разработка подходов для биосинтетического получения ХОС. У клубеньковых бактерий выявлена уникальная гликозилтрансфераза — N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, контролирующая синтез сигнальных молекул Nod-факторов (липохитоолигосахаридов). Этот фермент способен катализировать синтез ХОС, составляющих основу Nod-факторов и состоящих из определенного числа остатков Ы-ацетил-Э-глюкозамина (п = 4 - 6), что может быть удобным для получения соединений с необходимой степенью полимеризации. ХОС со степенью полимеризации не менее 5 и 6 остатков Ы-ацетил-Б-глюкозамина проявляют элиситорную и ростстимулирующую активность по отношению к растениям. Для синтеза таких соединений мы предложили использовать фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу двух видов ризобиальных бактерий - Rhizobium sp. GRH2 (симбионт акации) и Mesorhizobium loti (симбионт лядвенца). Rhizobium sp. GRH2 способен осуществлять синтез Nod-факторов, состоящих из шести остатков N-ацетилглюкозамина (наряду с пентамерами), a M. loti синтезирует строго пентамерные молекулы. Следовательно, ферменты этих бактерий контролируют синтез гекса- и пентамерных ХОС и могут быть использованы для биосинтетических целей.

У ризобий выявлен другой уникальный фермент хитоолигосахарид деацетилаза, способный деацетилировать олигомеры хитина по N-терминальному положению. Этим фермент отличается от деацетилазы грибов, которая деацетилирует все остатки аминосахаров. С помощью

хитоолигосахарид деацетилазы можно получить терминально N-деацетилированные ХОС, что позволило бы ковалентно присоединять к ним через аминогруппу различные соединения. Это свойство может быть использовано для облегчения переноса различных соединений (в частности, лекарственных веществ) в клетку за счет их конъюгации с олигомерами хитина. Известно, что олигомеры хитина с низкой степенью полимеризации (п < 10) свободно проникают через мембраны клеток по механизму облегченной диффузии. Это позволяет рассчитывать, что конъюгация олигомеров с лекарственными соединениями откроет путь для получения препаратов, эффективных при существенно более низких концентрациях. Синтез монодеацетилированных олигомеров хитина химическим путем практически невозможен из-за одинаковой химической активности аминогрупп в сахарных остатках, что не позволяет проконтролировать степень прохождения реакции деацетилирования. Именно поэтому перед нами стояла задача биосинтетического получения терминально N-деацетилированных олигомеров хитина.

Цель исследования. Целью диссертационной работы являлось изучение возможности биосинтеза гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов, а также их деацетилированных по терминальному положению производных с помощью уникальных ферментов ризобий.

Задачи работы:

1. Получение генетических конструкций, содержащих последовательности полноразмерных генов rtodC, кодирующих N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, двух видов ризобий Rhizobïum sp. GRH2 и Mesorhizobium loti 1803.

2. Оптимизация условий для эффективного синтеза олигомеров хитина, состоящих из пяти и шести остатков N-ацетилглюкозамина, в клетках Е. coli, трансформированных конструкциями для экспрессии N-ацетилглюкозаминилтрансферазы.

3. Разработка методов выделения и анализа синтезированных олигомеров хитина методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

4. Тестирование способности олигомеров хитина (п = 5, 6), полученных в процессе биосинтеза, индуцировать у растений защитные реакции (образование активных форм кислорода и экспрессию фермента фенилаланин-аммоний-лиазы).

5. Анализ способности хитоолигосахаридов индуцировать устойчивость у ячменя и томата к фитопатогенному грибу Fusarium culmorum.

6. Биосинтез терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы была определена нуклеотидная последовательность ранее не известного гена nodC Rhizobium sp. GRH2, а также получены конструкции, содержащие полноразмерный ген этого

вида ризобий, с помощью которых впервые биосинтетическим способом получены гексамерные ХОС (п = 6). В процессе биосинтеза получена тетра-N-ацетилхитопентаоза (деацетилированная по терминальному остатку хитопентаоза), которая может быть использована для конъюгации с биологически активными веществами.

Практическая ценность. Полученные в процессе работы штаммы-продуценты могут быть использованы для синтеза олигомеров хитина in vivo (в клетках микроорганизмов) из простых предшественников, либо для очистки экспрессируемых ферментов и синтеза олигомеров хитина in vitro. Разработанные подходы позволили осуществить синтез значительных количеств ХОС (до 100 мг на 1 л бактериальной культуры). Таким образом, полученные штаммы и разработанные подходы для синтеза ХОС позволят значительно снизить затраты на производство этих соединений.

Показана способность синтезированных ХОС вызывать активацию защитных систем растения, которая определяет развитие устойчивости растений к фитопатогенным грибам. Полученные соединения могут быть использованы в качестве эффективных элиситоров растений. По результатам работы получен патент РФ на изобретение.

Выполнение работы было поддержано: грантами РФФИ-офи 08-0412214, РФФИ 07-08-00700-а, РФФИ 12-08-01044-а, Министерством образования и науки (ГК № 16.512.11.2183, соглашение № 8056), грантом Президента РФ для поддержки научных школ (соглашение № 16.120.11.337-НШ), грантами Комитета по науке и высшей школе г. Санкт Петербурга за 2008, 2009,2010.

Апробация работы. По результатам работы были представлены доклады на 11 международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (РосХит 2012) в 2012 (г. Мурманск), 17 международном конгрессе по азотфиксации в 2011, г. Перт, Австралия, 10 международной конференции Европейского хитинового общества в 2011, г. Санкт-Петербург, 10 международной конференции РосХит 2010 (г. Нижний Новгород), школе-конференции «Агробиотехнология в корневых микробных системах» в рамках программы NOVA University Network в 2008 (г. Тюне, Дания), VIII Санкт-Петербургской Ассамблеи молодых ученых в 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ (4 статьи и 1 патент) и 5 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (234 источника). Работа изложена на 127 страницах, содержит 37 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы п методы исследования

Штаммы микроорганизмов. Для экспериментальной работы был использован штамм клубеньковых бактерий Mesorhizobium loti 1803 из Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии, WDCM 966

(http://www.arriam.spb.ru/rus/lablO/), а также штамм Rhizobiiim sp. GRH2, любезно предоставленный профессором Van Brüssel (Нидерланды). Для клонирования и синтеза белков использовали штамм Escherichia coli DH5a и С41. Заражение растений проводили штаммом фитопатогенного гриба Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. 333.

Условия культивирования микроорганизмов. Штаммы Е. coli культивировали в жидкой среде LB (Bertani, 1951) при 37'С. Для селекции устойчивых к антибиотикам бактерий добавляли ампициллин (100 мкг/мл), либо канамицин (50 мкг/мл). Штаммы ризобий культивировали в жидкой среде TY, содержащей необходимый антибиотик, при 28°С. Для получения грибного инокулята (суспензии макрокониднй) F. ciilmorum 333 выращивали в течение 7 суток при 25°С на агаризованной среде Чапека. Смыв гриба с чашек осуществляли стерильной водой. Полученный инокулят использовали для обработки растений, смешивая с вермикулитом в соотношении 1 л инокулята (при концентрации 3*105 конидий/мл) на 1 кг вермикулита.

Растительный материал. Исследования проводили на растениях томата Solanum licopersicum сорта Cormello и ячменя Hordeum distichum L. сорта Инари, также использовали линию гороха Pisuiп sativum L. Rondo из генетической коллекции ГНУ ВНИИСХМ.

Условия выращивания растений. Семена томата и ячменя стерилизовали 3-5 % раствором гипохлорнта, а семена гороха концентрированной серной кислотой в течение 5 минут. Промывали стерильной водой не менее 5 раз. Обработанные семена томата и гороха помещали на чашки, содержащие 1% водный агар, а семена ячменя - на чашки со стерильной фильтровальной бумагой, смоченной водой. Проращивали растения в темноте в течение 4-5 дней при комнатной температуре. Для изучения индукции защитных реакций проростки растений переносили в сосуды (объемом 30 мл) с агаризованной средой Jensen (Jensen, 1942). Обрабатывали корни проростков W6 М раствором ХОС (в объеме 100-200 мкл) в течение 8, 24 ч и 72 ч. На каждый вариант обработки брали не менее 5-10 растений. В экспериментах по изучению способности ХОС влиять на устойчивость растений к фитопатогенам проростки томата и ячменя обрабатывали 10"6 М раствором ХОС на чашках Петри в течение 24 ч. Переносили растения в сосуды с вермикулитом, смешанным с грибным инокулятом. В качестве контроля использовали проростки, обработанные стерильной водой. Растения выращивали в условиях теплицы при 16-часовом фотопериоде, температуре 2 ГС и относительной влажности 60 %.

Молекулярно-генетические процедуры. Для выделения ДНК ризобий использовали 1,5 мл ночной культуры. Осадок клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ, к суспензии добавляли 1 мкл раствора лизоцима (1 мг/мл) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Добавляли ДСН до конечной концентрации 0,5% и протеиназу К (0,05 мг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Дважды экстрагировали смесью фенол: хлороформ (1:1). ДНК осаждали двумя объемами этанола, промывали 70% этанолом. ДНК растворяли в 50 - 100 мкл деионизованной воды, ее концентрация составляла ~ 0,5 - 1 мкг/мл. Рестрикцию ДНК эндонуклеазами проводили в течение 3 - 24 ч при необходимой температуре. Плазмидную ДНК Е. coli выделяли из 3 мл ночной культуры клеток методом щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979). Генетические конструкции вводили в клетки Е. coli DH5a или С41 методом химической трансформации (Inoue et al„ 1990). Выделение РНК из корней растений осуществляли с помощью реагента PureZol (Bio-Rad, США).

Генетические конструкции, использованные в работе.

Наименование конструкции Назначение

pRSETb-A/7/îOi/C Экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803

pRSETb-Ä//GRH2/7o</C Экспрессия фермента N- ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2

pRS ШЪ-MlnodB Экспрессия фермента хитоолишсахарид деацетилазы M. loti 1803

pRSETb-M/wo</C-KD Экспрессия каталитического домена фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803

pUC19 -MlnodC Синтез пента-1Ч-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозашшилтрансферазы M. loti 1803

pK18 -Mlnodß Синтез тетра-1Ч-ацетилхитопентаозы совместно ферментами хитоолигосахарид деацетилазой и N-ацетилглюкозаминилтрансферазой M. loti 1803

pUC 19-RhGKH2nodC Синтез гекса-М-ацетилхитогексаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозашшилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2

pUC 19-MlnodC-Vx-MlnodB Синтез тетра-М-ацетилхитопентаозы с помощью ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы M. loti 1803

pUC 19-MlnodC-3'UTR-Pr-MInodB Синтез тетра-Ы-ацетилхитопентаозы с помощью ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы M. loti 1803

Синтез и выделение хитоолигосахарндов (ХОС). Для синтеза ХОС культивировали бактерии Е. coli, несущие необходимую плазмиду, в 100 - 300 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мг/л) при температуре 37°С до достижения культурой оптической плотности А600 = 0,6, затем индуцировали экспрессию белка при добавлении к среде 0,5 мМ ИПТГ. После культивирования в течение 3 ч в присутствии ИПТГ при 37°С, добавляли в среду в качестве источника углерода глицерол до конечной концентрации 4 г/л, а также субстрат для синтеза ХОС - N-ацетилглюкозамин в концентрации 0,1 г/л. Синтез проводили в течение 24 - 48 часов при температуре 35°С. После завершения процедуры синтеза ХОС клетки Е. coli осаждали при 3000 об/мин (центрифуга Beckman J2-21, США) в течение 20 минут при 4°С, ресуспендировали осадок клеток в 2 мл воды и кипятили суспензию в течение 30 минут. Водную фазу, содержащую ХОС, адсорбировали на активированном угле (Fluka, Германия). Смыв ХОС с угля проводили 50% этиловым спиртом. После выпаривания этанола осадок, содержащий ХОС, ресуспендировали в необходимом объеме воды и использовали для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Разделение ХОС методом ВЭЖХ. Разделение ХОС проводили на колонке с аминофазой SUPELCOSIL™ LC-NH2 (Sigma, США) в системе ацетонитрил : вода (70% : 30%), скорость элюции составляла 1 мл/мин. Идентификацию полученных соединений проводили посредством сравнения времени выхода пика анализируемого вещества со временем выхода пиков, соответствующих стандартам - пента-Ы-ацетилхитопентаозе и гекса-Ы-аиетилхитогексаозе (Medacshop, Германия).

Анализ синтезированных ХОС с помощью метода масс-спектрометрии. Масс-спектрометрический анализ проб проводили на ионно-циклотронном масс-спектрометре Varian 902-MS MALDI Mass Spectrometer (ICR FTMS) со сверхпроводящим магнитом 9.4 Тесла. Десорбцию и ионизацию пробы осуществляли с помощью третьей гармоники Nd:YAG лазера (355 нм). Образцы растворяли в 2 мкл 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты, смешивали с насыщенным раствором матрицы - 0,2 М 2,5-дигидрокси-бензойной кислоты (ДГБК), наносили на мишень и сушили на воздухе. Образцы облучали сериями лазерных импульсов (по 5 импульсов в серии). Определение молекулярной массы пробы производили методом внешней калибровки с использованием стандартных образцов.

Анализ экспрессии генов Pal. Оценку уровня экспрессии генов Pal проводили на матрице кДНК методом ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией и определением продуктов реакции в реальном времени. Для синтеза кДНК использовали суммарную РНК, выделенную из корней томата и гороха, собранных на разных сроках после обработки ХОС. Синтез проводили в объеме 20 мкл смеси, содержащей 2,5 мкг РНК, 10 мМ трис-HCl, pH 8.8, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ дНТФ, 100 пМ олиго(ёТ18), 1 ед. ингибитора рибонуклеаз и 200 ед. обратной транскриптазы M-MLV в течение 1 ч при 42°С. Для анализа экспрессии генов на матрице кДНК использовали набор SYBR GREEN (Bio-Rad, США). Реакцию проводили по методике, предложенной

производителем. Результаты оценки экспрессии генов были представлены как отношение экспрессии изучаемого гена к экспрессии гена убиквитина (Ubiq).

Оценка интенсивности заражения растений. Оценку интенсивности заражения растений фитопатогенными грибами проводили по методу, предложенному Танским и соавт. (Танский и др., 2002). Развитие признаков заболеваемости растений оценивали для томата на 11 и 17 сутки, для ячменя на 8 и 17 сутки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование и анализ последовательностей генов nodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.

Нуклеотидная последовательность гена nodC Rhizobium sp. GRH2 была неизвестна, поэтому на первом этапе исследований был амплифицирован фрагмент гена nodC (-1000 п. о.) с помощью вырожденных праймеров, подобранных к наиболее консервативным участкам гена. Далее с помощью ПЦР, основанного на использовании адапторов Vectorette и специфичных праймеров, были амплифицированы последовательности 5' - и 3' - концов гена nodC и проведен их анализ. Таким образом, нам удалось клонировать полноразмерный ген nodC Rhizobium sp. GRH2. Сравнительный анализ последовательности выявленного гена с известными ранее последовательностями генов nodC других штаммов ризобий показал наиболее высокий процент сходства с геном nodC Sinorhizobium meliloti GVPV12 (76% сходства), Sinorhizobium sp. BR816 (75,6%), Rhizobium sp. N33 (74%), M. loti MAFF303099 (70%). В процессе исследований нами также была определена последовательность гена nodC для использованного в работе штамма M loti 1803. Полноразмерные гены nodC двух видов ризобий были использованы для получения генетических конструкций в векторах pRSETb и pUC19 (pRSETb-RhGRHlnodC, pRSETb-MlnodC, p\JC\9-RhGRH2nodC, pUC19-MlnodC). Кроме того, нами была получена конструкция, содержащая фрагмент гена nodC M. loti 1803 (около 800 п.о.), кодирующий только каталитический домен фермента без гидрофобных сигнального пептида и трансмембранного доменов (pRSETb-MlnodC-KD). Полученные конструкции были использованы для экспрессии белков в бактериях E.coli DH5a и С41, а также для синтеза ХОС в культивируемых клетках бактерий.

2. Гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминнлтрансферазы, кодируемого геном ttodC, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.

При экспрессии в К coli генетических конструкций в векторе pRSETb, содержащих полноразмерные гены nodC Rhizobium sp. GRH2 и M loti 1803, наблюдали синтез белков с молекулярной массой около 50 кДа (Рис. 1 а, б), что соответствовало ожидаемой массе для фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Уровень экспрессии белков при этом был

достаточно высоким. Максимальное содержание рекомбинантных белков, выделенных из клеток, культивируемых в присутствии ИПТГ, наблюдали в нерастворимой фракции, полученной при осаждении при 4000 об/мин (фракция 1 на Рис. 1 а, б). Обычно при такой скорости центрифугирования осаждаются особые белковые образования - тельца включения. Некоторое количество рекомбинантного белка присутствовало также в нерастворимой фракции, полученной при осаждении при 16000 об/мин (фракция 2 на Рис. 1 а, б). В этой фракции преимущественно находятся мембранные белки. В растворимой фракции (цитозоль) рекомбинантные белки выявлены не были (фракция 3 на Рис. 1 а, б).

Рисунок 1. Выявление белков NodC Rhizobium sp. GRH2 (а) и M. loti (б) в клетках Е. coli С41, трансформированных конструкциями pRSETb-RhGRH2no(IC и pRSETb-MlnodC.

Разделение белков проводили методом ДСН-элекгрофореза в ПААГ с окраской красителем Кумасси (верхняя панель) или переносили на нитроцеллюлозу и гибридизовали с анти-His антителами (нижняя панель). Обозначения: контроль -нерастворимая фракция клеток, полученная при осаждении при 16000 об/мин (клетки трансформированы вектором pRSETb без вставки); 1, 2, 3 - клетки трансформированы pRSETb-7?/îGRH2«oc/C и pRSETb-M«odC; 1 - нерастворимая фракция, полученная при 4000 об/мин; 2 - нерастворимая фракция, полученная при 16000 об/мин; 3 - растворимая фракция, полученная при 16000 об/мин. «—» -экспрессия белка в отсутствии ИПТГ; «+» - экспрессия белка в присутствии ИПТГ. Стрелками обозначен экспрессируемый белок NodC.

Уровень экспрессии синтезирующихся белков в клетках Е. coli был также оценен при использовании генетических конструкций pUC19-MlnodC и pUC19-

ЛЮЯН2пос1С, полученных в другом типе вектора (Рис. 2 а, б). Так как в составе экспрессируемых рекомбинантных белков, полученных при этом, отсутствовала ро1у-Н^ последовательность, мы проводили сравнение с белками, полученными с помощью конструкций в рЯБЕТЬ. Было показано, что уровень синтеза рекомбинантного белка при использовании конструкций в векторе рис 19 был ниже по сравнению с тем, который наблюдался при экспрессии белка с помощью вектора рЯБЕТЬ. Однако при этом белок не образовывал нерастворимых образований телец включения и был сосредоточен, главным образом, в мембранной фракции, полученной при 16000 об/мин (фракция 3 на Рис. 2 а, б). Кроме того, было показано, что конструкции в векторе риС 19 не являются строго ИПТГ-индуцибельными.

а

не

1 2 3

pRSETb-nodc pUC19 -nodC p(JC19-nodC б

4000 Об/мин 4000 Об/мим 16000 об/мин

Î ■ i I

■ / .

». ^ «I. m ц/ S

fЩ - - 1Д ^ *"**•

25

f I

mé

I' 4 . É ■-*

35

1 2 3

pRSETb-nodC pUC19-r)odC pUC19 -nodC

4000 Об/мим 4000 об/мии ItûOO об/мин

.............^ '

Рисунок 2. Выявление белков NodC Rhizobium sp. GRH2 (а) и M. loti (б) в клетках E. coli DH5a, трансформированных pUC19-/f//GRH2norfC и pUC19-MlnodC.

Разделение белков проводили методом ДСН-электрофореза в ПААГ с окраской красителем Кумасси. Обозначения: 1 - нерастворимая фракция, полученная при осаждении при 4000 об/мин, выделенная из клеток Е. coli С41 при экспрессии в них конструкции pRSETb-/?/îGRH2«oc/C; 2 - нерастворимая фракция, полученная при 4000 об/мин, выделенная из клеток Е. coli DH5a при экспрессии в них конструкции pUC19-ß/iGRH2«ociC; 3 - нерастворимая фракция, полученная при 16000 об/мин, выделенная из клеток Е. coli DH5cc при экспрессии в них конструкции pUC19-RhGRH2nodC\ «-» - экспрессия белка в отсутствии ИПТГ; «+» - экспрессия белка в присутствии ИПТГ. Аналогичные обозначения представлены на рисунке 26 для конструкций, содержащих ген MlnodC. Стрелками обозначен экспрессируемый белок NodC.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оценен уровень экспрессии фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий M loti 1803 и Rhizobium sp. GRH2 в клетках Е. coli с помощью созданных нами генетических конструкций, полученных на основе векторов

pRSETb и pUC19. Наличие синтезируемого белка-фермента в клетках Е. coli, позволило нам перейти к следующему этапу исследований. Нами была оценена возможность биосинтеза ХОС в клетках бактерий с помощью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий.

Нами был также осуществлен синтез модифицированной формы фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляющей собой каталитический домен. При экспрессии в клетках Е. coli конструкции рRSKTb-MlnodC-KD нам удалось осуществить синтез укороченной формы фермента белка в растворимом виде, при этом уровень синтеза был достаточно высоким (Рис. 3 а, б). Было показано, что на синтез белка в растворимой форме влияла температура: при 28°С большая часть белка находилась в растворимом состоянии (Рис. 3 а). Таким образом, была получена в растворимом виде модифицированная форма фермента, которую использовали для синтеза ХОС in vitro.

116 66

45

осадок осадок

6000 16000 + - +

супер

16000 +

осадок осадок 6000 16000

т - +

супер 16000

37С

Рисунок 3. Выявление каталитического домена фермента N-ацетилглнжозаминилтрансферазы M. loti 1803 в клетках Е. coli С41 при температуре 28°С (а) и 37°С (б).

Веетерн-блот гибридизация с использованием анти-His антител. 1 -нерастворимая фракция, полученная при 4000 об/мин; 2 - нерастворимая фракция, полученная при 16000 об/мин; 3 — растворимая фракция, полученная при 16000 об/мин. «-» - экспрессия белка в отсутствии ИП'ГГ; «+» - экспрессия белка в присутствии 0,5 мМ ИПТГ.

3. Синтез ХОС в культуре клеток Е. coli с помощью конструкций, кодирующих полноразмерную форму фермента.

Для оценки ферментативной активности экспрессируемых в бактериях Е. coli белков была изучена их способность синтезировать ХОС. Для синтеза ХОС штаммы Е. coli, несущие конструкции с клонированным полноразмерным

геном посІС двух видов ризобий, инкубировали в среде с субстратом ЇЧ-ацетилглюкозамином. Для выявления синтезированных соединений использовали метод ВЭЖХ.

« а 2 1 А 3 \ 4 5 6 О б 2 _jU\JI 3

2 -1 6 8 JU 1! 14 16 18 20 22 24 26 28 3(1 2 4 6 8 10 12 14 16 IS 2<> 22 24 26 28 30

J iW pVC19-RhGHH2nodC 24 часа / .......і pUC19-/?/?GRH2noc/C 48 часов

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 9 2 -Г б Т Та' 12 І І ils ЇЙ' 20 22 24 26 2« 3ß

-< Дії Г ^ 2 3 JU_

0 2 4 ь 8 10 12 14 I« 18 20 22 24 26 28

і pUC19-MlnodC 24 часа У AVAvv J pRSETb-/W/noc/C 24 часа

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 ЗО 0 2 4 6 Я 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Рисунок 4. Хроматографическое разделение ХОС, полученных при синтезе в культуре клеток Е. coli DH5a, несущих плазмиды pUC19-Ä//GRH2/iö</C и p\JCl9-MlnodC (а, б, в) и Е. coli С41, несущих плазмиду pRSETb-M/«orfC(r).

В верхней части каждой панели (а-г) представлено разделение смеси ХОС от мономера до гексамера (обозначены цифрами), а и б - разделение продуктов реакции, полученных с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2, а - синтез в течение 24 ч, б - синтез в течение 48 ч; в и г - разделение продуктов реакции, полученных с помощью фермента NodC M loti 1803. Стрелками указаны пики, соответствующие пента-М-ацетилхитопентаозе и гекса-N-ацетилхитогексаозе.

Было показано, что уровень синтеза ХОС отличается при использовании разных конструкций. При культивировании бактерий Е. coli, несущих

плазмиду pUC 19-RhGRH2nodC со встроенным геном nodC Rhizobium sp. GRH2, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина были синтезированы соединения, время выхода которых при разделении соответствовало стандартам - гекса-Ы-ацетилхитогексаозе и пента-Ы-ацетилхитопентаозе (Рис. 4 а,б). После культивирования в течение 24 ч основным синтезируемым продуктом была пентаоза, а после 48 ч - гексаоза. Количество синтезируемых ХОС составляло до 20 - 30 мг/л бактериальной культуры. При культивировании бактерий Е. coli, несущих плазмиду p\JC\9-MlnodC со встроенным геном nodC M. loti 1803 была синтезирована пента->}-ацетилхитопентаоза (Рис. 4 в), количество которой в среднем составляло до 100 мг на 1 л. Таким образом, мы показали, что рекомбинантные ферменты обладают всеми свойствами нативных ферментов и могут быть использованы для синтеза олигомеров хитина (п = 5 и 6).

Напротив, при использовании культуры клеток Е. coli, содержащих плазмиду pRSETb-/MGRH2wi/C или pRSETb-AZ/ww/C, нам не удалось выявить сколько-нибудь значительного синтеза ХОС (Рис. 4 г). Вероятно, при использовании конструкций в векторе pRSETb уровень синтеза рекомбинантных белков-ферментов является высоким, но из-за формирования нерастворимых телец включения ферментативной активности они не проявляют.

При анализе каталитической активности модифицированной формы фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы также была выявлена способность синтезировать пента-М-ацетилхитопентаозу (данные не представлены).

4. Масс-спектрометрическии анализ ХОС, полученных биосинтетическим способом.

Для подтверждения того, что синтезированные в клетках Е. coli соединения являются гекса-1Ч-ацетилхитогексаозой и пента-N-ацетилхитопентаозой, нами был использован метод масс-спектрометрии. Проведенный анализ показал присутствие соединений с соотношением массы к заряду (m/z) равным 1259,5 и 1056,7, что соответствовало массе гекса-N-ацетилхитогексаозы и пента-Ы-ацетилхитопентаозы (Рис. 5).

5. Анализ элиситорнон активности ХОС.

Для анализа защитных реакций со стороны растений в ответ на обработку хитоолигосахаридами в качестве маркера был использован ген Pal, кодирующий фермент L-фенилаланин-аммоний-лиазу (ФАЛ, КФ 4.3.1.5). Анализ экспрессии данного гена был проведен на томате сорта Cormello, и горохе линии Rondo. Для проверки активности ХОС были выбраны растения томата, которые, согласно литературным данным, восприимчивы к влиянию гекса- и пентамерных олигомеров хитина. Для анализа были также использованы растения гороха, для которых гекса- и пентамерные олигомеры не являлись эффективными элиситорами (негативный контроль).

а

Рисунок 5. Масс-спектрометрический анализ соединений, полученных в результате синтеза и хроматографической очистки.

а - гекса-М-ацетилхитогексаоза; б - пента-М-ацетилхитопентаоза.

У томата известно шесть генов, кодирующих фермент ФАЛ, экспрессия двух из них Ра13 и Ра16, по литературным данным, наиболее сильно изменяется в ответ на обработку элиситорами. Действительно, в наших экспериментах было показано значительное усиление экспрессии генов Ра/З и Ра1б в ответ на обработку иента-Ы-ацетилхитопентаозой (Рис. 6 а). Максимальный уровень индукции экспрессии генов Ра13 и Ра/б наблюдали через 8 ч после обработки (увеличение экспрессии в 5 раз), хотя статистически достоверное увеличение было выявлено также через 24 ч после обработки.

При обработке растений гороха олигомерами хитина, полученными биосинтетическим способом, как мы и ожидали, не было выявлено статистически достоверного увеличения экспрессии генов Ра1 через 24 ч после обработки (Рис. 6 б). Для этих растений наиболее эффективным элиситорами являются олигомеры хитозана (п = 8 - 10). При использовании нами для сравнительного анализа коммерческого препарата олигомеров хитозана, уровни экспрессии генов Ра1 возрастали через 24 часа после обработки (приблизительно в 1,6-2 раза) (Рис. 6 в). Таким образом, анализ экспрессии гена, кодирующего фермент ФАЛ, показал, что обработка растений ХОС в концентрации 10"6 М приводит к активации защитных систем растения. Этот

гест явился специфичным для проверки влияния на растения ХОС различной структуры.

8ч 8ч 24ч 24ч 24ч 72ч 72ч 24ч 24ч т2ч 72ч

Рисунок 6. Анализ уровня экспрессии генов Pal методом ПЦР с детекцией в реальном времени при действии на растения ХОС в концентрации 10~6 М.

Контроль: обработка корней водой. Опыт: обработка растений пента-N-ацетилхитопентаозой (ХП) и октамером хитозана (ОХ), а - анализ экспрессии гена Ра! в корнях проростков томата, обработанных ХП. б и в - анализ экспрессии гена Pal в корнях проростков гороха, обработанных ХП и ОХ.

6. Анализ способности олигомеров хитина индуцировать устойчивость растений томата и ячменя к фитоиатогенному грибу ґ. сиітогит 333.

Нами был проведен анализ влияния предобработки растений ХОС, полученных биосинтетическим способом, на их устойчивость к заражению фитопатогенным грибом /\ сиЪпогит 333 (биологическая активность).

Проведенный анализ показал, что предварительная обработка растений 1 О"6 М ХОС позволяет значительно уменьшить проявление признаков заболеваемости фузариозом - поражение корней гнилями, подавление развития корневой системы. У растений томата, предварительно обработанных ХОС перед заражением фитопатогенным грибом Р. сиїтогит 333, признаки заболевания практически полностью отсутствовали (Рис. 7 а). У растений ячменя происходило значительное снижение интенсивности заражения (Рис. 7 б). Влияние ХОС, полученных биосинтетическим способом, было сравнимо с коммерческими аналогами.

Кроме того, в наших экспериментах было показано, что ХОС способны оказывать ростстимулирующее действие на растения. Длина корней проростков томата, которые были предварительно обработаны ХОС, превышала длину корней обработанных водой растений на 11 сутки в 4,6 (ХП) и 3,8 раз (ХГ) (данные не представлены). Длина корней проростков ячменя, обработанных ХП и ХГ, также превышала длину корней необработанных растений в 1,5 и 1,7 раза на 8 сутки после обработки.

О

_в

Fus/ХПК Fus/ХГ

Контроль Fusarium ■ Ячмень 8 дн

Fus/ХП Fus/ХПК

Ячмень 17 дн

Рисунок 7. Анализ признаков заболеваемости фузариозом у проростков томата сорта Cormello (а) и ячменя сорта Инари (б), предобработанных ХОС (10~б М) перед заражением F. culmorum 333.

Контроль - растения обработанные водой; Fusarium - растения, зараженные F.culmomm 333; Fus/ХП, Fus/ХГ - растения, зараженные F.culmorum 333 и предобработанные пента-Ы-ацетилхитопентаозой и гекса-М-ацетилхитогексаозой, полученными биосинтетическим способом; Fus/ХПК - растения, зараженные F.culmorum 333 и предобработанные коммерческой пента-К-ацетилхитопентаозой. Заболеваемость растений оценивали на 11 и 17 день (томат) и 8 и 17 день (ячмень) после обработки. На графиках представлены значения среднего, бары представляют стандартные отклонения среднего. * - варианты, достоверно отличающиеся от контроля (растений без обработки ХОС перед заражением фитопатогеном).

7. Биосинтез терминально N-деацетилированных ХОС с помощью двух ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы.

Важной задачей работы являлось получение терминально N-деацетилированных ХОС.

Для этого были получены штаммы Е. coli, экспрессирующие одновременно два фермента: N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (NodC) и хитоолигосахарид деацетилазу (NodB). В нашей работе были использованы две стратегии получения деацетилированных соединений: синтез с использованием отдельных конструкций для каждого гена (с помощью плазмид рК18, содержащей ген MlnodB и p(JC19, содержащей ген MlnodC), а также синтез ХОС с помощью конструкции p\JC\9-MlnodC-MlnodB, содержащей два гена в составе одной плазмиды.

1056,4

550 1000 1050

Масса'заряд

Рисунок 8. Масс-спектрометрический анализ соединений, полученных в результате синтеза в клетках Е. coli и хроматографической очистки бактериальных экстрактов.

Синтез ХОС осуществляли в культуре клеток штаммов Е. coli DH5a, содержащих конструкцию p\JC]9-MlnodC-3'UTR-Pr-MlnodB. Соединение с соотношением m/z, равному 1056, соответствует пента-Ы-ацетилхитопентаозе. Соединение с соотношением m/z, равному 996,4, соответствует тетра-N-ацетилхитопентаозе.

При культивировании бактерий Е. coli, содержащих плазмиду pUC19-MlnodC-MlnodB, были получены соединения, анализ которых методом масс-спектрометрии показал присутствие вещества с соотнощением массы к заряду (m/z) 1056.7 (ацетилированная пента-Ы-ацетилхитопентаоза), а также - с m/z, равному 996,4 (Рис. 8). Таким образом, нам впервые удалось получить с помощью ферментов M. loti терминально деацетилированную хитопентаозу (тетра-Ы-ацетилхитопентаозу), которую можно использовать для конъюгации с биологически активными веществами.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена последовательность гена nodC Rhizobium sp. GRH2, кодирующего фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу. Осуществлена эффективная гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий в клетках Е. coli с помощью генетических конструкций pRSETb-/?AGRH2«oí/C, pRSETb-MlnodC, pUC\9-RhGRH2nodC, pUC19-MlnodC, содержащих полноразмерные гены nodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.

2. Получена в растворимом виде в Е. coli редуцированная форма фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляющая собой каталитический домен, которая использована для синтеза олигомеров хитина in vitro.

3. С помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2 осуществлен синтез in vivo гекса-Ы-ацетилхитогексаозы и пента-N-ацетилхитопентаозы (до 20 - 30 мг на литр бактериальной культуры), высокий уровень синтеза пента-М-ацетилхитопентаозы (до 100 мг на 1 л) достигнут при использовании фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803.

4. Синтезирован терминально N-деацетилированный хитоолигосахарид -тетра-М-ацетилхитопентао'за - при культивировании штамма Е. coli, экспрессирующего одновременно два фермента M. loti N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и хитоолигосахарид деацетилазу.

5. Анализ изменений в уровне экспрессии генов Pal, кодирующих защитный фермент фенилаланин-аммоний-лиазу показал, что элиситорная активность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, сравнима с активностью коммерческих аналогов этих соединений.

6. Показана способность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, снижать заболеваемость фузариозом растений томата и ячменя.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Леппянен И.В., Артамонова Т.О., Лопатин С. А., Варламов В. П., Тихонович И. А., Долгих Е.А. Биосинтез гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов с помощью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобиальных бактерий // Экологическая генетика. 2013. T. XI. № 2.

2. Долгих Е.А., Леппянен И.В., Жуков В.А., Цыганов В.Е., Тихонович И.А. Экспрессия рекомбинантных белков-рецепторов SYM10 и SYM37 Pisum sativum, вовлеченных в связывание липохитоолигосахаридов Nod-факторов // Экологическая генетика. 2010. T. VIII. № 1. С. 16-23.

3.Dolgikh Е.А., Leppyanen I.V., Osipova M.A., Tikhonovich I.A. Role of signal exchange in control of Rhizobium - legume symbiosis specificity // Ecological genetics. 2008. V. 6. N 2. P. 27-34.

Статьи в других изданиях:

4. Леппянен И.В., Долгих Е.А.. Ферментативный синтез олигомеров хитина и изучение способности этих соединений стимулировать защитные реакции растений // Коллективная монография. Книга 2. Актуальные проблемы химии, биологии и медицины. Издательство «Научно-инновационный центр», г. Красноярск. 30 июня 2011 г. С. 149-175.

Патент:

5. Долгих Е.А., Долгих В.В., Леппянен И.В., Варламов В.П., Лопатин С.А., Тихонович И.А. Способ ферментативного получения пента-N-ацетилхитопентаозы // Патент на изобретение № 2460800 от 04.08.2010.

Тезисы:

1. Леппянен И.В., Лопатин С.А., Варламов В.П., Долгих Е.А. Биологический синтез терминально N-деацетилированных олигомеров хитина с помощью ферментов почвенных бактерий Rhizobium. Тезисы десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2012). г Мурманск, 25 - 30 июня 2012. С. 263-267.

2. Dolgikh Е.А., Leppyanen I.V., Lopatin S.A., Varlamov V.P., Tikhonovich I.A. Molecular approaches for synthesis of chitin oligosaccharides and their N-deacetylated derivatives, which are required in medicine, biotechnology and agriculture // In: Proceedings of 10(h International Conference of the European Chitin Society. St.-Petersburg. May 20-24, 2011. P. 59.

3.Долгих E.A., Леппянен И.В., Овцына A.O., Лопатин С.А., Варламов В.П., Тихонович И.А. Биологический синтез олигомеров хитина из простых предшественников с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы почвенных бактерий Rhizobium. Тезисы десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2010). г Нижний Новгород. 29 июня — 2 июля 2010. С. 263-267.

4. Leppyanen I.V., Ovtsyna А.О., Dolgikh Е.А. New approach to the synthesis of chitin olygomers - elisitors of plant defense reactions. Heterologous expression of

Mesorhizobium loti unique enzymes controlling this synthesis. In: Proceedings of the fourth Baltic sea region AB-RMS symposium and PhD-Course: novel technologies for management of the beneficial and harmful microbes in the root system. November 30 - December 5 2008. Tune, Denmark. P. 41.

5. Леппянен И.В. Гетерологичная экспрессия уникальных ферментов Rhizobium, контролирующих синтез хитиновых олигомеров - элиситоров защитных реакций растений. Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук. VIII Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов. Санкт-Петербург. 2008. С. 41.

Подписано в печать 26.04.2013г. Формат А5, цифровая печать Тираж 100 шт.

Отпечатано в ЦОП «Копировальный Центр Василеостровский» Россия, Санкт-Петербург, В.О., 6-линия, д.29. тел./факс: 328-61-84 e-mail: vs@copy.spb.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леппянен, Ирина Викторовна, Санкт-Петербург

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

04201 35781 6

ЛЕППЯНЕН Ирина Викторовна

БИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ОЛИГОМЕРОВ ХИТИНА И ИХ ТЕРМИНАЛЬНО ДЕАЦЕТИЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ С ПОМОЩЬЮ ФЕРМЕНТОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

Специальности: 03.02.03 - Микробиология

03.01.05 - Физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН

Тихонович Игорь Анатольевич кандидат биологических наук Долгих Елена Анатольевна

Санкт-Петербург 2013

На правах рукописи

Содержание

Условные обозначения и сокращения..............................................................................................5

Введение..............................................................................................................................................6

Глава 1. Обзор литературы..............................................................................................................14

Часть 1. Биосинтетический способ получения широкого спектра соединений в клетках микроорганизмов, растений и животных.......................................................................................14

1.1. Биологический синтез в клетках микроорганизмов......................................................14

1.2. Использование трансгенных растений для получения биологически активных соединений................................................................................................................................20

1.3. Особенности использования животных систем для синтеза биологически активных соединений...............................................................................................................22

Часть 2. Физиологическая роль олигосахаридов как универсальных сигнальных регуляторов межклеточного и межорганизменного взаимодействия.........................................25

2.1. Функции олигосахаридов, состоящих из остатков аминосахаров - Б-глюкозамина, О-галактозамина, Ы-ацетил-О-глюкозамина и ]Ч-ацетил-0-галактозамина.......................25

2.2. Биологическая активность хитоолигосахаридов...........................................................28

Часть 3. Основные способы получения хитоолигосахаридов.....................................................33

3.1. Химический и ферментативный гидролиз полимеров хитина и хитозана..................33

3.2. Химический синтез хитоолигосахаридов.......................................................................35

3.3. Ферментативный синтез хитоолигосахаридов...............................................................36

Заключение.......................................................................................................................................43

Глава 2. Материалы и методы.........................................................................................................45

2.1. Штаммы микроорганизмов......................................................................................................45

2.2. Условия культивирования микроорганизмов.........................................................................45

2.3. Растительный материал............................................................................................................45

2.4. Условия выращивания растений..............................................................................................46

2.5. Олигонуклеотиды, ферменты и векторы для клонирования.................................................46

2.6. Компьютерные и интернет-ресурсы........................................................................................47

2.7. Выделение ДНК бактерий........................................................................................................47

2.8. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные гены nodC двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803........................................................................48

2.9. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные гены nodC и nodBM. loti 1803...............................................................................................................................50

2.10. Определение нуклеотидных последовательностей генов...................................................53

2.11. Экспрессия белков в клетках Е. coli. Приготовление экстрактов клеток Е. coli и выделение различных субклеточных фракций..............................................................................53

2.12. Электрофорез белков в ПААГ и Вестерн-блот гибридизация............................................53

2.13. Синтез хитоолигосахаридов in vivo.......................................................................................54

2.14. Выделение хитоолигосахаридов............................................................................................54

2.15. Разделение хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)..................................................................................................................55

2.16. Анализ синтезированных хитоолигосахаридов с помощью метода масс-спектрометрии..................................................................................................................................55

2.17. Анализ деацетилированных олигомеров хитина методом тонкослойной хроматографии..................................................................................................................................55

2.18. Выделение РНК растений.......................................................................................................56

2.19. Анализ экспрессии генов Pal томата и гороха методом полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и определением продуктов реакции в реальном времени...........................................................................................................57

2.20. Определение содержания перекиси водорода в корнях растений......................................58

2.21. Анализ влияния олигомеров хитина на рост фитопатогенного гриба Fusarium culmorum 333.....................................................................................................................................58

2.22. Выделение ДНК растений......................................................................................................58

2.23. Оценка интенсивности заражения растений........................................................................59

2.24. Статистическая обработка результатов................................................................................59

Глава 3. Результаты и обсуждение.................................................................................................60

Часть 1. Ферментативный синтез гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов с помощью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобий..............................................................................60

3.1. Гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном nodC, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.........60

3.2. Синтез хитоолигосахаридов в культивируемых клетках Е. coli и анализ этих соединений................................................................................................................................71

Часть 2. Анализ биологической активности хитоолигосахаридов, полученных биосинтетическим способом...........................................................................................................78

3.3. Тестирование элиситорной активности хитоолигосахаридов....................................79

Часть 3. Биосинтез терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы. 90

3.4. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные последовательности генов nodC и nodB M. loti 1803............................................................91

3.5. Синтез деацетилированных по терминальному положению хитоолигосахаридов с помощью ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы M loti 1803..........................................................................................................95

3.6. Анализ синтезированных терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов методом тонкослойной хроматографии...........................................102

Заключение.....................................................................................................................................103

Выводы............................................................................................................................................107

Список литературы........................................................................................................................108

Благодарности.................................................................................................................................127

Условные обозначения и сокращения

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

дпи - дни после инокуляции

MC - масс-спектрометрия

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией ПЦР - полимеразная цепная реакция ХОС - хитоолигосахариды

CEBiP - рецепторная киназа, участвующая в связывании хитоолигосахаридов (от англ. -

Chitin Elicitor Binding Protein) CERK1 - рецепторная киназа, участвующая в связывании хитоолигосахаридов (от англ. -

Chitin Elicitor Receptor Kinase 1) LysM-РПК - LysM-содержащие рецептор-подобные киназы NodB - фермент хитоолигосахарид деацетилаза NodC - фермент N-ацетилглюкозаминилтрансфераза

Введение

Одной из приоритетных задач современной молекулярной микробиологии является получение высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, обладающих хозяйственно-полезными свойствами. Развитие этого направления исследования определяется необходимостью перехода от традиционного способа выделения штаммов микроорганизмов с полезными свойствами из природных источников к направленному получению в результате селекции, а также созданию с помощью методов генной инженерии микроорганизмов с новыми заданными свойствами. В результате таких исследований могут быть получены микроорганизмы - продуценты ценных биологически активных соединений (аминокислот, ферментов, гормонов, антибиотиков, витаминов и т.п.) для медицины, сельского хозяйства и различных промышленных технологий.

При селекции спонтанных или индуцированных (с помощью химического мутагенеза или ультрафиолетового облучения) мутантов проводят поиск, отбор и тестирование большого количества колоний на предмет наличия у них необходимых свойств, что позволяет выбрать микроорганизмы с высокой производительностью. Например, в известных работах с представителями рода Pénicillium с помощью селекции был примерно в тысячу раз увеличен выход пенициллина в сравнении с исходными дикими штаммами (Chain et al., 1940). Однако метод селекции занимает достаточно много времени. Более того, при этом можно рассчитывать только на усовершенствование уже существующих свойств штамма, а не на изменение его возможностей.

С развитием методов генной инженерии целенаправленное изменение свойств живых организмов заметно ускорилось и расширилось. Разработка новых подходов дала возможность использовать прокариотические и эукариотические организмы, как «биологические фабрики» для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусных антигенов и др. Микроорганизмы стали использоваться как естественные «биореакторы», в которых экспрессируются новые или измененные гены, которые никогда не могли бы быть получены методами мутагенеза или скрещивания.

Основные проблемы при использовании молекулярных методов связаны с низкой эффективностью экспрессии экзогенной ДНК в клетках микроорганизмов, а также с преждевременной деградацией продуктов трансляции. Наконец, серьезной проблемой является токсичность синтезируемых белков или продуктов их реакции для микроорганизмов из-за нарушения метаболизма. Разработка новых векторных конструкций для переноса ДНК, совершенствование методов трансформации и ко-трансформации клеток, оптимизация условий синтеза чужеродных белков в клетках

имеют большое значение как для фундаментальных исследований по молекулярной микробиологии и биохимии, так и для практического применения. Именно на решение этих проблем были направлены наши исследования.

В последние годы значительно вырос интерес к изучению, а также практическому использованию олигосахаридов (как конъюгированных, так и свободных) (Aam et al., 2010; Mourya et al., 2011). Это связано с особой ролью олигосахаридов в процессах межклеточного взаимодействия, в основе которых лежит узнавание этих соединений поверхностными рецепторами клеток у различных организмов (Gagneux, Varki, 1999). Конъюгированные олигосахариды входят в состав гликопротеинов и гликолипидов, углеводные части которых являются специфическими лигандами для многих рецепторов. Свободные олигосахариды также вовлечены в лиганд-рецепторные взаимодействия, выполняя во многих случаях функцию сигнальных молекул, регулирующих различные биохимические, иммунологические и морфогенетические процессы. Основной проблемой при изучении функций олигосахаридов является невозможность выделить их в интактном виде и достаточном количестве из биологического материала.

Отдельную группу составляют олигосахариды, которые содержат в своем составе аминосахара D-глюкозамин, D-галактозамин, а также И-ацетил-В-глюкозамин и N-ацетил-Б-галактозамин. Эти соединения выполняют ряд важных функций у различных организмов. У человека конъюгированные с гликопротеинами и гликолипидами мембран эритроцитов олигосахариды, состоящие из остатков N-ацетил-О-галактозамина, определяют специфичность групп крови (АВО система) (Yamamoto et al, 1990). Олигосахариды грудного молока, содержащие в своем составе М-ацетил-О-глюкозамин, действуют как ростовые факторы для Bifidobacterium bifidum и, вместе с тем, участвуют в подавлении развития патогенной микрофлоры Shigella sp., Helicobacter jejuni, Vibrio cholerae, Salmonella sp. (подавление адгезии бактерий в результате лиганд - рецепторных взаимодействий) (Kunz et al., 2000).

У представителей высших растений семейства бобовых (сем. Leguminosae) олигосахариды, состоящие из трех - шести остатков N-ацетил-О-глюкозамина и декорированные жирной кислотой на невосстанавливающем конце молекулы (Nod-факторы), выполняют роль сигнальных молекул. Олигосахаридная часть Nod-фактора представляет собой хитоолигосахарид, поскольку содержит в своем составе подобно полимеру хитину только остатки Ы-ацетил-О-глюкозамина. Синтезируемые симбиотическими бактериями Nod-факторы способны стимулировать развитие специализированных органов - азотфиксирующих корневых клубеньков, действуя в наномолярных концентрациях (Spaink et al., 1991). В результате связывания этих

соединений со специфичными рецепторами растений активируется целый комплекс регуляторных белков и гормонов, что приводит к органогенезу клубеньков. Возможность активации внеклеточными олигосахаридами рецепторов самого растения указывает на наличие у них сходных по структуре эндогенных соединений, влияющих на морфогенез и дифференцировку тканей. Поиск таких олигосахаридов в растении в настоящее время продолжается.

Олигосахариды, состоящие из остатков 1М-ацетил-0-глюкозамина, играют важную роль в эмбриогенезе позвоночных животных (Semino et al., 1996; Bakkers et al., 1997). В геноме пресноводных рыб Danio rerio семейства карповых Cyprinidae, а также в геноме мышей были выявлены близкие гомологи гена DG42 Xenopus, контролирующего синтез олигосахаридов, состоящих из остатков N-ацетил-О-глюкозамина (Ryan, Farmer, 1991; Semino et al., 1996; Kamst et al., 1999). Было показано, что выявленные гены влияли на раннее развитие эмбрионов (Semino, Allende, 2000). Сравнительный анализ показал гомологию между белком DG42 Xenopus и белком-ферментом ризобий NodC (N-ацетилглюкозаминилтрансферазой, контролирующей синтез хитоолигосахаридных молекул Nod-факторов) (Sargent, Dawid, 1983; Geremia et al., 1994). Более того, введение гена ризобий, вовлеченного в синтез хитоолигосахаридов, в эмбрионы рыб и мышей оказывало значительное влияние на их развитие, что подтвердило предположение об участии хитоолигосахаридов в контроле эмбриогенеза у позвоночных животных (Bakkers et al., 1997; Semino et al., 1998).

У низших растений, грибов и беспозвоночных животных (в основном, членистоногих - насекомых и ракообразных) выявлены как олигосахариды, так и полисахариды, состоящие из остатков аминосахаров. Полисахариды представлены, главным образом, такими соединениями как хитин и его деацетилированное производное хитозан, мономерными единицами которых являются Ы-ацетил-О-глюкозамин и D-глюкозамин, соответственно связанными между собой р-1,4-гликозидными связями. Эти соединения выполняют опорные и механические функции в организмах низших растений, грибов и беспозвоночных животных. Под влиянием целого комплекса ферментов полимеры хитин и хитозан могут быть расщеплены до низкомолекулярных производных, включая хитоолигосахариды (олигомеры хитина и хитозана).

Хитоолигосахариды обладают рядом уникальных свойств, оказывая специфичное воздействие на бактерии, высшие растения, человека и позвоночных животных. Известно, что некоторые хитоолигосахариды обладают противовоспалительным, антибактериальным и противоопухолевым действием (Harish Prashanth, Tharanathan, 2005; Xu et al., 2008; Simunek et al., 2010; Venkatesan et al., 2010). Олигомеры хитозана (n = 10 -

30) используются в качестве носителей для транспортировки белков, ДНК и лекарственных соединений через мембрану (Thanou et al., 2002; Koping-Hoggard et al., 2004). Кроме того, хитоолигосахариды способны индуцировать защитные реакции при взаимодействии с растениями (являются сигнальными молекулами - элиситорами) (Albersheim et al., 1983; Khan et al., 2003), а также обладают ростстимулирующим действием по отношению ко многим растениям. Применение этих соединений и их модифицированных аналогов для развития устойчивости растений к фитопатогенам и стимуляции роста является перспективным направлением в практике защиты растений. При этом хитоолигосахариды не токсичны в высоких концентрациях и легко утилизируются, что делает их применение предпочтительным по сравнению с химическими соединениями. Известно, что элиситорная и ростстимулирующая активность хитоолигосахаридов по отношению к растениям проявляется при степени полимеризации молекул не менее 5-6 остатков N-ацетил-О-глюкозамина.

Необходимость изучения олигосахаридов, состоящих из остатков аминосахаров, а также широкие возможности для практического использования этих соединений, оп�