Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические ферменты в тканях некоторых морских беспозвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухин, Вячеслав Анатольевич, Мурманск

П г *" / ( ' к - ь

ПОЛЯРНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРСКОГО РЫБНОГО ХОЗЯЙСТВА И ОКЕАНОГРАФИИ ИМ. Н.М. КНИПОВИЧА (ПИНРО)

На правах рукописи

Мухин Вячеслав Анатольевич

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ В ТКАНЯХ НЕКОТОРЫХ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Немова Нина Николаевна

кандидат биологических наук Лебская Татьяна Константиновна

МУРМАНСК- 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................9

1. Общая характеристика протеолиза и протеолитических ферментов.......9

2. Роль протеиназ в белковом метаболизме гидробионтов.........................12

2.1. Аспартильные протеиназы (катепсин Б, пепсин, катепсин Е)........12

2.2. Сериновые протеиназы (эластаза, трипсин, коллагенолитические протеиназы, химотрипсин)...................................................................................26

2.3. Са2+ - активируемые нейтральные протеиназы ...............................36

3. Посмертные изменения белков в тканях гидробионтов...........................42

4. Роль протеиназ в физиолого-биохимических адаптациях морских беспозвоночных......................................................................................................46

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Материал...................................................................................................48

1.1. Краткая характеристика исследуемых объектов...............................48

1.1.1. Исландский гребешок........................................................................48

1.1.2. Морской еж.........................................................................................49

1.1.3. Камчатский краб, акклиматизированный в Баренцевом море.....50

1.2. Методика отбора, хранения и обработки биологических проб........51

2. Методы исследований...............................................................................54

2.1. Определение стадий зрелости исследуемых организмов...................54

2.2. Приготовление гомогенатов тканей и экстракция протеиназ..........57

2.3. Определение активности протеиназ....................................................58

2.4. Определение концентрации белка в пробах.......................................59

2.5. Схема выделения и очистки исследуемых протеиназ......................59

2.5.1. Методы группового осаждения белков............................................59

2.5.2. Разделение белков из тканей исследуемых объектов методом гель-фильтрации на колонках с сефадексом G-100 и с ультрогелем АсА-34...........61

2.5.3. Определение молекулярной массы исследуемых белков методом гель-фильтрации....................................................................................................62

2.5.4. Оценка степени белкового автолиза тканей при различных режимах и сроках хранения сырья.......................................................................63

2.5.5. Ионообменная хроматография на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой.............................................................................................................63

2.5.6. Диск-электрофорез в ПААГ..............................................................64

2.6. Статистическая обработка данных......................................................64

ГЛАВА III. СПЕКТР И ТКАНЕВАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОТЕИНАЗ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.

1. Пищеварительные органы.........................................................................65

2. Половые органы........................................................................................73

3. Мышечные ткани......................................................................................77

ГЛАВА IV. ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ В ПРОЦЕССЕ ГОДОВЫХ ЦИКЛОВ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.

1. Динамика активности внутриклеточных протеолитических ферментов в гонадах морского ежа в процессе созревания половых продуктов......................81

1.1. Активность катепсина Б, эластазы и акрозина.................................81

1.2. Активность кальпаиноподобных ферментов......................................85

2. Динамика общей протеолитической активности в гонадах гребешка в процессе годового цикла развития..........................................................................90

ГЛАВА У. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНАЗ В ПРОЦЕССЕ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ И СРОКОВ ХРАНЕНИЯ СЫРЬЯ.

1. Камчатский краб.......................................................................................94

1.1. Изменения фракционного состава белков.........................................94

1.2. Изменение протеолитической активности.........................................96

2. Исландский гребешок................................................................................97

2.1. Изменения фракционного состава белков.........................................97

ГЛАВА VI. ЧАСТИЧНАЯ ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ ТКАНЕЙ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ.

1. Катепсин D..............................................................................................103

1.1. Катепсин D из гепатопанкреаса камчатского краба........................104

1.2. Катепсин D из гонад исландского гребешка....................................112

2. Комплексные препараты протеолитических ферментов.........................116

2.1. Комплекс кислых протеиназ из гонад исландского гребешка........116

2.2. Комплекс протеолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба...............................................................................................120

3. Сравнительная характеристика полученных препаратов протеолитических ферментов..............................................................................122

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................124

ВЫВОДЫ...................................................................................................125

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................128

ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................................150

ВВЕДЕНИЕ

Протеолиз - один из наиболее фундаментальных биохимических процессов. В течение последних десятилетий произошла полная переоценка значения протеолитических реакций в регуляции метаболизма и стало ясно, что именно протеолиз в значительной мере определяет физиолого-биохимический статус организма и направленность обменных процессов в нем, обеспечивает устойчивость организма к изменяющимся условиям внутренней и внешней среды (Тутельян, Васильев, 1982; Антонов, 1983).

Протеиназы в организме животных выполняют целый ряд важных функций: регулируют ключевые этапы метаболизма (ограниченный протеолиз); обеспечивают энергетические потребности организма путем расщепления белковой составляющей пищи (пищеварение); исправляя ошибки биосинтеза, защищают организм от возможного воздействия чужеродных белков (внутриклеточный протеолиз). Процесс катаболизма белков является неотъемлемой частью белкового обмена и характерен для всех живых организмов, но его интенсивность сильно варьирует в зависимости от типа обменивающихся белков и локализации протеолитических реакций.

У всех животных присутствует широкий набор протеолитических ферментов, способных расщепить белковую молекулу до составляющих аминокислот. Важная роль, которую играют эти ферменты в обмене веществ у животных, обуславливает огромный интерес к изучению их физиологических функций и механизмов протеолиза (Мосолов, 1971, 1983, 1988; Антонов, 1983; Немова, 1991; Уголев, Кузьмина, 1993; Gordon, 1973; Gildberg, 1988; ВоЫеу, 1987).

Успехи, достигнутые в исследованиях протеиназ человека, млекопитающих, микроорганизмов (Евтихина, Орехович, Шкипитер, 1963; •./ Казакова, Орехович, 1975; Contractor, Mason, Oakey, 1982) в меньшей степени относятся к гидробионтам и практически не коснулись морских

беспозвоночных. Вместе с тем, моллюски, ракообразные и иглокожие - одни из наиболее древних, многочисленных в видовом отношении и разнообразных по экологии классов животных. Изучение биохимических принципов, обеспечивающих жизнедеятельность морских беспозвоночных несомненно помогает в понимании биохимических процессов у высших таксонов (Сидоров, 1986).

Актуальность изучения протеиназ морских беспозвоночных определяется с одной стороны функциями, которые выполняют эти ферменты в организме, а с другой стороны, несомненной практической значимостью. Особый интерес представляет изучение вопросов, связанных с протеолизом у хозяйственно-ценных объектов, таких, как ракообразные и моллюски. Изучение протеолитических ферментов беспозвоночных, во-первых, может иметь значение для понимания их жизнедеятельности, во-вторых, это позволит более рационально использовать добываемое сырье, а именно - для получения препаратов протеолитических ферментов и использования их в медицине, пищевой и легкой промышленности.

Цель настоящих исследований, заключалась в изучении спектра, локализации и свойств протеолитических ферментов и в выяснении их физиологической роли в тканях некоторых промысловых беспозвоночных Баренцева моря в различные периоды годовых циклов. Выбор объектов исследований обусловлен, с одной стороны, промысловым значением этих видов, а, с другой стороны, необходимостью исследования представителей различных таксонов морских беспозвоночных в эволюционно-биохимическом аспекте, слабо представленном в литературе.

Исходя из поставленной цели решались следующие задачи: - изучить спектр и тканевую локализацию протеиназ представителей различных таксонов беспозвоночных Баренцева моря: ракообразных -камчатского краба, акклиматизированного в Баренцевом море РагаШкоёеБ сат15скШ\саш, моллюсков - исландского гребешка СЫатуз \slandica и трубача

Buccinum undatum; иглокожих - морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis и кукумарии Cucumaria frondosa .

- исследовать динамику активности некоторых протеиназ в ходе половых циклов исландского гребешка и морского ежа.

- провести работы по выделению, очистке и охарактеризовать наиболее перспективные для практического применения протеиназы: катепсин D и комплекс кислых протеиназ из гепатопанкреаса краба и гонад гребешка.

- изучить влияние протеолиза и активности протеиназ в тканях исландского гребешка и камчатского краба на степень сохранности сырья в процессе различных режимов и сроков хранения.

В данной работе исследован спектр протеиназ, участвующих в пищеварении и во внутриклеточном катаболизме белков в различных тканях камчатского краба, исландского гребешка, морского ежа, кукумарии и трубача. Результаты изучения изменения активности протеиназ в процессе гаметогенеза у морских беспозвоночных дают возможность оценить роль протеолиза в жизненном цикле морских беспозвоночных. Впервые выявлены закономерности изменения активности Са2+ - активируемых протеиназ, катепсина D и эластазы в процессе созревания половых продуктов морских беспозвоночных. Впервые, выделен и охарактеризован катепсин D и комплекс кислых протеиназ из гонад исландского гребешка и гепатопанкреаса камчатского краба.

Проведено детальное изучение динамики изменения фракционного состава белков и активности протеиназ в процессе хранения сырья. Определено, что отношение площади пика высокомолекулярных белков к сумме площадей пиков низкомолекулярных белковых веществ при использовании метода гель-фильтрации может быть использовано для оценки качества белковых продуктов и свежести сырья животного происхождения.

Результаты, полученные в ходе проведенных исследований, использованы для формирования банка данных по пищевой и биологической ценности гидробионтов, а также при разработке рекомендаций комплексного

использования сырья для получения пищевой продукции и биологически активных веществ.

Показатели уровня активности исследуемых протеиназ (особенно катепсина Б) могут быть использованы в качестве биохимических критериев оценки стадий зрелости и готовности к оплодотворению.

Показана возможность получения препаратов протеиназ из внутренних органов изученных гидробионтов, которые в настоящее время слабо используются и являются отходами промышленной переработки, что, в свою очередь, имеет значение для решения проблемы более рациональной эксплуатации морских ресурсов. Это касается, главным образом, комплексных ферментных препаратов из гонад исландского гребешка и гепатопанкреаса акклиматизированного камчатского краба.

Определены допустимые сроки холодильного хранения некоторых промысловых беспозвоночных для получения ферментных препаратов.

Эта работа является основой для более углубленного изучения системы протеолиза у морских беспозвоночных в сравнительно-биологическом и эволюционно-физийлогическом аспектах.

Теоретическое значение данной работы состоит в возможности оценить процесс протеолиза в сравнительно-эволюционном аспекте. Данные наших исследований можно использовать для оценки периодизации онтогенеза.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОЛИЗА И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ.

Протеолиз - один из важнейших биохимических процессов, включающий в себя ферментативный гидролиз пептидных связей в веществах белковой природы. Внутриклеточный протеолиз имеет два направления: 1). внутриклеточное переваривание белка пищевых и инородних частиц, захваченных путем фагоцитоза и пиноцитоза; 2). катаболические процессы белков, составляющих сами клетки. Клетки также выделяют ферменты для внеклеточного протеолиза, в частности для пищеварения и иммунных реакций.

Известно, что протеолиз осуществляется при участии целой системы протеиназ и пептидаз. Огромное разнообразие протеолитических ферментов объясняется, очевидно, большим количеством различных белков, каждый из которых имеет свою субстратную конформацию, особенности аминокислотного состава, доступность пептидных связей для расщепления. Кроме того, для каждого фермента характерна субстратная специфичность, свой оптимум рН, зависимость от температуры и локализация в клетке и во внеклеточном пространстве (ВоЫеу, 1987).

В зависимости от локализации протеолитических процессов в организме и условий функционирования, спектр протеиназ значительно варьирует. Так, для полостей, где происходит пищеварение (желудок, кишечник), характерен набор пищеварительных протеиназ: гастриксины, пепсины, трипсины, химотрипсины и др. Состав протеиназ внутри клетки также различен: в цитозоле, митохондриях и рибосомах преобладают протеолитические ферменты, обычно активные при нейтральных рН, в то время, как лизосомальная система, дающая максимальный вклад во внутриклеточный протеолиз, содержит катепсины, активные в слабокислой

среде. Общим является то, что любая система, где имеют место протеолитические реакции, обладает набором ферментов, способным наиболее эффективно расщепить белок до аминокислот и олигопептидов (Проссер, 1977).

Внутриклеточный протеолиз, деструктивная функция которого направлена, главным образом, на расщепление внутриклеточных компонентов, включает 2 пути: лизосомальный и нелизосомальный. Внутриклеточный протеолиз, осуществляемый при участии лизосомного аппарата позволяет устранять ошибки в транскрипции, трансляции и в посттрансляционных процессах с освобождением свободных аминокислот в качестве источников энергии из "неправильных" белковых молекул (ВоЫеу, 1987). Лизосомальные протеиназы не только обеспечивают энергией внутриклеточные процессы и избавляют клетку от ненужных белков, но и участвуют в реакциях ограниченного протеолиза, выступают в качестве инструмента выключения и переключения определенных звеньев белкового обмена (Локшина, 1979). Важную роль играют протеолитические ферменты при адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям внешней среды, в осуществлении защитных функций организма.

Обмен белков достаточно универсален и свойственен всем организмам. Интенсивность белкового обмена характеризует время полураспада. По этому признаку белки условно делятся на три главные группы:

1. очень быстро обменивающиеся белки (г/2 < 1 часа) 2. быстро обменивающиеся белки (т/2 =1-24 часа) 3. медленно обменивающиеся белки (т/2 > 24 часов) 4. белки устойчивые к действию протеиназ (коллаген, эластин, кератин и др.) (т/2 > 1 года).

Митохондриальные белки гораздо более стабильны, чем белки ядер, мембран, цитозоля. Локализация белков в митохондриях во многих случаях предохраняет их от протеолитического расщепления. Внутриклеточная локализация деградации очень быстро обменивающихся белков еще не совсем ясна (ВоЫеу а1., 1985). Медленно обменивающиеся и значительная

часть быстрообменивающихся белков деградируют в лизосомах (Дин, 1981; Barrett, 1975, 1980; Dingle, Fell, 1969; Hanson, Bohley, 1974). Это указывает на важную роль лизосом в общем протеолизе (De Duve, 1983; Hutson, Mortimore, 1982; Kominami, Ueno, 1990). Концентрация протеиназ в лизосомах достигает иногда очень высоких концентраций (до 1 мМ) (Дин, 1981; Bohley, 1987). Лизосомальная система играет главную роль во внутриклеточном протеолизе, так как она способна лизировать клеточные структуры и обладает огромной протеолитической способностью (Dean, 1980; Vaillant, 1978; Tapper, Sondler, 1990). Известно, что в клетке может расщепляться белковый материал трех категорий: 1. экзогенные белки, пептиды с разной длиной цепи, поступающие в клетку из окружаюющей среды или пищеварительных полостей; 2. эндогенные белки, являющиеся частью самой клетки; 3. белковые частицы, синтезируемые клеткой, но предназначенные для удаления из клетки (Gordon, 1973; De Duve, 1983; Bohley, 1987). Абсолютные показатели скорости катаболизма белков зависят от многих факторов, среди которых наиболее важными являются, вероятно, следующие: 1). концентр