Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибиторы сериновых протеиназ из семян кукурузы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ливенская, Ольга Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Белки-ингибиторы сериновых протеиназ у растений семейства злаковых

1.1. Распространение и локализация

1.2. Аминокислотный состав и физико-химические свойства

1.3. Первичная структура

I .4. Физиологические функции.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы.

2.2. Аффинная хроматография.

2.3. Гель-хроматография

2.4. Изоэлектрическое фокусирование

2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.6. Аминокислотный анализ.

2.7. Восстановление дисульфидных связей и их алкилиро-вание.

2.8. Определение содержания сульфгидрильных групп

2.9. Спектры кругового дихроизма.

2.10. Спектры поглощения и собственная флуоресценция

2.11. Диссоциация комплекса фермент-ингибитор

2.12. Определение активности ингибиторов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Содержание ингибиторов протеолитических ферментов в семенах растений семейства злаковых

3.2. Ингибиторы химотрипсина и трипсина из семян кукурузы.

3.2Д. Выделение и очистка.

3.2.2. Аминокислотный состав

3.2.3. Физико-химические свойства

3.2.4. Особенности структурной организации. Действие денатурирующих факторов

3.2.5. Взаимодействие с ферментами

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ингибиторы сериновых протеиназ из семян кукурузы"

Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в живом организме, начиная с переваривания белков пищи и запасных белков семян до специфических регуляторных процессов, таких как активация зимогенов, образование гормонов и других физиологически активных пептидов из их предшественников, транспорт белков, защитные реакции /1-4/. В связи с этим изучение механизмов регуляции активности протеолитических ферментов приобретает особую актуальность. Один из таких механизмов связан с наличием в органах и тканях специфических белковых веществ, действующих как ингибиторы протеолитических ферментов /5,6/.

В целом ингибиторы протеиназ представляют обширную группу белковых веществ, общим свойством которых является способность образовывать с ферментами соединения (комплексы), в которых субст-ратоподобное связывание в активном центре фермента приводит к конкурентному ингибированию всех каталитических функций. Несмотря на разнообразие встречаемых ингибиторов, все они могут быть сгруппированы в небольшое число классов или типов. Каждый тип или класс соответствует тому или иному классу протеолитических ферментов. Различают ингибиторы сериновых протеиназ, цистеиновых и аспар-тильных протеиназ и металлопротеиназ /7,8 /.

Широкое распространение ингибиторов сериновых протеиназ в различных органах и тканях животных, в растениях и микроорганизмах подчеркивает их биологическую значимость, что может быть связано с возможностью временных и локальных ограничений ферментативной активности.

В настоящее время накапливаются данные, указывающие на активную роль белков-ингибиторов протеиназ в защите растений от поражения насекомыми и фитопатогенными микроорганизмами. В 1954 году в семенах сои был впервые обнаружен специфический ингибитор пищеварительного цротеолиза насекомых рода Mboiium /9/, а затем из сои выделили два белка, подавляющие активность s Н-зависимых сериновых протеиназ ЛИЧИНОК жука Tribolium constaneum и Triboiium confusum /10,11,12/. Подобный белок-ингибитор обнаружен и в семенах пшеницы /13/. Одновременно из пищеварительного тракта насекомого Tenebrio moiitor очищена уб -протеиназа, активность которой подавлялась рядом ингибиторов трипсина и химотрипсина, полученных из растений /14/; а в 1979 году появилось сообщение о том, что ингибитор трипсина из вигны угнетает процесс развития жука Collosobruchus maculatus /15/.

Как известно, фитопатогенные грибы - обширная группа микроорганизмов, вызывающих различные заболевания растений, - выделяют в окружающую среду цротеолитические ферменты /16,17/. Поэтому интерес представляет тот факт, что в семенах фасоли присутствует специфический ингибитор протеаз фитопатогенного гриба Coiieto-trichum lindemuthianum /18/. Кроме того, протеолитическую активность экзоцротеиназ грибов рода Fusarium подавляют очищенные препараты ингибитора трипсина и химотрипсина из фасоли /19, 20/. Экзоцротеиназы этого гриба инактивируются также белками-ингибиторами Кунитца и Баумана-Бирк из сои, ингибиторами из лимской фасоли и клубней картофеля /21/. Недавно удалось показать, что ингибиторы химотрипсина и трипсина из семян гречихи способны ин-гибировать протеинаЗЫ, секретируемые грибом Alternaria tennuis Hess , а также угнетают рост мицелия этого гриба /22/. Приведенные результаты не согласуются с распространенным до сих пор в литературе взглядом на ингибиторы протеиназ, содержащиеся в растениях, только как на вещества, снижающие пищевую ценность растительных продуктов /23/. Очевидно, эти цредставления не учитывают значения ингибиторов для самих растений как фактора повышения их биологической устойчивости. Данные, касающиеся белков из растений семейства злаковых ( Gramineae ), инактивирующих цротеиназы микроорганизмов и насекомых, немногочисленны; они будут рассмотрены в разделе 1.4. обзора литературы.

В настоящее время наиболее подробно изучены ингибиторы протеиназ из растений, принадлежащих к семействам бобовых ( Legumi-nosae ) и пасленовых ( Soianaceae ). Сведения относительно ингибиторов протеиназ у растений других семейств носят отрывочный характер. Это относится и к растениям семейства злаковых. Поскольку семена злаков являются важнейшим источником пищевого и кормового белка, изучение содержащихся в них ингибиторов протеолитических ферментов имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение.

В настоящей работе была поставлена задача выделить и детально охарактеризовать ингибиторы сериновых протеиназ из семян кукурузы ( Zea mays. L. ), являющейся важным источником пищевого и > кормового белка.

В ходе исследований проведено количественное определение содержания ингибиторов протеиназ в семенах злаков. Из семян кукурузы выделены S формы ингибитора химотрипсина с pi 4,45, 4,65 и 5,10, а также 2 формы ингибитора трипсина с pi 4,50 и 5,60. Молекула ингибитора химотрипсина с молекулярным весом 19 ООО состоит из одинаковых субъединиц. Характерной чертой ингибитора является отсутствие в его составе остатков цистеина. Эта особенность представляет принципиальный интерес, так как ингибиторы протеиназ растительного происхождения обычно характеризуются высоким содержанием дисульфидных связей.

Ингибитор химотрипсина обладает широким спектром действия на ферменты и подавляет активность субтилизина и ряда других протеиназ микроорганизмов, образуя с ферментом комплексы двух типов IgEg и 12Е. Ингибитор трипсина из кукурузы напротив,отличается весьма узкой специфичностью и не оказывал заметного ингибирующего действия ни на одну из исследованных Еротеиназ за исключением протеиназ ИЗ Streptomyces griseus.

Исследованы особенности вторичной структуры ингибиторов с помощью метода БД. Анализ спектров КД позволяет отнести ингибитор химотрипсина к структурному классу белков (оС + б) и ингибитор

Необходимо отметить, что ингибиторы протеиназ из семян кукурузы оставались до сих пор малоисследованными. Имелись лишь немногочисленные и частично противоречивые данные об ингибиторах трипсина в семенах кукурузы. Что касается ингибиторов химотрипсина и микробных протеиназ, то такие данные полностью отсутствовали. Детальное знание ингибиторов протеиназ, содержащихся в семенах кукурузы, может послужить основой для направленной селекции с целью создания сортов, обладающих как высоким качеством белков, так и повышенной устойчивостью.

Отдельные части диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по перспективам использования биоспецифической хроматографии в технологии производства высокоочищенных ферментов (Вильнюс, 1982), 1У Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Киев, 1983), Международном симпозиуме ФШО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Пущино, 1983), У1 Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига, 1983), ХУТ конференции ФЕБО (Москва, 1984), а также на научных конференциях Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР. трипсина - к классу

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. БЕЛКИ-ШГИБИТОРЫ СЕРИНОШХ ПРОТЕИНАЗ У РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА ЗНАКОВЫХ

I.I. Распространение и локализапия,

С тех пор, как Кунитц /24-26/ первым выделил ингибиторы трипсина из поджелудочной железы быка и бобов сои, обнаружено большое количество белковых ингибиторов протеиназ в различных органах и тканях животных, в растениях и микроорганизмах /5,8,27,28/. Панкреатические ингибиторы трипсина, овомукоиды и овоингибиторы, ингибиторы из молозива и ингибиторы Ascaris -протеиназ - хорошо известные примеры ингибиторов протеолитических ферментов, найденные в тканях животных /29-31/. Ингибиторы трипсина из соевых бобов и ингибиторы из лимских бобов, ингибитор химотрипсина из картофеля - примеры детально изученных ингибиторов протеиназ из растений /32-86/.

Присутствие белковых ингибиторов протеиназ в растениях семейства злаковых отмечалось еще Линером в 1969 г./52/. Эти белки можно разделить на 4 группы: I) ингибиторы трипсина, 2) ингибиторы химотрипсина и щелочных сериновых протеиназ микроорганизмов, 3) специфические ингибиторы микробных протеиназ и 4) ингибиторы эндогенных протеиназ /57-52/. Необходимо отметить, что наиболее изученные к настоящему времени эндогенные цротеиназы зерна являются в основном ферментами папаинового типа с оптимумом рН в кислой среде /43,53,54/; ингибиторы этих протеиназ в настоящем обзоре рассматриваться не будут.

В семенах злаков белки-ингибиторы сериновых протеиназ содержатся в эндосперме, зародыше, алейроновом слое и оболочке (табл. I). Они обнаружены в корнях, колеоптили, листьях проростков, но отсутствуют в дифференцированных вегетативных тканях. Это не исключает возможности их црисутствия в меристематических тканях у

Таблица I

Локализация ингибиторов сериновых протеиназ у растений семейства злаковых

Вид Локализация Ссылки

I 2 3

ИНГИБИТОРЫ ТРИПСИНА

Zea mays L. Эндосперм, зародыш 55-57 кукуруза) Корни проростков 40,58

Panicum miliaceum Ъ. Семена 59-62 просо)

Triticum vulgare Host. Зародыш 63-66 пшеница) Эндосперм 63,65-67,94

Семенная оболочка 65

Проростки 66,68,69

Oryza sativa L. Зародыш, семенная оболочка 70-72 рис)

Secale сereale L. Зародыш 63,64,66 рожь) Эндосперм 37,63,73

Корни проростков 68,69

Sorghum bicolor L. Семена 74-76 сорго)

Triticale Семена 77-80 тритикале)

Avena sativa L. Зародыш, эндосперм 63 овес)

Hordeum vulgare L. Зародыш, эндосперм. 55,63,81,82 ячмень) алейроновый слой

Корни проростков,колеоптили 63,82,83

Таблищ I (продолжение)

ИНГИБИТОРЫ ХИМОТРИПСИНА Zea mays L. кукуруза) Panicum miliaceum L. Семена (просо)

Triticum vulgare Host. Эндосперм, зародыш, семенная оболочка

Семена

Семена

Семена

59,84

65,85

85

85

80,85

Oryza sativa L. рис) Secale cereale L. рожь) b

Sorgum bicolor b. сорго) Triticale тритикале) Avena sativa L. овес)

Hordeum vulgare L. Эндосперм, зародыш 81-83,86

Корни,колеоптили, 82,83,86 листья проростков СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИНГИБИТОРЫ МИКРОБНЫХ ПРОТЕАЗ Ингибитор протеаз Hordeum vulgare L. Листья цроростков 86 ячмень)

Таблица I (окончание)

Ингибиторы субтилизина и эндогенной -амилазы Secale sereale L. Семена 85 рожь)

Triticum vulgare Host. Эндосперм 85,87 пшеница)

Triticale Семена 85 тритикале)

Hordeum vulgare L. Эндосперм, 85,88-92 ячмень) алейроновый слой

Ингибитор субтилизина Oryza sativa L. Семена 85,87,93 рис)

Ингибитор sH-завиоимых сериновых протеиназ личинок МУЧНОГО жука Tribolium castaneum Triticum vulgare Host. Семена 13 пшеница) зрелых растений данной систематической группы. В эндосперме и зародыше ячменя, пшеницы, ржи /63/ на долю ингибиторов трипсина приходится 5-10% водорастворимого белка, а группа ингибиторов химотрипсина и микробных протеаз в ячмене /95-97/ составляет 4-5% водорастворимой фракции белков /98/. Высокое содержание ингибиторов трипсина также отмечалось в семенах кукурузы /40/.

Распределение ингибиторов трипсина и группы ингибиторов химотрипсина и щелочных бактериальных протеиназ в покоящихся семенах злаков до некоторой степени различается. Наиболее высокая ан~ титриптическая активность обнаружена в зародыше пшеницы, ржи, овса и ячменя /55,63/. В значительно меньших количествах ингибиторы трипсина присутствуют в эндосперме этих культур /37,63,65-68,73, 81,82/, алейроновом слое ячменя /63,81,82/, семенной оболочке пшеницы /65/.

С помощью высокочувствительного иммунологического метода для таких культур, как пшеница /67/ и ячмень /81/ было показано, что локализованный в зародыше ингибитор трипсина отличен от ингибитора, присутствующего в эндосперме семени. Более того, иммунологический и иммуноэлектрофоретический анализ показал, что данный белок из зародыша ячменя аналогичен соответствующим ингибиторам зародыша пшеницы и ржи /99/, а ингибитор трипсина из эндосперма ячменя аналогичен соответствующему белку из эндосперма ржи /63, 67/. Иммунологические свойства очищенного из эндосперма пшеницы ингибитора трипсина, по-видимому, являются отличными не только от ингибиторов, локализованных в зародыше пшеницы, но и от ингибиторов, полученных из эндосперма ячменя и ржи /67/.

Выделенный из кукурузы ингибитор трипсина /55,56,100,101/ локализован в эндосперме, однако, имеются сведения о присутствии белков, подавляющих активность трипсина, и в зародыше /57/. В семенах проса /59-62/, сорго /75/, тритикале /77-79/ локализация ингибиторов не изучена. Развивающиеся новые органы - корни и ко-леоптили - пшеницы /66,68/, ячменя /63,82,83/, кукурузы /40,58, 102/, ржи /68/ также содержат белки, инактивирующие трипсин.

Ингибиторы химотрипсина и ряда сериновых микробных протеиназ, подобно ингибиторам трипсина,присутствуют на всех стадиях развития ячменя и пшеницы в меристематических тканях /63,82,83,86/. Однако, в отличие от последних, их особенно много в эндосперме зрелого и развивающегося семени /65,81,83,85,86,103/. Они обнаружены в зародыше и семенной оболочке пшенины, зародаше ячменя /65,81-83, 85,86/.

Среди белков семян ячменя (SPI1 альбумины) были идентифицированы два иммунологически различных ингибитора химотрипсина и бактериальных протеиназ, названные CI-I и (Я-2 /51,104-109,198/. Содержание ингибиторов в двадцать раз повышено в Hiproly ячмене, отличающимся высоким содержанием лизина /107,108,110,111/. Джонасвй и Свендсен показали, что ингибитор CI-I накапливается в эндосперме /112/; локализация белка CI-2 не определена. Помимо ингибиторов химотрипсина и сериновых микробных протеаз, листья проростков ячменя содержат основной белок с молекулярным весом около 24 000, который подавляет активность щелочных цротеаз Aspergillus oryzae , но не ингибирует химотрипсин и ряд бактериальных цротеаз /86/.

В семенах ячменя был впервые обнаружен ингибитор субтилизи-на /90/. Белок не действовал на химотрипсин, пепсин, протеолити-ческие ферменты црорастающего зерна, на ряд микробных протеиназ /85,90,91/, но подавлял активность эндогенной ^-амилазы /88/. Ингибитор присутствует в относительно больших количествах - около т

1,4 мг*г х зерна /90/ и локализован в эндосперме и алейроновом слое /92/. Он обнаруживается в проростках ячменя /88,89/, но в процессе прорастания семени не наблюдается его активного синтеза /92/, и, по-видимому, в этот период белок-ингибитор играет лишь пассивную роль.

Аналогичные вышеописанному ингибиторы субтилизина присутствуют в семенах пшеницы, ржи, тритикале и риса /85,87/. Недавно Мунди и соавторы /87/, используя антитела, выработанные против ингибитора субтилизина и эндогенной «?С-амилазы из ячменя, виделили иммунологически идентичный ингибитор из пшениш. Полученный белок, как и ингибитор из ячменя,не действовал на химотрипсин, трипсин, но специфически ингибировал d -амилазы пшеницы и близкородственных злаков подсемейства Festucoideae . Белки, подавляющие активность субтилизина, обнаружены также в семенах кукурузы и сорго /85/, но их действие на другие протеиназы не изучалось.

Кирси /103/ было проведено исследование синтеза ингибиторов протеолитических ферментов при формировании семени ячменя. Оказалось, что ингибиторы трипсина появляются на ранних стадиях данного процесса прежде основной массы белков и крахмала. Б отличие от этого, ингибиторы химотрипсина и щелочных бактериальных протеиназ синтезируются вместе с основными запасными белками, а максимальная величина их активности достигается после полного созревания семени. Содержание ингибиторов химотрипсина в зерне увеличивается при внесении азотных удобрений.

Б начальный период црорастания семени ячменя активность ингибиторов химотрипсина и микробных протеаз снижается в эндосперме, но резко увеличивается в зародыше, снова уменьшаясь в более поздний период роста /81-83/. Содержание же ингибиторов трипсина, значительно падая в зародыше /50,82,83/, остается относительно постоянным в ходе всего периода при расчете на проросток /81/. Иммунологический анализ показал, что ингибиторы сериновых цротеиназ, присутствующие в побегах, корнях и листьях проростков ячменя, различаются между собой и отличны от ингибиторов, локализованных в эндосперме и зародыше покоящегося семени /63,81,83,86/. Таким образом, в ходе прорастания, по-видимому, не происходит транспорта ингибиторов из эндосперма к меристематическим тканям. В ходе роста побега наблюдается постепенное снижение ингибиторной активности в растущих частях ячменя, и она полностью исчезает в дифференцированных вегетативных тканях /50,81,82/.

Сведения о синтезе и деградации ингибиторов сериновых протеиназ у других представителей семейства злаковых отсутствуют. Имеется лишь указание на то, что на ранних стадиях прорастания в семенах ржи антитриптическая активность резко падает /37/.

Данные о локализации ингибиторов сериновых протеиназ у различных растении семейства злаковых, а также результаты исследования синтеза и распада белков-ингибиторов ячменя, по-видимому, свидетельствуют о том, что они вряд ли играют сколько-нибудь существенную роль в основном метаболизме белка развивающихся тканей. Возможно, функции ингибиторов сериновых протеиназ связаны с состоянием покоя семени и/или его прорастанием. Необходимо отметить, что различие в распределении, а также метаболизме ингибиторов трипсина и ингибиторов химотрипсина и сериновых микробных протеаз может говорить о разнообразии в выполняемых ими функциях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ливенская, Ольга Анатольевна

5. В Ы В О Д Ы

1. Показано, что покоящиеся семена злаков характеризуются высоким содержанием ингибиторов трипсина, химотрипсина и субтилизина. Во всех исследованных объектах содержание ингибиторов субтилизина было выше содержания ингибиторов трипсина и химотрипсина.

2. С помощью аффинной хроматографии на химотрипсин-сефарозе и трипсин-сефарозе из семян кукурузы выделены специфические белки-ингибиторы химотрипсина и трипсина. Ингибитор химотрипсина представлен тремя молекулярными формами с pi 4,4; 4,6 и 5,1. Ингибитор трипсина - двумя формами с pi 4,5 и 5,6.

3. Молекулярный вес ингибитора химотрипсина, определенный методом гель-хроматографии, равен 19000. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии DS-Ua и уб -меркаптоэтанола получено значение < 10000. На этом основании сделано заключение, что молекула ингибитора представляет собой димер. Ингибитор трипсина является мономером с молекулярным весом 10000 (гель-хроматография).

4. Характерной особенностью ингибитора химотрипсина из кукурузы является отсутствие в его составе остатков цистина, что опровергает представление о том, что наличие дисульфидных связей является неотъемлемым свойством ингибиторов протеиназ растительного происхождения.

5. Ингибитор химотрипсина из семян кукурузы подавляет активность субтилизина и ряда других сериновых протеиназ микроорганизмов. Реакция с ферментами не сопровождается диссоциацией димерной молекулы ингибитора на составляющие протомеры и преобладающая форма комплекса имеет состав

6. Вторичная структура ингибиторов химотрипсина и трипсина исследована с помощью метода КД. Ингибиторы из кукурузы по сравнению с другими ингибиторами протеиназ растительного происхождения характеризуются более высоким содержанием «^-спиральных участков. Проведенный анализ позволяет сделать заключение, что ингибитор химотрипсина относится к структурному классу белков (cL + уб), а ингибитор трипсина - к классу djJb .

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свойства ингибиторов протеолитических ферментов, содержащихся в высших растениях, интенсивно изучаются /5,27/. Однако эти исследования до последнего времени касались главным образом ингибиторов, присутствующих в семенах бобовых растений. Что касается ингибиторов протеиназ из семян злаков, то сведения о них весьма ограничены. Достаточно полно изучены лишь ингибиторы из семян ячменя, представленные тремя группами белков, включая ингибиторы трипсина /132,139/, химотрипсина и сериновых протеиназ микроорганизмов/90,108,149/, а также собственной цистеиновой протеиназы семян /50/. Б то же время высокие содержания ингибиторов протеиназ в растениях семейства злаковых (см.табл.1), а также обнаружение ингибиторов протеиназ ряда микроорганизмов в семенах ячменя /90,108,149/ и специфического ингибитора протеиназ пищеварительного тракта личинок жука Triboiium castaneum в пшеничной муке /13/ говорят о важности биологических функций, выполняемых ингибиторами сериновых протеиназ в растительных тканях.

В связи с этим актуальным является выявление новых ингибиторов сериновых протеиназ в растениях семейства злаковых и их сравнительное изучение.

В представленной работе описано выделение из семян кукурузы нового, ранее не описанного белка-ингибитора химотрипсина - высокоэффективного ингибитора субтилизина и ряда родственных микробных протеиназ. Проведено сравнительное изучение данного белка с другим белком, выделенным из семян кукурузы, - ингибитором трипсина.

Б качестве методического подхода для выделения белков была использована аффинная хроматография. Полученный методом биоспецифической хроматографии ингибитор химотрипсина представлен тремя фордами с положениями pi 4,45, 4,65 и 5,10; ингибитор трипсина -двумя формами с pi 4,50 и 5,60. Четыре белка с pi 4,45, 4,65, 5,10, 5,60 полностью гомогенны при электрофорезе в полиакриламидном геле.

Молекулярный вес белков из кукурузы, определенный методом гель-хроматографии, равен 19000 и 10000 соответственно для ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина.

Выделенный из кукурузы ингибитор химотрипсина отличается по ряду особенностей аминокислотного состава от ингибитора трипсина из той же культуры. Прежде всего,в молекуле ингибитора химотрипсина полностью отсутствует цистин, что коренным образом отличает его от большинства других ингибиторов протеиназ из растений. Ингибитор трипсина характеризуется относительно высоким содержанием полуцистина, что является особенностью ингибиторов трипсина, выделенных из растительных объектов; отсутствие свободных SH-rpynn в молекуле ингибитора трипсина говорит о наличии трех дисульфидных связей. Тогда, как аминокислотный состав ингибитора химотрипсина характеризуется высоким содержанием валина и лизина, в молекуле ингибитора трипсина особенно много остатков пролина и глинина.

Оба белка из кукурузы отличаются низким содержанием аромато-ческих аминокислот, а также одинаковым и невысоким содержанием аминокислотных остатков, белковые цепи которых способны принимать участие в образовании водородных связей. .Величина . ,nps. исследуемых белков ( hps =0,36) позволяет поставить полученные ингибиторы в один ряд с белками, характеризующимися высокой степенью гидрофобности /225/.

Оба ингибитора из кукурузы имеют характерные для белков спектры поглощения с максимумом при 280 нм и минимумом в районе 250 нм. Полученные невысокие значения молярных коэффициентов экстинкции коррелируют с низким содержанием ароматических аминокислот в молекулах ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина.

Как известно, люминиснирующими аминокислотами являются триптофан, тирозин и фенилаланин. При проведении аминокислотного анализа содержание триптофана в молекулах, выделенных из кукурузы белков не определялось, однако судя по спектрам собственной флуоресценции, люминесценция ингибиторов обусловлена не только остатками тирозина и фенилаланина, но и триптофана. Данные, полученные с помощью спектрофотометрического метода, показывают, что в ингибиторе трипсина содержится не менее трех остатков триптофана на молекулу. На основании значительной разница квантового выхода флуоресценции белков-ингибиторов можно полагать, что на поверхности ингибитора химотрипсина локализована лишь небольшая часть ароматических аминокислот.

Особенностью ингибитора химотрипсина из кукурузы является наличие у него четвертичной структуры. По результатам электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия молекула данного белка состоит из двух субъединиц одинакового молекулярного веса. Бели-чина молекулярного веса субъединиц, рассчитанная из реакции взаимодействия ингибитора с субтилизином, равна 9000.

Как было показано, взаимодействие ингибитора химотрипсина с ферментом не приводит к диссопиавди его молекулы на субъединицы. Отсутствие диссоциации на субъединицы было установлено и для ингибитора из картофеля /141/. Некоторые из известных ингибиторов микробных протеиназ, продуцируемых актиномицетами, также представляют собой стабильные димеры и не диссоциируют на субъединицы при образовании комплексов с ферментами /250/.

При изучении взаимодействия ингибитора химотрипсина с ферментами ( J, -химотрипсином и субтилизином), а также при определенш молекулярного веса образующихся комплексов выявлено, что в белке-ингибиторе химотрипсина из кукурузы присутствуют два независимых центра связывания ферментов. В молекуле же ингибитора трипсина с Mr 10000 содержится один пентр связывания трипсина.

Два белка-ингибитора сериновых протеиназ из семян кукурузы различаются по пространственной организации молекул и устойчивости к действию денатурирующих агентов. Анализ спектров "ИД в дальней УФ-области позволяет полагать, что ингибитор химотрипсина и ингибитор трипсина из кукурузы цринадлежат к двум различным структурным классам белков: ингибитор химотрипсина - к jb)-классу, ингибитор трипсина - к Л/Jb -классу. В характере спектра КД ингибитора трипсина в дальней УФ-области наблюдаются черты сходства с ингибиторами протеиназ из плазмы крови, особенно с антитромбином Ш /237-240/.

Заслуживает внимания более высокая степень спирализации молекул ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина из кукурузы по сравнению с другими изученными ингибиторами протеиназ из растений. На долю cL -спиральных участков в обоих белках из кукурузы приходится 16-21%, а в большинстве других ингибиторов из растений еА,-спирали полностью отсутствуют или их содержание составляет несколько процентов /229-232/.

Изучение влияния денатурирующих агентов(повышение температуры, гуанидинхлорид,додецилсульфат натрия) показало, что конформация ингибитора химотрипсина характеризуется большей лабильностью в значительной мере из-за отсутствия дисульфидных связей в молекуле.Характер и глубина изменений конформавди исследуемых ингибиторов и их активности в присутствии гуанидинхлорида и додецилсульфата натрия при низкой степени спирализованности белков,а также одинаковом и высоком содержании гидрофобных аминокислот в молекулах позволяет полагать, что гидрофобные взаимодействия играют значительную роль в формировании третичной структуры ингибитора химотрипсина и наряду с водородными связями вносят существенный вклад в поддержание нативной конформации ингибитора трипсина.

Ингибитор трипсина из кукурузы отличается узким спектром действия на ферменты. Константа ингибирования (K-j-) комплекса ингибитора с трипсином составляет 2,84«Ю-9 М. Б отличие от ингибитора трипсина ингибитор химотрипсина из кукурузы угнетал активность ряда микробных цротеиназ. Особый интерес представляет тот факт, что данный белок обладает более сильным ингибиторным действием на субтилизин и другие сериновые протеиназы микроорганизмов по сравнению с действием на химотрипсин. Константы ингибирования равны 2,1*10""® М для субтилизина и 7-Ю"8 М для химотрипсина.

Из числа известных ингибиторов протеиназ ингибитор химотрипсина и ряда микробных протеиназ, выделенный нами из семян кукурузы, в наибольшей степени напоминает ингибитор химотрипсина и сериновых протеиназ микроорганизмов из ячменя /52,108/. Оба белка близки по специфичности действия, молекулярному весу мономеров и димерных форм, аминокислотному составу. В связи с этим интерес представляет недавно установленная Свендсеном и соавторами гомология первичной структуры ингибитора химотрипсина и микробных протеиназ из ячменя и ингибитора химотрипсина I из клубней картофеля /106/. Существенно при этом отметить, что,как и в наших исследованиях ингибитор из картофеля также обладал высокой активностью по отношению к химотрипсину и некоторым другим сериновым протеиназам микроорганизмов /141/. Кроме того, как было обнаружено, профиль спектра КД ингибитора химотрипсина из кукурузы напоминает спектр КД ингибитора химотрипсина I, выделенного из картофеля /31/. Таким образом можно полагать, что все три ингибитора микробных протеиназ из ячменя, кукурузы и картофеля принадлежат к одному семейству белковых ингибиторов протеиназ /5/.

Б заключение необходимо отметить, что наши исследования, расширяя число известных ингибиторов протеиназ из растений, специфичных в отношении протеиназ микроорганизмов, существенно подтверждают предположение о важной роли ингибиторов в защите растений от бактериальных и грибных инфекций /28/.

114

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ливенская, Ольга Анатольевна, Москва

1. Neurath Н., Walsh А.К. Role of proteolytic enzymes in biological regulation. Pros. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, 73, 3825-3832.

2. Neurath H. Evolution of proteolytic enzymes. Science, 1984, 224, 350-357.

3. Blobel G., Dobberstein B. Transfer of protein across membranes. I. Presence of proteolytically pocessed a;nd unprocessed nascent immunoglobulin light chains of membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J. Cell. Biol., 1975, 67, 835-851.

4. Локшина JI.A. Регудяторная роль протеолитических ферментов. -Молекулярная биология, 1979, 13, 1205-1229.

5. Laskowski M.Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases. -Ann. Rev. Biochem., 1980, 593-626.

6. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протео-лиза. Баховские чтения ХХХ1У. М.: Наука, 1983 , 40.

7. Мосолов В.В. Цротеолитические ферменты. М.: Наука, 1971, 414.

8. Мосолов В.В. Природные ингибиторы протеолитических ферментов. -Успехи биологической химии, 1982, 22, I00-II8.

9. Lipke Н., Fraenkel G.S., Liener J.E. Effects of soybean inhibitors on growth Tribolium confusum. J. Agric. Food Chem., 1954, 2, 410-414.

10. Birk Y., Applebaum S.W. Effect of soybean trypsin inhibitors on the development and midgut proteolytic activity of Tribolium castaneum larvae. Enzymologia, I960, 22, 318-326.

11. Birk У., Gertler A., Khalef S. Seperation of a Tribolium-protease inhibitor from soybeans on a calcium phosphate column. Biochim. et biophys. acta, 1963, 67, 326-328.

12. Рагозина И.И., Шнейдер Ю.И., Липсиц Д.В. Активность протеиназ в пораженных "черной ножкой" ( Pectobacterium phytophtorum) тканях картофеля. Докл. АН СССР, 1969, 184 , 242-245.

13. Hancock T.G., Millar R.L. Association of cellulolytic , proteolytic and xylolytic enzymes with Southern anthoracuose, spring black stem and stemphylium leaf spot of alfalfa. -Phytopathology, 1965, 356-360.

14. Mosolov V.Y., Loginova M.D., Malova E.L., Benken I.I.

15. A specific inhibitor of Collettotrichum lindemuthianum protease from kidney bean (Phaseolus vulgaris) seeds. Planta, 1979, 144, 265-269.

16. Mosolov V.V., Loginova M.D., Fedurkina N.V., Benken I.I. The biological significance of proteinase inhibitors in plants. Plant Sci. Lett., 1976, 2, 77-80.

17. Федуркина H.B. Белки-ингибиторы сериновых протеиназ из фасоли. -Дис. канд. биол. наук. М., 1979, 156.

18. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы протеолитических ферментов. -Дис. докт. биол. наук. М., 1979, 396.

19. Покровский С.Н., Винницкая Н.Ю., Сизова Т.П., Белозерский М.А. Дейстше ингибиторов протеиназ из семян гречихи на протеолитичес-кие ферменты гриба Alternaria tenuis Ness . Докл. АН СССР, 1981, 259, 495-498.

20. Черников М.П., Стан Е.Я., Ляйман М.Э. Биологически активные белки и пептиды пищи. ®урн. Всесоюзн. хим. об-ва, 1978, 23, 379389.

21. Kunitz М., Nortrop J.H. Isolation from beef pancreas of crystalline trypsinogen, trypsin, a trypsin inhibitor andan inhibitor- trypsin compound. J. Gen. Physiol., 1936, 19, 991-Ю07.

22. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor. J. Gen. Physiol., 1946, 29, 149.

23. Kunitz M. Isolation of a crystalline protein compound of a trypsin and soybean trypsin-inhibitor. J. Gen. Physiol., 1947, 30, 311-320.

24. Richardson M. The proteinase inhibitors of plants and microorganisms. Phytochemistry, 1977, 16, 159-169.

25. Ryan C.A. Proteolytic enzymes and their inhibitors in plants. -Ann. Rev, Plant Physiol., 1973, 24, 173-196.

26. Vogel R., Trautshold I., Werle E. Natural proteinase inhibitors, New York and London! Acad. Press, 1968, 9-42.

27. Peeney R.E., Allison R.G. Evolutionary biochemistry of proteins. N.Y.: Willey-Interscience, Inc., 1969, 199.

28. Laskowski M.Jr., Sealock R.W. Protein proteinase inhibitors -molecular aspects. In! The Enzymes / Ed. Boeyr P.D. N.Y.: Acad, press, 1971, 3, 375-473.

29. Liener I.E., Kakade M.L. Proteinase inhibitors. In! Toxic constituents of plant foodstuffd / Ed. Liener I.E. N.Y.:1. Acad, press, 1969, 8-68.

30. Birk Y. Proteinase inhibitors from plant sources. In! Methods in Enzymol., 1976, 4£, 695-739.

31. Ryan C.A., Shumway L.K. Studies on the structure and function of chymotrypsin inhibitor I in the Solanaceae. In: Proc. Intern. Res. Conf. on Proteinase Inhibitors. B.I Walter de Gruyter, 1971, 175-188.

32. Sumathi S., Pattabiraman T.N. Natural plant enzyme inhibitors. Part V. A trypsin/chymotrypsin inhibitor from Alocasia macrorhiza tuber. Biochim. et biophys. acta, 1977, 485, 167-178.

33. Sumathi S., Pattabiraman T.N. Natural plant enzyme inhibitors. Part VI. Studies on trypsin inhibitors in Colocasia antiquorum tubers. Biochim. et biophys. acta, 1979, 566, II5-I27.

34. Polanowski A. Trypsin inhibitor from rye seeds. Acta biochim. polon., 1967, 14, 389-395.

35. Shain Y., Mayer A.M. Proteolytic enzymes and endogenous trypsin inhibitor in germinating lettuce seeds. Physiol, plant., 1965, 18, 853-859.

36. Burger W.C., Siegelman H.W. Location of a protease and its inhibitor in barley kernel. Physiol, plant., 1966, 19, Ю89-Ю93.

37. Chen I., Mitchell H.L. Trypsin inhibitors in plants. -Phytochemistry, 1973, 12, 327-330.

38. Перуанский Ю.В., Фурсов O.B. Биологические основы семеноведения и семеноводчеетва интродуцентов. Реф. докл. IУ Всесоюзн. совещания. Новосибирск: Наука, 1974, 219.

39. Фурсов О.В. Выделение и изучение системы протеиназа-ингибитор зерна пшеницы. Химия природных соединений, 1975, б, 642-645.

40. Kinger Y.E. Purification and some properties of malted-wheat

41. BAPAase. Cereal Chem., 1971, 48» 512-522.

42. Horiguchi Т., Kitagishi K. Studies on rice seed protease. V. Protease inhibitor in rice seed. Plant and Cell Physiol., 1971, 12, 907-915.

43. Harvey B.M.R., Oaks A. Characteristics of an acid protease from maise endosperm. Plant Physiol., 1974, 53, 449-454.

44. Enary T.-M., Mikola J. Characterization of the soluble proteolytic enzymes of green malt. In! Proc. Ilth Congr., Eur. Brew. Conv., Madrid*. Elsevier, Amsterdam, 1967, 9-16.

45. Mikola J., Enari T.-M. Changes in the contents of barley proteolytic inhibitors during malting and mashing. J. Inst. Brew., 1970, 76, 182-188.

46. Mikola J., Suolinna E.-M. Purification and properties of microbial alkaline proteinases from barley. Arch. Biochem. Biophys., 1971, 144» 566-575.

47. Warchalewski J.R., Skupin J. Isolation and properties of trypsin and chymotrypsin inhibitors from barley drifts afterstorage. J. Sci. Food Agric., 1973, 24, 995-Ю09.

48. Hanford J. The proteolytic enzymes of wheat and flour and their effect on bread quality in the united kingdem. Cereal Chem., 1967, 44» 499-511.

49. Skupin J., Rosiiisca K., Skupin A., Warchalewski J. Sulfhydryl nature of wheat grain protease B. Bull. Acad. Polon. Sci. Ser. biol., 1966, 14, 397-400.

50. Halim A.H., Wassom C.E., Mitchell H.L. Trypsin inhibitor in corn (Zea mays L.) as influenced by genotype and moisture stress. Crop. Sci., 1973, Ц, 405-407.

51. Melville J.C., Scandalios J.C. Maise endopeptidasegenetic control, chemical characterization and relationship to an endogenous trypsin inhibitor. Biochem. Genet., 1972, 7, 15-31.

52. Barber S.C., De Barber В., Flores M.J., Montes J.J. Toxic constituents of rice bran. I. Trypsin inhibitor activity of raw and heat-treated bran. In! 60th Ann. Meeting of AACC, Kansas City, MO, 1973.

53. Hojima Y., Pierce J.V., Pisano J.J. Purification and characterization of an inhibitor of Hageman factor fragments (HFf) from corn. Fed. Proc., 1979, 38, 836.

54. Manjunath N.H., Veerabhadrappa P.S., Virupaksha Т.К. Isolation and characterization of a trypsin inhibitor from finger millet. Phytochemistry, 1983, 22, 2349-2357.

55. Shivaraj В., Pattabiraman Т.К. Characterization of an unusual ^-amylase/trypsin inhibitor from ragi (Eleusine coracana Gaerth.). Biochem. J., 1981, 193,29-36.

56. Campos F.A.P., Richardson M. The complete amino acid sequence of the bifunctional ^-amylase/trypsin inhibitor from seedsof ragi (Indian finger millet, Eleuaine coracana Gaerth). -PEBS Lett., 1983, 152, 300-304.

57. Odani S., Koide Т., Ono T. A possible evolutionary relationship between plant trypsin inhibitor, ^-amylase inhibitor and mammalian pancreatic secretory trypsin inhibitor (Kazal).

58. J. Biochem., 1983, 93, I70I-I704.

59. Mikola J., Kirsi M. Differences between endospermal and embryonal trypsin inhibitors in barley, wheat, and rye. -Acta Chem. Scand., 1972, 26, 787-795.

60. Hochstrasser K., Werle E., Schwarz S., Siegelman R. Uber pflanzliche protease inhibitoren. III. Reindarstellung der trypsin inhibitoren aus keimen von weisen und roggensamen, lokalisierung der aktiven zentren. Z. Physiol. Chem., 1969, 350, 249-254.

61. Boisen S., Djurtoft R. Trypsin inhibitor from wheat endosperm.' purification and characterization. Cereal Chem., 1981, 58, 460-463.

62. Hochstrasser K., Werle E., Siegelman M.R., Schwarz S. Uber pflanzliche proteaseninhibitoren. V. Isolierung und charakte-risierung einiger polyvalenter proteaseninhibitoren aus Solanum tuberosum. Z. Physiol. Chem., 196?, 350, 897-902.

63. Fritz H., Fink E., Gebhardt M., Hochstrasser K., Werle E.1.entifizierung von lysin und argininresten als hemmzentren von proteasinhibitoren mit hilfe von maleinsaureanhydrid und butandion-(2.3). Z. Physiol. Chera., 1969, Д^О, 933-944.

64. Tashiro M., Maki Z. Purification and characterization of a trypsin inhibitor from rice bran. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1979, 2£, 255-264.

65. Tashiro M., Maki Z. Partial purification and some properties of a trypsin inhibitor from rice bran. Agr. Biol. Ghem., 1978, 42, III9-H24.

66. Maki Z., Tashiro M., Sugihara N., Kananmri M. Double-headed nature of a trypsin inhibitor from rice bran. Agr. Biol. Chem., 1980, 44, 953-955.

67. Boisen S., Djurtoft R. Trypsin inhibitor from rye endosperm: purification and properties. Cereal Chem., 1981, 58, 194198.

68. Pilho J.X. Trypsin inhibitors in sorghum grain. J. Pood Sci., 1974, Д9, 422-423.

69. Chang C.-R., Tsen C.C. Note on trypsin inhibitor activity in the acetate extract of cereal samples. Cereal Chem., 1979, 56» 493-494.

70. Chang C.-R., Tsen C.C. Characterization and heat stability of trypsin inhibitors from rye, triticale, and wheat samples. -Cereal Chem., 1981, 58, 2II-2I3.

71. Chang C.-R., Tsen C.C. Isolation of trypsin inhibitors fromrye, triticale, and wheat samples. Cereal Chem., 1981, 58, 207-210.

72. Madl R.L., Tsen C.C. Trypsin and chymotrypsin inhibitors of triticale. In: Triticale: First Man-Made Cereal. Am. Assoc. Cereal Chem: St. Paul, MN / Ed. Tsen C.C., 1974, 168.

73. Kirsi M., Mikola J. Occurence of proteolytic inhibitors in various tissues of barley. Planta, 1971, 96, 281-291.

74. Bruhn L.C., Djurtoft R. Protease inhibitor in barley. Z. Lebensm.-Unters. Forsch., 1977, 164, 247-254.

75. Kirsi M. Protease inhibitors in germinating barley embryos. -Physiol, plant., 1974, 32, 89-93.

76. Chandrasekher G., Raju D.S., Pattabiraman T.N. Natural plant enzyme inhibitors. Protease inhibitors in millets. J. Sci. Food Agric., 1982, Д2, 447-450.

77. Hejgaard J. Isoelectric focusing of subtilisin inhibitors: detection and partial characterization of cereal inhibitors of chymotrypsin and microbial proteases. Anal. Biochem., 1981, 116, 444-449.

78. Kirsi M., Mikola J. Occurrence tod heterogeneity of chymotrypsin inhibitors in vegetative tissues of barley. Physiol, plant., 1977, 39, II0-II4.

79. Mundy J., Hejgaard J., Svendsen I. Characterization of a bifunctional wheat inhibitor of endogenous ^-amylase and subtilisin. FEBS Lett., 1984, 167, 210-214.

80. Mundy J., Svendsen I., Hejga£rd J. Barley ^-amylase/subtilisin inhibitor. I. Isolation and characterization. Carlsberg Res. Commun., 1983, 48, 81-90.

81. Hejgaard J., Svendsen I., Mundy J. Barley ^-amylase/subtilisin inhibitor. II. N-terminal amino acid sequence and homology withinhibitors of the soybean trypsin inhibitor (Kunitz) family. -Carlsberg Res. Commun., 1983, 48, 91-94.

82. Yoshikawa M., Iwasaki Т., Fujii M., Oogaki M. Isolation and some properties of a subtilisin inhibitor from barley. J. Biochem., 1976, 79, 765-773.

83. Weselake R., MacGregor A., Hill R. An endogenous «^-amylase inhibitor in barley kernels. Plant Physiol., 1983, 72, 809812.

84. Rodaway S.J. Composition of ^-amylase secreted by aleurone layers of grains of Himalaya barley. Phytochemistry, 1978, 17, 385-389.

85. O'Connor C.M., McGeeney K.F. Isolation and characterization of four inhibitors from wheat flour which display differential inhibition specificities for human salivary and humam pancreatic c^-amylases. Biochim. et biophys. acta, 1981, 658, 387-396.

86. Learmonth E.M., Wood J.C. A trypsin inhibitor in wheat flour.-Cereal Chem., 1963, 40, 61-65•

87. Matsushima K. On the naturally occurring inhibitors of Aspergillus protease. I. Occurrence and distribution of the inhibitors in natural products. J. agric. chem. Soc. Jap., 1955, 29, 883-887.

88. Matsushima K. On the naturally occurring inhibitors of Aspergil-lus-protease. II. Properties of inhibitors. J. agric. chem. Soc. Jap., 1957, 31, 38-43.

89. Э7. Suolinna E.-M., Mikola J., Enari T.-M. The presence of proteolytic inhibitors against plant, animal and microbial proteinases in barley. In: Fed. Europ. Bicch. Soc. 5th Meet. Praha: Czehoslov. Bioch. Soc., 1968, Abstr.I87.

90. Shyamala G., Kennedy B.M., Lyman R.L. Trypsin inhibitor in wholewheat flour. Nature, 1961, 1^2, 360.

91. Boisen S., Djurtoft R. Protease inhibitor from barley embryo inhibiting trypsin and trypsin-like microbial proteases. Purification and characterization of two isoforms. J. Sci. Pood Agric., 1982, 33, 431-440.

92. Corfman R.S., Reeck J.R. Immunoadsorbent isolation of trypsin inhibitors from corn and teosinte seeds. Biochim. et biophys. acta, 1982, 713, 170-174.

93. Burkhard R.K., Adams S., Corfman R.S., Reeck C.R. Thermodynamic measurements on the interaction of porcine trypsin with single- and two-chain trypsin inhibitors from corn seeds. J. Agric. Pood Chem., 1979, 27, 452-454.

94. Hojima J., Pierce J.V., Pisano J.J. Hageman factor fragment inhibitor in corn seeds! purification and characterization.-Thrombosis Research, 1980, 20, 149-162.

95. Kirsi M. Formation of proteinase inhibitors in developing barley grain. Physiol, plant., 1973, 29, I4I-I44.

96. Jonassen I. Characteristics of Hiproly barley. I. Isolation and chyrycterization of two water-soluble high-lysine proteins. Carlsberg Res. Comraun. , 1980, 47-58.

97. Jonassen I. Characteristics of Hiproly barley. II. Quantification of two proteins contributing to its high lysine content. Carlsberg Res. Coinmun., 1980, 4^, 59-68.

98. Svendsen I., Jonassen I. Amino acid sequence homology between a serine protease inhibitor from barley and potato inhibitor I. Carlsberg Res. Commun. , 1980, 4^., 389-395.

99. Hejgaard J., Boisen S. High-lysine proetins in Hiproly barley breeding: identification nutritional significanceand new screening methods. Hereditas, 1980, £3, 311-320.

100. Boisen S., Andersen C.Y., Hejgaard J. Inhibitors of chymo-trypsin and microbial serine proteases in barley grains. -Physiol, plant., 1981, £2, 167-176.

101. Svendsen I. Amino acid sequence of serine protease inhibitor CI-I from barley. Homology with barley inhibitor CI-2, potato inhibitor I, and leech eglin. Carlsberg Res.Commun., 1982, 41, 45-53.

102. Miflin B.J., Shewry P.R. The synthesis of proteins in normal and high lysine seeds. In: Recent advances in the biochemistry of cereals / Eds. Laidman D.L., Jones R.G.W. London: Acad, press, 1979, 239-273.

103. Ingversen J., Ktfie B. Lysine-rich proteins in high-lysine Hordeum vulgare graine. Phytochemistry, 1973» 12, 1107-IIII.

104. Jonassen I., Svendsen I. Identification of the reactive sites in two homologous serine proteinase inhibitors isolated from barley. Carlsberg Res. Commun., 1982, 47, 199-203.

105. Hochstrasser K., Muss M., Werle E. Uber pflanzliche proteasen inhibitoren. I. Reindarstellung und characterisierung des trypsin-inhibitors aus mais. Z. Physiol. Chem., 1967, 348, 1337-1340.

106. Swartz M.J., Mitchell H.L., Cox D.J., Reeck G.R. Isolation and characterization of trypsin inhibitor from Opaque-2 corn seeds. J. Biol. Chem., 1977, 252, 8I05-SI07.

107. Koide Т., Tsunasawa S., Ikenaka T. The amino acid sequence of soybean trypsin inhibitor (Kunitz). J. Biochem., 1972, XI, 165-167.

108. Wilson K.A., Laskowski M.Jr. The partial amino acid sequence of trypsin inhibitor II from garden bean, Phaseolus vulgaris, with location of the trypsin and elastase-reactive sites. -J. Biol. Chem., 1975, 250, 4261-4267.

109. Koide Т., Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. 3. Amino-acid sequence of carboxyl-terminal region and the complete amino-acid sequence of soybean trypsin inhibitor (Kunitz). Europ. J. Biochem., 1973, 32, 417-431.

110. Jones G., Moore S., Stein W.H. Properties of chromatogra-phically purified trypsin inhibitors from lima beans. -Biochemistry, 1963, 2, 66.

111. Pusztai A. The isolation of two proteins, glycoprotein I and a trypsin inhibitor, from the seeds of kidney bean (Phaseolus vulgaris). Biochem. J., 1966, 101, 379-384.

112. Obara Т., Watanabe Y. Heterogeneity of soybean trypsin inhibitors. II. Heat inactivation. Cereal Chem., 1971, 48, 523-527.

113. Tur-Sinai A., Birk Y., Gertler A., Rigbi M. A basic trypsin-and chymotrypsin-inhibitor from groundnuts (Arachis hypogaea). Biochim. et biophys. acta, 1972, 263, 666-672.

114. Iwasaki Т., Kiyohara Т., Yoshikawa M. Purification and partial characterization of two different types of proteinaseinhibitors (inhibitors II-a and Il-b). J. Biochem., 1971, 70, 817-826.

115. Green N.M., Work E. Pancreatic trypsin inhibitor. 2. Reaction with trypsin. Biochem. J., 1953, 54, 347-352.

116. Iwasaki Т., Kiyohara Т., Yoshikawa M. Chemical and physico-chemical characterization of two different types of proteinase inhibitors (inhibitors Ila and lib) from potatoes. J. Biochem., 1972, 72, Ю29-Ю35»

117. Iwasaki Т., Kiyohara Т., Yoshikawa M. Amino acid sequence of an active fragment of potato proteinase inhibitor Ila. J. Biochem., 1976, 79, 381-391.

118. Polanowski A. Trypsin inhibitor from starchy endosperm of rye seeds. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 1974-, 43, 27-37.

119. Mistunaga T. Isolation and characterization of trypsin inhibitors from wheat germ. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1979, 25» 43.

120. Ogiso Т., Noda Т., Sako Y., Kato Y., Aoyama M. Studies on trypsin inhibitor in barley. I. Purification and some properties. J. Biochem., 1975, 78, 9-17.

121. Odani S., Koide Т., Ono T. The complete amino acid sequence of barley trypsin inhibitor. J. Biol. Chem., 1983, 258, 7998-8003.

122. Biedermann K., Montali H., Martin В., Svendsen I., Ottesen M.

123. The amino acid sequence of proteinase A inhibitor I from baker's yeast. Carlsberg Res. Commun., 1980, 45, 225-235.

124. Maier H., Miiller H., Tesch R., Witt I., Holzer H. Amino acid sequence of yeast proteinase Б inhibitor I. Comparison with inhibitor 2. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 91, I39I-I398.

125. Veerabhadrappa P.S., Manjunath H.N., Virupaksha Т.К. Proteinase inhibitors of finger millet (Eleusine coracana Gaerth).-J. Sci. Pood Agric., 1978, 29, 353-358.

126. Ikeda K., Kusano T. Isolation and some properties of a trypsin inhibitor from buckwheat grain. Agr. Biol. Chem., 1978, 42, 309-314.

127. Shyamala G., Lyman R.L. The isolation and purification of a trypsin inhibitor from whole wheat flour. Canad. J. Biochem., 1964, 42, 1825-1832.

128. Mikola J., Suolinna E.-M. Purificatiom and properties of a trypsin inhibitor from barley. Europ. J. Biochem., 1969, 9, 555-560.

129. Melvill Y.C., Ryan C.A. Chymotrypsin inhibitor I from potatoes. Large scale preparation and characterization of its subunit components. J. Biol. Chem., 1972, 247, 34453453.

130. Ryan C.A. Chymotrypsin inhibitor I from potatoes: reactivity mammalian, plant, bacterial, and fungal proteinases. -Biochemistry, 1966, 1592-1596.

131. Kiyohara Т., Iwasaki Т., Yoshikawa M. Chemical and physico-chemical characterization of potato proteinase inhibitor I and comparison of its specificity with those of inhibitors II-а and Il-b. J. Biochem., 1973, 73, 89-95.

132. Ogiso Т., Aoyama M., Watanabe M., Kato Y. Studies on barley trypsin inhibitor. II. Structural changes induced by denatu-rants and their reversibility. J. Biochem., 1976, 79, 321328.

133. Kassell В., Laskowski M.Jr. The basic trypsin inhibitor of bovine pancreas. IV. Sequence studies and disulphide linkages. Acta biochim. polon., 1966, 13, 287-303.

134. Vincent J.-P., Lazdunski M. Trypsin-pancreatic trypsin inhibitor associatiQn. Dynamics of the interaction and role of disulfide bridges. Biochemistry, 1972, II, 2967-2977.

135. Davie E.W., Neurath H. The terminal groups of soybean trypsin inhibitor. J. Biol. Chem., 1955, 212, 507-514.

136. Petrucci M., Tomasi M., Cantagally P., Silano V. Comparison of wheat albumin inhibitors of <т£-ату1азе and trypsin. -Phytochemistry, 1974, 13, 2487-2495.

137. Odani S., Koide Т., Ono T. Sequence homology between barley trypsin inhibitor and wheat «^-amylase inhibitors. FEBS Lett., 1982, 141, 279-282.

138. Kassell B. Naturally ocyrring inhibitors of proteolytic enzymes. In.' Methods in Enzymol., 1970, 19, 839-906.

139. Svendsen I., Boisen S., Hejgaard J. Amino acid sequence of serine protease inhibitor CI-I from barley. Homology with barley inhibitor CI-2 and potato inhibitor I. Carlsberg

140. Res. Commun., 1981, 46, 199-203.

141. Hochstrasser K., Schwarz S., Ilichmann K., Werle E. Uber pflanzliche proteinaseinhibitoren. II. Untersuchungen zun hemmechanismus pflanzlicher trypsininhibitoren. Z. Physiol. Chem., 1968, 349, 1449-1455.

142. Richardson M., Barker R.D.J., McMillan R.T., Cossins L.M. Identification of the reactive (inhibitory) sites of chymotryptic inhibitor I from potatoes. Phytochemistry, 1977, 16, 837-839.

143. Seemiiller U., Fritz H., Eulitz M. Eglin: elastase-cathepsin G inhibitor from leeches. In! Methods in Enzymol., 1981, 80, 804-816.

144. Plunkett G., Ryan C.A. Reduction and carboxamidomethylation of the single disulfide bond of proteinase inhibitor I from potato tubers. Effect on stability, immunological properties, and inhibitory activities. J. Biol. Chem., 1980, 255, 27522755.

145. Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of the secondery structure of proteins from their '^.mino acid sequence. Adv. Enzymol. / Ed. Meister A., J.Wiley and Sons, 1978, 47, 45160. Kominami E., Hoffschulte H., Leuschell L., Maier K., Holzer H.

146. The substrate specificity of proteinase В from baker's yeast. Bioohim. et biophys. acta, I981, 661, I36-I4I.

147. Huat L.T., Barker W.C., Dayhoff M.O. Epidermal growth factor.' internal duplication and probable relationship to pancreatic secretory trypsin inhibitor. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, 60, 1020-1028.

148. Redman D.G. N-terminal amino acid sequence of wheat proteins that lack phenylalanine and histidine residues. Biochem.J., 1976, 193-195.

149. Odani S., Koide Т., Ono Т., Ohnishi K. Structural relationship between barley (Hordeum vulgare) trypsin inhibitor and castor-bean (Ricinus communis) storage protein. Biochem.J., 1983, 213, 543-54-5.

150. Greene L.J., Bartelt D.C. The structure of the bovine pancreatic secretiry trypsin inhibitor Kazal's inhibitor. II. The order of the tryptic peptides. - J. Biol. Chem., 1969, 24A, 2646-2657.

151. Kato I., Schroder J., Wilson K.A., Laskowski M.Jr. Evolution of proteinase inhibitors. In! Protides of the Biol. Fluids/ Ed. Peters H. N.Y.Pergamon Press, 1976, 235-243.

152. Tschesche H. Biochemistry of natural proteinase inhibitors. -Angew. Chem. (Intern. Ed.), 1974, 13, 10-28.

153. Rigbi M., Greene L.J. Limited proteolysis of the bovine pancreatic secretory trypsin inhibitor at acid pH. J.Biol. Chem., 1968, 243, 5457-5464.

154. Norioka S., Ikenaka T. Amino acid sequence of a trypsin -chymotrypsin inhibitor, B-III, of peanut (Arachis hypogaea).-J. Biochem., 1983, 93, 479-485.

155. Vogel R., Trautschold I., Werle E. Natiirliche proteinasen-inhibitoren. Thieme Verlag, Stuttgare, 1966.

156. Nummi M., Vilhunen R., Enari T.-M. Exclusion chromatography of barley ^-amylase on Sephadex G-75. Acta Chem. Scand., 1965, 19, 1793-1795.

157. Ryan C.A.-, Green T.R. Proteinase inhibitors in natural plant protection. In: Metabolism and regulation of secondary plant product / Eds. Runeckles V.C., Conn E.E. N.Y. Г Acad, press, 1974, 123-140.

158. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы. Микробиология и фитопатология, 1976, 10, 198-201.

159. Поьфовский С.Н. Выделение и изучение белков-ингибиторов трип -сина и химотрипсина из семян гречихи. Дис. канд. биол. наук. М., 1981, 149.

160. Applebaum S.W. Proteolytic digestive enzymes of larvae of the yellow mealworm (Tenebrio molitor L.) and of the rust -red flour beetle (Tribolium casteneum Herbst.). Ph. D. Thesis. The Hebrew University of Jerusalem, 1963, 101.

161. Wong P.P., Kuo Т., Ryan C.A. Growth-dependent accumulation and utilization of proteinase inhibitor I in tobacco callus tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, 63, I2I-I25.

162. Shain Y., Mayer A.M. Activation of enzymes during germination trypsin-like enzyme in lettuce. Phytochemistry, 1968, 7, 1491-1498.

163. Puztai A. Metabolism of trypsin-inhibitory proteins in thegerminating seeds of kidney bean (Phaseolus vulgaris). -Planta, 1972, 101, I2I-I29.

164. Ryan C.A., Huisman О.С* Chymotrypsin inhibitor I from potatoes! a transient protein component in leaves of young potato plants. Nature, 1967, 214, 1047-1049.

165. Royer A., Mifcge M.N., Grange A., Mibge J., Mascherpa J.M. Inhibiteurs anti-trypsine et activity prot^olytiques des Albumines de graine Vigna unguiculata. Planta, 1974, 119, I-I6.

166. Gennis L.S., Cantor C.R. Double-headed protease inhibitors from black-eyed peas. II. Structural studies by optical absorption and circular dichroism. J. Biol. Chem., 1976, 251, 741-746.

167. Reddy M.N., Keim P.S., Heinrikson R.L., Kezdy P.J. Primary structural analysis of sulfhydryl protease inhibitors from pineapple stem. J. Biol. Chem., 1975, 2£0, I74I-I750.

168. Ryan C.A. Inhibition of carboxypeptidase A by a naturally occurring polypeptide from potatoes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, 44, 1265-1270.

169. Rancour J.M., Ryan C.A. Isolation of a carboxypeptidase В inhibitor from potatoes. Arch. Biochem. Biophys., 1968, 125., 380-383.

170. Baumgartner В., Chrispeels M.J. Partial characterization of a protease inhibitor which inhibits the major endopeptidase present in the cotyledons ©f mung beans. Plant Physiol., 1976, 58, 1-6.

171. Abe M., Arai S., Kato H., Fujimaki M. Thiol-proease inhibitors occurring in endosperm of corn. Agr. Biol. Chem., 1980,44, 685-686.

172. Applebaum S.W., Birk Y., Harpaz I., Bondi A. Comparative studies on proteolytic enzymes of Tenebrio molitor L. -Сотр. Biochem. Physiol., 19б4, II, 85-103.

173. Green T.R., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibitor in plant leaves! a possible defense mechanism against insect. -Science, 1972, 776-777.

174. Green T.R., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibitor in tomato leaves some effects of light and temperature of the wound responce. - Plant Physiol., 1973, 51, 19-21.

175. Ryan C.A. Proteinase inhibitors in plant leaves! a biochemical model for pest-induced natural plant protection. Trends in Biochemical Sciences, 1978, 3, 148-150.

176. McFarland D., Ryan C.A. Proteinase inhibitor-inducing factor in plant leaves. Plant Physiol., 1974, £4, 706-708.

177. Halim A.H., Mitchell H.L., Wassom C.E. Trypsin inhibitors in corn (Zea mays L.). Trans. Kans. Acad. Sci., 1973, 76, 289-293.

178. Halim A.H., Wassom C.E., Mitchell H.L., Edmunds L.K. Suppression of fungal growth by isolated trypsin inhibitors of corn grain. J. Agric. Pood Chem., 1973, 21, III8-III9.

179. Marshall J.J. Carbohydrate Research, 1977, 57, 27.

180. Richardson M. The complete amino acid sequence and the trypsin reactive (inhibitory) site of the major proteinase inhibitor from the fruits of aubergine (Solanum melongena L.), PEBS Lett., 1979, 104, 322-326,

181. Hass G.M., Venkatakrishnan R., Ryan C.A. Homologous inhibitors from potato tubers of serine endopeptidase and metallo-carboxypeptidases. Pros. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, 73, I94I-I944.

182. Svendsen I., Martin В., Jonassen I. Characteristics of Hiproly barley. III. Amino acid sequence of two lysine -rich proteins. Carlsberg Res. Comraun., 1980, 4Д, 79-85.

183. Ketcham L.K., Barker W.C., Dayhoff M.O. Atlas of protein sequence and structure / Ed. Dayhoff M.O., 1978, 5, 131-143» National Biomedical Reseach Foundation, Washington DC.

184. Katchalski E., Levin Y., Neumann H., Sharov N. Studies of the enzymatic hidrolysis of poly-e£-amino acids. Bull. Res. Couns. Israel., 1961, I0A, I59-I7I.

185. Нортроп Д., Кунитц M., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. М.: изд-во Ин. лит., 1950, 346.

186. Chase Т., Shaw Е. p-Nitrophenyl-p '-guanidino-benzoate HCLI a new active site titrant for trypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967, 29, 508-514.

187. Shonbaum G.R., Zerner В., Bender M.L. The spectrophotometric determination of the operational normality of an -chymo -trypsin solution. J. Biol. Chem., 1961 236, 2930-2935.

188. Кестере А.Я., Иевлева E.B., Мосолов B.B. ВЬщеление сериновой протеиназы плесневого гриба Aspergillus oryzae методом аффинной хроматографии и характеристика фермента. Прикл.биохим. и микробиол., 1980, 16, 653-660.

189. Ахёп R., Ernback S. Chemical fixation of enzymes to cyanogen halide activated polysaccharide carriers. Europ. J. Biochem., 1971, 18, 351-360.

190. Plat£ N.A., Valuev L.I. Polymeric biospecific adsorbents for binding some blood components. J. Polymer Sci., 1979, C-66, 149-170.

191. Платэ H.A., Валуев Л.И., Егоров H.C., Аль-Бури М.А. Ковалентное связывание актированного трипсина с полимерными носителями.

192. Прикл. биохим. и микробиол., 1977, 13, 673-676.

193. Дукашева Е.В., Айсина Р.В., Казанская Н.Ф., Еремеев Н.Л.

194. Свойства ^-химотрипсина, ковалентно включенного в сферические мшсрограцулы из полиакрил амид а. Биохимия, 1980, 45 , 449 -454.

195. Jacobsen С.Т. The activation of chymotrypsinogen. Compt.rend. trav. Lab. Carlsberg Ser. Chim., 1947, 25, 325210. Щдльгин M.H., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В.

196. Свойства утиного оэомукоица, очинённого методом аффинной хроматографии на трипсин сефарозе. - Биохимия, 1981, 46, 473 -480.

197. Davis J.G. Disc-electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964, 121, 404-411.

198. Maypep Г. Диск-электрофорез. M.: изд-во "Мир", ЮТ.

199. Weber К., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem., 1969, 244, 4406-4412.

200. Остерман JT.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1981, 286.

201. Moore S., Stein W.H. Chromatographic determination of amino acid by the use of automatic recording equipment. In! Methods in Enzymol., 1963, 819.

202. Hirs C.H.W. The oxidation of rebonuclease with perfomic acid. J. Biol. Chem., 1956, 219, 611.

203. Simpson R.L., Neuberger M.R., Lin T.J. Complete amino acid analysis of proteins from a single hydrolysate. J. Biol. Chem., 1976, 2§I, 1936-1940.

204. Ellman G.L. Tissue sulfhidryl groups. Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82, 70-77.

205. Болотина И.A., Чехов B.O., Лагаускас В.Ю., Пгицьгн О.Б. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. П. Учет вклада -изгибов. -Молекулярная биология, 1980, 14, 902-909.

206. Болотина И.А., Чехов В.О., Лагаускас В.Ю., ГЕгицын О.Б. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. Ш. Белковые реперные спектры для антипараллельной и параллельной ^-структур. Молекулярная биология, 1981, 15,167-175.

207. Ryan С.А., Balls А.К. An inhibitor of chymotrypsin from Solanum tuberosum and its behavior toward trypsin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1962, 48, 1839-1844.

208. Kakade M.L., Simons N., Liener I.E. An evaluation of natural vs. synthetic substrates for measuring the antitryptic activity of soybean samples. Cereal Chem., 1969, 46, 518-526.

209. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193» 265-275224. Barnes L.D., Stellwagen E. Enolase from the Thermophile

210. Thermus X-I. Biochemistry, 1973, 12, 1559-1565225- Bigelow C.C. On the average hydrophpbicity of proteins and the relation between it and protein structure.-J. Theoret. Biol.- 1967, 16, I87-2II.

211. Archer B.L. An alkaline protease inhibitor from Hevea brasiliensis latex. Phytochemistry, 1983, 22, 633-639.

212. Seidl D.S. Partial characterization of a subtilisin inhibitor from black bean seeds. Int. J. Peptide Protein Res., 1982, 19, 153-157.

213. Мосолов В.В., Малова E.JI., Чебан А.Н. Шделеше из семян фасоли специфического ингибитора сериновых протеиназ микроорганизмов. Биохимия, 1983, 48, 1680-1686.

214. Ikeda К., Haraaquichi К., Yaraamoto М., Ikenaka Т. Circular dichroism and optical rotatory dispersion of trypsin inhibitors. J. Biochem., 1968, 63, 521-531.

215. Bewley T.A., Birk Y. Circular dichroism spectra of isolated soybean and chickpea trypsin-chymotrypsin inhibitor. -Int. J. Peptide and Protein Res., 1978, 12, 249-257.

216. Sweet R.M., Wright H.T., Janin J., Chothia C.H., Blow D.M.

217. Crystal structure of the complex of porcine trypsin withоsoybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2,6 resolution. -Biochemistry, 1974, 13, 4212-4228.

218. Щульмина А.Й., Дронова JI.А., Назайкинский B.E., Щубин В.В., Мосолов В.В. Спектры кругового дихроизма белков-ингибиторов протеиназ. Биохимия, 1979, 44, 514-520.

219. Grenfield N., Pasman G.D. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. -Biochemistry, 1969, 8, 4I08-4II6.

220. Chen Y.-H., Yahg J.Т., Chan K.H. Determination of the helix and ^B-form of proteins in aqueous solution by circular dichroism. Biochemistry, 1974, 1Д, 3350-3359.

221. Chen Y.-H., Yang J.T. A new approach to the calculation of secondary structure of globular proteins by optical rotatory dispersion and circular dichroism. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, 44» 1285-1291.

222. Strickland E.H. Near-ultraviolet circular dichroism bands of proteins. Handb. Biochem. Mol. Biol. 3rd Ed., 1967, 3, I4I-I66.

223. Jirgensons В. Circular dichroism and conformation of human J^,j-antitrypsin. Biochim. et biophys. acta, 1977, 4-93, 352-358.

224. Laine A., Davril M., Hayem A., Lonchnenx-Lefebre M.H. Comparison of the interactions of human «^j-antichymotrypsin with human leukocyte cathepsin G and bovine chymotrypsin. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1982, 107, 337-344.

225. Nilsson I., Sjoholm I., Wiman B. Circular dichroism studies on c^-antiplasmin and its interaction with plasmin and plasminogen. Biochim. et biophys. acta, 1982, 705, 264270.

226. Villanueva G., Danishefsky I. Conformational changeshaccompanying the binding of antitrombin III to thrombin. -Biochemistry, 1979, 18, 810-817.

227. Mitsui Y., Satow Y., Watanabe Y., Hirono E., Iitaka Y. Crystal structures of Streptomyces subtilisin inhibitor and its complex with subtilisin BPN- Nature, 1979, 277, 447-452.

228. Heimburger N., Haupt H., Scheick H.G. Proteinase inhibitors of human plasma. Proc. Intern. Res. Conf. on Proteinase Inhibitors. В.: Walter de Gruyter, 1971, I-2I.

229. Inouye K., Tonomura В., Hiromi K. The effect of sodium dodecyl sulfate on the structure and function of a protein proteinase inhibitor! Streptomyces subtilisin inhibitor. -Arch. Biochem. Biophys., 1979, 192, 260-269.

230. Kuwjima K., Nitta K. Three-state denaturation of aC-lactal-bumin by guanidine hydrochloride. J. Mol. Biol., 1976, 106, 359-373.

231. Jirgensons B. Conformational transitions of non-helical proteins by dodesyl sulfate. Biochim. et biophys. acta, 1976, 434, 58-68.

232. Levitt M., Chothia C. Structural patterns in globular proteins. Nature, 1976, 26l, 552-558.

233. Manavelan P., Johnson C.Jr. Sensivity of circular dichroism to protein tertiary structure class. Nature, 1983, 305, 831-832.

234. Olafson R.W., Smillie L.B. Enzymatic and physicochemical properties of Streptomyces griseus trypsin. Biochemistry, 1975, 14, II6I-II67.

235. Sato S., Murao S. Complex formation of microbial alkaline protease inhibitor (S-SI) with subtilisin BPN' and its properties. Agr. Biol. Chem., 1974, 18, 2227-2233.