Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря

Рысакова, Кира Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря"

На правах рукописи

Рысакова Кира Сергеевна

Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 п1^ " 2223

Петрозаводск 2008

003452432

Работа выполнена в лаборатории биохимии и технологии Федерального Государственного унитарного предприятия Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н. М. Книповича (ФГУППИНРО)

Научный кандидат химических наук

руководитель: НОВИКОВ ВИТАЛИЙ ЮРЬЕВИЧ

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор НЕМОВА НИНА НИКОЛАЕВНА доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

Защита состоится «26» ноября 2008 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.087.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ГОУВПО «Карельский государственный педагогический университет» (185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17, ауд. 113).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельского государственного педагогического университета.

Автореферат разослан октября 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Л ЬЛ^ШЦЛ^")

кандидат педагогических наук, доцент N ' / А. И. Малкиель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В пищеварительных органах всех живых организмов присутствует широкий набор гидролитических ферментов. Огромный интерес к изучению физиологических функций этих ферментов и механизмов гидролиза объясняется их значительной ролью в обмене веществ у животных.

К настоящему времени данные, имеющиеся в литературе, в большей степени посвящены протеолитическим ферментам рыб и практически не касаются хитиназ беспозвоночных (Сидоров, 1980; Немова, 1996; Высоцкая, 1999; Кузьмина, 2005). Вместе с тем моллюски, ракообразные и иглокожие являются одними из наиболее древних и многочисленных в видовом отношении животных. Изучение биохимических принципов, обеспечивающих их жизнедеятельность, облегчает понимание биохимических процессов у организмов высших таксонов (Мухин, 1999).

Важным направлением использования хитинолитических ферментов в медицине является получение различных неогликоконъюгатов, применяемых в медицине для ингибирования процесса метастазирова-ния при онкопатологии. Производные хитина, такие как хитоолигоса-хариды и олигосахариды хитозана, получаемые с помощью хитинолитических ферментов, также обладают многими важными и полезными для здоровья свойствами, проявляют противоопухолевое действие, улучшают функции кишечника (последнее объясняется способностью стимулировать рост Bifidobacteria— полезной кишечной бактерии, которая помогает справляться со многими болезнями желудочно-кишечного тракта (Журавлева, 2004).

Кроме того, в последние десятилетия широкое распространение получил микробиологический метод защиты растений — использование препаратов на основе Bacillus thuringiensis, выделяющей хитино-литические ферменты. Перенос гена хитиназы в клетки растений позволил сделать их носителями собственного инсектицида (Журавлева, 2004).

Пищеварительные органы различных морских беспозвоночных, и, особенно, гепатопанкреас ракообразных являются уникальным сырьем для получения ферментов. Этот вопрос является предметом детального изучения огромного количества научных работ (Jeuniaux, 1963; Сахаров, 1992; Руденская, 1995; Климова, 1999). В ПИНРО также проводятся работы по исследованию протеолитической и хитинолитической активности гепатопанкреаса камчатского краба (Мухин, 1999; Новиков, 2007).

Цель и задачи исследования. Цель данной работы — исследование хитинолитической активности в пищеварительных органах некоторых беспозвоночных Баренцева моря и выделение фракций белков, ответственных за проявление этого вида активности.

Реализация данной цели потребовала решения следующих задач:

1. Провести сравнительное изучение хитиназной активности у морских беспозвоночных (камчатского краба, серрипеса, трубача, ку-кумарии, морской звезды).

2. Изучить динамику ферментативного гидролиза хитина и хитозана под действием ФП (ферментного препарата) из гепатопанкреаса камчатского краба при различных условиях проведения анализа.

3. Сравнить кинетические характеристики гидролиза хитина /хитозана под действием ФП из гепатопанкреаса камчатского краба.

4. Исследовать природу хитинолитических и протеолитических ферментов и охарактеризовать их молекулярные массы (ММ). Научная новизна. Впервые установлены основные характеристики хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба. Определены оптимальные условия гидролиза хитина. Проведено сравнительное исследование хитинолитической активности у морских беспозвоночных различных таксономических групп.

Установлено, что наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Причем эндохитиназная активность выше у фермента, выделенного из морской звезды, а экзохитиназная— из краба. Показано отсутствие экзохитозаназной активности у камчатского краба. Доказано, что за хитинолитическую и протеолитическую активности ФП из гепатопанкреаса камчатского краба отвечают различные ферменты. Подтверждена различная природа экзо- и эндохитиназ ФП. Впервые также установлена молекулярная масса (50,9 кД) хитиназы, выделенной из гепатопанкреаса камчатского краба. Практическое значение работы.

Результаты настоящих исследований и сделанные на их основании выводы расширяют представление о ферментативных системах беспозвоночных и позволяют лучше понять их физиологические особенности.

Получение хитиназ из отходов переработки морских гидробио-нтов может способствовать решению проблемы комплексного использования водных ресурсов.

Обнаружение хитинолитических ферментов в гепатопанкреасе камчатского краба, позволит расширить области его применения, что повысит рентабельность использования отходов крабового промысла.

Определенные в ходе исследования оптимальные условия гидролиза хитина, могут быть использованы для совершенствования процесса получения олигомеров и мономера хитина — N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), имеющих практическую ценность. При ферментативном гидролизе хитина, по сравнению с химическим гидролизом, происходит образование GlcNAc и не наблюдается выход D-глюкозамина (GlcN), что позволяет получать чистый ацетилирован-ный моносахарид. Мягкие условия ферментативного гидролиза и его избирательность обеспечивают получение целевых и побочных продуктов реакции, соответствующих требованиям экологической безопасности производства.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Российских, региональных и международных конференциях: Пятой региональной науч. студенческой конф. «Естественнонаучные проблемы Арктического региона», Мурманск, 2004; Между-нар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2004; 2-ой науч. конф. с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2007; XXV юбилейной конф. молодых ученых ММБИ РАН, Мурманск 2007; Межд. науч.— техн. конференциях «Наука и образование», Мурманск, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008; Межд. науч. — практ. конференции «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья», Мурманск, 2008; 10th Int. Chemical and Biological Engineering Conf. — CHEMPOR 2008, Braga, Portugal, 2008; Девятой Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Ставрополь, 2008; Всеросс. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 90-летию со дня рождения К. Г. Константинова, Мурманск, 2008 г.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах, включает 4 таблицы и 33 рисунка. Работа состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы, включающего 184 публикации, из них 105 иностранных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, включающих 7 статей, из которых 4 — в реферируемых источниках.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим наставникам: Новикову В. Ю. и Мухину В. А., а также всей лаборатории биохимии и технологии ПИНРО за помощь в организации и проведении исследований. Особая признательность Карасевой Т. А. и Жилину А. Ю. за поддержку и ценные замечания.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная работа проводилась автором в лаборатории биохимии и технологии ПИНРО в период с 2001 по 2008 год. Был проанализирован ферментный препарат, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба, выловленного в Баренцевом море в декабре 2006 года. Общий объем полученного ФП составил 2 кг из 20 кг гепатопанкреаса. Ферментные препараты, выделенные из пищеварительных органов других анализируемых в данной работе беспозвоночных, выловленных в Баренцевом море с 1999 по 2000 г., были выделены из 15-20 особей, выход порошкообразного ФП составлял около 100 г для группы особей каждого вида.

При проведении анализов проводилось 3-5 параллельных измерений. Приводимые в таблицах и рисунках данные представляют собой средние величины определяемых значений. Статистическую обработку результатов измерений проводили общепринятыми методами со статистической достоверностью результатов р < 0,05 % (Корн, 1978).

Объектом исследования служили ферментные препараты из пищеварительных органов беспозвоночных гидробионтов.

В качестве материала для исследования в работе использовали пищеварительные органы следующих морских беспозвоночных: ракообразных (камчатский краб Paralithodes camtschaticus Tilesius, 1815), моллюсков (трубач Buccinum undatum (Linnaeus, 1758), серрипес Ser-ripes groenlandicus (Bruguiere, 1789)), иглокожих (кукумария Cu-cumaria frondosa (Gunnerus, 1770), морская звезда Asterias rubens (Linnaeus, 1758)).

Для получения ферментных препаратов сырые органы пищеварения вышеперечисленных беспозвоночных обрабатывали ацетоном и н-бутанолом (для удаления липидов и низкомолекулярных соединений) и затем сушили в сублимационной сушилке (Сахаров, 1985).

Хитозан готовили многократным деацетилированием хитина в 50 % NaOH при 95-100 °С (No, 1997; Kurita, 2001).

Коллоидный хитин был приготовлен из креветочного хитина путем переосаждения в холодной концентрированной НС1 (Decleire, 1996). Коллоидный хитозан был получен переосаждением из 1 М раствора НС1.

Эндохитиназную активность оценивали по уменьшению оптического поглощения суспензии коллоидного хитина после инкубации (Declaire, 1996).

Экзохитиназную активность рассчитывали по выходу образующегося при гидролизе хитина GlcNAc, содержание которого определяли в растворе гидролизата по реакции с 4-диметиламинобензальдегидом (Decleire, 1996).

Гликолитическую активность определяли по образованию в растворе после инкубации восстанавливающих Сахаров, измерение концентрации которых осуществляли по реакции с гексацианоферратом (III) K3[Fe (CN)6] (Imoto, 1971).

Протеолитическую активность оценивали методом Ансона по гидролизу 1 %-ного раствора казеината натрия (Алексеенко, 1968).

Для хроматографического определения продуктов гидролиза хитина и хитозана использовали метод обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Обращено-фазная хроматография выполнялась с использованием колонки Supelcosil™ LC-18 (30 х 0,4 мм, 5 мкм) (SUPELCO, США). Для регистрации продуктов, содержащих свободные аминогруппы, проводили их дериватизацию с помощью ортофталевого альдегида (ОРА) (High-performance liquid chromatographic...., 1979).

Определение степени деацетилирования (СД) основано на обратном алкалиметрическом потенциометрическом титровании НС1, связанного с аминогруппами хитозана, в солянокислом растворе (Нудьга, 1973).

Фракционирование сульфатом аммония проводилось по общеизвестной методике (Скоупс, 1985). При фракционировании методом гель-фильтрации в качестве неподвижной фазы в колонке использовали Sephadex G-100 super fine, элюент— физиологический раствор. Ультрафильтрацию проводили с использованием ультрафильтрационной половолоконной установки УП-1 (НПП «Биоспектр», г. Санкт-Петербург) с набором половолоконных модулей с разными ММ пределами задержания: 5, 15, 50 и 100 кД.

Статистическая обработка результатов исследований выполнялась с использованием программ EXCEL на персональном компьютере PC IBM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Хитинолитическая активность ферментов морских беспозвоночных

Обнаружена экзо- и эндохитиназная активность в ацетоновых порошках (All), полученных из пищеварительных органов анализируемых беспозвоночных. Наибольшая хитинолитическая активность наблюдается в ФП, полученных из камчатского краба и морской звезды (таблица 1).

Таблица 1

Эндохитиназная и экзохитиназная активность ферментных препаратов, полученных из пищеварительных органов морских

гидробионтов

Название гидробионтов Метод получения ферментных препаратов Хитинолитическая активность

Aendo, % Аехо-мг GlcNAc/мл Лехс/ Aendu

Серрипес Sernpes gro-entandtcus АП 0,84x0,04 0,20+0,01 0,24

Трубач Buccinum undatum АП 0,41+0,03 0,35+0,02 0,86

Кукумария Cucumaria frondosa АП 0,35+0,02 0,08+0,01 0,22

Морская звезца Asterias rubens АП 14,54±0,32 0,09+0,01 0,006

Краб Paralithodes cam-tschcticus АП 4,32+0,08 1,83±0,02 0,42

Краб Paralithodes cam-tschaticus ФП 9,28+0,09 3,87±0,03 0,4

Примечание. АП — ацетоновый порошок; ФП — ферментный препарат из гепатопанхреаса краба, полученный по технологии, разработанной в лаборатории биохимии и технологии (Мухин, 2002).

Значительное различие в соотношении экзо- и эндохитиназной активности ферментов краба и морской звезды объясняется, по-видимому, тем, что краб использует продукты гидролиза хитина для построения собственного панциря, поэтому гидролиз обеспечивает получения легко усваиваемого С1сКАс. Морская звезда во время пищеварительного акта, вероятно, лишь разрушает хитин, что обеспечивает ей доступность белковой составляющей своих жертв.

Повышенная хитиназная активность в пищеварительных органах камчатского краба и морской звезды, по сравнению с другими беспозвоночными, вероятно, объясняется преобладанием в их рационе животных с хитиновым покровом. Такое увеличение хитиназной активности в пищеварительных органах необходимо этим двум видам хищных беспозвоночных для полного переваривания своих жертв и для лучшего усвоения питательных веществ.

Установленные нами различия эндо- и экзохитиназной активностей в образцах краба, полученных разными способами, свидетельствуют о том, что при втором способе получения ФП является более очищенным и следовательно, проявляет большую активность. Вместе

с тем, получение его нетехнологично, из-за низкого выхода продукта, поэтому в дальнейшем в работе применялся ацетоновый порошок, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба.

Таким образом, показано присутствие хитиназной активности в пищеварительных органах морских беспозвоночных различных таксонов. Решающую роль на соотношение эндо- и экзохитиназной активности, по-видимому, играет трофическая специализация организмов.

Глава 2. Свойства хитинолнтических ферментов краба

Зависимость эндо- и экзохитиназной активности от продолжительности инкубации

Данная ферментативная реакция относится к реакциям первого порядка, так как проходит в условиях избытка фермента. Определены константы реакции первого порядка, они составили для эндохитиназ-ной активности к = 0.0337 мин"1, для экзохитиназной активности к = 0.0978 мин'1. График зависимости хитиназной активности от времени инкубации имел обычную для ферментативных реакций форму (рис. 1). Кривые эндо- и экзохитиназной активности от времени инкубации практически совпадали.

1, МИН

Рис. 1. Зависимость эндо- и экзохитиназной активности фермента от времени инкубации (1, мин): 1 — эвдохитиназная активность АеП(Ь, %; 2 — исзохитиназная активность Аех0, мг С1сКтАс/мл

Зависимость эндо- и экзохитиназной активности от температуры

Установлено, что оптимальной температурой, при которой проявлялась эндо- и экзохитиназная активность была температура 36,5— 37,0°С (рис. 2). При этом наблюдаемые оптимумы эндо- и экзохитиназной активности совпадали. Скорость дезактивации экзохитиназной активности была больше, чем таковая для эндохитиназной активности.

I °С

Рис. 2. Зависимость активности фермента (А, %) от температуры инкубации (1, °С): 1 — эндохитиназная активность А,^,,, %; 2 — экзохитиназная активность А^хо» мг С1сЫАс/мл

Зависимость эндо- и экзохитиназной активности от рН

На основе сравнения зависимостей эндо- и экзохитиназной активности от рН, доказано что за эти два вида активности отвечают различные ферменты. Для эндохитиназной активности оптимум рН близок к 6,0, а для экзохитиназной активности сдвинут в кислую область — около 4,5 (рис. 3). Обнаруженное отличие указывает на различную природу экзо- и эндохитиназ. Наблюдается также совпадение оптимумов при рН 8,5 в обоих случаев.

РН

Рис. 3. Зависимость активности фермента (А, %) от рН раствора хитина: 1 — эндохитиназная активность Ая,^, %; 2 — экзохитиназная активность Аех0,

мг С1сКАс/мл

Зависимость эндо- и экзохитиназной активности от концентрации ФП

Наблюдаемое различие формы кривых, отображающих зависимости эндо- и экзохитиназной активности от концентрации ферментного препарата, подтверждает предположение о существовании различных ферментов, отвечающих за эти два вида специфической активности (рис. 4).

Сф, мг/мл

Рис. 4. Зависимость активности фермента от его концентрации при 50 °С (Сф, мг/мл): 1 — эндохитиназная активность Аеп(1о, %; 2 — экзохитиназная активность Аем, мг 01сМЛс/мл

Обнаружение хитозаназной активности

В ходе исследований была обнаружена зависимость экзохитиназ-ной активности ферментов от степени ацетилирования в образцах хитина и хитозана (таблица 2, рис. 5). Из этих данных следует, что экзо-хитиназная активность фермента, определенная по выходу С1сМАс, увеличивается с увеличением степени ацетилирования субстрата. Такое повышение активности объясняется увеличением количества аце-тилированных звеньев в молекуле хитина/хитозана.

Таблица 2

Зависимость экзохитииазной активности ферментов от степени ацетилирования в образцах хитина и хитозана

Показатель Анализируемый субстрат

Хитин Хиюзан СД 64,78 % Хитозан СД 83,5 %

Степень ацетилирования 85,0±3,5 35,2+2,7 17,2±2,5

Экзохитиназная активность, мг 01сЫАс/мл 2,8±0,3 1,32±0,3 0,097+.0,3

Если активность фермента по отношению к хитину/хитозану не зависит от СА полисахарида, тогда следует ожидать линейной зависимости активности от количества ацетильных групп в молекуле полимера. Наблюдалось отклонение от линейности. При СА меньше 35 % ферментативная экзохитиназная активность начинает уменьшаться быстрее с уменьшением СА. По-видимому, активность фермента по отношению к хитозану (хитозаназная активность) меньше его хити-назной активности.

100

Рис. 5. Зависимость экзохитииазной активности ферментного препарата (Аехо,мг 01сМЛс/мл) от степени ацетилирования субстрата (СА, %)

При высоком содержании ацетилированных звеньев в молекуле хитина также отмечается некоторое отклонение от ожидаемой линейной зависимости Аех0 от СА. По-видимому, оптимально пригодная для ферментативного расщепления конфигурация субстрата возникает при средней СА хитина и хитозана около 40-50 %.

Для оценки возможности использования ферментов из гепатопан-креаса краба для модификации хитозана проведена обработка двух образцов С88-1 и СБ8-2 и определено изменение ММ и СА.

Из полученных данных (таблица 3) следует, что в ходе ферментативного гидролиза хитозана наблюдается уменьшение ММ, что свидетельствует о наличии хитиназной/хитозаназной активности в данном ФП. С уменьшением СА относительное изменение ММ и степени полимеризации уменьшается. Статистическая обработка результатов показала, что различие ММ в исходном и ферментированном хитозане с СА = 35,2 % (С8Б-1) является достоверным.

Таблица 3

ММ, степень полимеризации и СА образцов хитозана с различной начальной СА до н после ферментативного гидролиза

Состояние хитозана СББ-!

ММ, кД СП СА, % ММ, кД СП СА, %

Исходный Ферментированный 329±44 274+52 1873 1561 35,2±1,1 30,6±2,6 280±46 241±58 1694 1435 17,2±2,5 12,2+2,4

Примечание. ММ— молекулярная масса, кД; СП— степень полимеризации; СА — степень ацетилирования, %.

Для образцов хитозана с СА = 17,2 % (С8Б-2) различие ММ статистически недостоверно. Это подтверждает предыдущий вывод о том, что фермент имеет меньшую хитозаназную активность.

Отмечается статистически достоверное уменьшение СА обоих образцов хитозана, что подтверждает наличие деацетилазной активности комплекса ферментов гепатопанкреаса камчатского краба.

Глава 3. Обнаружение гликолитической активности в ФП из гепатопанкреаса камчатского краба

Кинетика образования восстанавливающих Сахаров и СШАс

В отличие от кинетики образования 01сМАс, полученной при изучении экзохитиназной активности, мы не наблюдаем достижения предельного значения, которое может быть обусловлено инактивацией фермента. В случае восстанавливающих углеводов, как видно из

рис. 6, линейность сохраняется до 6 часов и, по-видимому, при более длительных временах инкубации.

t, МИН

Рис. 6. Зависимость концентрации суммы восстанавливающих углеводов

и GlcNAc от продолжительности ферментативного гидролиза хитина 1 — восстанавливающие углеводы, СФП = 0,055 г/л; 2 — то же, Сфп = 0,011 г/л;

3 —GlcNAc, Сфп=2г/л

Так как данная ферментативная реакция идет в условиях избытка субстрата, то она относится к реакциям нулевого порядка. Константы реакции будут равны: 0,0128 моль/л*с— для восстанавливающих углеводов, СфП = 0,055 г/л; 0,0053 моль/л*с — то же с СФП = 0,011 г/л.

Одна из причин наблюдаемого различия кинетических кривых образования суммы восстанавливающих углеводов и GlcNAc заключается, по-видимому, в разнице концентраций ФП, взятых для гидролиза.

При большой концентрации ФП (2 г/л) начинает заметно проявляться реакция гидролиза фермента, катализируемая самим ферментом. В результате концентрация фермента снижается, что приводит к уменьшению скорости образования продуктов гидролиза хитина (GlcNAc). Сравнение кинетических кривых образования суммы восстанавливающих углеводов и GlcNAc показывает, что, несмотря на значительное превышение концентрации ФП во втором случае, концентрация восстанавливающих углеводов выше концентрации GlcNAc. Очевидно, кроме GlcNAc при гидролизе хитина могут образовываться и другие продукты (небольшие количества GlcN и хито-олигосахариды), которые имеют функциональные группы на концах молекул.

Оптимальные значения рН для экзохитиназной и общей гликоли-тической активности совпадают в области рН 4.5. Для экзохитиназной

активности наблюдался также второй максимум при рН 8, который отсутствовал в случае гликолитической активности (рис. 7).

Влияние рН на ферментную активность

рН

Рис. 7. Зависимость от рН среды: 1 — сумма восстанавливающих углеводов, Сфп = 0,055 г/л; 2 — ОкЫАс, СФп = 2 г/л; 3 — протеолитическая активность,

1,5 % казеинат 1ч'а; 4 — протеолитическая активность, 1 % гемоглобин

Оптимальное значение рН для протеолитической активности ФП (рН 8.5) не совпадает с максимумом, полученным для гликолитической активности, но, по-видимому, близко ко второму максимуму эк-зохитиназной активности. Полученные данные подтверждают различную природу гликолитической и протеолитической активностей.

Совпадение максимумов при рН 8-8.5, вероятно, может рассматриваться как косвенный факт в пользу предположения, что протеоли-тические ферменты могут проявлять слабую хитинолитическую активность. Это предположение не является общепризнанным, но в ряде работ отмечается хитинолитическая активность некоторых ферментов, имеющих иную субстратную специфичность. Например, известно, что липазы могут эффективно гидролизовать хитозан (Ильина, 2002).

Влияние температуры на ферментную активность

Определены оптимальные температуры гликолитической (45 °С) и экзохитиназной активностей (35 °С), которые смещены в сторону меньших температур по сравнению с оптимумом протеолитической активности (55 °С) (рис. 8).

с 16

£ 1.2

1 0.8

1 — сумма восстанавливающих углеводов, СФП = 0,055 г/л; 2 — С1сМЛс, Сфп = 2 г/л; 3 — протеолитическая активность, 1,5 % казеинат 4 — протеолитическая активность, 1 % гемоглобин

Несовпадение температурных оптимумов подтверждает вывод о том, что за гликолитическую и протеолитическую активность отвечают разные ферменты, содержащиеся в ФП из гепатопанкреаса камчатского краба. Полученные данные позволяют предполагать, что глико-литическая активность обусловлена несколькими ферментами, имеющими различную зависимость от температуры инкубации и температурные оптимумы. Поэтому, суммарный оптимум оказался смещенным относительно температурного оптимума одного из ферментов, отвечающего за экзохитиназную активность.

Влияние концентрации реагентов на ферментную активность

1. Влияние концентрации фермента

Зависимости гликолитической и экзохитиназной активности от концентрации ФП носят одинаковый характер: участок быстрого увеличения концентрации углеводов (около 0.5 г/л ФП) и участок более медленного нарастания концентрации продуктов гидролиза (рис. 9) Наблюдаемая зависимость объясняется конкурированием реакции ФП с субстратом и реакцией гидролиза самого ФП, как белкового субстрата. На первом участке происходит преимущественно катализ гидроли-

Рис. 8. Зависимость от температуры инкубации:

за хитина. На втором концентрация катализатора снижается, что приводит к уменьшению скорости гидролиза хитина.

СФП, г/л

Рис. 9. Зависимость концентрации суммы восстанавливающих углеводов и

ОсМЛс при ферментативном гидролизе хитина от концентрации ФП.

1 — сумма восстанавливающих углеводов; 2 — в^Ас; 3 — восстанавливающие углеводы без вкКАс

Если предположить, что восстанавливающие углеводы представлены только асЫАс и САсТ\, из результатов, приведенных на рис. 9 можно оценить содержание С1сК' по разнице между зависимостями 1 и 2 (кривая 3). Так как известно, что хитиназы и хитозаназы расщепляют только гликозидные связи хитина (или хитозана), такой большой избыток восстанавливающих углеводов не может быть объяснен образованием только мономеров.

Таким образом, полученные результаты подтверждают предположение об образовании олигосахаридов хитина.

2. Влияние концентрации субстрата (хитина)

Эксперимент по влиянию концентрации субстрата показал, что при концентрациях хитина более 2 г/л наблюдается насыщение на кривой.

Таким образом, эксперименты проводились в области избытка субстрата и все кинетические характеристики обусловлены только концентрацией ферментного препарата и характеризуют именно свойства данного ФП.

Глава 4. Хроматографическое определение О-глюкозамина

С целью оценки количества и возможных олигомеров в продуктах гидролиза хитина и хитозанов было применено хроматографическое определение продуктов, имеющих свободные аминогруппы. Время выхода хроматографического пика в1сЫ составляет 9,6 мин. Ферментативному гидролизу были подвергнуты образцы хитина (СД = 12 %) и хитозанов с СД 67, 82 и 95 %. ВЭЖХ анализ не показал заметного увеличения в1сЫ в гидролизатах.

Этот результат позволяет утверждать, что ФП проявляет только хитиназную активность, так как не вызывал отщепления отдельных 01сЫ молекул. Следовательно в ФП присутствуют ферменты, относящиеся к группе хитиназ (ЕС 3.2.1.14). В частности, к этой группе относятся р-М-ацетилгексозаминидазы (ЕС 3.2.1.52), расщепляющие оли-гомеры С1сЫАс. Отсутствие в продуктах в1сЫ может служить подтверждением отсутствия процесса деацетилирования С1сМАс (И-ацетилглюкозамин деацетилаза ЕС 3.5.1.33).

Таким образом, полученные результаты показали, что ФП приводит к образованию олигомеров хитина и хитозана с низкой СД. То есть, ФП проявляет явно выраженную хитиназную активность. Полученные в настоящей работе данные подтвердили наличие экзохитиназ-ной активности (образование ИсМАс), эндохитиназной (и возможно эндохитозаназной) активности и отсутствие хитозаназной (в частности, экзохиотозаназной) и Ы-ацетилглюкозамин деацетилазной активности.

Глава 5. Выделение фракций ферментов с максимальной активностью

Было произведено фракционирование фермента из гепатопанкреа-са камчатского краба сульфатом аммония, ультраф}щьтрацией, гель-фильтрацией и препаративной эксклюзионной ВЭЖХ.

Фракционирование сульфатом аммония

Сульфатом аммония осаждали 2 %-ный раствор ФП. При насыщении раствора сульфата аммония 40-60 % осаждается больше фермента, чем при насыщении 60-80 %, 10-40 %. Выход белка на данной стадии очистки составил 18,4 %. В каждой фракции была определена протеолитическая активность на субстрате казеинат натрия. Максимальной протеолитической активностью обладают фракции 12-14, которым соответствуют степени насыщения раствора 60-70 %. Каждая фракция, полученная осаждением сульфатом аммония была охаракте-

ризована также с помощью зксклюзионной ВЭЖХ с целью связать максимум активности с фракцией белков определенной ММ.

Сравнение хроматограмм позволило сделать вывод, о том что за протеолитическую активность отвечают, по-видимому, белки с ММ, лежащими в области 18—24 и 70-120 кД.

Фракционирование методом гель-фильтрации В отличие от фракционирования по растворимости (с сульфатом аммония) гель-хроматография позволяет получать разделение по молекулярным массам белков. Был и получены различные объемы элюи-рования фракций, проявляющих хитинолитическую и протеолитическую активности. Это подтверждает различную природу ферментов, ответственных за эти два вида активности.

Фракционирование методом ультрафильтрации Раствор ФП с начальной концентрацией 1 % фракционировали с помощью ультрафильтрации на мембранах с пределами задержания ММ 100, 50, 15 и 5 кД. В результате разделения из анализируемого раствора ФП были получены 4 фракции, содержащие белки с кажущимися ММ: >100, 50-100, 15-50, 5-15 кД. Выход белка для первой фракции (>100 кД) составил 77 %, второй (50-100 кД)— 9,4 %, третьей (15-50 кД) — 11,5 %, четвертой (5-15 кД) — 2,1 %. В каждой фракции определяли протеолитическую и экзохитиназную активности, а также ММР белков.

Из данных, приведенных на рис. 10, видно, что максимальную протеолитическую активность имели белки с ММ 50 -100 кД. Экзохи-тиназная активность была распределена между фракциями с ММ 50100 и более 100 кД, причем наибольшая активность наблюдалась во фракции с ММ больше 100 кД.

800

£ 600

| 400

I 20О

Фракции, кД

Рис. 10. Распределение экзохитиназной и протеолитической активности в зависимости от ММ белка: 1 — протеолитическая активность: 2 — экзохитиказная активность

> 100 50-100 15-50 5-15

Эти данные согласуются с опубликованными результатами: большинство выделенных исследователями хроматографически чистых протеолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба имеют ММ в диапазоне 22-66 кД (ватаги, 1988; Литвин, 1993; Выделение и свойства..., 1995), хитиназы членистоногих имеют молекулярную массу 40-90 кД и 120 кД (Журавлева, 2004). Полученное распределение активностей по фракциям позволило утверждать, что протеолитическую и экзохитиназную активность определяют ферменты с разными ММ. Каждая фракция, полученная после ультрафильтрации, была разделена методом эксклюзионной ВЭЖХ.

Из полученных хроматограмм следует, что ультрафильтрация не дала четкого разделения белков по молекулярным массам: хромато-граммы каждой фракции перекрываются. Полученное обогащение каждой фракции белками с разными ММ позволило заметить преобладание протеолитической и экзохитиназной активностей в разных фракциях. Более четкое разделение по ММ было получено путем препаративной ВЭЖХ.

Фракционирование методом эксклюзионной ВЭЖХ В ходе исследования, было выделено четыре фракции (1 — V эл: 9,90 мл, 2-10,73 мл, 3-11,39 мл, 4-12,75 мл). Для первой фракции выход белка составил 12 %, для второй — 21 %, для третьей — 9%, для четвертой— 14%. В каждой фракции определяли протеолитическую и экзохитиназную активности.

Судя по полученным данным, совершенно очевидно, что максимальная хитиназная активность сосредоточена во фракциях с большей ММ по сравнению с протеазами (таблица 4).

Таблица 4

Распределения хитиназной и протеазной активности ферментого препарата по фракциям с разной ММ

Фракция Диапазон ММ ММ, кД А „о, мг АсИсЫ/г Арт1, мкмоль Туг/г

1 63,8-40,5 50,9 0.339 33,155

2 29,4-18,7 23,4 0,0292 119,9

3 15,5-9,9 13,0 0,154 83,236

4 <4,0 <4,0 0,434 0,9883

Наблюдаемое повышение экзохитиназной активности в 4-й фракции, по-видимому, объясняется преобладанием в последней аминокислот, а именно триптофана, который вступает в реакцию с

4-диметиламинобенз-альдегидом с образованием окрашенного комплекса (Дэвени, 1976).

Таким образом необходимо комплексное использование различных способов фракционирования для последовательной очистки препарата, начиная с разделения белковых фракций ультрафильтрацией или осаждением сульфатом и заканчивая тонкой очисткой методом жидкостной хроматографии и, возможно, электрофокусированием.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено наличие экзо- и эндохитиназной активности в пищеварительных органах камчатского краба, серрипеса, трубача, ку-кумарии, морской звезды. Наибольшей хитиназной активностью обладают ФП, выделенные из камчатского краба и морской звезды, что объясняется их пищевыми предпочтениями. Причем эндо-хитиназная активность выше у ФП, выделенного из морской звезды, а экзохитиназная — из краба, что связано с полнотой использования продуктов гидролиза для потребностей организма у этих двух видов беспозвоночных.

2. При сравнении зависимостей экзохитиназной активности ФП из гепатопанкреаса камчатского краба (Ас):о, мг С1с^тАс/мл) от СА субстрата показано, что хитиназная активность фермента, возрастает с увеличением СА.

3. Установлены оптимальные условия гидролиза хитина на основе полученных зависимостей: гликолитической, эндо- и экзохитиназной активности ФП от продолжительности инкубации, концентрации ФП, температуры и рН реакционной среды. Оптимальные значения соответствуют температуре 36,5-37 °С; рН среды 4,5 для экзохитиназной активности и рН 6,0 для эндохитиназной активности и степени ацетилирования субстрата (хитина / хитозана) 4050 %.

4. Сравнение положения температурных и рН-оптимумов позволяет считать, что за хитинолитическую и протеолитическую активности отвечают различные ферменты. Эти же данные, подтверждаются разными видами фракционирования: максимальные пики этих двух активностей соответствуют фракциям белков с разными ММ. Причем, белки отвечающие за хитиназную активность имеют большую ММ (50,9 кД) по сравнению с протеазами (23,4 кД).

кинетики образования суммы восстанавливающих Сахаров, реакция идет в условиях избытка субстрата и относится к реакциям нулевого порядка.

6. Выявлено отсутствие М-ацетилглюкозамин деацетилазной и экзо-хитозаназной активности. Это обусловлено тем, что в продуктах гидролиза хитина и хитозанов С1сМ не был обнаружен.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Новиков, В. Ю. Изучение активности ферментных препаратов из морских гидробионтов Северного промыслового бассейна / В. Ю. Новиков, В. А. Мухин, К. С. Рысакова // Наука и образование— 2003: Матер. Всеросс. науч.-техн. конф.— Мурманск: МГТУ, 2003, —Ч. 4, —С. 160-161.

2. Новиков, В. Ю. Хитинолитическая активность ферментов морских беспозвоночных / В. Ю. Новиков, К. С. Рысакова // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: Матер. Междунар. конф.— Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2004. — С. 103, 212 англ.

3. Новиков, В. Ю. Хитинолитическая активность ферментов морских беспозвоночных / В. Ю. Новиков, К. С. Рысакова // Естественнонаучные проблемы Арктического региона: Тез. докл. Пятой региональной науч. студенческой конф. — Мурманск: Полярный геофизический институт КНЦ РАН, 2004. — С. 33-34.

4. Мухин, В. А. Влияние способа сушки на свойства ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithod.es сат1зсИа(1'сиз / В. А. Мухин, В. Ю. Новиков, К. С. Рысакова // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2005. — № 8. — С. 2931.

5. Рысакова, К. С. Свойства хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodгs сшЫьскаист / К. С. Рысакова, С. И. Овчинникова, В. Ю. Новиков, В. А. Мухин // Наука и образование— 2005: Матер. Междунар. науч.-техн. конф. — Мурманск: МГТУ, 2005. — Ч. 6. — С. 151-154.

6. Новиков, В. Ю. Обнаружение хитинолитической активности в пищеварительных органах гидробионтов Баренцева моря / В. Ю. Новиков, К. С. Рысакова, В. А. Мухин, С. И. Овчинникова // Вестник МГТУ. — 2006. — Т. 9, № 5. — С. 786-791.

7. Рысакова, К. С. Специфическая ферментативная активность тканей беспозвоночных северного бассейна / К. С. Рысакова, В. Ю. Новиков, Е. М. Серафимчик // Матер, междунар. науч.-техн. конф. «Наука и образование— 2006».— Мурманск: МГТУ, 2006. — С. 647-654.

8. Рысакова, К. С. Изменение свойств ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба РагаШкойеь ссиЫхскайсж в зависимости от способа сушки / К. С. Рысакова, В. А. Мухин, В.Ю. Новиков//Научная жизнь. —2007,—№ 1. —С. 16-21.

9. Новиков, В. Ю. Свойства хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба Рага1йкос1с$ са/Шхскаисш / В. Ю. Новиков, В. А. Мухин, К. С. Рысакова // Прикл. биохимия и микробиология. — 2007. — Т. 43, № 2. — С. 178-183.

10. Мухин, В. А. Влияние способа сушки на свойства ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба РагаИ^юйеъ сагШзскайст / В. А. Мухин, К. С. Рысакова, И. И. Лыжов,

B.Ю.Новиков // Рыбное хозяйство. — 2007,— №3.— С. 103105.

11. Новиков, В. Ю. Исследование фракционного состава ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба Paralhhod.es сат-¡зсИайсиз / В. Ю. Новиков, К. С. Рысакова // Матер. XXV юбилейной конф. молодых ученых Мурманского морского биологического института. — Мурманск: Изд-во ММБИ КНЦ РАН, 2007. —

C. 182-183.

12. Рысакова, К. С. Фракционирование ферментного препарата гепатопанкреаса камчатского краба РагаШ}юс1е$ сапйьсИаПсиь / К. С. Рысакова, В. Ю. Новиков // Матер, междунар. науч.-техн. конф. «Наука и образование— 2007».— Мурманск: МГТУ,

2007, —С. 821-824.

13. Рысакова, К. С. Выделение фракций с максимальной протео- и гликолитической активностью из ферментного препарата гепатопанкреаса камчатского краба РагаИ^юЛез сатксИаИсиз / К. С. Рысакова, В. Ю. Новиков, В. А. Мухин // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: Матер. 2-й науч. конф. с участием стран СНГ. — Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. — С. 130.

14. Рысакова, К. С. Изучение фракционного состава ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба Paralhhod.cs сат-¡ъсИаист методом ультрафильтрации / К. С. Рысакова, В. Ю. Новиков // Матер, междунар. науч.-техн. конф. «Наука и образование — 2008». — Мурманск: МГТУ, 2008. — С. 637-640.

15. Рысакова, К. С. Гликолитическая активность ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба РагаШИос1ез сат-1зсИайсш I К. С., Рысакова, В. Ю. Новиков, В. А. Мухин, Е. М. Серафимчик // Прикл. биохимия и микробиология.—

2008. — Т. 44, № 3. — С. 281-286.

16. Рысакова, К. С. Очистка ферментного препарата из гепатопан-креаса камчатского краба Parahthodes camtschaticus методом ультрафильтрации / К. С. Рысакова, В. Ю. Новиков // Матер, ме-ждунар. науч.-практ. конф. «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья». — Мурманск: МГТУ, 2008. — С. 49-52.

17. Mukhin, V. A. Enzymatic agent from red king crab hepatopancreas and its ap plications / V. A. Mukhin, V. Yu. Novikov, K. S. Rysakova // Book of Abstracts of the 10th Int. Chemical and Biological Engineering Conf.— CHEMPOR 2008,— Braga, Portugal: Universidade do Minho, Departamento de Engenharia Biologica, 2008. — P. 549-550.

18. Mukhin, V. A. Enzymatic agent from red king crab hepatopancreas and its applications / V. A. Mukhin, V. Yu. Novikov, K. S. Rysakova // Proc. of the 10th Int. Chemical and Biological Engineering Conf.— CHEMPOR 2008. — Braga, Portugal: Universidade do Minho, Departamento de Engenharia Biologica, 2008. — P. 1302-1307.

19. Рысакова, К. С. Изучение распределения хитиназной и протеаз-ной активности ферментого препарата из гепатопанкреаса камчатского краба по молекулярно-массовым фракциям / К. С. Рысакова, В. Ю. Новиков // Матер. Девятой Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Ставрополь, 13-17 октября 2008. — М: Изд-во ВНИРО, 2008. — С. 224226.

20. Рысакова К. С. Сравнение различных способов фракционирования ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба Paraliíhodes camtschaticus // Матер. Всеросс. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 90-летию со дня рождения К.Г.Константинова. Мурманск, 30-31 октября 2008.— Мурманск: Изд-во ПИНРО, 2008. — С. 156-160.

Подписано в печать 23 10 2008 Формат 60x84 '/|6 Бумага офсетная Гарнитура Тайме Печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ 187

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Карельский государственный педагогический университет» Республика Карелия 185680, г Петрозаводск, ул Пушкинская, 17 Печатный цех КГПУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рысакова, Кира Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Строение, свойства и применение хитина и его производных.

1. 2. Пути деградации хитина в природе.

1.3. Гидролитические ферменты беспозвоночных.

1.3.1. Протеолитические ферменты.

1.3.2. Характеристика и действие хитинолитических ферментов.

1.3.3. Хитозаназа.

1.3.4. Хитиндеацетилаза.

1.4. Ферменты других классов, гидролизующие хитин и хитозан.

1.5. Распространенность хитиназ в природе.

1.6. Хитиназы ракообразных.

1.7. Изменение сезонной активности хитиназ у различных видов беспозвоночных.

1.8. Физико-химические свойства хитиназ.

1.9. Преимущество ферментативного гидролиза хитина и хитозана.

1.10. Применение хитинолитических ферментов.

1.10.1 Применение хитинолитических ферментов в защите растений.

1.10.2 Применение хитинолитических ферментов в медицине.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2.1. Получение ферментного препарата.

2.2.2. Приготовление субстратов.

2.2.3. Методики определения хитиназной активности.

2.2.4. Определение протеолитической активности.

2.2.5. Определение гликолитической активности.

2.2.5.1 Методика определения восстанавливающих Сахаров после ферментативного гидролиза полисахаридов (хитина, хитозана).

2.2.6. Хроматографическое определение D-глюкозамина.

2.2.7. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана.

2.2.8. Определение степени деацетилирования хитозана.

2.2.9 Определение степени деацетилирования хитина и хитозана методом инфракрасной спектроскопии.

2.10. Проведение фракционирования.

2.11. Определение химической чистоты.

2.12. Математическая и статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Хитинолитическая активность ферментов морских беспозвоночных

3.2. Свойства хитинолитических ферментов краба.

3.2.1. Зависимости экзо- и эндохитиназной активности от продолжительности инкубации.

3.2.2. Зависимость экзо- и эндохитиназной активности от температуры

3.2.3. Зависимость экзо- и эндохитиназной активности от рН.

3.2.4. зависимость а экзо- и эндохитиназной активности от концентрации ферментного препарата.

3.3. Обнаружение хитозаназной и деацетилазной активности, влияние степени ацетилирования субстрата.

3.4. Обнаружение гликолитической активности в ферментном препарате из гепатопанкреаса камчатского краба.

3.4.1. Методика определения восстанавливающих Сахаров.

3.4.2. Кинетика образования суммы восстанавливающих Сахаров и ацетнлглюкозамина.

3.4.3 Влияние рН на ферментную активность.

3.4.4. Влияние температуры на ферментную активность.

3.4.5. Влияние концентрации реагентов на степень ферментативного гидролиза.

3.5. Хроматографическое определение D-глюкозамина.

3.6. Выделение фракций ферментов, обладающих максимальной активностью.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря"

К настоящему времени, данные, имеющиеся в литературе, в большей степени посвящены ферментам рыб и практически не касаются хитиназ беспозвоночных (Сидоров, 1980; Немова, 1996; Высоцкая, 1999; Кузьмина, 2005). Вместе с тем моллюски, ракообразные и иглокожие являются одними из наиболее древних и многочисленных в видовом отношении животных. Изучение биохимических принципов, обеспечивающих их жизнедеятельность, облегчает понимание биохимических процессов у организмов высших таксонов (Сравнительная физиология., 1977; Мухин, 1999).

Актуальность изучения гидролаз морских беспозвоночных определяется, с одной стороны, функциями, которые выполняют эти ферменты в организме, а с другой - их несомненной практической значимостью. Особый интерес представляет изучение вопросов, связанных с такими хозяйственно-ценными объектами, как ракообразные и моллюски. Исследование ферментов беспозвоночных позволяет более рационально использовать добываемое сырье для получения препаратов ферментов и применения их в медицине, микробиологии, пищевой, комбикормовой и легкой промышленности (Мухин, 2002).

Важным направлением использования хитинолитических ферментов в медицине является получение различных неогликоконъюгатов, применяемых в медицине для ингибирования процесса метастазирования при онкопатологии. Производные хитина, такие как хитоолигосахариды и олигосахариды хитозана, получаемые с помощью хитинолитических ферментов, также обладают многими важными и полезными для здоровья свйствами, проявляют противоопухолевое действие, улучшают функции кишечника (последнее объясняется способностью стимулировать рост Bifidobacteria — полезной кишечной бактерии, которая помогает справляться со многими болезнями пищеварительного тракта.

Кроме того, в последние десятилетия широкое распространение получил микробиологический метод защиты растений - использование препаратов на основе Bacillus thuringiensis, выделяющей хитинолитические ферменты. Перенос гена хитиназы в клетки растений позволил сделать их носителями собственного инсектицида (Журавлева, 2004).

Ферментативный гидролиз хитина и хитозана является альтернативным и, как считают многие биохимики, перспективным и более предпочтительным способом переработки хитина и хитозана по сравнению с уже традиционными химическими методами (Sashiwa, 2001; Ильина, 2002).

Акклиматизированный в Баренцевом море камчатский краб не только ценный промысловый вид, но и потенциальный объект аквакультуры. Основные биологические показатели камчатского краба Paralithodes camtschaticus в Баренцевом море не имеют существенных отличий от таковых в естественных популяциях его обитания в Тихом океане. Однако особенности экологии Баренцева моря, по всей вероятности, могут оказывать влияние на соотношение частей тела, химический состав и биохимические свойства мяса, гепатопанкреаса и других внутренних органов краба. Сведения об этих параметрах важны для обоснования возможности использования этого объекта на пищевые цели, а также для разработки комплексной технологии переработки сырья. Анализ научной литературы свидетельствует о том, что к настоящему времени при переработке камчатского краба используются практически все части тела. Из панциря получают производные хитина. Гепатопанкреас представляет собой ценное сырье для получения ферментных препаратов и жиров (Камчатский краб., 2003).

Проблема утилизации отходов промысла и переработки камчатского краба весьма актуальна с точки зрения не только рационального использования добытого сырья, но и получения разнообразных продуктов, находящих широкое применение в медицине и промышленности. (Мухин, 1998).

Отходы промысла и переработки камчатского краба содержат значительное количество таких неутилизируемых соединений, как белки, хитин, липиды и ферменты.

Пищеварительные органы различных морских беспозвоночных, и, особенно, гепатопанкреас ракообразных являются уникальным сырьем для получения ферментов. Этот вопрос является предметом детального изучения огромного количества научных работ (Jeuniaux, 1963; Сахаров, 1992; Shigemasa, 1994; Руденская, 1995; Климова, 1999). В ПИНРО также проводятся работы по исследованию протеолитической и хитинолитической активности гепатопанкреаса камчатского краба (Мухин, 1999; Новиков, 2007).

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование хитинолитической активности в пищеварительных органах некоторых беспозвоночных Баренцева моря и выделение фракций белков, ответственных за ее проявление.

Задачи исследования сводились к следующему:

1. Провести сравнительное изучение хитиназной активности у различных таксономических групп морских беспозвоночных (камчатского краба, серрипеса, трубача, кукумарии, морской звезды)

2. Изучить динамику ферментативного гидролиза хитина и хитозана под действием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба при различных условиях проведения анализа.

3. Сравнить кинетические характеристики гидролиза хитина (хитозана) под действием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба.

4. Исследовать природу хитинолитических и протеолитических ферментов и охарактеризовать их молекулярные массы (ММ).

Научная новизна. Впервые установлены основные характеристики хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба. Определены оптимальные условия гидролиза. Проведено сравнительное исследование хитинолитической активности у морских беспозвоночных различных таксономических групп.

Установлено, что наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Причем эндохитиназная активность выше у фермента выделенного из морской звезды, а экзохитиназная - из краба. Показано отсутствие хитозаназной активности, в частности, экзохитозаназной активности. Доказано, что за хитиназную и протеазную активность ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба отвечают различные ферменты. Также подтверждена различная природа экзо- и эндохитиназ ферментного препарата. Впервые также установлена молекулярная масса (50,9) кД хитиназы, выделенной из гепатопанкреаса камчатского краба.

Практическое значение работы.

Получение хитиназ из отходов переработки морских гидробионтов может способствовать решению проблемы комплексного использования водных ресурсов.

Определенные в ходе исследования оптимальные условия гидролиза хитина, могут быть использованы для совершенствования процесса получения олигомеров и мономера хитина - N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), имеющих практическую ценность. При ферментативном гидролизе хитина, по сравнению с химическим гидролизом, происходит образование GlcNAc и не наблюдается выход D-глюкозамина (GlcN). что позволяет получать чистый ацетилированный моносахарид. Мягкие условия ферментативного гидролиза и его избирательность обеспечивают получение целевых и побочных продуктов реакции, соответствующих требованиям экологической безопасности производства.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. В пищеварительных органах, полученных из камчатского краба, серрипеса, трубача, кукумарии и морской звезды обнаруживается экзо- и эндохитиназная активность. Наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Эндохитиназная активность выше у фермента выделенного из морской звезды, а экзохитиназная - из краба.

2. Хитиназная активность фермента, определенная по выходу N-ацетилглюкозамина, увеличивается с увеличением степени ацетилирования субстрата.

3. В гепатопанкреасе камчатского краба отсутствует экзохитозаназная активность.

4. За хитиназную и протеазную активность в гепатопанкреасе краба отвечают различные ферменты. Причем белки, отвечающие за хитиназную активность, имеют большую молекулярную массу (ММ) по сравнению с протеазами.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Российских, региональных и международных конференциях: Пятой региональной науч. студенческой конф. «Естественнонаучные проблемы Арктического региона», Мурманск, 2004; XXV юбилейной конф. молодых ученых ММБИ РАН, Мурманск 2007; 2-ой науч. конф. с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2007; Междунар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2004; Межд. науч.-техн. конференциях «Наука и образование», Мурманск, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008; Межд. науч.-практ. конференция «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья», посвященная памяти профессора Н. Н. il

Рулёва, Мурманск, 2008; 10 Int. Chemical and Biological Engineering Conf. -CHEMPOR 2008, Braga, Portugal, 2008; Девятой Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», 2008; Всеросс. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 90-летию со дня рождения К. Г. Константинова, 2008 г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, включающих 7 статей, из которых 4 — в реферируемых источниках.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 145 страницах, включает 4 таблицы и 33 рисунка. Работа включает введение, 3-й главы, заключение, выводы, список сокращений и список литературы, включающий 184 публикации, из них 105 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рысакова, Кира Сергеевна

выводы

1. Обнаружено наличие экзо- и эндохитиназной активности в пищеварительных органах камчатского краба, серрипеса, трубача, кукумарии, морской звезды. Наибольшей хитиназной активностью обладают ФП, выделенные из камчатского краба и морской звезды, что объясняется их пищевыми предпочтениями. Причем эндохитиназная активность выше у ФП, выделенного из морской звезды, а экзохитиназная — из краба, что связано с полнотой использования продуктов гидролиза для потребностей организма у этих двух видов беспозвоночных.

2. При сравнении зависимостей экзохитиназной активности ФП из гепатопанкреаса камчатского краба (Аехо, мг GlcNAc/мл) от степени ацетилирования субстрата показано, что хитиназная активность фермента, возрастает с увеличением СА.

5. Определен порядок и константы реакций гидролиза хитина. В первом случае, при зависимости экзо- и эндохитиназной активности от времени инкубации, реакция проводилась в условиях избытка фермента и была отнесена к реакциям первого порядка; в случае кинетики образования суммы восстанавливающих Сахаров, реакция идет в условиях избытка субстрата и относится к реакциям нулевого порядка.

6. Выявлено отсутствие N-ацетилглюкозамин деацетилазной и экзохитозаназной активности. Это обусловлено тем, что в продуктах гидролиза хитина и хитозанов GlcN не был обнаружен.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своим наставникам: Новикову В. Ю. и Мухину В. А., а также всей лаборатории биохимии и технологии ПИНРО за помощь в организации и проведении исследований. Особая признательность Карасевой Т. А. и Жилину А. Ю. за поддержку и ценные замечания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследований обнаружено наличие экзо- и эндохитиназной активности в ферментных препаратах, полученных из камчатского краба, серрипеса, трубача, кукумарии, морской звезды. Наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Причем эндохитиназная активность выше у фермента выделенного из морской звезды, а экзохитиназная - из краба.

Детально изучен ферментативный гидролиз хитина и хитозана под действием ферментного препарата, полученного из гепатопанкреаса камчатского краба. Получены зависимости эндо- и экзохитиназной активности ФП от продолжительности инкубации, концентрации ФП, температуры и рН реакционной среды. Определены оптимальные условия гидролиза. Установлена зависимость активности ФП от степени ацетилирования субстрата.

Определен порядок и константы реакций гидролиза хитина. В первом случае, при зависимости экзо- и эндохитиназной активности от времени инкубации, реакция проводилась в условиях избытка фермента и была отнесена к реакциям первого порядка. В случае исследования кинетики образования суммы восстанавливающих Сахаров использовался аналитический метод с более высокой чувствительностью, что позволило изучать гидролиз с меньшей концентрацией фермента. В этом случае реакция шла в условиях избытка субстрата и имела нулевой порядок.

Проведено исследование процессов гликолитического ферментативного расщепления хитина и -хитозана под действием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба.

На основании установленных зависимостей гликолитической активности ферментного препарата от различных условий инкубации (рН субстрата, температуры, времени инкубации, концентрации фермента и субстрата) и сравнении их с аналогичными зависимостями, полученными для протеолитической и экзохитиназной активностей, сделаны предположения относительно вероятного направления ферментативного гидролиза хитина и хитозана.

Подтверждено наличие эндохитиназной активности ФП. В продуктах гидролиза хитина показано образование низкомолекулярных фракций и олигомеров.

Показано отсутствие хитозаназной активности, в частности, экзохитозаназной активности. GlcN не был обнаружен в продуктах гидролиза хитина и хитозанов с разной степенью деацетилирования.

Показано отсутствие N-ацетилглюкозамин деацетилазной активности. В продуктах гидролиза хитина и хитозанов был обнаружен GlcNAc и отсутствовал GlcN.

Сравнение положения температурных и рН-оптимумов, наблюдаемых на зависимостях активности ФП позволяет считать, что за хитиназную и протеазную активность ФП отвечают различные ферменты. Эти же экспериментальные данные, по-видимому, указывают на различную природу экзо- и эндохитиназ ФП. Последнее предположение, вероятно, свидетельствует в пользу двухступенчатого процесса ферментативного расщепления хитина: эндогидролиз до олигомеров (эндохитиназа) и экзогидролиз олигомеров (ацетилхитобиозы) до ^ацетил-Б-глюкозамина.

Фракционирование различными методами (высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрация, ультрафильтрация, препаративной эксклюзионной ВЭЖХ) проводимое с целью количественного выделения фракций белков, проявляющих максимальную протеолитическую и хитинолитическую активности подтвердило тот факт, что за хитинолитическую и протеолитическую активность отвечают различные ферменты: максимальные пики этих двух видов активностей соответствуют фракциям белков с разными ММ. Причем, белки отвечающие за хитиназную активность имеют большую ММ (50,9 кД) по сравнению с протеазами (23,4 кД).

Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что в ФП присутствуют разные ферменты, проявляющие хитинолитическую и протеолитическую активность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рысакова, Кира Сергеевна, Мурманск

1. Актуганов, Г. Э. Выделение и свойства хитозаназы штамма Bacillus sp. 739 / Г. Э. Актуганов, А. В. Широков, А. И. Мелентьев // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39, № 5. - С. 536-541.

2. Алексеенко, Л. П. Определение активности протеиназ по расщеплению белковых субстратов // Современные методы в биохимии. Т. 2. — М.: Медицина, 1968. -112 с.

3. Барнард, Е. Сравнительная биохимия и физиология пищеварения / Е. Барнард // Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1977. - С. 285-348.

4. Беленький, Б. Г. Хроматография полимеров / Б. Г. Беленький, Л. 3. Виленчик. -М.: Химия, 1978. 344 с.

5. Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. М.: Медицина, 1983. - 752 с.

6. Биофизика / Под ред. Б. Н. Тарусова и О. Р. Колье. М.: Высш. шк., 1986.-466 с.

7. Влияние способа сушки на свойства ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus / В. А. Мухин, К. С. Рысакова, И. И. Лыжов, В. Ю. Новиков // Рыбное хозяйство. — 2007. -№ 3. С. 103-105.

8. Герасимова, Н. А. Свойства протеиназ из внутренних органов камчатского краба Paralithodes camtschatica / Н. А. Герасимова, Н. М. Купина // Прикл. биохимия и микробиол. 1996. — Т. 32, № 4. - С. 411-415.

9. ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа. — М.: Изд-во стандартов, 1985.— 141 с.

10. Гудимова, Е. Н. Распространение Cucumaria frondosa (Gunnerus) в Баренцевом море в связи с абиотическими факторами среды //

11. Особенности биологии и условия обитания гидробионтов Баренцева моря. — Апатиты, 1988. С. 125-139. - Рук. деп. в ВИНИТИ 23.03.88, № 2246-В88.

12. Гудимова, Е. Н., Биология, экология и ресурсы промысловой голотурии кукумарии / Е. Н. Гудимова, С. Г. Денисенко. Мурманск, 1995. -43 с.

13. Дёрффель, К. Статистика в аналитической химии / Пер. с нем. -М.: Мир, 1994.-268 с.

14. Донные беспозвоночные Баренцева моря (рекомендации к промысловому использованию). Мурманск, ПИНРО, 1989. — 68 с.

15. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей / Пер. с англ. М.: Изд-во «Мир», 1976. - 366 с.

16. Журавлева, Н. В. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии / Н. В. Журавлева, П. А. Лукьянов. Вестник ДВО РАН. - 2004. - № 3. - С. 83.

17. Зажигаев, Л. С. Методы планирования и обработки результатов физического эксперимента / Л. С. Зажигаев, А. А. Кирьяш, Ю. И. Романиков. М.: Атомиздат, 1978. - 232 с.

18. Ильина, А. В. Энзимология синтеза и деградации хитина и хитозана / А. В. Ильина, В. П. Варламов // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под. ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. М.: Наука, 2002. - С. 79-90.

19. Исаев, В. А. Способ получения препарата коллагеназы : Пат. RU 2008353, МКИ5 С 12 N 9/64, С 12 N 9/48 / В. А. Исаев, Г. Н. Руденская, О. Г. Купенко, В. М. Степанов, И. М. Попова, Ю. Г. Диденко. Опубл. 28.02.94.

20. Казицына, Л. А. Применение УФ-, ИК-, ЯМР- и масс-спектроскопии в органической химии / Л. А. Казицына, Н. Б. Куплетская. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1979. 240 с.

21. Камчатский краб в Баренцевом море. Изд. 2-е, перераб. и доп. -Мурманск : Изд-во ПИНРО, 2003. - 383 с.

22. Климова, О. А. Коллагенолитический комплекс протеаз изгепатопанкреаса камчатского краба: разделение на индивидуальные компоненты / О. А. Климова, В. Ю. Чеботарев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. - Т. 128, № 9. - С. 308313.

23. Кнорре, Д. Г. Биологическая химия / Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. М.: Высш. шк., 2002. - 479 с.

24. Компанцев, В. А. Разработка лечебных и профилактических препаратов на основе пектина и хитина / В. А. Компанцев, И. И. Самокиш, A. JI. Казаков, JI. П. Гокжаева // Научные труды ВНИИ фармации. 1990. -Т. 28.-С. 18-23.

25. Корн, Г. Справочник по математике (для научных сотрудников и инженеров) / Г. Корн, Т. Корн / Пер. с англ. М.: Наука, 1978. - 832 с.

26. Кочетков, Н. А. Химия углеводов / Н. А. Кочетков, А. Ф. Бочков и др. М.:Химия, 1967. - 672 с.

27. Кудинов, С. А. Способ получения комплекса протеолитических f ферментов: А. с. 933097 СССР, МКИЗ А 61 К 35/60 / С. А. Кудинов, Л. М. Эпштейн, М. В. Колодзейская, В. Н. Акулин, Т. Н. Пивненко. — Заявл. 29.05.80; № 2955550/28-13; Опубл. 07.06.82.

28. Кузьмина, В. В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб. М.: Наука, 2005. - 300 с.

29. Кулезнев, В. Н. Химия и физика полимеров: Учеб. для хим. -технол. вузов / В. Н. Кулезнев, В. А. Шершнев. М.: Высшая школа, 1988. -312 с.

30. Купина, Н. М. Характеристика протеолитических комплексов, выделенных из гепатопанкреаса крабов / Н. М. Купина, Н. А. Герасимова // Прикладная биохимия и микробиология, 1999. Т. 35, № 3. - С. 303-307.

31. Лакин, Г. Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов / Г. Ф. Лакин / 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

32. Левин, В. С. Дальневосточный трепанг / В. С. Левин. -Владивосток, 1982.- 191 с.

33. Ленинджер, А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки / А. Ленинджер. М.: Мир, 1974. - 960 с.

34. Литвин, Ф. Е. Коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса камчатского краба: выделение и свойства: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ф. Е. Литвин. -М., 1993.-20 с.

35. Манасова, Т. А. Липиды дальневосточного трепанга, их гликолипидемическое действие в эксперименте: Автореф. дис. канд. биол. наук, 1978.-40 с.

36. Манушин, И. Е. Трофические взаимоотношения камчатского краба с местной фауной; 8.11.2001 // Мурманские рыбные ресурсы; сайт: www.murfish.ru

37. Мухин, В. А. Кислая протеин аза из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica / В. А. Мухин, Н. Н. Немова и др. — Прикладная биохимия и микробиология, 1999. Т. 35, № 4, С. 409-412.

38. Мухин, В. А. Протеолитические ферменты в тканях некоторых морских беспозвоночных : Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1998. - 22 с.

39. Мухин, В. А. Ферментативные белковые гидролизаты тканей морских гидробионтов : получение, свойства и практическое использование / В. А. Мухин, В. Ю. Новиков. Мурманск : Изд-во ПИНРО, 2001. - 97 с.

40. Мухин, В. А. Рекомендации по рациональному использованию отходов переработки камчатского краба Баренцева моря / В. А. Мухин, В. Ю. Новиков // Камчатский краб в Баренцевом море. Изд. 2-е, перераб. и доп. - Мурманск: Изд-во ПИНРО, 2003. - С. 312-325.

41. Мухин, В. А. Протеолиз и протеолитические ферменты в тканях морских беспозвоночных / В. А. Мухин, В. Ю. Новиков. — Мурманск: Изд-во1. ПИНРО, 2002.-118 с.

42. Немова, Н. Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. Петрозаводск: КНЦ РАН, 1996. - 104 с.

43. Новиков, В. Ю. Кинетика реакции деацетилирования хитина и хитозана / В. Ю. Новиков, Т. А. Орлова, И. Э. Воронина // Изв. вузов. Пищ. технология. 1990. - № 5. - С. 64-67.

44. Новиков, В. Ю. Свойства хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus / В. Ю. Новиков, В. А. Мухин, К. С. Рысакова // Прикл. биохимия и микробиол. -2007. Т. 43, № 2. - С. 178-183.

45. Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: Материалы Шестой международной конференции. Москва-Щелково, 22-24 октября, 2001. -М.: Изд-во ВНИРО, 2001. 398 с.

46. Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Пятой конференции. Москва Щелково, 25-27 мая, 1999. - М.: Изд-во ВНИРО, 1999. - 296 с.

47. Несмеянов, А. Н. Радиохимия. М.: Химия, 1972. - 592 с.

48. Нудьга, JI. А. О-Алкилирование хитозана / JT. А. Нудьга, Е. А. Плиско, С. Н. Данилов // Журнал общей химии. 1973. - Т. 43, №12. - С. 2752-2756.

49. Определитель фауны и флоры северных морей СССР / Под ред. Гаевской Н. С. -М.: Сов. наука, 1948. С. 431.

50. Орлов, Ю. И. Камчатский краб в Северо-Восточной Атлантике / Ю. И. Орлов // Рыбное хозяйство. 1993. - № 5. - С. 37-38.

51. Павлов, Г. М. Скоростная седиментация, молекулярная масса иконформационные параметры некоторых растворимых производных хитина / Г. М. Павлов, С. Г. Селюнин // Высокомолекул. соедин. А. 1986. - Т. 28, № 8.-С. 1727-1731.

52. Перечень критических технологий Российской Федерации (Утв. Президентом Российской Федерации В. В. Путиным 30 марта 2002 г. Пр-578).

53. Пивненко, Т. Н. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности / Т. Н. Пивненко, Ю. М. Позднякова, В. В. Давидович // Изв. ТИНРО-центра , 1997. Т. 120. - С. 23-31.

54. Плиско, Е. А. Хитин и его химические превращения / Е. А. Плиско, Л. А. Нудьга, С. Н. Данилов // Успехи химии, 1977. Т. 46, № 8. -С. 1470-1488.

55. Руденская, Г. Н. Выделение и свойства карбоксипептидазы камчатского краба Paralithodes camtschatica / Г. Н. Руденская, О. Г. Купенко, В. А. Исаев, В. М. Степанов, Я. Е. Дунаевский // Биоорганическая химия, 1995. Т. 21, № 4. - С. 249-255.

56. Сафронова, Т. М. О роли гексозаминов в покоричневении мяса крабов в консервах / Т. М. Сафронова, Т. Д. Щиголева // Рыбное хоз-во. — 1973.-№9-С. 59-60.

57. Сахаров, И. Ю. Очистка и характеристика коллагенолитической протеазы из гепатопанреаса Paralithodes camtschatica / И. Ю. Сахаров, Ф. Е. Литвин, А. А. Артюков, Н. Н. Кофанова // Биохимия, 1988. Т. 53, № 11. -С. 1844-1849.

58. Сахаров, И. Ю. Способ получения коллагеназы / И. Ю. Сахаров,

59. A. В. Джунковская, А. А. Артюков, В. В. Сова, О. Г. Саканделидзе, Э. П. Козловская; Институт иммунологии и Тихоокеанский институт биоорганической химии: А. с. SU 1343591 А1, МКИ4 А 61 К 35 / 56. Заявл. 13.12.85 ; № 3992368 /28 - 14.-2 с.

60. Сахаров, И. Ю. Физико-химические свойства коллагенолитической протеазы С камчатского краба / И. Ю. Сахаров // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 1. - С. 40-44.

61. Сенников, А. М. Результаты акклиматизации камчатского краба в Баренцевом море / А. М. Сенников // Материалы отчетной сессии по итогам НИР ПИНРО в 1992 г. Мурманск : Изд-во ПИНРО, 1993. - С. 210-219.

62. Сидоров, В. С. Активность лизосомальных ферментов у взрослых самок озерного лосося Saimo salar L. в период преднерестового созревания /

63. B. С Сидоров, Р.У. Высоцкая, Ю.А. Костылев // Вопр. ихтиологии. 1980. -Т. 20, вып. 4, № 123. - С. 713-718.

64. Скоупс, Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 358 с.

65. Сравнительная физиология животных. Т. 1. / Под ред. проф. Л. Проссера / Пер. с англ. под ред. чл.-корр. АН СССР Т. М. Турпаева. М.: Мир, 1977.-608 с.

66. Телишевская, Л. Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / М. : Аграрная наука, 2000. - 296 с.

67. Технология рыбы и рыбных продуктов: учебник для ВУЗов / В. В. Баранов, И. Э. Бражная, В. А. Гроховский и др.; Под ред. А. М. Ершова. -СПб.: ГИОРД, 2006. 944 с

68. Технологическая инструкция № 9280-026-00472182-04 по изготовлению полуфабриката ферментного препарата: Утв. И. о. директора

69. ФГУП ПИНРО В. Л. Мишиным 14Л2.2004. 16 с.

70. Тимофеев, С. Ф. Макропланктон / С. Ф. Тимофеев // Биологические ресурсы прибрежья Кольского полуострова — Апатиты, 1995.- С. 46-52.

71. Уголев, А. М. Пищеварительные процессы и адаптация у рыб: Монография / А. М. Уголев, В. В. Кузьмина. СПб. : Гидрометеоиздат, 1993.-239 с.

72. Хочачка, П. Биохимическая адаптация / П. Хочачка, Дж. Сомеро.1. М.: Мир, 1988.-567 с.

73. Чеботок, Е. Н. Влияние кристалличности хитина и хитозана на кинетику щелочного деацетилирования / Е. Н. Чеботок, В. Ю. Новиков, И. Н. Коновалова // Журнал прикладной химии. 2007. - Т. 80 , № 10. - С. 1724-1729.

74. Шмид, Р. Неформальная кинетика. В поисках путей химических реакций / Р. Шмид, В. Н. Сапунов / Пер. с англ. М.: Мир, 1985. - 264 с.

75. Bade, M. L. Localization of moulting chitinase in incect culture / M. L. Bade // Biochem. et Biophys. 1974. - Vol. 372, No. 2. - P. 474-477.

76. Bade, M. L. Time pattern of appearance and disappearance of active molting chitinase in Manduca cuticle. The endogenus activity / M. L. Bade // FEBS Lett. 1975. - Vol. 51. - P. 161-163.

77. Bade, M. L. Structure and isolation of native animal chitins / M. L. Bade // Application of chitin and chitosan. Lancaster, Pennsylvania, USA: Technomic Publishing Company, Inc., 1997. - P. 255-277.

78. Bernier, I. Characterization of chitinases from haemolymph and cell cultures of cockroach {Periplaneta americana) / I. Bernier, J.-C. Landureau, P. Grellet, P. Jolles // Comparative Biochemistry and Physiology. Part B:

79. Biochemistry and Molecular Biology. 1974. - Vol. 47, No. 1. - P. 41-44.

80. Biochemical Organics Compounds for Research and Diagnostic Reagents : Catalog SIGMA. St. Louis, MO USA: Sigma Chemical Co., 1994. -2352 p.

81. Candy, D. J. Studies on chitin synthesis in the Desert Locust / D. J. Candy, B. A. Kilby // J. Exp. Biol. 1962. - Vol. 39, No. 1. - P. 129-140.

82. Chen, H.-C. Purification and characterization of a chitinase from Alteromonas haloplanktis K-12 / H.-C. Chen, M.-L.Yeh, S.-T. Jiang // Chitin Enzymology. Vol. 2 / Ed. by R.A.A. Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni, 1996. - P. 253-260.

83. Colin, D. A. Etude comparee des systems enzymatiques chitinolytiques du tube digestive de quelquels teleosteens marins / D. A. Colin, G. Peres // Ann. Inst. Mishee Pacha. 1971. - № 4. - P. 1-9.

84. Cornelius, C. Biosynthesis of chitinases by mammals of the order carnivore. Biochem / C. Cornelius, G. Dandrifosse, C. Jeuniaux // Syst. and Ecol. 1975. - Vol. 3, No. 2. - P. 121-122.

85. Dandrifosse, G. Purification of chitinases contained in panereas or gastric mucosa of frog / G. Dandrifosse // Biochemie. 1975. - Vol. 57. - P. 829831.

86. Davies, G. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases / G. Davies, B. Henrissat // Structure, 1995. Vol. 3, No. 9. - P. 853-859.

87. Davis, B. Chitosanases: occurrence, production and immobilization / B. Davis, D. Eveleigh // Chitin, chitosan and related enzymes / Ed. by J. P. Zikakis. Orlando: Academic Press, 1984. - P. 161-179.

88. Davis, T. P. High-performance liquid chromatographic analysis of biogenic amines in biological materials as o-phthalaldehyde derivatives / T. P.

89. Davis, С. W. Gehrke, С. W. Gehrke, Jr., T. D. Cunningham, К. C. Kuo, К. O. Gerhardt, H. D. Johnson, С. H. Williams // J. Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications. 1979. - Vol. 162, No. 3. - P. 293-310.

90. Deshpande, M. V. Enzymatic degradation of chitin and its biological applications / M. V. Deshpande // Journal of Scientific and Industrial Research. -1986. Vol. 45. - P. 273-281.

91. Domszy, J. G. Evaluation of infrared spectroscopic techniques for analysing chitosan / J. G. Domszy, G. A. F. Roberts // Die Makromolekulare Chemie. 1985. - Vol. 186, No. 8. - P. 1671-1677.

92. Faire, J. R. Crustacean and fish derived multifunctional enzyme / J. R. Faire, R. L. Franklin, J. Kay, R. Lindblom // US Pat. N 00594102 A. 1999.

93. Fukamizo, T. Mechanism of chitin hydrolysis by the binary chitinase system in insect moulting fluid / T. Fukamizo, K. Kramer // Insect Biochem. -1985. Vol. 15, № 2. - P. 141-145.

94. Fukamizo, T. Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate binding, and their application / T. Fukamizo // Curr. Protein and Peptide Sci. 2000. - Vol. 1, № l.-P. 105-124.

95. Fukamizo, T. Comparative Enzymology of Chitinases from Plants and Microbes / T. Fukamizo // Chitin enzymology, 2001 / Ed. by R. A. A. Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni, 2001. - P. 213-218.

96. Galgani, F. Digestive proteolysis and digestive proteinases in deep sea crabs Geryon offinis and Chionoecetes japonicus / F. Galgani, F. Nagayama // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1988. - Vol. 54, No. 6. - P. 983-987.

97. Gao, X. D. Purification and characterization of chitin deacetylase from Absidia coerulea / X. D. Gao, T. Katsumoto, K. Onodera // The Journal of Biochemistry (Tokyo). 1995. - Vol. 117, No. 2. - P. 257-263.

98. Goodrich, T. D. Incidence and estimation of chitinase activity associated with marine fish and other estuarine samples / T. D. Goodrich, R. Y. Morita // Marine Biology: Historical Archive. 1977. - Vol. 41, No. 4. - P. 349353.

99. Henrissat, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat // Biochemical Journal. 1991. - Vol. 280, Pt. 2. - P. 309-316.

100. Henrissat, B. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat, A. Bairoch // Biochem. J. -1993. Vol. 293. - P. 781-788.

101. Hirano, S. Chitin biotechnology applications / S. Hirano // Biotechnol. Annu. Rev. -1996. Vol. 2, № 1. - P. 237-258.

102. Hohnke, L. A. Enzymes of chitin metabolism in the decapode

103. Hemigapsas nudus / L. A. Hohnke // Сотр. Biochem. Phisiol. 1971. - Vol.40, No.3.-P. 757-779.

104. Imoto, T. A simple activity measurement of lisozyme / T. Imoto, K. Yagishita // Agricultural and Biological Chemistry, 1971. Vol. 35, No. 7. - P. 1154-1156.

105. Smidsrod. Norway, Trondheim : NTNU, 2003. - P. 145-148.

106. Jeuniaux, C. Chitinases in digestive tract of vertebrates / C. Jeuniaux // Nature. 1961. - Vol. 192. - P. 135-136.

107. Jeuniaux, C. Chitinases of vertebrates and invertebrates / C. Jeuniaux // Arch. Int. Physiol. Biochem. 1963. - Vol. 71. - P. 307.

108. Jeuniaux, C. Chitine et chitinolyse / C. Jeuniaux. Paris: Masson, 1963. -181 p.

109. Jeuniaux C. Chitinases. In methods of Enzymology / C. Jeuniaux / Ed. by N. E. F. Ginsburg. 1966. - Vol. 8. - P. 644-650.

110. Khan, T. A. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods / T. A. Khan, К. K. Peh, H. S. Chang // Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science. 2002. - Vol. 5, No. 3. - P. 205-212.

111. Kim, J. Agarase, amylase, cellulase and chitinase activity at deep-sea pressures / J. Kim, С. E. Zobell // J. Oceanogr. Soc. Jap. 1972. - Vol. 28. - P. 131-137.

112. Koga, D. Comparative biochemistry of insect and plant chitinases / D. Koga // Chitin Enzymology. Vol. 2. / Ed. Muzzarelli R. A. A. Grottammare,1.aly: Atec Edizioni, 1996. P. 85-94.

113. Kolodziejska, I. Properties of chitin deacetylase from crude extracts of Mucor rouxii mycelium / I. Kolodziejska, M. Malesa-Ciecwierz, A. Lerska, Z. Sikorski // Journal of Food Biochemistry, 1999. Vol. 23, No. 1. - P. 45-57.

114. Kumar, M. N. V. R Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives / M. N. V. R. Kumar, R. A. A. Muzzarelli, C. Muzzarelli, H. Sashiwa, A. J. Domb // Chemical Reviews, 2004. Vol. 104, No. 12. - P. 60176084.

115. Kumar, А. В. V. A comparative study on depolymerization of chitosan by proteolytic enzymes / А. В. V. Kumar, R. N. Tharanathan // Carbohydrate Polymers. 2004. - Vol. 58, No. 3. - P. 275-283.

116. Kurita, K. Controlled functionalization of the polysaccharide chitin / K. Kurita // Progress in Polymer Science. 2001. - Vol. 26, No. 9. - P. 19211971.

117. Lorito, M. Synergistic, antifungal interactions of chitinolytic enzymes from fungi, bacteria and plants / M. Lorito, S. L. Woo et al. // Chitin Enzymology. Vol. 2 / Ed. by R. A. A. Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni, 1996. - P. 157-164.

118. McMurrough, I. Properties of a particulate chitin synthetase from Mucor / I. McMurrough, S. Bartnicki-Garcia // J. Biol. Chem. 1971. - Vol. 246. -P. 4008-4016.

119. Martin, M. M. The presence of chitinase in the digestive fluids of ants / M. M. Martin, M. J. Grieselmann, J. S. Martin // Сотр. biochem. phisiol. Part A. 1976. - Vol. 53, No 4. - P. 331-332.

120. Monreal, J. The chitinase of Serratia marcescens / J. Monreal, E. T. Reese // Canadian Journal of Microbiology. 1969. - Vol. 15, No. 7. - P. 689696.

121. Morrisey, R. F. Chitinase production by an Arthrobacter sp. lysing cells of Fusarium roseum / R. F. Morrisey, B. P. Dugan and J. S. Koths // Soil Biology and Biochemistry. 1976. - Vol. 8, No. 1 - P. 23-28.

122. Lin, H. Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain / H. Lin, H. Wang, C. Xue, M. Ye // Enzyme and Microbial Technology. 2002. -Vol. 31, No. 5.-P. 588-592.

123. Lundblad, G. Chitinase in goat serum. Preliminary purification and characterization / G. Lundblad, B. Hederstect, J. Lind, M. Steby // Eur. J. Biochem. 1974. - Vol. 46. - P. 367-376.

124. Martin, M. M. The presence of protease activity in the rectal fluids of primitive attine ants / M. M. Martin, J. S. Martin // J. Insect. Physiol. 1971. -Vol. 17.-P. 1897-1906.

125. McWhile, M. Bload glucose in the crab Hemigrapsus nudus / M. McWhile, В. T. Scheer // Science. 1959. - Vol. 128. - P. 90-93.

126. Morrisey, R. F. Chitinase production by an Arthrobacter sp. lysing cells of Fusarium roseum / R. F. Morrisey, B. P. Dugan, J. S. Koths I I Soil Biology and Biochemistry. 1976. - Vol. 8, No. 1 - P. 23-28.

127. Muzzarelli, R. A. A. Chitin / R. A. A. Muzzarelli. Oxford, New York et al.: Pergamon Press, 1977. - 310 p.

128. Muzzarelli, R. A. A. The discovery of chitin, a > 570 Megayear old polymer / R. A. A. Muzzarelli // Chitosan in Pharmacy and Chemistry / Ed. by R. A. A. Muzzarelli and C. Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni, 2002. -P. 1-8.

129. Muzzarelli, R. A. A. Depolymerization of chitosan with the aid of papain / R. A. A. Muzzarelli, M. Tomasetti, P. Ilari // Enzyme and Microbial Technology. 1994. - Vol. 16, No. 2. - P. 110-114

130. Nanjo, F. Purification and characterization of an exo-p-D-glucosaminidase, a novel type of Enzyme, from Nocarardia orientalis / F. Nanjo, R. Katsumi, K. Sakai // The Journal of Bioligical Chemistry. 1990. - Vol. 265, No. 17. - P. 10088-10094.

131. No, H. K. Preparation of chitin and chitosan / H. K. No, S. P. Meyers // Chitin Handbook / Ed. by R. A. A. Muzzarelli, M. G. Peter. Grottammare, Italy: Atec Edizioni, 1997. - P. 475-489.

132. No, H. K. Preparation and characterization of chitin and chitosan a review / H. K. No, S. P. Meyers // Journal of Aquatic Food Product Technology. - 1995. - Vol. 4, No. 2. - P. 27-52.

133. Bezouska, K. Oligosaccharide ligands for NKR-P1 protein activate NK cells and cytotoxicity / K. Bezouska, С. T. Yuen, J. O'Brien et al. // Nature. -1994. Vol. 372, № 6502. - P. 150-157.

134. Piavaux, A. B. Digestive tract -polysaccharidases of Ran a temporaria L. during growth and metamorphosis / A. B. Piavaux // Arch Int Physiol Biochim 1972. Vol. 80, No. 1. - P. 153-160.

135. Price, J. S. Production, purification, and characterization of an extracellular chitosanase from Streptomyces / R. Storck // Journal of Bacteriology. 1975. - Vol. 124, No. 3. - P. 1574-1565.

136. Pujalte, J. M. The basic treatment of osteoarthrosis / J. M. Pujalte, E. P. Llavore, F. R. Ylescupidez // Current Med. Res. and Opinion. 1980. - Vol. 7. -P. 110.

137. Raa, A. J. Purification and Characterization of chymotrypsin, trypsin and elastase like proteinases from cod Gadus morhua (L.) / A. J. Raa, B.T. Walther // Сотр. Biochem. Physiol. 1989. - Vol. 93 B, No. 2. - P. 317-324.

138. Reissing, J. L. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars. / J. L. Reissing, J. L. Strominger, L. F. Leloir // The journal of biological chemistry. 1955. - Vol. 217, No 2. - P. 959-966.

139. Renaud, L. Le cycle des reserves organiqes chez les crustaces decapods / L. Renauld // Ann. Inst. Jceanog. (Paris). 1949. - Vol. 24. - P. 259557.

140. Roseman, S. Glucosamine metabolism. I. N-Acetylglucosamine deacetylase / S. Roseman // The Journal of Biological Chemistry. 1957. - Vol. 226, No. 115-123.

141. Sadorf, P. A. Chitosan: commercial uses and potential applications / P. A. Sadorf // Chitin and Chitosan / Ed. by G. Skjak-Braek, T. Anthonsen, P. A. Sadorf. Elsevier, 1989. - P. 51-69.

142. Samsinakova, A. Action of enzymatic systems of Beauveria bassiana on the cuticle of the greater wax moth larvae (Galleria mellonella) / A. Samsinakova, S. Misikova, J. Leopold // Journal of Invertebrate Pathology. -1971. -Vol. 18, No. 3. P. 322-330.

143. Schlumbaum, A. Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth / A. Schlumbaum, F. Mauch, K.Vogeli, T. Boiler // Nature. 1986. - Vol. 324, No. 11. - P. 365-367.

144. Shigemasa, Y. Enzymatic degradation of chitins and partially deacetylated chitins / Y. Shigemasa, K. Saito, H. Sashiwa, H. Saimoto // Int. J. Biol. Macromol. 1994. - Vol. 16, No. 1. - P. 43-49.

145. Skujins, J. Adsorption and reactions of chitinase and lysozyme on chitin / J. Skujins, A. Pukite, A. D. McLaren // Molecular and Cellular Biochemistry. 1973. - Vol. 2, No. 2. - P. 221-228.

146. Stefansson, J. Enzymes in the fishing industry / J. Stefansson // Food Technol. 1988. - Vol. 42, No. 3. - P. 64-65.

147. Tominago, Y. Purification and some enzymatic properties of the chitosanase from Bacillus R-4 which lyses Rhizopus cell walles / Y. Tominago, Y. Tsujisaka // Biochem. et biophys. acte. Enzymology. 1975. - Vol. 410, No. 1. -P. 141-155.

148. Toyoda, H. Suppression of the powdery mildew pathogen by chitinase microinjected into barley coleoptile cells / H. Toyoda, Y. Matsuda, T. Yamaga, S. Ikeda, M. Morita, T. Tamai, S. Ouchi // Plant Cell Rep. 1991. - Vol. 10, No. 5. - P. 217-220.

149. The 5th International Conference of the European Chitin Society (EUCHIS"02). Trondheim, Norway, 26-28 June, 2002: Abstract Book. Norway, Trondheim: The Norwegian University of Science and Technology, 2002. - 154 p.

150. Tronsmo, A. Chitinolytic enzymes from the biocontrol agent Trichoderma harzianum / A. Tronsmo, L. Hjeljord, S. S. Klemsdal et al. // Chitin Enzymology. Vol. 2. / Ed. by R. A. A. Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni, 1996. - P. 235-244.

151. Vonk, H. J. Comparative aspects of digestion / H. J. Vonk // Comparative Biochemistry, Vol. 6 / Ed. by M. Florkin and H. S. Mason. New York: Academic Press, 1964. - P. 347-401.

152. Usui, T. Transglycosylation reaction of a chitinase purified from Nocardia orientalis / T. Usui, Y. Hayashi, F. Nanjo, K. Sakai, Y. Ishido // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - Vol. 923, No. 2. - P. 302-309.

153. Van Ceillie, R. Rythmicle ensymatique saisonpiere ches ungasterropode d'eau douse. / R! Van Ceillie, A. Reusseau, C. Van Ceillie-Raron I I Ann. Limnol. 1973. - Vol. 9. - P. 1-10.

154. Varum, К. M. Acid hydrolysis of chitosans / K. M.Varum, M. H. Ottoy, O. Smidsrod // Carbohydrate Polymers. 2001. - Vol. 46, No. 1. - P. 8998.

155. Wang, T. Selected properties of pH-sensitive, biodegradable chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel / T. Wang, M. Turhan, S. Gunasekaran // Polymer International. 2004. - Vol. 53. - P. 911-918.

156. Yatsunami, K. Changes in nitrogenous components and protease activity of fermented sardine with rice-bran / K.Yatsunami, T. Takenaka // Fish. Sci., 1996. Vol. 62, No. 62. - P. 790-795.

157. Yokoe, Y. Cellulase in invertebrates / Y. Yokoe, I. Yasumasu // Сотр. Biochem. Physiol. 1964. - Vol. 13. - P. 323-338.

158. Winicur, S. Chitinase activity during Drosophila development / S. Winicur, H. K. Mitchely // J. insect. Physiol. 1974. - Vol. 20, № 9. - P. 17951805.

Информация о работе

Рысакова, Кира Сергеевна
кандидата биологических наук
Мурманск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы