Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительные исследования панкреотических сериновых протеиназ гидробионтов Тихого океана

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Пивненко, Татьяна Николаевна, Владивосток

■ /

Тихоокеанский иаучно-исследовательскии рыоохозяиственныи цен тр

.¿президиум ВАК Рос-.-.

глазмо от " " 19 г„

На правах рукопири

судил ученую степень ДОК' 1 О t

5

■УДК 577.152,344

1_л ■

'чадъник управления ВАК Рос

Пивненко Татьяна Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ СЕРИНОВЫХ ГТРОТЕИНАЗ ГИДРОБИОНТОВ ТИХОГО ОКЕАНА 03. 00. 04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант лауреат Государственной премии СССР, доктор биологических наук, профессор Л.М. Эпштейн

Владивосток - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.........................................................6

Глава 1. Обзор литературы......................................... 10

1.1. Эффективность действия сериновых протеиназ и их роль в регуляции белкового

обмена..........................................................10

1.1.1 .Строение активного центра и структура фермент-субстратных комплексов

...................................................................10

1.1.2. Регуляция белкового обмена и контроль протеолиза...............20

1.2. Филогенетические аспекты взаимосвязи структуры и свойств сериновых протеиназ.........................................................24

1.3. Сериновые протеиназы рыб......................................29

1.3.1. Локализация и секреция........................................29

1.3.2. Выделение, молекулярные и каталитические свойства..............31

1.4. Панкреатические сериновые протеиназы морских беспозвоночных.....40

1.5. Общие свойства металлозависимых коллагенолитических протеиназ ... 44

1.6. Методы выделения сериновых протеиназ............................50

1.6.1. Традиционные способы получения комплексных препаратов и индивидуальных ферментов...........................................50

1.6.2. Аффинная хроматография и ее применение для выделения и исследования трипсина и химотрипсина..............................................52

1.7. Иммобилизация и стабилизация ферментов..........................69

1.7.1. Модификация водорастворимыми полимерами....................70

1.7.2. Иммобилизация на носителях смешанного типа....................71

1.7.3. Стабилизация ферментов в водно-органических системах...........73

1.7.4. Стабилизация в системах с твердыми фазами......................75

1.7.5. Иммобилизованные ферменты как лекарственные средства..........76

Экспериментальная часть Глава 2. Материалы и методы

2.1. Биологические материалы и реактивы................................79

2.2. Методы анализа химического состава................................80

2.3. Методы определения активности протеолитических ферментов........80

2.3.1. Определение активности с использованием растворимых белковых субстратов.......................................................... 80

2.3.2. Определение активности с использованием нерастворимых белковых субстратов......................................................... 81

2.4. Определение эстеразной активности............................... 82

2.5. Определение амидазной активности............................... 82

2.6. Метод гель-фильтрации, определение молекулярной массы............83

2.7. Метод электрофореза, определение молекулярной массы..............85

2.8. Ионообменная хроматография....................................86

2.9. Аффинная хроматография........................................86

2.10. Синтез аффинных сорбентов.......................................87

2.10.1. Активация сорбентов с помощью бромциана.....................87

2.10. 2. Использование глутарового альдегида..........................88

2.10.3. Применение карбодиимидов...................................88

2.10.4. Радиационно-химический метод активации целлюлозы............90

2.10.5. Синтез сополимера силохрома и поливинилового спирта...........92

2.11. Иммобилизация ферментов на эпителии слизистой оболочки кишечника

2.12. Иммобилизация в альгинатных гелях............................. 94

2.13. Статистическая обработка....................................... 94

Результаты и обсуждение Глава 3. Содержание и состав сериновых протеиназ в панкреатической ткани гидробионтов.......................................................96

3.1. Протеолитическая активность панкреатической ткани гидробионтов.....98

3.2. Состав изоформ трипсинов и химотрипсинов.........................103

3.3. Молекулярная масса трипсинов и химотрипсинов.....................114

3.4. Классификация панкреатических сериновых протеиназ гидробионтов ... 115

Глава 4. Выделение и очистка ферментных препаратов................120

4.1. Применение ультрафильтрационной технологии для получения комплексных препаратов панкреатических протеиназ..................................120

4.1.1. Очистка экстракта с использованием адсорбентов.................... 124

4.1.2. Ультрафильтрация...............................................126

4.1.3. Сравнительный анализ предлагаемых и известных ранее методов.......128

4.2. Использование метода аффинной хроматографии для очистки и выделения трипсина и химотрипсина..............................................134

4.2.1. Аффинные сорбенты для очистки трипсина и химотрипсина, содержащие природные высокомолекулярные ингибиторы.............................134

4.2.2. Аффинные сорбенты, содержащие в качестве лигандов аминокислоты и их производные............................................................138

4.2.3. Аффинные сорбенты для выделения анионных форм трипсина и химотрипсина..........................................................143

4.2.3.1.Аффинные сорбенты, содержащие в качестве лигандов 1,6 гексаметилендиамин....................................................144

4.2.3.2. Аффинные сорбенты, имеющие в качестве лиганда гетероауксин......150

4.2.3.3. Аффинные сорбенты, имеющие в качестве лиганда бензоил-s-аминокапроновую кислоту-гексаметилендиамин...........................154

4.2.4.Концентрирование белковых фракций и удаление элтоэнтов.............159

Глава 5. Исследование субстратно-ингибиторной специфичности

панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения.

5.1. Гидролиз белков панкреатическими ферментными системами различного происхождения..........................................................162

5.1.1. Кинетика гидролиза белковых субстратов.............................164

5.1.2. Молекулярный состав гидролизатов.................................166

5.1.3. Состав свободных аминокислоте ферментативных гидролизатах........171

5.2. Гидролиз коллагена: вклад отдельных протеиназ и влияние различных факторов ........................................................................175

5.3. Субстратная специфичность гидролиза низкомолекулярных субстратов......193

5.4. Ингибиторная специфичность панкреатических сериновых протеиназ......193

5.4.1.Взаимодействие с низкомолекулярными обратимыми ингибиторами.......200

5.4.2. Взаимодействие с природными белковыми ингибиторами...............202

5.4.3. Взаимодействие с необратимыми ингибиторами.......................206

5.4.4. Взаимодействие протеолитических ферментов с пептидными иммунорегулято

рами, очистка и выделение ингибиторов...................................206

5. 4. 4.1. Сравнительный анализ ингибиторных свойств иммуномодуляторов ... .206

5.4.4.2. Аффинная хроматография пептидных ингибиторов..................209

5.4.4.3. Некоторые свойства пептидных ингибиторов.......................210

Глава 6. Получение и характеристика иммобилизованных форм

панкреатических сериновых протеиназ..................................215

6.1. Адсорбционная иммобилизация на неорганических матрицах...........216

6.2. Иммобилизация протеолитических ферментов на эпителии слизистой оболочки кишечника..............................................................218

6.3. Иммобилизация протеолитических ферментов в среде альгинатных гелей . .223 Глава 7. Применение протеолитических ферментных препаратов из гидробионтов в различных отраслях....................................230'

7.1. Ферментативные способы приготовления белковых гидролизатов с использованием препаратов различной специфичности......................230

7.2. Применение ферментов для обработки мясного сырья....................234

7.3. Применение ферментных препаратов для обработки икры.................238

7.4. Производство питательных сред на основе рыбного сырья................246

7.4.1. Ферментативный гидролиз белковых субстратов для получения питательных сред....................................................................246

7.4.2. Использование аминопептидного концентрата для получения питательных сред....................................................................252

7.5. Использование протеолитических ферментных препаратов в качестве ростостимулирующих кормовых добавок................................. 256

7.5.1. Гидролиз комбикормов и их составных частей........................256

7.5.2. Эффективность использования ферментных препаратов в рационе свиней. 258

7.5.3. Испытания ферментной добавки в рационах телят.....................260

7.5.4. Испытания ферментных препаратов при выращивании бройлеров........262

7.5.5. Использование протеолитических ферментов при выращивании молоди

рыб...................................................................263

Заключение

Выводы ...........

Список литературы

268

271 274

/

ВВЕДЕНИЕ

Исследование ферментов как биологических катализаторов представляет собой одно из наиболее перспективных направлений современной биохимии. Теоретические аспекты взаимосвязи структуры и механизма действия ферментов, а также направления их практического применения исследуются и разрабатываются на протяжении многих лет. Однако эта проблема не теряет своей актуальности, так как развитие современных технологических процессов позволяет упростить и удешевить многоступенчатую и высокозатратную процедуру выделения ферментных препаратов, а развитие научных методов исследования - определить тонкие механизмы действия биокатализаторов и находить пути регулирования процессов in vivo и in vitro, масштабировать их.

Понимание регуляторной роли протеолитических ферментов имеет первостепенное значение для расшифровки молекулярных механизмов таких сложнейших биологических явлений как деление и трансформация клеток, дифференцировка и морфогенез, метаморфоз, адаптационные перестройки обмена, нейробиологические процессы и другие. В осуществлении таких функций организма, как свертывание крови, активация системы комплимента, переваривание пищи, протеолиз служит не только для запуска, но и для реализации всего процесса. Этим определяется большой интерес к изучению протеиназ в различных областях биологии и медицины.

В пищеварительном процессе ведущая роль принадлежит таким простейшим (с точки зрения структуры) ферментам как трипсин, химотрипсин и эластаза. Их основная функция заключается в расщеплении пищевых белков; широкое распостранение и доступность в относительно больших количествах делает их удобными объектами для изучения структуры, функции, регуляции активности и решения других актуальных задач энзимологии. Установление структуры кристаллических ферментов показало, что полипептидные остовы всех трех ферментов при наложении их друг на друга практически совмещаются за исключением участков, где добавлено или пропущено несколько аминокислот. Различия же в специфичности этих ферментов обусловлены небольшими изменениями в строении «кармана», связывающего боковые цепи аминокислот.

Специфичность сериновых протеиназ и определяет основные различия между весьма близкими по физиологическим функциям и структурным параметрам ферментами, осуществляющими гидролиз пептидных, эфирных и амидных связей по единому механизму при сохранении высокой степени гомологичности, как между представителями отдельных классов ферментов, так и внутри классов между ферментами различного происхождения. Взаимосвязь между структурой и функциями протеолитических ферментов может быть установлена при сравнительном анализе детально изученных ферментов (например, бычьих трипсина и химотрипсина) и ферментов, выделенных из панкреатической ткани животных различных таксономических групп, обладающих характерными отличиями. При этом необходимо учитывать, что структурные особенности, влияющие на взаимодействие с субстратами и ингибиторами, могут затрагивать не только «гидрофобный карман», но и окружение каталитического центра, регуляторный участок и даже поверхность всей молекулы.

В настоящее время при рассмотрении эволюции ферментов и их филогенетического разнообразия используют следующий подход. Ферменты, которые имеют сходство каталитических функций, должны проявлять весьма близкое сходство и в структуре. Отсюда проистекает возможность предполагать те структурные требования, которые необходимы для проявления определенных функций. В случае сериновых протеиназ этот подход особенно продуктивен: по причине отсутствия простатических групп и субъединичного строения их свойства напрямую зависят от аминокислотной последовательности.

Одним из богатейших источников для выделения протеолитических ферментов являются внутренние органы морских организмов. Перспектива их использования определяется следующими аспектами: обширной сырьевой базой за счет утилизации отходов рыбного промысла и неординарными свойствами биокатализаторов из морских организмов. Уникальность этих свойств связана с тем, что добываемые в процессе рыбного промысла организмы находятся на различных эволюционных ступенях развития.

Поиск и идентификация новых ферментов, обладающих необычными свойствами, являются актуальными задачами энзимологии. Именно на этом пути возможно выявление еще не исследованных особенностей и принципов

ферментативного действия, неизвестных механизмов и даже типов биокаталитического действия. Таким необычным свойством, ранее неизвестным для сериновых протеиназ, является способность некоторых из них гидролизовать с высокой скоростью фибриллярный коллаген. Первоначально обнаруженное для ракообразных и некоторых паразитических насекомых и гельминтов, проявление этого качества связывалось с приспособлениями к пищевым потребностям. Накопленный при дальнейшем изучении материал позволяет связать указанные свойства с филогенетической градацией. Кроме того, изучение молекулярной структуры и каталитических свойств сериновых протеиназ ракообразных и насекомых не позволяет сделать однозначного заключения о том, как имеющиеся различия могут сказываться на процессах деструкции коллагена. Процесс коллагенолиза является весьма сложным и осуществляется узкоспецифичными металло-зависимыми протеиназами, и имеет многофакторную систему регуляции, нарушения которой вызывают ряд патологических изменений всего организма. Изучение деструкции коллагена под действием ферментов, иных по специфичности и механизму действия, позволяет уточнить детали его протекания и экзогенной регуляции.

Наличие в организме достаточно тонких и надежных механизмов контроля протеолиза позволяет обеспечить его максимальную эффективность и высокую избирательность. Считают, что в организме имеется система биологических регуляторов (цитомединов), осуществляющих перенос специфической информации, необходимой для нормального функционирования клеточных популяций. Некоторые из них представляют собой низкомолекулярные тканеспецифичные пептиды, обладающие ингибиторными свойствами по отношению к сериновым протеиназам. Зависимость между ингибиторными и иммунными свойствами в настоящее время совершенно не исследована. Данная проблема представляет интерес для выявления механизма действия ингибиторов протеиназ как иммуностимуляторов, и разработки новых методологических подходов к определению потенциальных иммуномодуляторов.

Отличия структуры и специфичности сериновых протеиназ гидробионтов предполагают также разработку новых методов их выделения, очистки и стабилизации, т.к. ранее предложенные для выделения катионных сериновых

протеиназ приемы в большинстве случаев оказались малоэффективными. Это относится и к методам работы с тканевыми экстрактами, и к разделению ферментов на аффинных сорбентах. Высокая эффективность аффинной хроматографии обеспечивается изучением и соответствующим использованием механизма комплексообразования между аффинными лигандами и активными центрами ферментов, этот метод также позволяет идентифицировать локусы ферментов, принимающие участие в таких процессах. Продуктивность и селективность взаимодействия зависят от ряда факторов: степени сродства и концентрации лиганда, наличия или отсутствия неспецифической сорбции, а также условий реакционной среды. Эти факторы должны быть учтены при создании сорбентов для ферментов отдельных групп или даже индивидуальных их представителей.

Актуальность исследования протеолитических ферментов имеет также практический аспект. Сфера применения протеолитических ферментов необычайно широка, она включает медицину, фармакологию, легкую и пищевую промышленности, сельское хозяйство, аналитическую биохимию и биотехнологию. Введение в эту сферу новых препаратов позволит не только расширить сырьевую базу для их получения, но и предложить новые способы и области их использования.

В свете вышеизложенной актуальности изучаемой проблемы целью данной работы являются: сравнительный биохимический анализ сериновых протеиназ гидробионтов различных таксономических групп, определение основных каталитических, физико-химических, молекулярных свойств, а также общих закономерностей, связывающих свойства и структуру ферментов, разработка эффективных методов выделения, стабилизации и регуляции активности ферментов, определение наиболее рациональных путей их применения.

Настоящая работа является продолжением и развитием многолет�